KR102305012B1 - 나노포어를 이용한 인플루엔자 바이러스 존부 확인방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법과, 상기 방법을 다양하게 응용하는 기술에 관한 것이다.

Description

나노포어를 이용한 인플루엔자 바이러스 존부 확인방법{A METHOD FOR IDENTIFING THE PRESENCE OF INFLUENZA VIRUS USING NANOPORES}

본 발명은 나노포어를 이용하여 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법과, 상기 방법을 다양하게 응용하는 기술에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 매년 전 세계적으로 250,000-640,000 명의 높은 사망률로 급성 호흡기 질환과 심각한 전염병을 유발한다. 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)는 인플루엔자 바이러스의 주요 표면 단백질 중 하나로 숙주 감염, 바이러스 복제 및 높은 병원성과 같은 바이러스 라이프 사이클의 중요한 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 상기 단백질은 당 단백질, 당지질 및 올리고당과 같은 기질에서 말단 시알산(Sialic acid, SA)을 절단하는 글루코시드 가수분해효소로 작용하며, 특히 인플루엔자 바이러스의 NA는 숙주 세포 수용체의 글리칸에서 말단 시알산 잔기를 절단한다. 이러한 NA의 효소 활성은 감염된 숙주 세포에서 새로운 표적 세포로 새로 형성된 바이러스의 방출, 바이러스 응집 방지, 혈구 응집소를 통한 숙주 세포로의 재결합 억제를 담당하는 것으로 입증되었기 때문에 인플루엔자 바이러스의 확산에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, NA는 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 잘 알려진 진단 바이오 마커이며 치료 중화 항체 및 소분자 억제제의 중요한 표적이다.

현재 인플루엔자 바이러스 감염의 진단은 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 바이러스 핵산을 분석하거나, 신속항원검사(rapid antigen test, RAT) 및 면역형광분석(Immunofluorescence)을 통해 인플루엔자 바이러스의 항원을 검출하는 방법을 사용한다. 그러나, PCR을 이용한 분자 분석법은 각 아형에 맞는 프라이머가 필요하다는 단점이 있고 항체를 이용한 면역학적 방법은 노동력과 시간이 많이 소요되고, 민감도가 낮으며 한번에 측정할 수 있는 샘플의 개수가 적다는 단점이 있다. 이에, 바이러스 감염 초기에 현장에서 신속한 진단을 통해 감염의 전파를 차단할 수 있는 고감도의 인플루엔자 바이러스 진단 키트의 개발이 요청된다.

인플루엔자 바이러스 치료제로 FDA의 승인을 받은 뉴라미니다아제 억제제인 오셀타미비르(Tamiflu^TM) 및 자나미비르(Relenza^TM)는 뉴라미니다아제의 활성 부위 프레임 워크에 맞는 시알산 기질 또는 구조적 유사체의 변형을 통해 개발되었으며, 감염된 세포로부터 증식된 인플루엔자 바이러스의 방출을 효과적으로 방해하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 뉴라미니다아제의 활성 부위 또는 그 주변에서의 순차적인 돌연변이는 뉴라미니다아제 억제제에 대한 약물 내성을 증가시키는 것으로 나타났다. 내성 인플루엔자 바이러스의 급속한 출현과 전파는 위협적이므로 기존 치료제에 대한 내성 여부를 신속하게 확인하는 것과 새로운 항바이러스 약물의 개발이 임상적으로 중요하다.

나노포어(nanopore)는 단일 분자 수준에서 생체 분자의 미묘한 형태 변화를 감지 할 수 있는 새로운 고정밀 바이오 센서이다. 나노미터 크기의 포어(pore)에 전위가 가해지면 나노포어를 가로지르는 이온 플럭스(flux)가 전기적 신호를 생성한다. 나노포어를 통과하는 분석물은 이온 전류의 일시적인 차단을 유도하며, 이는 전류 세기(current amplitude) 등으로 측정된다. 나노포어 바이오 센서는 게놈 시퀀싱, 다양한 개별 생체 분자의 검출 및 생체 분자 상호 작용을 감지하는데 사용되었다(비특허문헌 1). 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)는 포어 형성 단백질로, 도데카머에서 테트라데카머 나노포어를 형성하는 것으로 알려져 있다. ClyA 나노포어는 직경이 3.3nm 이상인 협착부(constriction)를 가지며 다양한 생체 분자, 단백질-리간드 상호 작용 등을 모니터링 하기 위해 연구되었다(비특허문헌 2). 그러나, 바이러스의 존부 확인 또는 약물 스크리닝/약물 내성 검출에 나노포어를 적용하는 기술은 미미한 실정이다.

이에, 나노포어를 기반으로 인플루엔자 바이러스의 감염여부를 현장에서 신속하게 진단하여 전파를 차단하고, 치료제에 대한 내성 여부를 신속하게 확인하는 기술 및 새로운 약물을 스크리닝하는 기술 개발이 더욱 필요한 실정이다.

Kwak, D. K.; Chae, H.; Lee, M. K.; Ha, J. H.; Goyal, G.; Kim, M. J.; Kim, K. B.; Chi, S. W., Probing the Small-Molecule Inhibition of an Anticancer Therapeutic Protein-Protein Interaction Using a Solid-State Nanopore. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2016, 55 (19), 5713-7. Wloka, C.; Van Meervelt, V.; van Gelder, D.; Danda, N.; Jager, N.; Williams, C. P.; Maglia, G., Label-Free and Real-Time Detection of Protein Ubiquitination with a Biological Nanopore. ACS Nano 2017, 11 (5), 4387-4394.

본 발명의 일 목적은 나노포어를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 목적은 나노포어를 이용하여 뉴라미니다아제 활성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 목적은 나노포어를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성 여부 확인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 목적은 나노포어를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 인플루엔자 바이러스가 존재할 것으로 예상되는 생물학적 시료를 시알릴갈락토오스와 반응시키는 단계; 및 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 뉴라미니다아제 및 시알릴갈락토오스를 뉴라미니다아제 활성 억제제 후보 물질과 함께 반응시키는 단계; 및 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 뉴라미니다아제 활성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 인플루엔자 바이러스가 포함된 시료 및 시알릴갈락토오스를 항바이러스제와 함께 반응시키는 단계; 및 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성 여부 확인 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane); 및 상기 막(membrane)에 의해 나뉜 일 구획에 포함된 시알릴갈락토오스;를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 의하면 극미량의 시료로도 인플루엔자 바이러스의 존부에 대한 정보를 제공할 수 있으며 인플루엔자 바이러스 입자 외부에 존재하는 단백질인 뉴라미니다아제를 표적으로 하는 약물을 효율적으로 스크리닝 할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면 간섭현상 없이 10분이라는 짧은 시간 내에 인플루엔자 바이러스의 존부를 확인할 수 있으므로 인플루엔자 바이러스의 조기 현장 검출 및 진단에 유용한다.

