JP6454682B2 - グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカンの量を決定する方法およびキット - Google Patents

Description

本発明は、試料、特に、グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカンのアッセイに関する。

無菌性炎症の発症は、治療目的（たとえば、腹膜透析、非経口栄養、静脈経路による注射）で製造された製品を用いた治療時に観察される主な合併症である。これらの炎症の発症のいくつかは、化学的性質の問題（化学汚染物質の偶発的存在、または特定の化合物の不適正投与）と関係があるが、ほとんどの症例は、製造プロセス時に放出される微生物由来の汚染物質の存在に起因する。現在では、リポ多糖（ＬＰＳ）およびペプチドグリカン（ＰＧＮ）は、製造された製品中に痕跡程度で存在する場合に、そのような炎症の発症を引き起こすリスクの高い主な汚染物質であることが明らかになっている。

ＬＰＳによる汚染を検出およびアッセイするために、ＬＡＬ（カブトガニ血球抽出成分）アッセイが、多くの品質管理研究室によって日常的に使用されている。このアッセイは、リムルス属（カブトガニ）の血リンパから抽出された感知複合体によるエンドトキシンの認識に基づく。

治療に使用される製品中のＰＧＮを検出するために、現在、無脊椎動物の血リンパの抽出物の反応性に基づく他のアッセイも提案されている（ＳＬＰ−Ｗａｋｏ，Ｉｍｍｕｎｅｔｉｃｓ）。しかしながら、微生物起源の他の分子、たとえば、β−グルカンとも反応するので、これらのアッセイは、それほど特異的ではないという欠点を有する。さらに、これらの方法では、この使用のために特別な装置の購入が必要となるので、コストが大幅に増加し、ひいてはこれらのアッセイ技術の利用が制限される。

さらに、ＬＰＳおよびＰＧＮは、それらの細菌起源に応じて構造が変わりやすいので、炎症反応性に大きな差を生じる原因となる。そのため、標準分子（たとえば、ＬＡＬアッセイでの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＬＰＳ）に換算した単位でアッセイの結果を表現することがさらに必要となる。

さらに、これらの分子は、ほとんどの場合、高分子複合体の形態で存在するので、それにより、それらの溶解性およびそれらの炎症の値が影響を受ける。たとえば、ＰＧＮは、大きさが非常に変わりやすく、多くの場合、リポテイコ酸やリポペプチドなどの細菌壁の他の分子と凝集を起こす。

したがって、「生物学的」方法は、これらの分子に関連する炎症の負荷のみを考慮して開発されてきた。炎症反応のエフェクター細胞は、感染性因子により特異的に生成される分子構造を認識するための特別なセンサーを有する。病原体関連分子パターン分子に因んでＰＡＭＰと呼ばれるこれらの分子は、本質的にＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）およびＮＬＲ（Ｎｏｄ様受容体）により認識され、それらの特異性は、異なる種類の炎症性分子の分子構造に関連している。ＬＰＳ（ＴＬＲ４型受容体により認識されるリガンドである）とは対照的に、ＰＧＮは、ＴＬＲ２型受容体により認識されるリガンドである。

近年、炎症応答の動物モデルを置き換えるべく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞アッセイが開発されてきている。これらのアッセイのほとんどは、汚染された製品の存在下での単球細胞の培養と、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ）の産生の逆滴定と、に基づく。しかしながら、血液から単離された一次細胞
を用いたアッセイは、ドナーの個体間変動をかなり受けやすいため、これが実験の偏りの原因となる。

これとは対照的に、単球細胞株は一定の反応を与えるので、このことが、一次細胞よりも一般に好ましい理由の説明になっている。しかしながら、これら株もまた、完全には満足すべきものではない。たとえば、ほとんどが一過的に発現され、培養培地中の濃度が必ずしも炎症性分子の実際の負荷を反映するわけではないので、サイトカインの選択は批判されることが多い。すべての単球細胞がＴＬＲ／ＮＬＲの大部分を発現するので、それらの使用に基づくアッセイは、汚染物質の１つのタイプに対して選択的ではなく、全てに対して炎症反応を与えるであろう。

