JP6467110B2

JP6467110B2 - エタノールアミンリン酸の測定方法

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Publication number: JP6467110B2
Application number: JP2018505750A
Authority: JP
Inventors: 一謹佐々木; 佐藤　俊; 俊佐藤; かおり阿部; 香織塙; 綾星; 崇臣福原
Original assignee: HUMAN METABOLOME TECHNOLOGIES, INC.
Current assignee: HUMAN METABOLOME TECHNOLOGIES, INC.
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2019-02-06
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: WO2018062204A1; JP6868649B2; JP2019092511A; JPWO2018062204A1

Description

本発明は、サンプル中に存在するエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）の測定方法に関する。

うつ病は気分障害の一種であり、その主な症状は「抑うつ気分」と「興味・喜びの喪失」である。日本の医療機関に対する調査によると、２００８年のうつ病の患者数は７０万人以上とされている。また、２０１４年の厚生労働省の調査によると、気分障害（感情障害）患者数は１１２．２万人であり、患者数が増加してきている。しかし、うつ病の診断は、患者の精神面についての医師や心理士の主観、または患者自身の主観や申告に依存する面が大きく、そのため、客観的な判断がなされているとは言い難い。そこで、うつ病を客観的に診断するために、近年、患者の体液中の成分をうつ病の診断の目安として用いる試みがなされている。

従来、うつ病の予測マーカーとして、体液中のトリプトファンまたはその分解物、あるいは特定の遺伝子の発現量などを用いることが報告されていたが（特許文献１、２）、本発明者らは以前に、血液中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）がうつ病を診断するためのバイオマーカーとして有用であることを見出した（特許文献３、４）。本発明者らはさらに、γ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）を用いてＰＥＡからアセトアルデヒド、リン酸、およびアンモニアを生成させることにより、サンプル中のＰＥＡを測定する方法を開発した（特許文献５）。

国際公開第２００６／１０５９０７号特開２００８−２５３２５８号公報国際公開第２０１１／０１９０７２号国際公開第２０１６／０４７６７７号特許第５６８８１６３号明細書特開第２００３−３３４０９９号公報特許第４１２７７６７号明細書特許第５３２７５７８号明細書特許第５４５８４８７号明細書

本研究者らは、これまでの研究結果から、患者がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための血液中のＰＥＡ量の閾値が約１．５μＭであることを見出した（特許文献４）。しかしながら、従来のＰＥＡの測定方法では（特許文献５）、１．５μＭ未満の値を測定することができなかった。また、測定前のサンプル中にはアセトアルデヒド、リン酸、およびアンモニアが存在しており、従来のＰＥＡの測定方法では（特許文献５）、ＰＥＡを正確に測定することが困難であった。そのため、従来法と比べて高感度にＰＥＡを測定する方法が必要とされている。

したがって、本発明の解決課題は、サンプル中のＰＥＡを高感度に測定するための方法、ならびにその方法を実施するためのキット、プログラム、および装置等を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、従来のＰＥＡの測定方法と比べて高感度にＰＥＡを測定する方法を確立し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下を提供する：
［１］サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を高感度に測定する方法であって、
（ａ）サンプル中のアンモニアおよび／またはリン酸を除去する段階、
（ｂ）段階（ａ）で得られたサンプルに酵素を添加して、サンプルに含まれるＰＥＡからアンモニアおよび／またはリン酸を生成する段階、
（ｃ）段階（ｂ）で得られたサンプルにアンモニア検出用組成物および／またはリン酸検出用組成物を添加する段階、および
（ｄ）段階（ｃ）で得られたサンプル中のアンモニアおよび／またはリン酸を検出する段階
を含む、方法；
［２］段階（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる、［１］に記載の方法；
［３］酵素が、ＰＥＡリアーゼまたはγ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）である、［１］または［２］に記載の方法；
［４］酵素が、
（ｉ）ヒト由来エタノールアミンリン酸ホスホリアーゼ（ＡＧＸＴ２Ｌ１）（配列番号１）、
（ｉｉ）パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓ）由来ＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号２）、
（ｉｉｉ）大腸菌由来のＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号３）、
（ｉｖ）ＧＸＸＸＢＡＤＥＢＱＸＧＦＺＲＸＧ［ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｂはイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）である］（配列番号４）で定義されるアミノ酸配列を含む酵素、
（ｖ）タグが付加された（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに記載の酵素またはタンパク質、および
（ｖｉ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに記載の酵素またはタンパク質の変異体
からなる群から選択される１つ以上の酵素である、［３］に記載の方法；
［５］段階（ａ）において、アンモニアが樹脂を用いて除去される、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の方法；
［６］サンプルが生体試料サンプルである、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の方法；
［７］サンプルが、全血、血清、または血漿サンプルである、［６］に記載の方法；
［８］サンプルが、ＥＤＴＡ、クエン酸、シュウ酸、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）、およびヘパリンからなる群から選択される１つ以上の抗凝固剤で前処理されている全血または血漿サンプルである、［６］に記載の方法；
［９］段階（ｂ）〜（ｄ）の少なくとも１つ以上がアンモニアおよび／またはリン酸が実質的に存在しない環境下で実施される、［１］〜［８］のいずれか一つに記載の方法；
［１０］対象がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）［１］〜［９］のいずれか一つに記載の方法により、サンプル中のＰＥＡを測定する段階；および
（ｂ）サンプル中のＰＥＡの測定値が１．５μＭ未満である場合に、対象がうつ病に罹患していると判定する段階
を含む、方法；
［１１］アンモニアを除去する手段および／またはリン酸を除去する手段を含む、［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の方法を実施するためのキット；
［１２］アンモニア検出用組成物および／またはリン酸検出用組成物を含む、［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の方法を実施するためのキット；
［１３］コンピュータに、［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の方法を実行させるためのプログラム；
［１４］［１３］に記載のプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体；ならびに
［１５］［１１］または［１２］に記載のキットを含む、または［１３］に記載のプログラムが組み込まれた、ＰＥＡを測定するための装置。