본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 GBP가 포획된 나노포어를 사용하여 갈락토오스의 결합에 따른 GBP의 특성을 분석한 결과를 나타낸 것이다: 도 1의 a는 리간드-프리 (open) 및 리간드 결합 (closed) 상태에서 갈락토오스 결합 단백질의 구조적 변화; 도 1의 b는 GBP가 포획된 ClyA 나노포어; 도 1의 c는 인가 전압 -90mV에서 갈락토오스의 농도 증가에 따른 전류 트레이스 (Current Trace)(왼쪽); 30초의 전류 트레이스에서 닫힌 구조(L1) 및 열린 구조(L2)의 이벤트 지속시간 히스토그램(오른쪽); 도 1의 d는 계수가 1로 설정된 Hill 함수에 맞춰진 갈락토오스 농도에 대한 L1(닫힌, 갈락토오스 결합 상태)의 시간 분율(fractional time), 오차 막대는 표준 편차를 나타냄.
도 2는 인플루엔자 바이러스 유래 NA의 효소 활성에 대한 SG 기질의 농도 의존성을 나타낸 것이다: 도 2의 a는 SG 기질이 NA에 의해 시알산과 갈락토오스로 절단되는 것을 나타낸 것; 도 2의 b는 포어에 포획된 GBP의 구조적 변화를 사용하여 ClyA 나노포어에 의한 갈락토오스 검출 메커니즘의 예시; 도 2의 c는 SG의 농도를 달리하여 5mU mL^-1의 NA와 1시간 동안 반응시킨 후 GBP 포획 ClyA 나노포어에 첨가한 후 모니터링한 전류 트레이스; 도 2의 d는 계수가 1로 설정된 Hill 함수에 맞춰진 SG 기질 농도에 대한 L1(닫힌, 갈락토오스 결합 상태)의 시간 분율, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄.
도 3은 인플루엔자 바이러스 유래 NA의 효소 활성의 실시간 탐지 및 농도 의존성을 나타낸 것이다: 도 3의 a는 SG (2 μM) 및 NA (35 mU mL^-1)를 GBP가 포획된 ClyA 나노포어의 트랜스 구획에 첨가하여 전류 트레이스를 30 분 동안 실시간으로 측정한 다음 L1의 상대적 이벤트 지속시간을 10 분마다 나노포어 데이터에 대해 분석한 결과; 도 3의 b는 갈락토오스, SG 및 시알산에서 얻은 L1의 상대적 이벤트 지속시간의 비교, 각각의 화합물은 배경 신호를 분석하기 위해 NA 없이 GBP 포획된 ClyA 나노포어의 트랜스 구획에 독립적으로 추가됨; 도 3의 c는 NA 효소의 농도 증가에 따른 전류 트레이스; 도 3의 d는 계수가 1로 설정된 Hill 함수에 맞춰진 NA 효소 농도에 대한 L1의 시간 분율(f _L1), 오차 막대는 표준 편차를 나타냄. 도 3의 e는 음성 대조군인 폐렴구균(Streptococcus pneumonia) 유래의 NA(NAp) 효소를 사용하여 측정한 전류 트레이스.
도 4는 뉴라미니다아제 억제에 대한 나노포어 기반 약물 스크리닝 및 약물 감수성 확인 방식을 나타낸 것이다: 도 4의 a는 약물 스크리닝 및 감수성 테스트에 사용한 저분자 화합물을 나타낸 것이다; 도 4의 b는 SG (2μM) 및 NA (5mU mL^-1)를 OC, ZN, BZ, EC 또는 VA와 함께 반응시킨 후 각각의 혼합물을 GBP가 포획된 ClyA 나노포어의 트랜스 구획에 독립적으로 처리하여 얻은 전류 트레이스; 도 4의 c는 각각의 화합물과 NA의 효소 반응에서 얻은 L1의 시간 분율(f _L1)의 비교, 각 화합물의 f _L1 값은 two-tailed Student's t-test를 사용하여 분석하였고, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄, ***p < 0.001; ns = 의미 없음.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 존부에 관한 정보를 제공하는 방법은 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)(예컨대, 제1 구획과 제2 구획, 또는 cis 구획과 trans 구획)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 인플루엔자 바이러스가 존재할 것으로 예상되는 생물학적 시료를 시알릴갈락토오스와 반응시키는 단계; 및 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함한다.

상기 “나노포어”는 어느 한 구획에서 다른 구획으로 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질을 통과시킬 수 있는 구조물을 의미한다. 나노포어의 “나노(nano)”는 약 1 ㎛ 미만이고 약 0.1 nm 이상의 크기를 의미한다. 상기 나노포어의 직경은 구체적으로 약 0.5 nm 내지 약 25 nm, 약 0.5 nm 내지 약 10 nm, 약 0.5 nm 내지 약 8 nm, 약 0.5 nm 내지 약 6 nm, 약 1 nm 내지 약 5 nm, 약 2 nm 내지 약 4 nm, 또는 약 3 nm일 수 있다.

상기 나노포어는 포어 내부에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질이 포획될 수 있는 것이면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 좁은 협착부 (또는 전위의 효율을 억제 또는 저하시키는 영역)을 가지는 단백질 나노포어 일 수 있고 보다 구체적으로 사이토라이신 A(ClyA) 등 일 수 있다. 상기 ClyA 나노포어는 야생형 ClyA (ClyA-WT)뿐만 아니라 변형된 ClyA (ClyA-mutant)가 모두 포함될 수 있고, 상기 변형된 ClyA 나노포어는 예컨대, Soskine et al, J.Am Chem Soc. 2013, 135(36), 13456-63에 기재된 대장균(E.coli)의 ClyA-AS 나노포어 일 수 있다.

상기 “막(membrane)”은 상기 나노포어가 고정될 수 있는 지지대로서의 역할을 하는 한편, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획으로 나눌 수 있는 것이면 제한없이 포함될 수 있으며, 예컨대 지질 이중층(lipid bilayer) 등 일 수 있다.

상기 “글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)”은 갈락토오스의 결합 전후 구조가 변화하는 단백질을 의미하고, 갈락토오스와 결합할 수 있는 최소한의 길이를 갖는 단백질이면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 포함하거나, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 단백질일 수 있다.

상기 “인플루엔자 바이러스”는 뉴라미니다아제(neuraminidase)를 갖는 인플루엔자 바이러스라면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 인플루엔자 A 바이러스 등 일 수 있다.

상기 “전기적 신호”는 막에 의해 분리된 어느 한 구획에서 다른 구획으로, 예컨대 제1 구획에서 제2 구획으로 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질이 통과하면서 발생되는 신호를 의미하고, 구체적으로 열린 포어 전류(open pore current: I₀), 전류 하강의 크기(ΔI), 이벤트 지속시간(event duration) 등일 수 있다. 본 발명에서 상기 열린 포어 전류는 나노포어만 있는 상태의 전류를 의미할 수 있다. 상기 전류 하강의 크기(ΔI)는 나노포어를 통한 전류 차단(current blockade)으로도 칭할 수 있고, 나노포어 내부에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질이 포획됨으로써 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 통과량이 감소하는 것 및/또는 갈락토오스가 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질에 결합하여 발생하는 단백질의 구조적 변화에 의한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 통과량이 감소하는 것을 의미할 수 있다. 상기 이벤트 지속시간은 이벤트가 서로 다른 전류 차단(ΔI) 레벨로 나타날 경우 하나의 이벤트(예컨대, L1 이벤트)가 지속되는 시간을 또 다른 하나의 이벤트(예컨대, L2 이벤트)가 지속되는 시간에 대한 상대적인 백분율로 나타낸 상대적 이벤트 지속시간 일 수 있다.