さらに、主な問題は、異なる炎症性分子に対する細胞の感受性の違いにより、生じる。このように、ＴＬＲ２のリガンドであるＰＧＮは、ＬＰＳよりも反応性がはるかに低いので、このことが、これらの方法による検出を困難にしている。実際に、ＬＰＳはｎｇ／ｍＬ程度の濃度に対して有意な反応を誘導するが、ＰＧＮは同様の応答（ｗ／ｗ比）を得るのに１００倍の濃度が必要である。

数年間にわたり、炎症性化合物の反応性を検出および定量するための生物学的アッセイで上記のモデルを置き換えるために、トランスフェクト細胞株が提案されてきた。これらの非炎症性の株（たとえば、ＨＥＫ−２９３）は、ある種類の炎症性アゴニストの特異的な受容体をコードする遺伝子により安定的にトランスフェクトされる。それらはまた、合成が炎症性受容体の活性化に依存する酵素（たとえば、ルシフェラーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードするレポーター遺伝子に対する発現ベクターも含む。したがって、適切な受容体を発現する細胞により汚染物質が認識されると、酵素の合成がトリガーされるので、その生成に続いて、その基質から着色生成物または発光性の生成物への変換が起こる。この生成物は容易に定量可能であるので、この方法により汚染物質の種類に関連する炎症反応の迅速なアッセイが可能になる。

これらの細胞モデルは、多くの利点を有する。すなわち、サイトカインのＥＬＩＳＡアッセイが酵素アッセイにより置き換えられ、系の安定性に起因してアッセイの再現性が高く、発現される受容体の関数として特定の種類の炎症性分子が標的となり、非常に低い閾値で汚染物質が検出される。

したがって、所与のＴＬＲまたはＮＬＲのアゴニストである炎症因子を特異的に標的として、このアゴニストに関連する炎症応答を定量できるので、これらの細胞モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのサイトカイン応答のアッセイと置き換えることができる。たとえば、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を特異的に発現する細胞は、食品中の汚染物質を検出するためにすでに使用されている（Ｃｌｅｔｔ Ｅｒｒｉｄｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−ＵＫ ｉｎ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１０５／ｉｓｓｕｅ ０１／Ｊａｎ ２０１１，ｐｐ１５−２３の研究）。

さらに、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎなどの会社は、現在、種々のＴＬＲまたはＮＲＬ受容体でトランスフェクトされた広範にわたるＨＥＫ−２９３系の細胞（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標））を市販している。これらの細胞は、炎症性アゴニストに対する応答の迅速かつ容易な比色アッセイを可能にする分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：分泌型胎盤アルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子をレポーターとして含有する。

これらのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞は、グルコースポリマーの濃厚溶液中の汚染物
質の存在およびそれらの相乗効果を検出するために、すでに使用され、成功を収めている（国際公開第２０１２／１４３６４７号パンフレット）。この出願に明記された目的は、炎症活性を呈する形態の汚染物質を単に検出することであるので、この特許出願に記載の方法は、試料中に含まれるＰＧＮの全量の測定に適していない。実際に、可溶性ＰＧＮ（ＭＭ≒１２０ｋＤａ）は、ＴＬＲ２受容体を介して炎症応答を誘導するものである。したがって、炎症性であったり他の分子と凝集を起こしたりするのに好適なサイズを有しないＰＧＮは、この出願に記載の方法により検出されない。

したがって、試料、特に、グルコースポリマーの試料において全ＰＧＮをアッセイする代替法を開発する必要性が、常に存在する。

したがって、本発明は、試料、特に、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカンをアッセイする方法に関する。

特に、本発明は、
ａ）超音波処理、加熱、および／またはアルカリ化によりグルコースポリマーの試料を処理すること、
ｂ）処理された試料またはその稀釈液を、ＴＬＲ２受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞に接触させることであって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードすること、
ｃ）レポーター遺伝子由来のシグナルを測定すること、
ｄ）ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線を用いて、試料中のＰＧＮの量を決定することと、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイする方法に関する。