本発明によれば、サンプル中のＰＥＡを高感度に測定するための方法、ならびにその方法を実施するためのキット、プログラム、および装置等が提供される。また、対象がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための方法、ならびにその方法を実施するためのキット、プログラム、および装置等が提供される。

図１は、本発明のＰＥＡを測定する方法の一例を示すフロー図である。測定対象として血漿を用いる場合の例を示している。この例では、ＰＥＡをアンモニアに変換して、ＰＥＡの量を測定している。図１において、試薬１はＰＥＡをアンモニアに変換する酵素を含む試薬であり、試薬２は酵素サイクリング溶液であり、試薬３は検出溶液である。図２は、本発明の装置が行う処理を示すフローチャート図の一例である。図３は、陽イオン交換樹脂による処理後の試料中の成分の残存率を示す。ＮＨ３：アンモニア、ＰＥＡ：エタノールアミンリン酸。図４は、酵素法および沈殿法による処理後の試料中の成分の残存率を示す。ＰＥＡ：エタノールアミンリン酸。図５は、オイルでのシールの有無がサンプルへのアンモニア透過に及ぼす影響を調べた結果を示すグラフである。

一つの実施態様では、本発明は、サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を高感度に測定する方法に関する。当該方法は、（１ａ）サンプル中のアンモニアおよび／またはリン酸を除去する段階、（１ｂ）段階（１ａ）で得られたサンプルに酵素を添加して、サンプルに含まれるＰＥＡからアンモニアおよび／またはリン酸を生成する段階、（１ｃ）段階（１ｂ）で得られたサンプルにアンモニア検出用組成物および／またはリン酸検出用組成物を添加する段階、および（１ｄ）段階（１ｃ）で得られたサンプル中のアンモニアおよび／またはリン酸を検出する段階を含む。

本明細書で用いる場合、用語「高感度に」とは、従来のＰＥＡ測定法（特許文献５）に比べて定量限界が低いことを指す。具体的には、１．５μＭ未満のＰＥＡを定量できることを指す。

本明細書で用いる場合、「ＰＥＡを測定する」とは、サンプル中にＰＥＡが存在することを確認し、その量を測定することだけでなく、サンプル中にＰＥＡが存在しない（すなわち、ＰＥＡの量が検出限界以下である）ことを確認することも包含する。

一実施形態では、本発明のＰＥＡを測定する方法では、下記式（１）で示される加水分解反応が利用される。

段階（１ａ）では、アンモニアを除去する公知の手段および方法のいずれを用いてもよい。一実施形態では、段階（１ａ）においてアンモニアが樹脂によって除去される。かかる樹脂の例としては、ＭＣＩＧＥＬＡＦＲ２（三菱化学）、ダウエックス５０Ｗｘ８２００−４００メッシュ強酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ形）などの陽イオン交換樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、段階（１ａ）においてアンモニアが酵素処理によって除去されてもよい。かかる酵素処理の例としては、グルタミン酸脱水素酵素、グルタミン合成酵素、またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド合成酵素による処理が挙げられるが、これらに限定されない。アンモニアの除去については、例えば、特開第２００３−３３４０９９号公報（特許文献６）および特許第４１２７７６７号明細書（特許文献７）に記載されている。

上記式（１）で示される反応が利用される場合、段階（１ｂ）では、上記式（１）で示される反応を触媒する任意の酵素が用いられる。かかる酵素の例として、ＰＥＡリアーゼおよびγ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、段階（１ｂ）で、ヒト由来エタノールアミンリン酸ホスホリアーゼ（ＡＧＸＴ２Ｌ１）（配列番号１）、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓ）由来ＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号２）、および大腸菌由来のＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号３）からなる群から選択される１つ以上の酵素が用いられる。あるいは、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓ）由来ＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号２）または大腸菌由来のＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号３）の変異体を用いてもよい。例えば、上記式（１）で示される反応を触媒し、かつ配列番号２または３のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を用いてもよい。あるいは、上記式（１）で示される反応を触媒し、かつ配列番号２または３のいずれかのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質を用いてもよい。あるいは、配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列にタグが付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質を用いてもよい。例示的なタグとしては、Ｈｉｓ_６−タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、およびＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。タグは、アミノ酸配列のＮ末端に付加してもよく、Ｃ末端に付加してもよい。ヒト由来ＡＧＸＴ２Ｌ１については、ＩＵＢＭＢＬｉｆｅ．２０１３Ｊｕｌ；６５（７）：６４５−５０を参照のこと。