상기 “인플루엔자 바이러스 존부에 대한 정보”는 상기 인플루엔자 바이러스의 존재 여부에 자체에 관한 정성적인 정보는 물론, 인플루엔자 바이러스가 존재하는 경우 어느 정도 존재하는지에 관한 정량적인 정보도 포함한다. 따라서, 상기 “인플루엔자 바이러스 존부에 대한 정보를 제공하는 방법”은 인플루엔자 바이러스 감염의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 생물학적 시료로부터 인플루엔자 바이러스의 존재 여부를 검출하거나, 대상체의 생물학적 시료에 인플루엔자 바이러스가 얼마나 존재하는지를 확인하는 방법으로 이용될 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 존부에 관한 정보를 제공하는 방법은 인플루엔자 바이러스의 단백질인 뉴라미니다아제가 기질인 시알릴갈락토오스와 반응하여 유리된 갈락토오스가 나노포어의 내강에 포획된 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질에 결합함에 따라, 상기 나노포어를 통해 막을 통과하던 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 양이 감소하게 되고, 그에 따라 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서 변화하는 전기적 신호를 측정하고, 상기 반응 전후에 걸친 전기적 신호를 비교하여 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법은, 상기 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미한 경우, 상기 생물학적 시료에 인플루엔자 바이러스가 존재하는 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 “전기적 신호의 변화가 유의미한 경우”는 상기 반응 전후의 이벤트 지속시간(event duration)의 변화가 유의미한 경우를 의미하고, 구체적으로 서로 다른 두 종류의 이벤트의 상대적 지속 시간이 반응 후에 증가하거나 감소하는 경우를 의미할 수 있다. 상기 증가 또는 감소는 구체적으로 반응 전과 비교하여 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.3 배 이상, 1.5배 이상, 1.8배 이상 또는 2배 이상의 증가 또는 감소일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 인플루엔자 바이러스의 단백질인 뉴라미니다아제를 시알릴갈락토오스와 반응시키기 전과 후에 발생된 전기적 신호의 변화를 측정한 결과, L1에 해당하는 신호의 상대적 지속 시간이 반응 전에는 28% 였다가 반응 후에 31% 이상으로 나타나는 것을 확인함으로써 본 발명의 GBP가 포획된 나노포어를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공할 수 있음을 증명하였다(도 1의 c 및 도 2의 c).

또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법은, 상기 측정된 전기적 신호를 이용하여, 상기 생물학적 시료 내에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 정량화하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 뉴라미니다아제의 효소 활성을 정량화하기 위하여 닫힌 구조의 갈락토오스-GBP 복합체의 정규화에 해당하는 L1 이벤트의 시간 분율을 Hill 함수로 피팅하여 적정 곡선을 도출하였으며(도 3의 d), 이 적정곡선과 아래 수학식 1을 이용하여 뉴라미니다아제의 효소 활성을 정량적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.

<수학식 1>

상기 f _L1은 L1 이벤트의 시간 분율(fractional time)을 의미하고,

_min은 GBP 단독상태에서 나타나는 L1 이벤트의 상대적인 지속시간을 의미하고, 0.92는 갈락토오스가 포화 상태일 때의 GBP에서 나타나는 L1 이벤트의 상대적인 지속시간을 의미하고,

는 특정 농도의 갈락토오스가 존재할 때 GBP에서 나타나는 L1 이벤트의 상대적 지속시간(실험값)을 의미한다. 또한, 상기 시간 분율(fractional time)은 시간의 비율을 의미하고, L2 이벤트만 나타나면 f _L1 값은 0이고, L2 이벤트만 나타날 경우 f _L1은 값은 1이다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질이 포획된 나노포어를 이용하여 뉴라미니다아제 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 뉴라미니다아제 억제제의 스크리닝 방법은 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 뉴라미니다아제 및 시알릴갈락토오스를 뉴라미니다아제 억제제 후보 물질과 함께 반응시키는 단계; 및 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함한다.

상기 “후보 물질”은 뉴라미니다아제의 활성을 억제하는 효과를 가질 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미하며, 예를 들어 단백질, 올리고펩티드, 저분자 화합물, 다당류, 및 폴리뉴클레오티드 등의 임의의 분자일 수 있다. 이러한 후보물질은 천연 물질뿐만 아니라 합성 물질을 모두 포함한다.

상기 “스크리닝”은 샘플들 또는 후보물질들 중에서 바람직한 감수성 또는 활성을 갖는 화합물을 가능한 최소의 단계를 거쳐 추출, 분리 및 확인하는 과정을 의미한다.

본 발명의 스크리닝 방법은 억제제 후보 물질의 억제 활성에 따라 변화하는 뉴라미니다아제의 활성을 전기적 신호로 측정 및 비교하여 뉴라미니다아제 억제제를 스크리닝할 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 상기와 같이 측정된 전기적 신호의 변화에 기초하여, 상기 후보 물질을 뉴라미니다아제 억제제로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 전기적 신호의 변화는 상기 일 구획에 시알릴갈락토오스와 함께 처리되는 뉴라미니다아제와 뉴라미니다아제 억제제 후보 물질을 동시에 처리하는지, 또는 순차적으로 처리하는지 여부에 따라 달라질 수 있다. 보다 구체적으로, 먼저, 상기 뉴라미니다아제와 뉴라미니다아제 억제제 후보 물질을 동시에 처리하는 경우, 억제제 활성을 갖는 후보 물질에 의해 뉴라미니다아제의 활성이 처음부터 억제되면 애초에 유리 갈락토오스가 생성 조차 되지 않거나, 미량으로 생성되기 때문에 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동에 전혀 영향이 없게 되거나, 미미하게 영향을 주게 될 것이므로, 상기 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미하지 않을 때 상기 후보 물질을 뉴라미니다아제 억제제로 판단할 수 있다. 다음으로, 상기 뉴라미니다아제와 뉴라미니다아제 억제제 후보 물질을 순차적으로 처리하는 경우, 뉴라미니다아제 선처리에 의해 시알릴갈락토오스가 분해되고 그로 인해 유리 갈락토오스가 생성되어 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동이 감소된 상태에서, 억제제 활성을 갖는 후보 물질이 처리되어 뉴라미다아제의 활성이 사후적으로 억제되면 다시 유리 갈락토오스의 생성이 감소되고 결국 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동이 다시 증가하게 될 것이므로, 상기 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미할 때 상기 후보 물질을 뉴라미니다아제 억제제로 판단할 수 있다.

결국, 본 발명의 뉴라미니다아제 억제제 스크리닝 방법은 시료에 존재하는 후보 물질이 뉴라미니다아제 억제제가 아니면 뉴라미니다아제에 의해 시알릴갈락토오스가 분해되어 갈락토오스가 유리되고 유리된 갈락토오스는 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질의 입체 구조를 변화시켜 나노포어의 개구부에 가깝게 위치할 수 있게 하므로 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동이 제한되는 반면, 시료에 존재하는 후보 물질이 뉴라미니다아제 억제제이면 뉴라미니다아제의 활성이 억제되어 기질인 시알릴갈락토오스의 분해반응은 일어나지 않게 되고, 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질의 입체 구조가 그대로 유지되어 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동은 제한되지 않는다. 이러한 원리에 기초하여, 뉴라미니다아제와 뉴라미니다아제 억제제 후보 물질을 동시에 또는 순차적으로 처리하는 경우의 전기적 신호의 변화를 관찰하여 각각의 상황에 맞게 전기적 신호의 유의적 변화 또는 미변화로 뉴라미니다아제 억제제로서의 활성을 가지는지 여부를 판단할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 뉴라미니다아제 억제제로 알려진 화합물이 부존재(Blank) 또는 존재하는 상태에서 시알릴갈락토오스와 뉴라미니다아제를 반응시켰을 때, 뉴라미니다아제 억제제가 존재하지 않으면 현저하게 증가하는 것으로 나타나던 L1 이벤트의 상대적인 지속 시간이 뉴라미니다아제 억제제가 존재하면 감소하는 것을 확인하였다. 특히 FDA 승인 약물인 오셀타미비르 및 자나미비르를 처리한 경우에는 L1 이벤트의 상대적 지속 시간이 뉴라미니다아제 억제제가 존재할 때 현저하게 감소하는 것을 실험적으로 확인함으로써 본 발명의 GBP가 포획된 나노포어를 이용하여 오셀타미비르나 자나미비르와 같은 뉴라미니다아제 억제제를 발굴할 수 있음을 규명하였다(도 4의 b 및 c).

본 발명의 또 다른 측면은 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질이 포획된 나노포어를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성 여부 확인 방법을 제공한다.

본 발명의 내성 여부 확인 방법은 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 인플루엔자 바이러스가 포함된 시료 및 시알릴갈락토오스를 항바이러스제와 함께 반응시키는 단계; 및 상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함한다.