好ましくは、超音波処理、加熱、および／またはアルカリ化により試料を処理することにより、試料中に含まれるＰＧＮの断片化および分解を可能にし、特に、ＴＬＲ２受容体の活性化が可能になるようにする。特に、試料を処理することにより、主に約１２０ｋＤａのサイズを有するＰＧＮの生成を可能にする。

好ましくは、レポーター遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼである。好ましい実施形態では、細胞は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞である。

好ましくは、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）から、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから、選択される細菌に由来するＰＧＮを用いて調製されたものである。特に、本方法は、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから選択される細菌に由来するＰＧＮを用いて検量線を作成する予備工程を含む。

好ましくは、試料は、必要であれば、検量線の直線部に対応するレポーター遺伝子由来のシグナルを生成するように希釈される。

好ましくは、試料は、イコデキストリンの溶液の試料である。

好ましくは、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線は、ＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて、標準化または較正される。

他の実施形態では、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線は、ＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて作成されたものである。特に、本方法は、ＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて、検量線を作成する予備工程を含む。

本発明はさらに、
−ＴＬＲ２受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞であって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードする組換え細胞と、
−ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線、またはＰＧＮ標準、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから選択される細菌に由来するもの、またはＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準、のいずれかと、
−任意で、使用説明書および／または試料を前処理するための溶液と、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイするためのキットに関する。

好ましくは、キットは、ＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準をさらに含む。

ＰＧＮ濃度の増加の関数としての細胞応答の理論曲線。 ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞を用いて得られた黄色ブドウ球菌のＰＧＮ濃度の関数としての細胞応答の検量線。 異なる細菌種に由来するＰＧＮ濃度の増加の関数としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞の応答。 異なるロットから得られた黄色ブドウ球菌のＰＧＮ濃度の増加の関数としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞の応答。 ＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩（ＰＡＭ３（ｃｙｓ））の構造。 ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞において黄色ブドウ球菌のＰＧＮおよびＰＡＭ３（ｃｙｓ）により誘導された応答の比較。 補正されたＰＧＮ濃度の関数としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞の応答。 補正応答活性ＰＧＮ濃度の関数としてのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞の応答の検量線。

したがって、本発明は、試料、特に、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカンをアッセイする方法に関する。

特に、本発明は、
ａ）超音波処理、加熱、および／またはアルカリ化によりグルコースポリマーの試料を処理すること、
ｂ）処理された試料またはその稀釈液を、ＴＬＲ２受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞に接触させることであって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードすること、
ｃ）レポーター遺伝子由来のシグナルを測定すること、
ｄ）ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線を用いて、試料中のＰＧＮの量を決定すること、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイする方法に関する。

好ましくは、グルコースポリマーは、腹膜透析、経腸栄養および非経口栄養、ならびに新生児哺乳に供することが意図される。好ましい実施形態では、試験されるグルコースポリマーは、イコデキストリンまたはマルトデキストリンである。特に、それらは、腹膜透析用に調製することが意図さる。それらは、それらの調製の１つ以上の段階で、特に原材料のレベルで、それらの調製プロセスの任意の工程で、および／またはプロセスの最終生成物のレベルで試験可能である。それらはまた、腹膜透析用の溶液の試料として試験される。

本方法の第１の工程では、グルコースポリマーの試料は、超音波処理、加熱、および／またはアルカリ化により処理される。この処理の目的は、凝集体中に含有またはトラップされたＰＧＮを断片化および／またはＰＧＮを分解することであり、その目的は、ＴＬＲ２受容体と相互作用してそれを活性化しうるＰＧＮを生成することである。以上に述べたように、この処理により、凝集体中に含有またはトラップされたＰＧＮを分解したり、大きすぎるＰＧＮを断片化したりして、特に、３０〜５０００ｋＤａ、特に、約１２０ｋＤａのサイズを有する可溶性ＰＧＮを生成できるはずである。しかしながら、その処理は、ＴＬＲ２受容体と相互作用するＰＧＮの能力に影響を及ぼしてはならない。好ましくは、ＴＬＲ２と相互作用して受容体を活性化するＰＧＮが最大に放出されるように、およびＴＬＲ２上のすでに活性なＰＧＮが最大に貯蔵されるように、最適化される。

