CN116008537A - 一种基于阳极氧化铝膜表面修饰的适配体结合刺突蛋白的SARS-CoV-2检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于阳极氧化铝膜表面修饰的适配体结合刺突蛋白的SARS‑CoV‑2检测方法，为新型冠状病毒检测开辟了一个新的途径。利用阳极氧化铝材料为基础构建电流传输通道，表面氨基的活化可实现通道的功能化，修饰有醛基的S1核酸适配体可通过席夫碱反应桥联到电流通道的表面；靶标蛋白的引入改变通道内的空间位阻及通道表面的电荷性质，利用电流的变化实现对S1蛋白的生物传感。将电化学的检测灵敏性与阳极氧化铝材料的广域响应性结合，制备快速灵敏的电化学传感器，以用来特异性捕获和检测SARS‑CoV‑2刺突蛋白S1。与其他分析方法相比，该方法无需扩增，可以一步完成，具有响应快、成本低的优点，满足了检测群体广泛的迫切要求。实验结果显示该方法可成功检测SARS‑CoV‑2刺突蛋白S1，检测下限为1fM，且该方法成功用于临床样本检测，SARS‑CoV‑2患者组与正常人组临床样本分析存在显著差异。

Description

一种基于阳极氧化铝膜表面修饰的适配体结合刺突蛋白的SARS-CoV-2检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，尤其涉及SARS-CoV-2的检测原理、组装过程、实验条件及应用。

背景技术

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，虽然最近关于疫苗开发的消息令人鼓舞，但检测、跟踪、追踪和隔离(TTTI)仍然是减少病毒传播的有效策略。要实施这一行动，为抗击新型冠状病毒做好长期准备，需要更快速、更灵敏、更廉价的诊断方法。临床诊断中广泛使用的检测方法通常是基于酶促反应的，包括定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)这一金标准方法，逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法和CRISPR/Cas辅助核酸检测方法。然而，缺乏先进的仪器、昂贵的试剂和训练有素的仪器操作人员可能会限制这些方法特别是在资源有限的地区的广泛使用。

此外，病毒RNA在运输和储存过程中比蛋白质更不稳定，这可能会由于标本保存不当或处理不当而导致假阴性结果。也可由引物与其他病毒合并感染引起的核酸交叉反应而产生假阳性结果，因此，靶向刺突蛋白(S1蛋白)的研究成为了SARS-CoV-2检测的有力手段。

构建低成本、高灵敏度的刺突蛋白检测设备，对抗击新冠肺炎疫情具有重要意义。特别适合这一目标的适体，又称“化学抗体”，因其体积小、成本低、对靶点的特异性和亲和力高、合成均匀等独特优势，非常适合用于疾病监测。与其他用于靶标识别的分子相比，具有特异性结合特征的DNA适配体越来越受到人们的关注。另一方面，近年来，仿生纳米通道在快速、灵敏的生物分子检测方面表现出了卓越的性能。对于这类检测方法，靶标的检测通常是通过靶标诱导的构象变化、亲水性或电荷密度的变化来实现的，这些变化导致离子输运的变化，通过电化学信号反映出来。基于这个原理，本发明提供了一种基于适配体功能化纳米通道构建SARS-CoV-2检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一类SARS-CoV-2的检测方法。

发明原理：

如图1所示，受到SARS-CoV-2刺突蛋白与其受体人类血管紧张素转换酶 II(ACE2)结合的启发，我们用S1适配体功能化多孔阳极氧化铝(PAA)，以特异性捕获和检测SARS-CoV-2刺突S1蛋白。由于PAA阻挡层中的亚纳米通道，表面的微小变化可以引发大电流变化。当已存在的目标物被适配体捕获后，空间位阻增大，S1蛋白的电荷中和作用(等电点为8.36)也使得电荷密度降低，阻碍了离子的输运，导致离子电流幅值大幅下降。结合电化学技术，无需酶促反应，一步即可灵敏地识别出蛋白或SARS-CoV-2病毒颗粒。这种新型的无试剂检测方法大大简化了冗长的实验步骤，提高了检测灵敏度，满足了抗击COVID-19大流行的要求。

需要的试剂：

SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike S1-Histine重组蛋白购自中国北京中生物股份有限公司。寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成。氯化钾(KCl)和乙醇购自南京化学试剂有限公司。1×PBS缓冲液购自生工生物技术有限公司。 (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)购自阿拉丁有限公司。血红蛋白 (Hb)、牛血清蛋白(BSA)、凝血酶(Thr)、免疫球蛋白(IgG)购自 Sigma-Aldrich公司。多孔阳极氧化铝(PAA)薄膜是从安徽合肥普元纳米技术有限公司订购的。新冠肺炎患者和健康人临床样本由东南大学第二附属医院提供。本研究经南京市第二医院科学伦理委员会批准(项目编号：2020-LS- ky003)，所有病例均获得知情同意。所有溶液都是用Milli-Q净化系统 (Bedford，MA，USA)净化过的去离子水制备的，其电阻为18.2MΩcm。