상기 “내성”은 약물에 대하여 바이러스의 성장 또는 증식의 저해 또는 바이러스의 사멸 효과가 나타나지 않는 것을 의미하며, 유전자형의 변이에 의하여 특정 약물로 저해/사멸되지 않는 바이러스는 상기 약물에 대하여 내성을 갖는다고 할 수 있다. 본 발명에서 상기 약물은 항바이러스제를 의미한다.

상기 “항바이러스제”는 뉴라미니다아제 억제제를 의미한다. 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제를 저해하여 숙주세포로부터 바이러스의 재증식을 억제하는 기능을 하는 것이라면 제한없이 포함될 수 있고, 구체적으로 오셀타미비르 (Oseltamivir), 자나미비르 (Zanamivir), 페라미비르 (Peramivir), 라니나미비르 (Laninamivir) 등 일 수 있고, 보다 구체적으로 오셀타미비르 (Oseltamivir), 자나미비르 (Zanamivir) 등일 수 있다.

본 발명의 항바이러스제 내성 확인 방법은 항바이러스제에 대한 감수성에 따라 변화하는 뉴라미니다아제의 활성을 전기적 신호로 측정 및 비교하여 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성을 확인할 수 있다.

상기 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성 확인 방법은 상기와 같이 측정된 전기적 신호의 변화에 기초하여, 상기 시료에 포함된 인플루엔자 바이러스를 항바이러스제 내성이 있는 것으로 판단하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 전기적 신호의 변화는 상기 일 구획의 시알릴갈락토오스에 시료와 항바이러스제를 동시에 처리하는지, 또는 순차적으로 처리하는지 여부에 따라 달라질 수 있다. 보다 구체적으로, 먼저, 상기 시료와 항바이러스제를 동시에 처리하는 경우, 항바이러스제 내성을 갖는 시료 내의 인플루엔자 바이러스는 항바이러스제의 존재에도 불구하고 뉴라미니다아제의 활성이 처음부터 억제되지 않을 것이므로 애초에 유리 갈락토오스가 생성되어 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동이 감소될 것이므로, 상기 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미할 때 상기 시료 내에 포함된 인플루엔자 바이러스를 항바이러스제 내성이 있는 것으로 판단할 수 있다. 다음으로, 상기 시료와 항바이러스제를 순차적으로 처리하는 경우 시료의 선처리에 의해 시료 내에 포함된 인플루엔자 바이러스에 의해 시알릴갈락토오스가 분해되어 애초부터 유리 갈락토오스가 생성되고 그로 인해 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동이 감소된 상태에서, 시료 내에 포함된 인플루엔자 바이러스가 항바이러스제 내성을 가지는 것이라면 사후적으로 처리된 항바이러스제에 의하더라도 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제의 활성에는 아무런 영향이 없을 것이기 때문에 인플루엔자 바이러스에 의해 시알릴갈락토오스가 분해되어 갈락토오스가 유리되고, 그로 인해 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동에도 전혀 영향이 없게 될 것이므로, 상기 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미하지 않을 때 상기 시료 내에 포함된 인플루엔자 바이러스를 항바이러스제 내성이 있는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성 여부 확인 방법의 경우에도, 시료에 존재하는 인플루엔자 바이러스가 시험 대상 항바이러스제에 내성이 있으면 항바이러스제가 존재하더라도 인플루엔자 바이러스가 시알릴갈락토오스를 분해하게 되고 유리된 갈락토오스는 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질의 입체 구조를 변화시켜 나노포어의 개구부에 가깝게 위치할 수 있게 하므로 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동이 제한되는 한편 시료에 존재하는 인플루엔자 바이러스가 시험 대상 항바이러스제에 내성이 없으면 항바이러스제에 의해 인플루엔자 바이러스의 활성이 저해되어 시알릴갈락토오스의 분해반응은 일어나지 않게 되고, 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질의 입체 구조가 그대로 유지되어 나노포어를 통한 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질의 이동이 제한되지 않는다. 이러한 원리에 기초하여, 시료와 항바이러스제를 동시에 또는 순차적으로 처리하는 경우의 전기적 신호의 변화를 관찰하여 각각의 상황에 맞게 전기적 신호의 유의적 변화 또는 미변화로 시료 내에 존재하는 바이러스가 시험 대상 항바이러스제에 내성이 있는지 여부를 확인할 수 있는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는, 시알릴갈락토오스를 뉴라미니다아제 및 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제로 알려진 화합물들과 함께 반응시키고, 반응 전과 후에 발생된 전기적 신호의 변화를 측정한 결과, 상기 반응 전에 비해 L1 이벤트의 상대적 지속 시간이 상기 반응 후에 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 위 상대적 지속 시간의 감소는 항바이러스제 각각의 알려진 약효가 클수록 더 큰 폭으로 감소하는 것을 실험적으로 확인하였다(도 4의 b 및 c). 이를 통해 본 발명의 나노포어를 기반으로 하는 약물 감수성 테스트를 통해 반응 전후의 전기적 신호의 변화를 관찰함으로써 시료에 있는 인플루엔자 바이러스가 항바이러스제 내성이 있는지 여부를 판단할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면은 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질이 포획된 나노포어를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane); 및 상기 막(membrane)에 의해 나뉜 일 구획에 포함된 시알릴갈락토오스;를 포함한다.

본 발명의 인플루엔자 바이러스 검출용 키트는, 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함는 막(membrane)에 의해 상기 나노포어가 존재하는 공간이 두 개의 구획(compartment)(예컨대, 제1 구획 및 제2 구획, 또는 시스(cis) 구획 및 트랜스(trans) 구획)으로 나뉘어진 상태로 제공될 수 있다.

그리고, 상기 두 개의 구획 중, 어느 한 구획에 시알릴갈락토오스가 포함된 상태로 제공될 수 있다. 이렇게 제공되는 본 발명의 인플루엔자 바이러스 검출용 키트에, 상기 시알릴칼락토오스가 포함된 구획으로 인플루엔자 바이러스가 존재할 것으로 예상되는 시료를 공급하면, 상기 시료에 포함된 인플루엔자 바이러스가 시알릴갈락토오스와 반응하여 유리 갈락토오스가 생성되게 되고, 이렇게 생성된 유리 갈락토오스가 나노포어의 내강에 포획된 글루코스/칼락토오스-결합 단백질에 결합하게 되면 상기 나노포어를 통과하는 이온 및/또는 전하를 띠는 저분자 물질들의 양이 감소하는 등 전기적 신호의 변화가 발생된다. 이때 나타나는 전기적 신호의 변화를 측정 및 비교하여 시료 내에 인플루엔자 바이러스가 존재하는지 여부를 확인할 수 있다. 즉, 시료 내에 인플루엔자 바이러스가 존재할 경우에는 반응 전후에 걸쳐 전기적 신호가 유의미하게 변화하게 되고, 시료 내에 인플루엔자 바이러스가 존재하지 않는 경우에는 반응 전과 후에 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미하지 않게 되므로 시료 내의 인플루엔자 바이러스 여부를 검출 할 수 있는 것이다.

본 발명의 키트는 이온 전류, 전류 하강의 크기, 이벤트 입체 형태 또는 이벤트 지속시간을 측정할 수 있는 구성이 추가로 구비될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

시료의 준비 및 나노포어의 제조

<1-1>. 시료의 준비

시알릴갈락토오스는 Carbosynth사에서 구매하였고, 브라질린(brazilin)은 AdooQ bioscience사에서, 에피카테킨(epicatechin)과 바닐릭산(vanillic acid)은 Biopuify사에서, 뉴라미니다아제는 Sino Biological사에서, 지질들은 Avanti Polar Lipids사에서 구매하여 실험에 사용하였다. 오셀타미비르(Tamiflu^TM)의 활성 대사체인 오셀타미비르 카르복실산(oseltamivir carboxylate)을 얻기 위해 10 mM 오셀타미비르 인산 (oseltamivir phosphate) 80 mL를 10% NaOH 20 mL와 실온에서 혼합한 후 빙초산(glacial acetic acid)을 넣어 pH7.5가 되도록 조절하였다. 그 외 언급되지 않은 모든 화합물은 Sigma-Aldrich사에서 구매하여 사용하였다.