第１の実施形態では、試料の処理は、少なくとも１回の超音波処理工程を含む。任意で、超音波処理は３０秒間〜５分間を要し、２０〜４０ｋＨｚの周波数を使用し、かつ／または１回以上の超音波処理サイクル（たとえば、１〜５サイクル）を含む。好ましい実施形態では、試料は、単一サイクルにより３５ｋＨｚで１分間かけて超音波処理により処理される。任意で、超音波処理による処理は、加熱および／またはアルカリ化による処理と組み合わされる。

第２の実施形態では、試料の処理は、少なくとも１回のアルカリ化工程を含む。好ましくは、アルカリ化剤は、特に０．１〜１Ｍの濃度のＮａＯＨである。任意で、アルカリ化工程の継続時間は５分間〜６０分間である。任意で、アルカリ化工程は、高温、特に、２０、４０、６０、または８０℃の温度、たとえば、２０℃〜８０℃の温度で行われる。任意で、アルカリ化による処理は、超音波処理による処理と組み合わさる。

第２の実施形態では、試料の処理は、少なくとも１回の加熱工程を含む。任意で、加熱工程の継続時間は５分間〜６０分間である。任意で、加熱工程は、高温、特に２０℃〜８０℃の温度、たとえば、２０、４０、６０、または８０℃の温度で行われる。任意で、加熱処理は、超音波処理によるおよび／またはアルカリ化による処理と組み合わされる。

試料処理の方法は、酵素処理、特にムタノリシンによる工程を含まない。

後続ステップでは、試料および／またはその希釈液は、ＴＬＲ２受容体を発現する組換え細胞に接触される。細胞は、ＴＬＲ２受容体、好ましくはヒトＴＬＲ２受容体をコードする核酸の導入により修飾された細胞であり、その初期の細胞はＴＬＲ２を発現しないので、組換え体として適している。

ＴＬＲ２受容体の活性は、前記受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下にあるレポーター遺伝子を用いて検出される。好ましくは、このレポーター遺伝子は、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードする。特に、レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼをコードする。特に、レポーター遺伝子は、合成がＴＬＲ２に関連するシグナル伝達経路の直接依存下にある分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：分泌型胎盤アルカリホスファターゼ）を産生する。

好ましい実施形態では、使用される細胞株は、ヒトＴＬＲ２をコードするベクターを用いて安定なトランスフェクションにより修飾されたＨＥＫ−１０ Ｂｌｕｅ（商標）株（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社により市販されている）、すなわち、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２株である。しかしながら、当業者はまた、市販の他の株（Ｉｍｇｅｎｅｘ）を使用してもよく、または、それを調製可能であることに留意すべきである。

細胞がＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２である場合、細胞は、好ましくは、９６ウェルプレートに対して約５０，０００細胞／ウェルの密度で使用される。

特定の実施形態では、グルコースポリマーの試料またはその稀釈液は、５〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５〜１０、２０、３０、または４０ｍｇ／ｍＬの濃度のグルコースポリマーを有する。好ましい実施形態では、グルコースポリマーの試料またはその稀釈液は、約３７．５ｍｇ／ｍＬの濃度のグルコースポリマーを有する。

他の特定の実施形態では、グルコースポリマーの試料またはその稀釈液は、３．７５％（重量／体積）、好ましくは３％の最大濃度のグルコースポリマーを有する。

たとえば、試料は、３．７５％（重量／体積）、好ましくは３％の濃度のグルコースポリマーを有するように調製され、かつ試料は、本発明に係るアッセイ方法に付され、試料さらには１／１０、１／１００、および１／１０００希釈液がアッセイされる。