他の実施形態では、段階（１ｂ）で、ＧａｂＴドメインを有する酵素が用いられる。ＧａｂＴドメインとは、ＧＸＸＸＢＡＤＥＢＱＸＧＦＺＲＸＧ［ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｂはイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）である］（配列番号４）で定義されるアミノ酸配列領域である。特許第５６８８１６３号明細書（特許文献５）には、様々な生物種におけるＧａｂＴドメインの配列が記載されている。例示的なＧａｂＴドメインを有する例示的な酵素もまた、特許第５６８８１６３号明細書（特許文献５）に記載されている。別の実施形態では、上記式（１）で示される反応を触媒し、かつＧａｂＴドメインのアミノ酸配列（配列番号４）と５０％以上、例えば、５２％、５８％、６４％、７０％、７６％、８２％、８８％、または９４％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が用いられる。さらに別の実施形態では、上記式（１）で示される反応を触媒し、かつＧａｂＴドメインのアミノ酸配列（配列番号４）において１または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質が用いられる。かかるタンパク質には、上記のようなタグが付加されていてもよい。

好ましい実施形態では、段階（１ｂ）で用いられる酵素は、ヒト由来エタノールアミンリン酸ホスホリアーゼ（ＡＧＸＴ２Ｌ１）（配列番号１）またはパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓ）由来ＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号２）である。より好ましい実施形態では、段階（１ｂ）で用いられる酵素は、ヒト由来エタノールアミンリン酸ホスホリアーゼ（ＡＧＸＴ２Ｌ１）（配列番号１）である。

別の実施形態では、段階（１ａ）の前に、サンプルに上記式（１）で示される反応を触媒する任意の酵素、例えばＰＥＡリアーゼまたはγ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）を添加し、その酵素反応を実施する段階がさらに含まれてもよい。

段階（１ｃ）で用いられる「アンモニア検出用組成物」には、サンプル中に存在するアンモニアを検出するための、任意の組成物、試薬、およびキットが含まれる。例えば、市販のアンモニア検出用の組成物、試薬、またはキットを用いてもよい。例として、シカリキッドＮＨ_３（関東化学株式会社）、アンモニア−Ｌ（株式会社セロテック）、およびＦ−キットアンモニア（株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）が挙げられるが、これらに限定されない。

あるいは、上記の市販品の改良品を用いてもよい。例えば、以下の表に記載の試薬Ｉおよび試薬ＩＩの組み合わせを用いて、サンプル中に存在するアンモニアの量を測定してもよい。

上記の試薬ＩおよびＩＩのｐＨは、適切なバッファーを用いて調整される。ｐＨ調整のために用いられるバッファーには、例えばリン酸カリウムやＴｒｉｓ−ＨＣｌが挙げられるが、これに限定されない。上記の試薬は、例えば塩化ナトリウムなどの塩をさらに含んでもよい。

別の実施形態では、段階（１ｂ）および（１ｃ）が同時に行われる。すなわち、各段階で必要な酵素、組成物、試薬、および／またはキットを同時に用いてもよい。段階（１ｂ）および（１ｃ）を同時に行うことで、サンプルが外気に触れる機会を減らすことができ、より正確な測定が可能となる。

上記式（１）に示されるとおり、加水分解されるＰＥＡと、生成されるアセトアルデヒド、アンモニア、およびリン酸の比率は、ＰＥＡ：アセトアルデヒド：アンモニア：リン酸＝１：１：１：１である。このことから、生成されたアセトアルデヒド、アンモニア、またはリン酸の量を測定することで、元のサンプル中に存在していたＰＥＡの量を測定することができる。したがって、上記式（１）で示される反応が利用される本発明のＰＥＡを測定する方法において、アンモニアと共に、あるいはアンモニアに代えて、アセトアルデヒドまたはリン酸を採用してもよい。

リン酸を測定対象物とする場合、段階（１ａ）では、リン酸を除去する公知の手段および方法のいずれを用いてもよい。リン酸を除去する方法の例として、酵素法および沈殿法が挙げられるが、これらに限定されない。

酵素法では、例えばプリンヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）が用いられる。リン酸を含む試料にキサントシンおよびＰＮＰを添加すると、ＰＮＰの作用によりリン酸がキサントシンと反応し、キサンチンおよびリボース１−リン酸（Ｒｉ１Ｐ）が生じ、リン酸の除去が可能となる。この場合、反応後にＰＮＰの作用を停止するために、ＰＮＰ阻害剤を添加してもよい。あるいは、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を用いてもよい。リン酸を含む試料にスクロースおよびＳＰを添加すると、ＳＰの作用によりリン酸がスクロースと反応し、α−グルコース１−リン酸（α−Ｇｌｃ−１−Ｐとフルクトースが生じ、リン酸の除去が可能となる。この場合、反応後にＳＰの作用を停止するために、ｐＨ約９〜約１０のバッファー（例えばＣＨＥＳバッファー）、あるいは、フルクトースなどのＳＰ阻害剤を添加してもよい。