<1-2>. 단백질의 분리 및 정제

타입 I ClyA-AS 유전자를 코딩하는 재조합 플라스미드는 Giovanni-Maglia(그로닝겐대학교, 네덜란드)교수로부터 제공받은 것을 사용하였다. GBP를 코딩하는 DNA 컨스트럭트는 pT7-SC1 플라스미드에 클로닝하였다. 단백질의 발현 및 정제는 IPTG로 처리한 후 세포를 20℃에서 16시간 배양한 것을 제외하고는 Galenkamp et al, Nat. Commun. 2018, 9(1), 4085에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 GBP 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 타입 I ClyA-AS 단백질 단량체를 수득하였다(표 1).

이름	아미노산 서열	서열번호
GBP	MANKKVITLS AVMASMLFGA AAHAADTRIG VTIYKYDDNF MSVVRKAIEQ DAKAAPDVQL LMNDSQNDQS KQNDQIDVLL AKGVKALAIN LVDPAAAGTV IEKARGQNVP VVFFNKEPSR KALDSYDKAY YVGTDSKESG IIQGDLIAKH WAANQGWDLN KDGQIQFVLL KGEPGHPDAE ARTTYVIKEL NDKGIKTEQL QLDTAMWDTA QAKDKMDAWL SGPNANKIEV VIANNDAMAM GAVEALKAHN KSSIPVFGVD ALPEALALVK SGALAGTVLN DANNQAKATF DLAKNLADGK GAADGTNWKI DNKVVRVPYV GVDKDNLAEF SKKGSSHHHH H	1
ClyA-AS 단량체	MTGIFAEQTV EVVKSAIETA DGALDLYNKY LDQVIPWKTF DETIKELSRF KQEYSQEASV LVGDIKVLLM DSQDKYFEAT QTVYEWAGVV TQLLSAYIQL FDGYNEKKAS AQKDILIRIL DDGVKKLNEA QKSLLTSSQS FNNASGKLLA LDSQLTNDFS EKSSYYQSQV DRIRKEAYAG AAAGIVAGPF GLIISYSIAA GVVEGKLIPE LNNRLKTVQN FFTSLSATVK QANKDIDAAK LKLATEIAAI GEIKTETETT RFYVDYDDLM LSLLKGAAKK MINTSNEYQQ RHGRKTLFEV PDVGSSYHHH HH	2

<1-3>. 타입 I ClyA-AS 도데카머의 추출

타입 I ClyA-AS 도데카머를 얻기 위해 단량체 타입 I ClyA-AS 단백질을 37 °C에서 1 시간 동안 0.5 % n-도데실-β-D-말토시드 (DDM)로 처리했다. 그 후, 올리고머화 된 단백질은 4-16 % 그래디언트 블루 네이티브 폴리아크릴 아미드겔 전기영동 (Invitrogen^TM)으로 분리하였다. 도데카머 타입 I ClyA-AS에 해당하는 밴드를 겔에서 잘라내어 15mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 7.5에 0.2 % DDM 및 10mM EDTA를 첨가한 다음 25 °C에서 밤새 반응하여 단백질을 추출하였다. 재구성된 도데카머 타입 I ClyA-AS를 함유하는 상등액을 이후 실험에 사용하였다.

<1-4>. GBP가 포획된 나노포어의 제조

1ml 부피의 챔버 두 개를 100-150 μm의 기공이 있는 50 μm 두께의 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, PTFE) 필름을 사용하여 조립하였다. 기공은 조립 전에 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocoline in n-decane (3 % w/v)으로 prepainting 후 n-decane은 상온에서 증발시켰다. 조립된 챔버에 버퍼(15 mM Tris, 150 mM NaCl, pH7.5, 5 mM EDTA)를 채우고 피펫으로 기공을 버블링(bubbling) 해서 지질이중층을 만들었다. ~0.1 ng의 타입 I ClyA-AS를 cis 구획에 넣은 후 -50 mV 전압을 가하면서 포어를 형성하였다. 그리고 GBP를 cis 구획에 넣은 후 -90 mV 전압을 인가하여 GBP가 포어에 캡쳐(capture)되도록 하였다. 그리고 trans 구획에 다양한 시료를 투입한 후 전기적 신호를 측정하였다.

[실시예 2]

나노포어 실험 데이터의 분석

<2-1>. 전류 트레이스(trace)의 분석

이온 전류 전이는 Clampfit 소프트웨어 (Molecular Devices)의 단일 채널 검색 기능을 사용하여 분석하였다. 2ms보다 짧은 이벤트는 무시하였다. K _d ^app은 50 % 신호 포화도에서 갈락토오스의 농도로 결정하였다. 잔류 전류의 퍼센트 비율 (I _res %)은 I _res% = I _b/I _o Х 100 (여기서, I _b 는 차단된 포어 전류이고, I _o는 열린 포어 전류)의 수학식으로 계산하였다. 상대적인 체류 시간(dwell time)은 t _c / (t _c + t _o) Х 100 (여기서, t _c 는 닫힌 구조(L1)의 상주 시간, t _o 는 열린 구조(L2)의 상주 시간)으로 계산하였다. 갈락토오스의 검출한계(LOD^GAL) 값은 블랭크 한계(LOB)와 1.645 (SD_{low concentration of GA})의 합에서 추정되었으며, 여기서 LOB는 블랭크 샘플을 테스트 할 때 측정할 수 있는 가장 높은 겉보기 농도이다. GBP가 포획된 ClyA 나노포어의 LOB는 LOB = mean_blank + 1.645 (SD_blank) (여기서 SD는 표준 편차임) 방정식에 따라 닫힌 구조의 28.2 %로 계산되었다. 마찬가지로, NA의 검출한계(LOD^NA) 값은 LOB와 1.645 (SD_{low concentration of NA})의 합으로 계산되었다.

<2-2>. 보정 곡선 (Calibration curve)

열린 구조 및 닫힌 구조의 상대값은 모든 점 전류 히스토그램에 대한 가우스 피팅 곡선 아래 면적으로 측정되었다. 갈락토오스가 없거나 갈락토오스의 포화 농도(예: 50 μM)에서 열린 구조 및 닫힌 구조가 여전히 관찰되었으므로 열린 구조 및 닫힌 구조는 아래의 수학식 1을 사용하여 정규화되었다.

<수학식 1>

여기서, f _L1 은 정규화된 값이고,

_min은 GBP 단독상태에서 나타나는 닫힌 구조(L1)의 상대적인 지속시간을 의미하고, 0.92는 갈락토오스가 포화 상태일 때의 GBP에서 나타나는 닫힌 구조(L1)의 상대적인 지속시간을 의미하고,

는 특정 농도의 갈락토오스가 존재할 때 GBP에서 나타나는 닫힌 구조(L1)의 상대적 지속시간(실험값)을 의미한다.

[실험예 1]

나노포어를 이용한 갈락토오스의 검출

단일 분자 수준에서 갈락토오스를 검출할 수 있는지 테스트하기 위하여 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(이하, GBP라 함)과 갈락토오스의 결합에 의한 전기적 신호의 변화를 대장균(Escherichia coli type I)의 ClyA-AS 나노포어(이하, ClyA라 함)를 사용하여 확인하였다.