好ましくは、グルコースポリマーの試料またはその稀釈液と細胞との接触は、約５〜４８時間、好ましくは１０〜３６時間、より好ましくは１６〜２４時間行われる。

次いで、本方法は、レポーター遺伝子由来のシグナルの測定を含む。

ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞を用いた好ましい実施形態では、シグナルはアルカリホスファターゼの活性の尺度である。好ましくは、酵素反応は、１：３のアッセイ培地対ＳＥＡＰ試薬比（たとえば、５０μＬの培地および１５０μＬのＳＥＡＰ試薬）
を用いて行われる。さらに、少なくとも６０分間の反応時間が好ましい。

最後に、試料中のＰＧＮの量は、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線を用いて決定される。

この曲線は、好ましくは、同一の細胞を用いて、同一の条件で、漸増用量のＰＧＮ、特にＰＧＮ標準を用いて得られる。

ＰＧＮ標準は、細菌起源の任意のＰＧＮである。たとえば、ＰＧＮは、次の微生物、すなわち、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスに由来する。特に、使用される標準は、精製かつ部分消化されたＰＧＮである。そのような標準は、市販されている（大腸菌由来のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｇｎｅｃまたはｔｌｒｌ−ｐｇｎｅｋ、枯草菌由来のカタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｇｎｂ２、黄色ブドウ球菌由来のカタログ番号ｔｌｒｌ−ｐｇｎｓａ）（Ｍ．ルテウス由来のＷａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号１６２−１８１０１）。

ＰＧＮ標準は、好ましくは、活性ＰＧＮに換算した単位で結果を表現するように、ＴＬＲ２のアゴニストである内部標準を用いて較正される。内部標準は、リポペプチド、好ましくは合成品、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩（ここで、Ｐａｍ３（ｃｙｓ）、ＰＡＭ、またはＰａｍは、パルミチン酸を意味する）である（図５参照）。したがって、ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線は、好ましくは、ＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて、標準化または検量される。この内部標準は、好ましくは、合成品であるかまたは明確な構造／組成を有するものである。検量または標準化は、各用量応答曲線の直線部の傾きを比較することにより、かつ検量標準およびＰＧＮ標準を用いて得られた曲線の重畳を可能にする補正率を計算することにより、行われる。

たとえば、検量線は、０．００１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＰＧＮを用いて取得される。

この検量線は、ＰＧＮのみを用いるか、または規定量のＰＧＮが添加されたグルコースポリマーの溶液を用いるかのいずれかにより得られる。特に、使用されるグルコースポリマーの溶液は、３．７５％（重量／体積）、好ましくは３％のグルコースポリマーを含む。

ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応のこの曲線はまた、ＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準を用いて、特に、同一の細胞を用いて、同一の条件で、漸増用量のＴＬＲ２アゴニスト内部標準を用いて、取得可能である。この内部標準は、好ましくは、合成品であるかまたは明確な構造／組成を有するものである。ＰＧＮの場合とまったく同様に、グルコースポリマーの不在下または好ましくは存在下で、取得可能である。

典型的には、検量線は、シグモイド型の細胞応答の古典的な曲線である（図１）。
−（Ａ）部は、ＴＬＲ２の有効活性化を与える濃度未満の低濃度のＰＧＮで得られる応答に対応する。したがって、この非線形ゾーンは、本方法の検出限界に対応する。本方法の変動を含めると、この検出の閾値は、バックグラウンドノイズ（刺激の不在下で得られる反応）の３倍の値であると推定される。
−（Ｂ）部は、線形応答が観測されるので、最も興味深い。有効応答を有するこのゾー
ンにより、細胞応答とＰＧＮレベルとの間の直接的関係を決定することが可能である。したがって、これはアッセイゾーンである。
−（Ｃ）部は、過剰濃度のＰＧＮの存在下での細胞応答の飽和に対応する。実際に、ＴＬＲ２受容体の飽和が存在する。

検量線の直線部が考慮の対象となり、この部分は、ＰＧＮの量がレポーター遺伝子由来のシグナルに正比例するゾーン（Ｂ部）に対応する。

ＰＧＮでかなり汚染されている可能性のある試料の場合、常に線形ゾーン内に位置するように、複数回の段階希釈を行う必要がある。他の場合、低濃度のＰＧＮでは、アッセイの感度を増加させることが望まれるのであれば、試料を濃縮する工程が必要となる。