沈殿法では、リン酸を含む試料に希土類金属イオンまたはアルカリ土類金属イオン（Ｍ^Ｘ＋）が添加される。これにより、難溶性のリン酸塩（ＭＰＯ_４）が生じ、リン酸の除去が可能となる。Ｍ^Ｘ＋の添加後に、溶液のｐＨを９より大きくする、あるいは炭酸イオン（ＣＯ_３ ^２−）を添加して、余剰金属を除去してもよい。沈殿法に用いる試薬としては、ＣａＣｌ_２などの水溶性のカルシウム塩が挙げられる。

一実施形態では、酵素法および沈殿法が併用される。これらの方法を併用することで、より確実にリン酸を除去することができる。

リン酸を測定対象物とする場合、段階（１ｃ）では、リン酸検出用組成物として、サンプル中に存在するリン酸を検出するための、任意の組成物、試薬、および／またはキットが用いられる。例えば、市販のリン酸検出用の組成物、試薬、またはキットを用いてもよい。例示的なリン酸検出用試薬は、マラカイトグリーン（ＭＧ）試薬である。ＭＧ試薬を添加する前にサンプルを限外ろ過に供してもよい。リン酸の測定については、例えば、特許第５３２７５７８号明細書（特許文献８）および特許第５４５８４８７号明細書（特許文献９）に記載されている。

他の実施態様では、下記式（２）で示される加水分解反応を利用して、ＰＥＡを測定してもよい。

上記式（２）で示される反応が利用される場合、本発明は、サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を高感度に測定する方法であって、（２ａ）サンプル中のエタノールアミンを除去する段階、（２ｂ）段階（２ａ）で得られたサンプルに酵素を添加して、サンプルに含まれるＰＥＡからエタノールアミンを生成する段階、（２ｃ）段階（２ｂ）で得られたサンプルにエタノールアミン検出用組成物を添加する段階、および（２ｄ）段階（２ｃ）で得られたサンプル中のエタノールアミンを検出する段階を含む、方法を提供する。あるいは、当該方法において、エタノールアミンと共に、あるいはエタノールアミンに代えて、リン酸を除去および検出してもよい。

段階（２ａ）では、エタノールアミンを除去する公知の手段および方法のいずれを用いてもよい。一実施形態では、段階（２ａ）においてエタノールアミンが樹脂によって除去される。かかる樹脂の例としては、ＭＣＩＧＥＬＡＦＲ２（三菱化学）などの陽イオン交換樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、段階（２ａ）においてエタノールアミンが酵素処理によって除去されてもよい。

上記式（２）で示される反応が利用される場合、段階（２ｂ）では、上記式（２）で示される反応を触媒する任意の酵素が用いられる。かかる酵素の例として、アルカリホスファターゼが挙げられるが、これに限定されない。一実施形態では、段階（２ｂ）で、アルカリホスファターゼまたはその変異体が用いられる。好ましい実施形態では、段階（２ｂ）で用いられる酵素は、アルカリホスファターゼである。

別の実施形態では、段階（２ａ）の前に、サンプルに上記式（２）で示される反応を触媒する任意の酵素、例えばアルカリホスファターゼを添加し、その酵素反応を実施する段階がさらに含まれてもよい。

段階（２ｃ）で用いられる「エタノールアミン検出用組成物」には、サンプル中に存在するエタノールアミンを検出するための、任意の組成物、試薬、およびキットが含まれる。例えば、市販のエタノールアミン検出用の組成物、試薬、またはキットを用いてもよい。

別の実施形態では、段階（２ｂ）および（２ｃ）が同時に行われる。すなわち、各段階で必要な酵素、組成物、試薬、および／またはキットを同時に用いてもよい。段階（２ｂ）および（２ｃ）を同時に行うことで、サンプルが外気に触れる機会を減らすことができ、より正確な測定が可能となる。

上記式（２）に示されるとおり、加水分解されるＰＥＡと、生成されるエタノールアミンおよびリン酸の比率は、ＰＥＡ：エタノールアミン：リン酸＝１：１：１である。このことから、生成されたエタノールアミンまたはリン酸の量を測定することで、元のサンプル中に存在していたＰＥＡの量を測定することができる。したがって、上記式（２）で示される反応が利用される本発明のＰＥＡを測定する方法において、エタノールアミンと共に、あるいはエタノールアミンに代えて、リン酸を採用してもよい。その場合、段階（２ａ）では、上記のような、リン酸を除去する公知の手段および方法のいずれを用いてもよい。また、段階（２ｃ）では、リン酸検出用組成物として、サンプル中に存在するリン酸を検出するための、任意の組成物、試薬、およびキットが用いられる。例えば、市販のリン酸検出用の組成物、試薬、またはキットを用いてもよい。例示的なリン酸検出用試薬は、マラカイトグリーン（ＭＧ）試薬である。