구체적으로, 50 nM의 GBP를 ClyA 나노포어의 시스 구획(cis compartment)에 추가하였다. -90mV보다 낮은 전압을 인가하면 나노포어에 포획되어 있던 GBP가 방출되고 -90mV보다 높은 전압을 인가하면 ClyA 나노포어의 자체 폐쇄(self-closure) 또는 게이팅(gating)을 유발하였다. 따라서, 실험 전반에서 -90mV의 전압을 인가하였다(도 1의 b).

먼저, 갈락토오스가 존재하지 않는 경우, GBP를 검출하기 위한 나노포어 이벤트는 2가지 전류 레벨 (L1 = -95 ± 0.25 pA 및 L2 = -97 ± 0.27 pA)을 나타내었고, 이는 나노포어 내부에 포획된 GBP가 2개의 입체 구조를 가지고 있음을 의미한다. GBP 단독상태의 검출을 위한 3번의 독립적인 나노포어 실험 (N = 3)을 통해 L1 및 L2의 전류 차단(current blockade, Ires_%)은 열린 포어 전류(open pore current) 대비 측정된 백분율 비율이 각각 69.1 ± 0.8 % 및 67.4 ± 0.7 %임을 확인하였다(도 1의 c). 각 전류 레벨에서 GBP 단독상태의 상대적인 이벤트 지속시간은 28 % (L1) 및 72 % (L2)였으며, 이는 NMR 분광법에 의해 검출된 열린 구조(open conformation) (32 %) 및 닫힌 구조(closed conformation) (68 %)의 백분율과 일치하였다.

다음으로, 최대 50 μM의 갈락토오스를 ClyA 나노포어의 트랜스 구획에 적정(titration)하면 닫힌 구조에 해당하는 L1의 상대적 이벤트 지속시간이 28 %에서 83 %로 변화되었다(도 1의 c). 따라서, 갈락토오스의 농도가 증가함에 따라 50μM의 갈락토오스 농도에서 포화 될 때까지 L1 이벤트의 지속시간이 급격히 증가했음을 알 수 있다. L1과 L2의 2개의 전류 차단은 ClyA 포어 내강 내의 GBP 단백질에 대한 2 개의 상주 자리(residence site)가 있음을 반영한다. L1은 깊고 공간적으로 제한된 자리에 상주하는 GBP와 관련이 있는 반면, L2는 ClyA 포어의 더 넓은 시스 입구에 더 가까운 자리에 상주하는 GBP와 관련이 있다. GBP는 갈락토오스가 결합하지 않은 상태에서는 열린 구조를 하고 있으며, 갈락토오스가 GBP에 결합하면 닫힌 구조로 구조적 변화가 일어나고, 갈락토오스가 결합하지 않았을 때 N- 및 C- 말단의 힌지 각도는 134°이고, 갈락토오스가 결합했을 때 N- 및 C- 말단의 힌지 각도는 100°이므로, 열린 구조에서 닫힌 구조로의 구조적 변화로 인해 N- 및 C- 말단 도메인 사이의 힌지 각도의 변화(각각 134°에서 100°까지)가 발생할 수 있다 (도 1의 a). GBP-갈락토오스 복합체의 더 조밀한 구조는 GBP-갈락토오스 복합체가 ClyA 포어의 좁은 트랜스 출구에 더 가깝게 위치할 수 있게 하고, 그 결과 GBP 단독상태의 전류 차단(L2)보다 더 높은 전류 차단(L1)의 효과를 보인다. 따라서, 갈락토오스가 GBP에 결합함으로써 L1 레벨 전류의 이벤트 지속시간이 증가할 것이다.

갈락토오스 농도에 대한 닫힌 구조의 갈락토오스-GBP 복합체의 정규화(normalization)에 해당하는 L1 이벤트의 시간 분율(fractional time) (f _L1)은 Hill 함수로 피팅하였다(도 1의 d). GBP가 포획된 ClyA 나노포어에서 GBP와 갈락토오스간의 해리상수(K _d ^app)는 0.23 ± 0.02 μM으로 나타났으며, 이는 자가형광적정법(autofluorescence titration) 및 방사성표지 갈락토오스 적정법(radiolabeled galactose titration)을 사용하여 대량으로 측정한 것과 유사하였다.

추가적으로, GBP가 포획된 ClyA 나노포어를 사용하여 갈락토오스 (LOD^GAL)의 검출 한계(limit of detection)를 확인하였다. 3번의 독립적인 실험에서 LOD^GAL은 38 nM (N = 3)으로 판단되었다. 이 결과는 본 발명의 나노포어 센서가 기존의 갈락토오스 검출용 상업용 키트의 검출 한계(1.3~10.0 μM)에 비해 34배나 더 높은 민감도(sensitivity)를 가지고 있음을 의미한다.

이를 통해, 본 발명의 GBP가 포획된 ClyA 나노포어를 사용하면, 단일 분자 수준에서 갈락토오스를 높은 민감도로 검출할 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 2]

나노포어를 이용한 뉴라미니다아제(NA) 효소 활성의 검출

나노포어를 사용하여 NA의 효소 활성을 검출하기 위해, NA에 의한 효소 절단 후 갈락토오스의 방출을 허용하는 시알릴갈락토오스(이하, SG라 함) 기질을 이용하였다(도 2의 a).

구체적으로, SG 기질과 H5N1 (A/Anhui/1/2005)로부터 얻은 NA를 GBP가 포획된 ClyA 나노포어의 트랜스 구획에 추가하였다(도 2의 b). 갈락토오스 (0.17 X 0.45 X 0.62 nm)와 같이 작은 분자는 ClyA (3.3nm)의 좁은 협착부(constriction)를 통해 자유롭게 확산되어 시스 챔버에서 포획된 GBP에 결합 할 수 있는 반면 NA (4.6 X 5.0 X 5.6 nm)는 나노포어의 좁은 협착부로 들어갈 수 없다. SG의 농도는 NA (5 mU mL^-1)의 존재 하에서 0.1 μM에서 50 μM로 증가시켰다.

그 결과, SG의 농도가 증가함에 따라 L1의 상대적인 이벤트 지속시간이 45 %에서 80 %로 증가하는 것으로 나타났다 (f _L1에서 0.27에서 0.82로) (도 2의 c). 따라서, L1 이벤트의 지속시간은 50μM의 SG 기질 농도에서 포화 될 때까지 현저하게 증가하는 것으로 관찰되었다. SG 농도에 따른 L1의 시간 분율(fractional time) (f _L1)은 계수가 1로 설정된 Hill 함수로 피팅하였다(도 2의 d). SG에서 절단된 갈락토오스(SG-cleaved galactose)에 의해 결정된 K _d ^app 값 (0.3 ± 0.03 μM)은 정제된 갈락토오스 (0.23 ± 0.02 μM)를 사용하여 측정한 것과 유사한 것으로 나타났다.

이를 통해, 본 발명의 나노포어가 NA 효소에 의한 SG 절단 과정 동안 생성된 갈락토오스 및 NA의 농도를 모니터링 할 수 있을 뿐만 아니라, NA의 효소 활성을 측정할 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 3]

나노포어를 이용한 뉴라미니다아제(NA) 효소 활성의 실시간 및 정략적 검출 확인

<3-1>. 실시간 감지 및 검출 시간 확인

본 발명의 GBP가 포획된 나노포어를 이용하여 NA의 효소 반응 시간에 따른 전기적 신호의 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 3의 a에 나타난 바와 같이 -90mV의 인가 전압에서 NA의 효소 반응 시간이 0에서 30분까지 증가함에 따라 L1의 상대적인 이벤트 지속시간이 30분 동안 80 %로 실질적으로 증가하는 것으로 관찰되었다. 이는 NA의 활성으로 인해 갈락토오스 농도가 증가했음을 나타낸다.