任意で、本方法は、ＴＬＲ２を発現しない、より一般的には、先天性免疫受容体発現しない対照細胞を用いたアッセイをさらに含む。たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２細胞を使用できる。これは対照系であり、その使用は、グルコースポリマーの試料が、内因性機序による酵素の産生を誘導しないことを検証するのに有用である。

本発明はまた、
−ＴＬＲ２受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞であって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードし、特に、細胞が、好ましくは、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞であり、ネガティブコントロールとして、キットがまた、先天性免疫受容体を発現しない細胞、たとえば、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２細胞を含む組換え細胞と、
−ＰＧＮの量とレポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線、または検量されたＰＧＮ標準、好ましくは、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから、好ましくは、黄色ブドウ球菌から選択される細菌に由来するもの、またはＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準、のいずれかであって、任意で、キットが、両方、すなわち、検量線、さらにはこの検量線の作成に使用したのと同一の微生物に由来する検量されたＰＧＮ標準を含む、いずれかと、
−任意で、使用説明書、試料を前処理するための溶液、レポーター遺伝子の反応を測定するために使用される試薬、マイクロプレートなどと、
を含む、グルコースポリマーの試料においてペプチドグリカン（ＰＧＮ）をアッセイするためのキットに関する。

好ましくは、キットは、ＴＬＲ２のアゴニスト、好ましくはリポペプチド、特にＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩である内部標準をさらに含む。

アッセイは、ＴＬＲ２受容体を発現する系によるＰＧＮの特異的認識と、ＴＬＲ２に関連するシグナル伝達経路の活性化を介して測定可能な酵素活性の生成と、に基づく。

細胞物質
このアッセイに関する実験のために、以下の２つの種が使用される。
−ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞（ＨＥＫ−ＴＬＲ２）：可溶性ＰＧＮに対して強い反応性を有する、ＴＬＲ２リガンドに対する特異的反応。
−ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ２細胞（ＨＥＫ−Ｎｕｌｌ）：試料の細胞毒性に関連する非特異的反応。

供給業者（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の推奨事項に従って細胞を培養する。７５％のコンフルエンスの時に、細胞を０．２８×１０^６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させる。刺激の前に、１８０μＬの細胞懸濁液を培養ウェル（９６ウェルプレート）中に分配する（すなわち、５０，０００細胞／ウェル）。次いで、３７．５％（重量／体積）のグルコースポリマーの試料を２０μＬ添加することにより（すなわち、３．７５％の試料の最終稀釈液）、細胞を２４時間刺激する。２４時間の刺激後、生成された酵素活性を定量することにより、細胞応答を測定する。

１−用量応答曲線の作成
３７．５％（重量／体積）で調製された汚染されていないイコデキストリン溶液中に黄色ブドウ球菌のＰＧＮ標準を異なる量で希釈することにより（図２）、用量応答曲線を作成した（図２）。

結果は、シグモイド型の細胞応答の古典的な曲線である。
−（Ａ）部は、ＴＬＲ２の有効的な活性化を与える濃度未満の低濃度のＰＧＮで得られる応答に対応する。したがって、この非線形ゾーンは、本方法の検出限界に対応する。
−（Ｂ）部は、線形応答が観測されるので、最も興味深い。有効な応答のこのゾーンにより、細胞応答とＰＧＮ量との間の直接的関係を決定することが可能である。したがって、これはアッセイゾーンである。
−（Ｃ）部は、過剰な濃度のＰＧＮの存在下での細胞応答の飽和に対応する。実際、ＴＬＲ２受容体の飽和が存在する。

黄色ブドウ球菌のＰＧＮに対するＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の応答の標準曲線は、０．０７〜１０ｎｇ／ｍＬ（すなわち、２〜２６７ｎｇ／ｇイコデキストリン）の濃度で線形ゾーンを有する。