上述のとおり、本発明のＰＥＡを測定する方法は、第１段階として、サンプルからアンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンを除去する段階を含む。アンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、およびエタノールアミンは天然に存在し得るため、サンプル中にこれらが既に存在している可能性が高い。また、サンプル取得段階で、これらがサンプル中に混入する可能性もある。したがって、上記式（１）または（２）の反応を実施する前にサンプル中に存在しているアンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンを除去することにより、従来法に比べて正確かつ高感度に、ＰＥＡから生成したアンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、またはエタノールアミンを検出することができる。

別の実施態様では、本発明は、機器分析法を用いることによる、ＰＥＡを高感度に測定する方法を提供する。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＣ）および蛍光検出器（ＦＬＤ）を利用し、ＰＥＡのポストカラム蛍光誘導体化による定量法によって、ＰＥＡが測定される。他の実施形態では、ＣＥ（キャピラリ−電気泳動法）およびＭＳ（質量分析計）を利用して、ＰＥＡが測定される。この場合、三連四重極型（ＱｑＱ型）のＭＳ装置を用いてもよい。

上述した本発明のＰＥＡを測定する方法は、アンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンが実質的に存在しない環境（アンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンフリーの環境）下で実施されてもよい。「アンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンが実質的に存在しない環境」とは、これらの物質の外部からの流入が軽減または防止されている環境を指す。「実質的に存在しない」とは、これらの物質が完全に存在しない状態だけでなく、これらの物質が検出限界以下である状態も意味する。

かかる環境としては、例えば、大気との接触が遮断された状態を指す。例えば、反応液の上に被膜を形成することで、反応系と大気との接触を遮断してもよい。被膜の形成に用いられる物質の例としては、無色、非揮発性、疎水性、非極性の物質等が挙げられる。例えば、オイルまたは有機溶媒が用いられる。用いられるオイルの例として、ミネラルオイル、植物由来性オイルが挙げられるが、これらに限定されない。用いられる有機溶媒の例として、オクタノール、ドデカノールが挙げられるが、これらに限定されない。

あるいは、減圧下または真空下で本発明のＰＥＡを測定する方法を実施してもよい。「減圧」とは、常圧よりも低い圧力を意味し、例えば周囲の圧力に対して減圧された状態を示しており工業的に利用できる圧力として定義されているＪＩＳ規格の低真空とする９．８６×１０^-４気圧以上であり、９．８６×１０^-４〜９．９９×１０^-１気圧、７．０×１０^-４〜９．９９×１０^-１気圧である。

あるいは、本発明のＰＥＡを測定する方法を実施する環境（例えば、容器）中の大気を、アンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンを実質的に含まない大気に置換してもよい。「アンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンを実質的に含まない」とは、これらの物質が完全に含まれない状態だけでなく、これらの物質が検出限界以下である状態も意味する。

上記式（１）で示される反応が利用される場合、一実施形態では、段階（１ｂ）〜（１ｄ）の少なくとも１つがアンモニア、リン酸、および／またはアセトアルデヒドが実質的に存在しない環境下で実施される。他の実施形態では、段階（１ｂ）〜（１ｄ）の少なくとも２つがかかる環境下で実施される。別の実施形態では、段階（１ｂ）〜（１ｄ）全てがかかる環境下で実施される。

上記式（２）で示される反応が利用される場合、一実施形態では、段階（２ｂ）〜（２ｄ）の少なくとも１つがエタノールアミンおよび／またはリン酸が実質的に存在しない環境下で実施される。他の実施形態では、段階（２ｂ）〜（２ｄ）の少なくとも２つがかかる環境下で実施される。別の実施形態では、段階（２ｂ）〜（２ｄ）全てがかかる環境下で実施される。

別の実施態様では、本発明は、対象がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための方法に関する。当該方法は、（ｉ）本発明のＰＥＡを高感度に測定する方法により、サンプル中のＰＥＡを測定する段階；および（ｉｉ）サンプル中のＰＥＡの測定値が１．５μＭ未満である場合に、対象がうつ病に罹患していると判定する段階を含む。

上述した本発明の方法で用いられるサンプルは、ＰＥＡを含む、または含んでいる可能性がある任意のサンプルである。かかるサンプルの例としては、全血、血清、血漿、組織、脳髄液、および尿などの生体試料サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明で用いられるサンプルは全血、血清、または血漿サンプルであり、好ましくは血漿サンプルである。

他の実施形態では、本発明で用いられるサンプルは、後続の段階に適した状態にするために、事前に処理されていてもよい。例えば、本発明で用いられるサンプルは、抗凝固剤で事前に処理された全血または血漿サンプルである。抗凝固剤の例としては、ＥＤＴＡ、クエン酸、シュウ酸、フッ化ナトリウム、ヘパリンが挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施態様では、本発明は、上述した本発明の方法を実施するためのキットに関する。一実施形態では、本発明のキットはアンモニアを除去する手段を含む。例えば、アンモニアを除去するために用いられる樹脂が含まれる。かかる樹脂の例としては、ＭＣＩＧＥＬＡＦＲ２（三菱化学）、ダウエックス５０Ｗｘ８２００−４００メッシュ強酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ形）などの陽イオン交換樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、アンモニアを別の物質に変換する酵素が含まれる。かかる酵素の例としては、グルタミン酸脱水素酵素、グルタミン合成酵素、およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド合成酵素が挙げられるが、これらに限定されない。