또한, 도 3의 b에 나타난 바와 같이 NA가 존재하지 않는 경우 SG 또는 시알산은 GBP에 포획된 ClyA 나노포어의 전류 차단(current blocaked)에 대한 간섭을 유발하지 않았다.

이를 통해, 본 발명의 GBP가 포획된 나노포어를 NA의 효소 활성을 실시간으로 감지하는 데 활용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 나노포어 센서는 샘플을 로딩한 후 10분 이하의 시간에 인플루엔자 바이러스의 NA를 빠르게 감지하였는데, 이는 시간이 많이 소요되는 다른 진단 방법에 비해 상당히 유리한 점이다.

<3-2>. 정량적 검출 및 검출 한계의 확인

본 발명의 GBP가 포획된 나노포어를 이용하여 NA의 효소 활성을 정량적으로 검출할 수 있는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, NA의 활성에 대한 적정곡선(calibration curve)을 얻기 위해, 2 μM의 SG 존재 하에 다양한 농도의 NA (0.05 ~ 5 mU mL^-1)에서 나노포어 실험을 수행하였다. 상기 SG 농도는 상기 실험예 2에서 0.1 μM에서 50 μM 범위의 다양한 SG 기질 농도에서 수행한 나노포어 실험 결과를 토대로, NA 효소 활성도의 거의 완전한 포화(f _L1=1)가 달성될 수 있는 농도인 2μM SG를 선택하였다(도 2d).

그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이 3번의 독립적 실험에서 NA의 농도가 증가함에 따라 L1의 상대적인 이벤트 지속시간이 각각 ~49 %에서 ~75 %로 증가하는 것으로 관찰되었다. NA 농도에 대한 f _L1의 의존성은 Hill 함수로 잘 피팅되었다 (도 3d). 갈락토오스가 결합된 분획 (GBP의 닫힌 구조)은 1mU mL^-1 NA 농도에서 포화되었다. 이러한 결과는 GBP가 포획된 ClyA 나노포어가 NA의 정량화에 이용될 수 있음을 의미하고, 결과적으로 인플루엔자 바이러스 검출에 적용 할 수 있음을 의미한다.

또한, GBP가 포획된 ClyA 나노포어를 사용한 NA (LOD^NA)의 검출 한계는 0.17 ng mL^-1로 나타났으며, 이는 본 발명의 나노포어 센서가 전기화학적분석법 (14.8 ng mL^-1) 및 효소면역분석법 (7 ng mL^-1) 과 같은 기존 방법보다 40 ~ 80 배 더 높은 민감도를 가지고 있음을 의미한다(표 2).

Method	LOD (ng mL -1 )	Dynamic range (ng mL -1 )	Detection time	Reference
ELISA	7	7.4 - 952	6 hours	Gerentes et al., J. Virol. Methods 1998, 73(2), 185-95
4-MUNANA assay	60	0.6 - 60000	1 hour	Yang et al., Carbohydr. Res. 2012 , 359, 92-6.
Gold nanoparticles boron-doped diamond electrodes	14.8	14.8 - 720	30 min	Wahyuni et al., Anal. Biochem. 2016, 497, 68-75.
ClyA nanopore	0.17	0.17 - 300	10 min	This study

이러한 데이터를 기반으로 나노포어 센서를 활용하면 바이러스 입자의 수를 정량적으로 확인 할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 표면에 대략 50 개의 NA 테트라머(tetramer)가 존재하는 것으로 알려져 있으므로 시알산을 절단 할 수 있는 200개의 NA 단량체가 있는 것으로 추정할 수 있다. 이를 기반으로 계산하면, 검출한계에서의 NA 농도 (LOD^NA)(0.17 ng mL^-1)는 약 8.4 Х 10⁹개의 바이러스 입자로 변환 될 수 있다.

<3-3>. 검출 특이성 확인

본 발명의 GBP가 포획된 나노포어 센서의 특이성을 확인하기 위하여 음성 대조군으로, GBP가 포획된 ClyA 나노포어를 사용하여 폐렴구균(Streptococcus pneumonia)에서 얻은 박테리아 유래 NA(NAp)의 효소 활성을 모니터링 했다.

그 결과, 도 3의 e에 나타난 바와 같이 L1의 상대적인 이벤트 지속시간이 SG만 있는 경우와 비교하여 크게 변화되지 않는 것으로 관찰되었다. 인플루엔자 바이러스 유래의 NA와는 대조적으로, NAp는 SG의 α-2,6 글리코시드 결합을 인식 할 수 없으므로 무시할 수 있는 비율로 SG를 절단하는 것으로 알려져 있다.

이로부터, 본 발명의 GBP가 포획된 나노포어는 α-2,6 결합을 이용하여 SG 기질을 절단할 수 있는 바이러스 또는 박테리아 유래의 NA를 모니터링하는 데 유용함을 알 수 있다. 나아가, 기질을 다양하게 대체(예컨대, α-2,3 글리코시드 결합을 인식할 수 있는 NAp의 기질로 대체)하면 다른 종류의 바이러스 또는 박테리아의 NA를 특이적으로 모니터링 할 수 있으므로 이러한 기질 특이성을 다양한 종류의 NA로 확장할 수 있음을 알 수 있다.

[실험예 4]

나노포어를 이용한 약물 스크리닝 및 약물 감수성의 확인

약물 감수성 테스트 또는 약물 스크리닝에 본 발명의 나노포어 센서의 잠재적인 활용을 테스트하기 위해, 오셀타미비르 카르복실레이트(Oseltamivir Carboxylate, OC), 자나미비르(zanamivir, ZN), 브라질린(brazilin, BZ) 및 에피카테킨(epicatechin, EC)과 같은 항바이러스제와 함께 GBP가 포획된 ClyA 나노포어를 사용하여 NA의 활성 억제 효과를 조사하였다(도 4의 a). 이전 연구에서 OC 및 ZN은 IC₅₀값이 각각 0.45 nM 및 0.95 nM로 인플루엔자 바이러스의 NA에 강력하고 특이적이고 잘 알려진 억제제인 반면, IC₅₀값이 각각 0.2 μM 및 >100 μM인 BZ 및 EC는 각각 OC에 비해 상대적으로 감소된 억제 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. 바닐릭산(Vanillic acid, VA)은 음성 대조군으로 사용되었다.

구체적으로, 2 μM 농도의 SG 및 5 mU mL^-1 농도의 NA를 1 μM의 OC, ZN, BZ, EC 또는 VA와 함께 37 ℃에서 1시간 동안 반응한 후, GBP가 포획된 ClyA 나노포어를 사용하여 L1의 상대적인 이벤트 지속시간을 측정하였다.

그 결과, L1의 상대적인 이벤트 지속시간은 NA 억제제가 존재하지 않을 때 75 %로 증가하는 것으로 나타났지만, VA를 제외하고 억제제가 존재하면 이러한 값이 크게 감소하는 것을 관찰하였다(도 4의 b). 나노포어 기반 NA 활성 검출에서, OC 및 ZN 처리에 대한 상대적인 이벤트 지속시간 L1 값이 각각 38 % 및 40 %로 감소한 것으로 나타났으며, 이는 OC 및 ZN 모두 갈락토오스 방출을 위해 SG를 절단하는 NA의 활성을 억제했음을 알 수 있었다. 유사하게, BZ 및 EC 처리에 대한 L1의 상대적인 이벤트 시간은 각각 47 % 및 55 %로 감소했으며, 억제 효과는 OC 및 ZN보다 낮았습니다. 이러한 억제 효과에 대한 f _L1을 비교하면, NA의 억제 순서 (OC @ ZN > BZ > EC)가 이전에 보고 된 IC₅₀ 값과 일치함을 알 수 있었다(도 4의 c).