２−内部標準を用いたＰＧＮの生物学的アッセイの検量線の作成
３７．５％（重量／体積）で調製された汚染されていないマルトデキストリン溶液中に異なる細菌種のＰＧＮを希釈することにより（Ｐ−１１．１１参照）、用量応答曲線を作成した。アッセイされるＰＧＮは、黄色ブドウ球菌（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７７１４０）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号５３２４３）、枯草菌（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、番号ｔｌｒｌ−ｐｇｎｂ２）、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（個人的な調製）から抽出される。

得られた曲線は、細胞物質を用いて行われるアッセイ（バイオアッセイ）で観測される応答の古典的な曲線である（図３）。０．２未満の吸光度は、細胞応答を誘導するには低すぎるＰＧＮ濃度であることの裏付けとなり、一方、２超の値は、ＴＬＲ２受容体の飽和に関連するプラトー効果を示す。したがって、吸光度のこれらの２つの限界値間のゾーンのみが、ＳＥＡＰの産生と試料中に存在するＰＧＮの量との相関を可能にする。

観測された反応は、各種のＰＧＮに関連する細胞応答性の大きな変動を示す。実際に、最大反応の５０％に等しい応答を与える濃度（ＥＣ５０）は、黄色ブドウ球菌および枯草菌のＰＧＮでは約２０ｎｇ／ｍＬ、Ｍ．ルテウスでは１５００ｎｇ／ｍＬ、ならびにＡ．アシドカルダリウスおよび大腸菌Ｋ１２から抽出されたものでは２０００ｎｇ／ｍＬ超である。

しかしながら、ＰＧＮは、その細菌起源に依存して異なる構造を有し、このことが、炎症応答性に大きな変動を生じる原因となるので、これらの差は、予想されるものであった。これらの観測から、ＰＧＮに換算した単位で結果を表現できるように、内部標準を規定
することの重要性が際立つ。

ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の応答を変化させる可能性のある他の因子は、ＰＧＮのサイズであり、これは、その溶解性およびＴＬＲ２に対する応答性に影響を与える。したがって、この高分子の精製のための手順は、抽出条件がＰＧＮのサイズを変化させ、さらには部分分解を引き起こすので、細胞の応答にかなりの影響を及ぼす。この仮説を試験するために、黄色ブドウ球菌から抽出されたＰＧＮの３つの個別のロット、すなわち、２つのＳｉｇｍａロット（カタログ番号７７１４０：ロット１、０００１４４２７７７、ロット２、ＢＣＢＨ７８８６Ｖ）および１つのＩｎｖｉｖｏＧｅｎロット（番号ｔｌｒｌ−ｐｇｎｓａ）を用いて、アッセイを再現した。

結果は、３つのロット間の応答性の変動を示す（図４）。実際に、ＥＣ５０値は、３つのロットにおいて、それぞれ、４、２０、および４００ｎｇ／ｍＬである。これらのデータから、同一の供給業者からロットを入手して、同一の手順によりあらかじめ抽出したとしても、同一の細菌種から抽出されたＰＧＮが、応答性の違いを示す危険性があることが示唆される。したがって、ＰＧＮの変動に関連する誤差を回避して、「活性」ＰＧＮの量として結果を表現するようにすべく、検量線に対して内部標準を導入する必要があるように思われる。

ＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩（ＰＡＭ３（ｃｙｓ）、図５）は、細菌リポペプチドの構造を模倣するトリアシル化合成リポペプチドであり、ＴＬＲ２の強力なアゴニストとして作用する。均質構造であるので、それは、多くの場合、ＴＬＲ２受容体を発現する細胞の応答を検量するためのポジティブコントロールとして使用される。

したがって、我々の試験で、ＰＧＮをＰＡＭ３（ｃｙｓ）に置き換えて実験を再現した。予想どおり、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞は、この化合物に対して強い応答性を示す。さらに、用量応答曲線の形状はＰＧＮの存在下で得られたものに類似しており、ＥＣ５０は、１０ｎｇ／ｍＬと推定された（図６）。これらの結果から、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）は、最も応答性のあるＰＧＮと等価な応答を誘導するが、後者とは対照的に、構造変動を示さないことが示唆される。したがって、ＰＧＮのロットを検量し、標準化された検量線を作成するためにこの合成リポペプチドを使用することが可能であり、これにより、「活性」ＰＧＮの量で、すなわち、同一量のＰＡＭ３（ｃｙｓ）を用いて得られるものに等しいＴＬＲ２応答を与えるＰＧＮの量で、結果を定式化することが可能である。