他の実施形態では、本発明のキットは、アンモニアを除去する手段と共に、あるいはアンモニアを除去する手段に代えて、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンを除去する手段を含む。例えば、アセトアルデヒド、リン酸、またはエタノールアミンを除去するために用いられる樹脂、あるいはアセトアルデヒド、リン酸、またはエタノールアミンを別の物質に変換する酵素が含まれる。

別の実施形態では、本発明のキットはアンモニア検出用組成物を含む。この場合、サンプル中に存在するアンモニアを検出するための、任意の組成物、試薬、および／またはキットが含まれる。例えば、市販のアンモニア検出用の組成物、試薬、またはキットが含まれる。例として、シカリキッドＮＨ_３（関東化学株式会社）、アンモニア−Ｌ（株式会社セロテック）、およびＦ−キットアンモニア（株式会社Ｊ．Ｋ．インターナショナル）が挙げられるが、これらに限定されない。

あるいは、上記の市販品の改良品を用いてもよい。例えば、上述した試薬Ｉおよび試薬ＩＩの組み合わせを用いてもよい（表１および２を参照のこと）。

別の実施形態では、本発明のキットは、アンモニア検出用組成物と共に、あるいはアンモニア検出用組成物に代えて、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミン検出用組成物を含む。例えば、市販のアセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミン検出用の組成物、試薬、またはキットが含まれる。リン酸検出用試薬の例として、マラカイトグリーン（ＭＧ）試薬が挙げられるが、これらに限定されない。

キットは、本発明の方法に用いられる任意の試薬を含んでもよい。また、測定の実施を簡便にするための適当な試薬、例えばサンプル希釈液、反応希釈液、バッファー、洗浄剤などを含んでもよい。通常、試薬は適切な容器に入れて提供される。またさらに、本発明の方法の実行に必要な説明書などの資材を含んでもよい。

一実施形態では、本発明のキットは、研究専用（ＲｅｓｅａｒｃｈＵｓｅＯｎｌｙ：ＲＵＯ）キットである。他の実施形態では、本発明のキットは、調査専用（ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌＵｓｅＯｎｌｙ：ＩＵＯ）キットである。別の実施形態では、本発明のキットは、臨床診断キットである。

別の実施態様では、本発明は、コンピュータに、上述した本発明の方法を実行させるためのプログラムに関する。本発明のプログラムは、コンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録させてもよく、装置に付属するコンピュータの記録媒体に記録してもよい。記録媒体の例としては、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ＵＳＢメモリ、およびフロッピー（登録商標）ディスクが挙げられるが、これらに限定されない。

別の実施態様では、ＰＥＡを測定するための装置に関する。一実施形態では、本発明の装置は上述した本発明のキットを含む。別の実施形態では、本発明の装置に上述した本発明のプログラムが組み込まれている。本発明の装置が行う処理を示すフローチャート図の一例を図２に示す。

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的かつ詳細に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されると解すべきではない。

（Ｉ）アンモニアを用いるＰＥＡ測定法１
１．陽イオン交換樹脂によるアンモニア除去
サンプルとして血漿を用いた。カチオン交換樹脂ＭＣＩＧＥＬＡＦＲ２（三菱化学社製、カタログ番号１−０３３−０１）をカラムに充填し、４００μＬの超純水で洗浄した。５０μＬのサンプルを、洗浄したカラムに充填して通液し、溶液を回収した。回収した溶液中のアンモニアおよびＰＥＡの残存率を測定した。アンモニアは、シカリキッドＮＨ_３（関東化学株式会社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定することで測定した。ＰＥＡは後述のＣＥ−ＭＳ機器法により測定した。

結果を図３に示す。アンモニアの残存率は１．５％であった。ＰＥＡの残存率は１００％であった。このことから、陽イオン交換カラムを用いることで、ＰＥＡに対してアンモニアの選択的な除去が可能であることが示された。

２．ＰＥＡからのアンモニアの生成
アンモニア除去後のサンプル５０μＬに、５０μＬのＰＥＡ酵素溶液（５００μｇ／ｍＬ）を添加混和し、２０分間２５℃で静置した。酵素サイクリング溶液（試薬Ａ）１００μＬを添加混和し、５分間２５℃で静置した。検出溶液（試薬Ｂ）５０μＬを添加混和した。試薬ＡおよびＢの組成は以下の表のとおりである。上記の手順により、溶液中のＰＥＡからアンモニアを生成した。

３．ＰＥＡ濃度の測定
１０分後と１２分後に４５０ｎｍの吸光度を測定し、アンモニアを検出した。得られた結果をＰＥＡ濃度に換算した。なお、機器法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＩＣ−ＦＬＤおよびＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製ＣＥ−ＭＳ）を用いる測定も行った。使用した機器および装置は以下のとおりである：ＩＣ−ＦＬＤ（ＩＣＳ５０００）；カラム（ＡＳ２０）；ＣＥ（Ｇ１６００）；およびＭＳ（６４６０）。製造業者の使用説明書に従い、標準物質（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、製品番号２９２８６９）のピークとサンプルのピークを比較して測定した。結果を以下の表に示す。