이로부터, GBP가 포획된 ClyA 나노포어는 바이러스성 NA 활동에 대한 항바이러스 약물의 억제 효과를 신속하게 모니터링하는 데 사용될 수 있고, 약물 감수성 테스트 및 새로운 저분자 항바이러스제의 스크리닝에 있어서 중요한 의미를 가짐을 알 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Biosience and Biotechnology <120> A METHOD FOR IDENTIFING THE PRESENCE OF INFLUENZA VIRUS USING NANOPORES <130> 2020-DPA-3721 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GBP <400> 1 Met Ala Asn Lys Lys Val Ile Thr Leu Ser Ala Val Met Ala Ser Met 1 5 10 15 Leu Phe Gly Ala Ala Ala His Ala Ala Asp Thr Arg Ile Gly Val Thr 20 25 30 Ile Tyr Lys Tyr Asp Asp Asn Phe Met Ser Val Val Arg Lys Ala Ile 35 40 45 Glu Gln Asp Ala Lys Ala Ala Pro Asp Val Gln Leu Leu Met Asn Asp 50 55 60 Ser Gln Asn Asp Gln Ser Lys Gln Asn Asp Gln Ile Asp Val Leu Leu 65 70 75 80 Ala Lys Gly Val Lys Ala Leu Ala Ile Asn Leu Val Asp Pro Ala Ala 85 90 95 Ala Gly Thr Val Ile Glu Lys Ala Arg Gly Gln Asn Val Pro Val Val 100 105 110 Phe Phe Asn Lys Glu Pro Ser Arg Lys Ala Leu Asp Ser Tyr Asp Lys 115 120 125 Ala Tyr Tyr Val Gly Thr Asp Ser Lys Glu Ser Gly Ile Ile Gln Gly 130 135 140 Asp Leu Ile Ala Lys His Trp Ala Ala Asn Gln Gly Trp Asp Leu Asn 145 150 155 160 Lys Asp Gly Gln Ile Gln Phe Val Leu Leu Lys Gly Glu Pro Gly His 165 170 175 Pro Asp Ala Glu Ala Arg Thr Thr Tyr Val Ile Lys Glu Leu Asn Asp 180 185 190 Lys Gly Ile Lys Thr Glu Gln Leu Gln Leu Asp Thr Ala Met Trp Asp 195 200 205 Thr Ala Gln Ala Lys Asp Lys Met Asp Ala Trp Leu Ser Gly Pro Asn 210 215 220 Ala Asn Lys Ile Glu Val Val Ile Ala Asn Asn Asp Ala Met Ala Met 225 230 235 240 Gly Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala His Asn Lys Ser Ser Ile Pro Val 245 250 255 Phe Gly Val Asp Ala Leu Pro Glu Ala Leu Ala Leu Val Lys Ser Gly 260 265 270 Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu Asn Asp Ala Asn Asn Gln Ala Lys Ala 275 280 285 Thr Phe Asp Leu Ala Lys Asn Leu Ala Asp Gly Lys Gly Ala Ala Asp 290 295 300 Gly Thr Asn Trp Lys Ile Asp Asn Lys Val Val Arg Val Pro Tyr Val 305 310 315 320 Gly Val Asp Lys Asp Asn Leu Ala Glu Phe Ser Lys Lys Gly Ser Ser 325 330 335 His His His His His 340 <210> 2 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClyA-AS <400> 2 Met Thr Gly Ile Phe Ala Glu Gln Thr Val Glu Val Val Lys Ser Ala 1 5 10 15 Ile Glu Thr Ala Asp Gly Ala Leu Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr Leu Asp 20 25 30 Gln Val Ile Pro Trp Lys Thr Phe Asp Glu Thr Ile Lys Glu Leu Ser 35 40 45 Arg Phe Lys Gln Glu Tyr Ser Gln Glu Ala Ser Val Leu Val Gly Asp 50 55 60 Ile Lys Val Leu Leu Met Asp Ser Gln Asp Lys Tyr Phe Glu Ala Thr 65 70 75 80 Gln Thr Val Tyr Glu Trp Ala Gly Val Val Thr Gln Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Tyr Ile Gln Leu Phe Asp Gly Tyr Asn Glu Lys Lys Ala Ser Ala Gln 100 105 110 Lys Asp Ile Leu Ile Arg Ile Leu Asp Asp Gly Val Lys Lys Leu Asn 115 120 125 Glu Ala Gln Lys Ser Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Phe Asn Asn Ala 130 135 140 Ser Gly Lys Leu Leu Ala Leu Asp Ser Gln Leu Thr Asn Asp Phe Ser 145 150 155 160 Glu Lys Ser Ser Tyr Tyr Gln Ser Gln Val Asp Arg Ile Arg Lys Glu 165 170 175 Ala Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ile Val Ala Gly Pro Phe Gly Leu 180 185 190 Ile Ile Ser Tyr Ser Ile Ala Ala Gly Val Val Glu Gly Lys Leu Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Asn Asn Arg Leu Lys Thr Val Gln Asn Phe Phe Thr Ser 210 215 220 Leu Ser Ala Thr Val Lys Gln Ala Asn Lys Asp Ile Asp Ala Ala Lys 225 230 235 240 Leu Lys Leu Ala Thr Glu Ile Ala Ala Ile Gly Glu Ile Lys Thr Glu 245 250 255 Thr Glu Thr Thr Arg Phe Tyr Val Asp Tyr Asp Asp Leu Met Leu Ser 260 265 270 Leu Leu Lys Gly Ala Ala Lys Lys Met Ile Asn Thr Ser Asn Glu Tyr 275 280 285 Gln Gln Arg His Gly Arg Lys Thr Leu Phe Glu Val Pro Asp Val Gly 290 295 300 Ser Ser Tyr His His His His His 305 310

Claims (9)

1. 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 인플루엔자 바이러스가 존재할 것으로 예상되는 생물학적 시료를 시알릴갈락토오스와 반응시키는 단계; 및
   상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;
   를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 나노포어는 사이토라이신 A(Cly A)인, 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 막은 지질 이중층(lipid bilayer)인, 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법.
   
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 측정된 전기적 신호의 변화가 유의미한 경우, 상기 생물학적 시료에 인플루엔자 바이러스가 존재하는 것으로 판단하는 단계;를 더 포함하는 것인, 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법.
   
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 측정된 전기 신호를 이용하여, 상기 생물학적 시료 내에 존재하는 인플루엔자 바이러스를 정량화하는 단계;를 더 포함하는 것인, 인플루엔자 바이러스의 존부에 관한 정보를 제공하는 방법.
   
6. 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 뉴라미니다아제 및 시알릴갈락토오스를 뉴라미니다아제 활성 억제제 후보 물질과 함께 반응시키는 단계; 및
   상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;
   를 포함하는 뉴라미니다아제 활성 억제제의 스크리닝 방법.
   
7. 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane)의 일 구획에서, 인플루엔자 바이러스가 포함된 시료 및 시알릴갈락토오스를 항바이러스제와 함께 반응시키는 단계; 및
   상기 막에 의해 나뉜 두 개의 구획에서, 상기 반응의 전후에 걸쳐 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;
   를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성 여부 확인 방법.
   
8. 청구항 7에 있어서,
   상기 항바이러스제는 오셀타미비르(Oseltamivir) 또는 자나미비르(Zanamivir)인 것인, 인플루엔자 바이러스의 항바이러스제 내성 여부 확인 방법.
   
9. 포어에 글루코오스/갈락토오스-결합 단백질(glucose/galactose-binding protein, GBP)이 포획된 나노포어를 포함하고, 상기 나노포어가 존재하는 공간을 두 개의 구획(compartment)으로 나누는 막(membrane); 및
   상기 막(membrane)에 의해 나뉜 일 구획에 포함된 시알릴갈락토오스;
   를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 검출용 키트.

Images