制备方法包括如下过程：

一、PAA的结构表征：

为去除纳米通道中的杂质，依次将PAA薄膜在酒精、水中超声5min，于氮气中吹干，如图2所示，对PAA膜的形态结构进行了表征。从整体形貌可以看出，该薄膜是由两层、多孔层和阻挡层不对称组成的(图2a)。通道长度约为55μm(图2a)，多孔层由直径为40-70nm的通道阵列组成(图2b)。阻挡层厚度约为60nm(图2c)，对应的带有亚纳米通道的凸起紧密分布在阻挡层内(图2d)。

二、适配体功能化纳米通道的制备

将PAA膜置于加入乙醇溶液(含5％的APTES)的小皿中于摇床上轻轻摇动12小时，在PAA膜表面产生NH₂，再次用酒精清洗，去除残留的硅化试剂并用N2吹干。接着将40μL的DNA溶液滴到PAA膜的表面反应24h。需要注意的是，在密封的培养皿中需要加入少许水，以防止DNA溶液蒸发。然后用 X射线光电子能谱(XPS)对氨基化的PAA进行了表征。与裸PAA的XPS光谱 (灰色曲线)相比，APTES修饰后的PAA光谱(红色曲线)出现了一个明显的 Si 2p峰(图2f)，表明进一步成功激活了氨基。靶蛋白SARS-CoV-2刺突蛋白的适体通过希夫碱反应固定在阻挡层表面，XPS光谱中有明显的P 2p峰(图2g 红色曲线)，表明PAA膜的阻挡层已经成功进行了适配体的功能化。

三、核酸适配体功能化纳米通道用于S1蛋白检测的可行性

我们通过zeta电位测量和电流-电压(I-V)测量，研究了适配体与S1蛋白的相互作用以及适配体功能化纳米通道用于S1蛋白检测的可能性。如图3a 所示，适配体的zeta电位为-44.1mV。与S1蛋白特异性结合后，zeta电位变为-8.54mV，说明负电荷密度大大降低，这个差异为生物传感功能提供了可能。随后用H型电解槽进行I-V测量(图3b)，适配体与S1蛋白结合后，电压为- 1V时的电流值降低，这是因为表面的电荷改变影响了离子输运(图3c)。根据这一原则，我们下一步优化了检测的实验条件。

四、实验条件对传感性能的影响

作为捕获靶标作用的适配体，它的浓度对纳米通道的检测性能有很大影响。我们选择1μM、10μM、20μM、50μM和100μM 5个浓度，得到优化的适配体浓度。对应的在-1V的电流值显示在图3c，很容易发现电流下降最大时的适配体浓度为50μM，这是由于存在足量的适配体可以容纳S1蛋白，并且适体浓度过高可能形成干扰性的位阻。为了减少检测时间，同时获得更准确的结果，我们研究了S1蛋白与适配体结合的时间。在0.25h时，出现电流降差。孵育时间为1h时的电流降值大到足以检测到变化(图4d)，因此我们选择1h 作为检测时间。

五、利用核酸适配体功能化纳米通道检测SARS-CoV-2 S1蛋白

改变的离子电流整流(ICR)的机理可以用图4a所示的原理来解释。当从阻挡层一侧施加正电压到多孔层一侧时，阳离子(K⁺离子)向电场方向移动，而阴离子(Cl^-离子)向相反方向移动。在中性电解质溶液中，适配体功能化的纳米通道带负电荷，当S1蛋白与适配体相互作用时，由于电荷中和作用，电荷密度降低。因此，相应的静电相互作用和空间位阻的变化引起了电流的大幅降低，从而实现了S1蛋白的灵敏检测。为了确定检测范围，我们用不同浓度的 SARS-CoV-2 S1蛋白与PAA膜阻挡层上修饰的50μM适配体相互作用1h，然后进行I-V测量(图4b)。图4c显示了在-1V下测量的电流值绝对值随着S1蛋白浓度的增加而逐渐减小。图4d中观察到目标浓度的对数与电流下降值之间的线性关系。线性回归方程为y＝-3.5+0.42Log C，相关系数R为0.994。基于核酸适体的纳米通道检测限降至1fM，证实了对SARS-CoV-2刺突S1蛋白的敏感性分析能力。