（ＩＩ）アンモニアを用いるＰＥＡ測定法２
１．サンプル中のＰＥＡ除去
サンプルとして血漿を用いた。サンプル（１）１００μＬに１ＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）１０μＬ、限外ろ過したＰＥＡ酵素溶液（４ｍｇ／ｍＬ）２５μＬを添加混和し、２０分間３７℃で静置した。サンプル（２）１００μＬに１ＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）１０μＬ、ＰＥＡ酵素溶液（４ｍｇ／ｍＬ）２５μＬを添加混和し、２０分間３７℃で静置した。その後、サンプル（１）および（２）をそれぞれ限外ろ過に供した。限外ろ過条件は次のとおりであった：排除限界３ｋＤａ、１４０００ｇ、４℃。

２．陽イオン交換樹脂によるアンモニア除去
カチオン交換樹脂ＭＣＩＧＥＬＡＦＲ２（三菱化学社製、カタログ番号１−０３３−０１）をカラムに充填し、４００μＬの超純水で洗浄した。サンプル（１）、（２）それぞれ１００μＬを、洗浄したカラムに充填して通液し、溶液を回収した。

３．ＰＥＡからのアンモニアの生成
アンモニア除去後のサンプル（１）、（２）それぞれ６７．５μＬに、１２．５μＬのＰＥＡ酵素溶液（４ｍｇ／ｍＬ）、１ＭＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）１０μＬを添加混和し、２０分間３７℃で静置した。上記の手順により、溶液中のＰＥＡからアンモニアを生成した。

４．ＰＥＡ濃度の測定
上記で得られた酵素反応溶液５０μＬに、酵素サイクリング溶液（試薬Ａ）１００μＬ、検出溶液（試薬Ｂ）１００μＬを添加混和した。試薬ＡおよびＢの組成は以下の表のとおりである。

４分後と６分後に４５０ｎｍの吸光度を測定し、アンモニアを検出した。サンプル（１）の結果からサンプル（２）の結果を差し引き、サンプル中のＰＥＡ濃度を求めた。なお、機器法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＩＣ−ＦＬＤ）を用いる測定も行った。使用した機器および装置は以下のとおりである：ＩＣ−ＦＬＤ（ＩＣＳ５０００）；カラム（ＡＳ−２０）。結果を以下の表に示す。

（ＩＩＩ）リン酸を用いるＰＥＡ測定法
１．塩化カルシウムによるリン酸除去（沈殿法）
サンプルとして血清を用いた。サンプル１８０μＬに１Ｍ塩化カルシウム２０μＬを添加混和した後、溶液を限外ろ過した。

２．スクロースホスホリラーゼによるリン酸除去（酵素法）
限外ろ過したサンプル１１０μＬに、５００ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）１０μＬ、１Ｍスクロース１０μＬ、スクロースホスホリラーゼ（２００Ｕ／ｍＬ）１０μＬを添加混和し、１０分間３７℃で静置した。得られたリン酸除去後のサンプル１４０μＬに、１ＭＣＨＥＳバッファー（ｐＨ９．０）２０μＬを添加混和して、酵素反応を停止させた。ここで、ＣＨＥＳバッファー添加前の溶液中のリン酸およびＰＥＡの残存率を別途測定した結果を、図４に示す。リン酸はＭａｌａｃｈｉｔｅＧｒｅｅｎＰｈｏｓｐｈａｔｅＡｓｓａｙＫｉｔ（フナコシ株式会社）を用いて、６２０ｎｍの吸光度を測定することで測定した。ＰＥＡは実施例１に記載のＣＥ−ＭＳ機器法により測定した。図４に示すとおり、リン酸の残存率は検出限界以下であり、ＰＥＡの残存率は約１００％であった。このことから、沈殿法および酵素法を用いることで、ＰＥＡに対してリン酸の選択的な除去が可能であることが示された。

３．ＰＥＡからのリン酸の生成
ＣＨＥＳバッファー添加後のサンプル１５０μＬに、ＰＥＡ酵素溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）４０μＬを添加混和し、２０分間３７℃で静置した。上記の手順により、溶液中のＰＥＡからリン酸を生成した。

４．ＰＥＡ濃度の測定
上記で得られた酵素反応溶液１６０μＬに、ＭａｌａｃｈｉｔｅＧｒｅｅｎＰｈｏｓｐｈａｔｅＡｓｓａｙＫｉｔ（フナコシ株式会社）のＲｅａｇｅｎｔＭＩＸ４０μＬを添加混和して、室温で２０分間静置した。６２０ｎｍの吸光度を測定し、リン酸を検出した。検出したリン酸濃度からＰＥＡ濃度を求めたところ、２．３２μＭであった。なお、機器法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＩＣ−ＦＬＤ）を用いる測定も行った。使用した機器および装置は以下のとおりである：ＩＣ−ＦＬＤ（ＩＣＳ５０００）；カラム（ＡＳ−２０）。機器法による結果は２．３３μＭであった。