各用量応答曲線の直線部の傾きを比較し、補正率を計算してＰＧＮの曲線をＰＡＭ３（ｃｙｓ）の曲線に重ね合わせることにより、ＰＧＮの各ロットをＰＡＭ３（ｃｙｓ）に対して較正する。図６に提示された実施例では、補正率は、ロット１、２、および３に対して、それぞれ、０．４、２、および４０と推定された。このことは、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）により誘導されるものと同一の応答を得るためにロット１のＰＧＮでは１／２．５にする必要があり、ロット２のＰＧＮでは２倍におよびロット３のＰＧＮでは４０倍にする必要があることを意味する。ＰＧＮの生の量を補正した後、ＰＡＭ３（ｃｙｓ）を用いて得られたものに重ね合わせることが可能な同一曲線上にすべての点が整列されていることが分かる（図７）。したがって、内部標準を用いて、ＰＧＮのすべてのロットに対する補正濃度を取得し、活性ＰＧＮに対して較正された用量応答曲線を作成することが可能である。

この方法を適用すると、ＨＥＫ−ＴＬＲ２細胞の応答の標準曲線は、０．５〜２００ｎｇ／ｍＬ（図８）または１３〜５４００ｎｇ／ｇのグルコースポリマーの活性ＰＧＮの濃度に対して線形ゾーンを有する。

Claims (8)

1. グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）の量を決定する方法であって、
   ａ）超音波処理、加熱、および／またはアルカリ化により前記グルコースポリマーの試料を処理して前記試料中に含まれるＰＧＮを断片化および分解し、３０〜５０００ｋＤａのサイズを有する可溶性ＰＧＮを生成すること、
   ｂ）前記処理された試料またはその稀釈液を、ＴＬＲ２受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞に接触させることであって、前記レポーター遺伝子が分泌型アルカリホスファターゼであること、
   ｃ）前記レポーター遺伝子由来のシグナルを測定すること、
   ｄ）前記ＰＧＮの量と前記レポーター遺伝子由来のシグナルの強度との間の対応の検量線を用いて、前記試料中のＰＧＮの量を決定すること、
   を含み、
   前記ＰＧＮの量と前記レポーター遺伝子由来のシグナルの強度との対応の検量線が、ＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩を用いて標準化または較正されることを特徴とする、方法。
2. 前記細胞が、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ２細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＰＧＮの量と前記レポーター遺伝子由来のシグナル強度との対応の検量線が、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから選択される細菌に由来するＰＧＮを用いて作成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記方法が、黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、枯草菌、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスから選択される細菌に由来するＰＧＮを用いて、検量線を作成する予備工程を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記方法が、ＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩を用いて前記検量線を作成する予備工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 必要に応じて、前記試料が、前記検量線の直線部に対応する前記レポーター遺伝子由来のシグナルを生成するように希釈されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記試料が、イコデキストリン溶液の試料であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. グルコースポリマーの試料中のペプチドグリカン（ＰＧＮ）の量を決定するためのキットであって、
   −ＴＬＲ２受容体に関連するシグナル伝達経路の直接依存下で外因性ＴＬＲ２受容体（Ｔｏｌｌ様受容体２）とレポーター遺伝子とを発現する組換え細胞であって、前記レポーター遺伝子が、有色タンパク質もしくは蛍光タンパク質または基質を用いてもしくは用いずに活性を測定可能なタンパク質をコードする、組換え細胞と、
   −ＰＧＮ標準と、
   −任意で、使用説明書および前記試料を前処理するための溶液と、
   −ＰＡＭ_３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４三塩酸塩と、
   を含む、キット。