六、适配体功能化纳米通道检测S1蛋白的特异性

为了进一步验证纳米通道的特异性，如图5a所示，我们使用牛血清白蛋白 (BSA)、血红蛋白(Hb)、免疫球蛋白G(IgG)和凝血酶(Thr)等几种不同的蛋白进行相同的实验。图5b显示了不同系统中电压为-1V时的电流值，实验结果表明只有S1蛋白存在时电流才增加，只有S1蛋白可以被固定化在阻挡层上的适配体特异性捕获，从而证明了适配体功能化的纳米通道能够特异性检测SARS-CoV-2 S1蛋白。

七、核酸适配体功能化纳米通道检测SARS-CoV-2在临床样本中的应用

为了评估这种检测方法的效果，我们对SARS-CoV-2患者和正常健康人群的咽拭子样本进行了盲法研究，对阳性和阴性样本进行初步RT-PCR检测。12 个临床咽拭子标本的电流测量如图5c所示。6份SARS-CoV-2阳性样本产生了较大的电流变化，与正常健康人获得的6份样本产生较大区别(图5d)。虽然在复杂的样品中，与S1蛋白相比，SARS-CoV-2病毒颗粒通过S1蛋白附着在阻挡层上造成了很大的空间位阻，极大地阻碍了离子的传输。这些结果表明，适配体功能化的纳米通道能够区分COVID-19患者和正常样本，与PCR结果准确地吻合。

八、结论

总之，本专利提出了一种新型的SARS-CoV-2检测方法，该方法基于 SARS-CoV-2S1蛋白与纳米通道阻挡层功能化的适配体相互作用。受生物通道的启发，纳米通道被阻挡层表面的适配体功能化。纳米通道一侧的适配体与S1 蛋白的识别和结合调节离子在纳米通道中的传输。阻挡层内的亚纳米通道极大地提高了传感器的灵敏度，S1蛋白或SARS-CoV-2与之前固定在阻挡层上的配体结合所引起的空间位阻会极大地抑制离子传输。此外，在生理环境中，带正电荷的蛋白质降低了纳米通道的电荷密度，这也是离子传输的重要影响因素。这两个因素都阻碍了离子在纳米通道中的传输。将这种方法结合电化学技术，无需酶促反应，即可一步灵敏检测SARS-CoV-2，避免了专业操作和长时间等待的限制。

该方法已成功用于人工合成SARS-CoV-2 S1蛋白的检测，并进一步用于临床标本中病毒颗粒的检测。核酸适配体功能化纳米通道对S1蛋白的检测灵敏度可达1fM水平，并可成功评估COVID-19患者咽拭子样本中的SARS-CoV-2病毒颗粒。盲法检测本方法的结果与RT-PCR结果吻合较好，证明了本方法的准确性。与其他分析方法相比，本方法具有响应速度快、成本低等优点，满足了新冠病毒检测推广应用的迫切需要。此外，便携式恒电位器现在已经商业化，因此我们期待基于适配体的纳米通道能够提供一种新的即时检测(POC)工具，以抗击COVID-19大流行。

以上详细描述了本发明的装置原理，实施的方法及检测条件等，但是本发明不限于上述检测的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明进行检测底物的变换，这些检测底物的变换均属于本发明的保护范围内，另外需要说明的是，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

说明书附图

图1：基于阳极氧化铝膜表面修饰的适配体结合刺突蛋白检测SARS-CoV-2的装置原理。

图2：阳极氧化铝薄膜PAA的表征与功能化。

图3：S1蛋白检测适体功能化纳米通道实验条件的可行性和优化。

图4：用基于适配体的方法定量刺突蛋白。

图5：适配体功能化感知层的特异性和临床样本分析。

具体实施方式

电化学检测：

在CHI 660D电化学工作站的H型电解槽中测量I-V曲线。PAA膜固定在电解槽的两个腔室之间。采用两个Ag/AgCl电极分别作为阴极和阳极，施加电位，在10mM KCl溶液(pH7.4)中用线性扫描伏安法(LSV)测量离子电流。扫描电压为-1.0至+1.0V，扫描速率为0.05V/s。

Claims (1)

1.将阳极氧化铝薄膜浸泡在5％氨丙基三乙氧基硅烷溶液中12h活化膜表面的氨基，再加入修饰有醛基的S1核酸适配体，核酸适配体通过席夫碱反应结合到阳极氧化铝薄膜的表面，将修饰了核酸适配体的阳极氧化铝薄膜夹在H型电解池的中间，两个电解池中各插入一个Ag/AgCl参比电极形成回路，在靶标SARS-CoV-2存在的情况下，刺突蛋白与适配体结合，这会使通道表面的空间位阻增大，电荷密度变小，因此电流减小，装置可以通过对SARS-CoV-2刺突蛋白的生物传感来检测SARS-CoV-2病毒。

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