（ＩＶ）大気中アンモニアのサンプルへの透過に対するオイルの阻害効果
サンプルとして超純水（和光純薬工業（株）ＬＣ／ＭＳ用（ＣＡＳ．Ｎｏ．７７３２−１８−５））およびヒト血漿（出願人にて調製したもの）を用いた。オイルとしてミネラルオイルを用いた。９６ウェルプレート中に、ミネラルオイルでシールした系と、ミネラルオイルでシールしない系を用意した。大気下で実験を行った。測定開始後、４分から２０分まで、２分ごとにサンプル中のアンモニア濃度を測定した。アンモニアは、シカリキッドＮＨ_３（関東化学株式会社）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定することで測定した。

結果を図５に示す。血漿、純水いずれのサンプルにおいても、オイルの有無でアンモニア濃度が大きく変化した。これらの結果から、本発明の方法を、「アンモニア、アセトアルデヒド、リン酸、および／またはエタノールアミンが実質的に存在しない環境」において実施することの効果および意義が確認された。

本発明によれば、従来法よりも高感度にＰＥＡを測定する方法およびキットが提供される。したがって、本発明は、研究試薬、検査薬、診断薬等の分野において利用可能である。

配列番号１：Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｙａｓｅ
配列番号２：Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｔａｂｏｌｉｃｅｎｚｙｍｅ
配列番号３：Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｔａｂｏｌｉｃｅｎｚｙｍｅ
配列番号４：ＧａｂＴｄｏｍａｉｎ

Claims

サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法であって、
（Ａ）カルシウムイオンを用いてリン酸を除去する段階、および
（Ｂ）スクロースホスホリラーゼを用いてリン酸を除去する段階
を含む、方法。
サンプル中のエタノールアミンリン酸（ＰＥＡ）を測定する方法であって、
（ａ）サンプル中の、（Ａ）カルシウムイオンを用いてリン酸を除去する段階、および（Ｂ）スクロースホスホリラーゼを用いてリン酸を除去する段階、
（ｂ）段階（ａ）で得られたサンプルに酵素を添加して、サンプルに含まれるＰＥＡからリン酸を生成する段階、
（ｃ）段階（ｂ）で得られたサンプルにリン酸検出用組成物を添加する段階、および
（ｄ）段階（ｃ）で得られたサンプル中のリン酸を検出する段階
を含む、方法。
段階（ｂ）および（ｃ）が同時に行われる、請求項２に記載の方法。
酵素が、ＰＥＡリアーゼまたはγ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）である、請求項２または３に記載の方法。
酵素が、
（ｉ）ヒト由来エタノールアミンリン酸ホスホリアーゼ（ＡＧＸＴ２Ｌ１）（配列番号１）、
（ｉｉ）パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓ）由来ＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号２）、
（ｉｉｉ）大腸菌由来のＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号３）、
（ｉｖ）ＧＸＸＸＢＡＤＥＢＱＸＧＦＺＲＸＧ［ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｂはイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）であり、Ｚはグリシン（Ｇ）またはアラニン（Ａ）である］（配列番号４）で定義されるアミノ酸配列を含む酵素、
（ｖ）タグが付加された（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかに記載の酵素またはタンパク質、および
（ｖｉ）（ｉｉ）または（ｉｉｉ）に記載のタンパク質のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ＰＥＡからリン酸を生成する、タンパク質の変異体
からなる群から選択される１つ以上の酵素である、請求項４に記載の方法。
サンプルが生体試料サンプルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
サンプルが、全血、血清、または血漿サンプルである、請求項６に記載の方法。
サンプルが、ＥＤＴＡ、クエン酸、シュウ酸、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）、およびヘパリンからなる群から選択される１つ以上の抗凝固剤で前処理されている全血または血漿サンプルである、請求項６に記載の方法。
段階（ｂ）〜（ｄ）の少なくとも１つ以上がリン酸が実質的に存在しない環境下で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
対象がうつ病に罹患しているかどうかを判定するための方法であって、
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により、サンプル中のＰＥＡを測定する段階；および
（ｂ）サンプル中のＰＥＡの測定値が１．５μＭ未満である場合に、対象がうつ病に罹患していると判定する段階
を含む、方法。
リン酸を除去する手段としてカルシウム及びスクロースホスホリラーゼを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
ＰＥＡからリン酸を生成する手段としてＰＥＡリアーゼまたはγ−アミノブチルアミノ基転移酵素（ＧａｂＴ）をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
コンピュータに、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を実行させるためのプログラム。
請求項１３に記載のプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体。
請求項１１または１２に記載のキットを含む、または請求項１３に記載のプログラムが組み込まれた、ＰＥＡを測定するための装置。
サンプル中のリン酸を除去する方法であって、
（Ａ）カルシウムイオンを用いてリン酸を除去する段階、および
（Ｂ）スクロースホスホリラーゼを用いてリン酸を除去する段階
を含む、方法。