JP6454682B2 - グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカンの量を決定する方法およびキット - Google Patents
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- G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides
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Description
を用いたアッセイは、ドナーの個体間変動をかなり受けやすいため、これが実験の偏りの原因となる。
質の存在およびそれらの相乗効果を検出するために、すでに使用され、成功を収めている(国際公開第2012/143647号パンフレット)。この出願に明記された目的は、炎症活性を呈する形態の汚染物質を単に検出することであるので、この特許出願に記載の方法は、試料中に含まれるPGNの全量の測定に適していない。実際に、可溶性PGN(MM≒120kDa)は、TLR2受容体を介して炎症応答を誘導するものである。したがって、炎症性であったり他の分子と凝集を起こしたりするのに好適なサイズを有しないPGNは、この出願に記載の方法により検出されない。
a)超音波処理、加熱、および/またはアルカリ化によりグルコースポリマーの試料を処理すること、
b)処理された試料またはその稀釈液を、TLR2受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性TLR2受容体(Toll様受容体2)とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞に接触させることであって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードすること、
c)レポーター遺伝子由来のシグナルを測定すること、
d)PGNの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線を用いて、試料中のPGNの量を決定することと、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン(PGN)をアッセイする方法に関する。
−TLR2受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性TLR2受容体(Toll様受容体2)とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞であって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードする組換え細胞と、
−PGNの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線、またはPGN標準、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから選択される細菌に由来するもの、またはTLR2のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にPAM3Cys−Ser−(Lys)4三塩酸塩である内部標準、のいずれかと、
−任意で、使用説明書および/または試料を前処理するための溶液と、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン(PGN)をアッセイするためのキットに関する。
a)超音波処理、加熱、および/またはアルカリ化によりグルコースポリマーの試料を処理すること、
b)処理された試料またはその稀釈液を、TLR2受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性TLR2受容体(Toll様受容体2)とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞に接触させることであって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードすること、
c)レポーター遺伝子由来のシグナルを測定すること、
d)PGNの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線を用いて、試料中のPGNの量を決定すること、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン(PGN)をアッセイする方法に関する。
を用いて行われる。さらに、少なくとも60分間の反応時間が好ましい。
−(A)部は、TLR2の有効活性化を与える濃度未満の低濃度のPGNで得られる応答に対応する。したがって、この非線形ゾーンは、本方法の検出限界に対応する。本方法の変動を含めると、この検出の閾値は、バックグラウンドノイズ(刺激の不在下で得られる反応)の3倍の値であると推定される。
−(B)部は、線形応答が観測されるので、最も興味深い。有効応答を有するこのゾー
ンにより、細胞応答とPGNレベルとの間の直接的関係を決定することが可能である。したがって、これはアッセイゾーンである。
−(C)部は、過剰濃度のPGNの存在下での細胞応答の飽和に対応する。実際に、TLR2受容体の飽和が存在する。
−TLR2受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性TLR2受容体(Toll様受容体2)とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞であって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードし、特に、細胞が、好ましくは、HEK−Blue(商標)hTLR2細胞であり、ネガティブコントロールとして、キットがまた、先天性免疫受容体を発現しない細胞、たとえば、HEK−Blue(商標)Null2細胞を含む組換え細胞と、
−PGNの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線、または検量されたPGN標準、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから、好ましくは、黄色ブドウ球菌から選択される細菌に由来するもの、またはTLR2のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にPAM3Cys−Ser−(Lys)4三塩酸塩である内部標準、のいずれかであって、任意で、キットが、両方、すなわち、検量線、さらにはこの検量線の作成に使用したのと同一の微生物に由来する検量されたPGN標準を含む、いずれかと、
−任意で、使用説明書、試料を前処理するための溶液、レポーター遺伝子の反応を測定するために使用される試薬、マイクロプレートなどと、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン(PGN)をアッセイするためのキットに関する。
このアッセイに関する実験のために、以下の2つの種が使用される。
−HEK−Blue(商標)hTLR2細胞(HEK−TLR2):可溶性PGNに対して強い反応性を有する、TLR2リガンドに対する特異的反応。
−HEK−Blue(商標)Null2細胞(HEK−Null):試料の細胞毒性に関連する非特異的反応。
37.5%(重量/体積)で調製された汚染されていないイコデキストリン溶液中に黄色ブドウ球菌のPGN標準を異なる量で希釈することにより(図2)、用量応答曲線を作成した(図2)。
−(A)部は、TLR2の有効的な活性化を与える濃度未満の低濃度のPGNで得られる応答に対応する。したがって、この非線形ゾーンは、本方法の検出限界に対応する。
−(B)部は、線形応答が観測されるので、最も興味深い。有効な応答のこのゾーンにより、細胞応答とPGN量との間の直接的関係を決定することが可能である。したがって、これはアッセイゾーンである。
−(C)部は、過剰な濃度のPGNの存在下での細胞応答の飽和に対応する。実際、TLR2受容体の飽和が存在する。
37.5%(重量/体積)で調製された汚染されていないマルトデキストリン溶液中に異なる細菌種のPGNを希釈することにより(P−11.11参照)、用量応答曲線を作成した。アッセイされるPGNは、黄色ブドウ球菌(Sigma、カタログ番号77140)、ミクロコッカス・ルテウス(Sigma、カタログ番号53243)、枯草菌(InvivoGen、番号tlrl−pgnb2)、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス(個人的な調製)から抽出される。
することの重要性が際立つ。
Claims (8)
- グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン(PGN)の量を決定する方法であって、
a)超音波処理、加熱、および/またはアルカリ化により前記グルコースポリマーの試料を処理して前記試料中に含まれるPGNを断片化および分解し、30〜5000kDaのサイズを有する可溶性PGNを生成すること、
b)前記処理された試料またはその稀釈液を、TLR2受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性TLR2受容体(Toll様受容体2)とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞に接触させることであって、前記レポーター遺伝子が分泌型アルカリホスファターゼであること、
c)前記レポーター遺伝子由来のシグナルを測定すること、
d)前記PGNの量と前記レポーター遺伝子由来のシグナルの強度との間の対応の検量線を用いて、前記試料中のPGNの量を決定すること、
を含み、
前記PGNの量と前記レポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線が、PAM3Cys−Ser−(Lys)4三塩酸塩を用いて標準化または較正されることを特徴とする、方法。 - 前記細胞が、HEK−Blue(商標)hTLR2細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記PGNの量と前記レポーター遺伝子由来のシグナル強度との対応の検量線が、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから選択される細菌に由来するPGNを用いて作成されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記方法が、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから選択される細菌に由来するPGNを用いて、検量線を作成する予備工程を含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、PAM3Cys−Ser−(Lys)4三塩酸塩を用いて前記検量線を作成する予備工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 必要に応じて、前記試料が、前記検量線の直線部に対応する前記レポーター遺伝子由来のシグナルを生成するように希釈されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、イコデキストリン溶液の試料であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン(PGN)の量を決定するためのキットであって、
−TLR2受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性TLR2受容体(Toll様受容体2)とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞であって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードする、組換え細胞と、
−PGN標準と、
−任意で、使用説明書および前記試料を前処理するための溶液と、
−PAM3Cys−Ser−(Lys)4三塩酸塩と、
を含む、キット。
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