CN102095825B - 超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，用于分析天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性。将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到酶抑制剂筛选中，样品检测快速、准确，线性方程相关系数达到0.998，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，可用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，并且可用于黄嘌呤氧化酶的动力学研究。得到20微摩尔/升浓度别嘌呤醇的抑制率I为80％。得到20微摩尔/升异鼠李素的抑制率为73％。得到20微摩尔/升染料木素的抑制率为50％。得到0.1毫克/毫升银杏水提物的抑制率为27％。
Description
发明领域
本发明属于分析化学领域，涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，具体而言，涉及天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。
技术背景
黄嘌呤氧化酶是生物体内广泛存在的一种黄素蛋白酶，它属于钼蛋白酶家族，是体内核酸代谢途径的关键酶。黄嘌呤氧化酶催化底物黄嘌呤和次黄嘌呤氧化成尿酸，并产生超氧阴离子(O- 2·)和过氧化氢(H2O2)。尿酸浓度过高会导致高尿酸血症，并且随着尿酸在关节处的沉积结晶可引起痛风发作。超氧阴离子自由基则与炎症，癌变和衰老相关。近几年的研究还发现黄嘌呤氧化酶在缺血再灌注组织和血管损伤，炎症疾病和慢性心力衰竭中也起着重要的作用。而作为临床应用的黄嘌呤氧化酶抑制剂药物只有上世纪60年代上市的别嘌呤醇，但是它有很多副作用，应用后病人可有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚至有肝功能损害等副作用。所以寻找黄嘌呤氧化酶抑制剂和研究黄嘌呤氧化酶抑制剂在临床中的应用对于开发新药有着非常重要的意义。
黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选一般使用光谱法，其不足之处在于光谱法易受到背景干扰，可能得到假阳性或假阴性结果(Akihiko Nagao，Michiko Sehi，Hidetaka Kobayashi，Biosci.Biotechnol.Biochem63(1999)1787-1790；ChunmaoLin，Chienshu Chen，Chientsu Chen，Yuchih Liang,and Jenkun Lina，Biochemicaland Biophysical Research Communications294(2002)167-172)；也曾有人为了克服光谱法中的缺点而采用液相色谱法进行黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，但是液相色谱方法所需的样品用量大，耗费的时间长(Akihiko Nagao，Michiko Sehi，Hidetaka Kobayashi，Biosci.Biotechnol.Biochem63(1999)1787-1790)。质谱方法最大的优势在于它的检测本质是基于一个分子的质荷比。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分(Gejing Deng，Gautam Sanyal.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis40(2006)528-538)。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相色谱进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R.de Boer，Thomas Letzel，Danny A.van Elswijk，HenkLingeman,Wilfried M.A.Niessen，and Hubertus Irth.Anal.Chem.2004，76，3155-3161)。
发明内容
本发明的目的是提供超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。本发明可用于分析天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。
本发明所述的天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶的体外抑制是指天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；
本发明所述的黄嘌呤氧化酶催化活性是指在37℃，黄嘌呤氧化酶催化底物生成尿酸的量，也可以用底物黄嘌呤减少的量来表示。
本发明包括以下内容：以黄嘌呤为底物，黄嘌呤氧化酶在37℃催化底物生成尿酸，用超高效液相色谱和质谱联用对黄嘌呤进行定量，通过计算底物黄嘌呤含量的变化得到黄嘌呤氧化酶的活性，进一步计算出黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率。
本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：
所述的超高效液相色谱，与高效液相色谱相比具有超高分离度，超高速度和超高灵敏度；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体；本发明优选别嘌呤醇、异鼠李素、染料木素或银杏水提物；
(1)酶促反应缓冲液的配制
酶促反应缓冲液包括50毫摩尔／升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔／升盐酸，1毫摩尔／升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；
(2)标准品的配制
用2摩尔／升的氨水溶液将标准品分别配成浓度为1微摩尔／升、2微摩尔／升、5微摩尔／升、10微摩尔／升、15微摩尔／升或20微摩尔／升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔／升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为黄嘌呤；黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶的底物；
(3)对照品、空白样品和样品的酶促反应
对照品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
空白样品的配制：反应总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
样品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的黄嘌呤氧化酶抑制剂于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测
对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取黄嘌呤和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以黄嘌呤与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔／升至20微摩尔／升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到黄嘌呤的线性方程：
y=ax+b
式中，y为所述的标准品黄嘌呤与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔／升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2；
①超高效液相色谱的检测条件
超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50毫米，1.7微米)；
流动相：甲醇(A)和水(B)；
梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；
流速：0.2毫升／分钟；
进样量：5微升；
②质谱条件
质谱仪：Waters Xevo TQ；
离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；
毛细管电压：2000伏特；
去溶剂气氮气温度：350摄氏度；
去溶剂气氮气流速：800升／小时；
锥孔气氮气流速：50升／小时；
碰撞气氩气流速：0.15升／小时；
第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；
第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5；
以上所述质谱条件在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；
锥孔电压在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测黄嘌呤时锥孔电压是28伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；
碎裂能量和选择的碎片离子在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测黄嘌呤时碎裂能量是20J，碎片离子是107.98；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30J，碎片离子是124.08；
对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；
(5)黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率
黄嘌呤氧化酶抑制剂天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；所以抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率可以通过底物黄嘌呤含量或者产物尿酸含量的变化进行评价；本发明是利用底物黄嘌呤含量的变化进行计算的；
分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品、空白样品和样品中黄嘌呤浓度，黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式计算：
I样品=(C样品-C对照)／(C空白-C对照)×100％
式中，I样品为黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率；
C样品为根据线性方程求得的样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升；
C对照为根据线性方程求得的对照品中黄嘌呤的浓度，量纲为微摩尔／升；
C空白为根据线性方程求得的空白样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升。
有益效果：本发明提供了超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体。本发明用超高效液相色谱和质谱联用的方法，用于分析天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性。本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到酶抑制剂筛选中，样品检测快速、准确，线性方程相关系数高于0.998，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，可用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，并且可用于黄嘌呤氧化酶的动力学研究。
附图说明
图1为实施例1中10微摩尔／升的标准品黄嘌呤(峰1)和1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠(峰2)的多反应检测负离子模式的总离子流色谱图，信号强度为1.41×105。
图2为实施例1中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.10×105。
图3为实施例1中10微摩尔／升的标准品黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为1.41×105。
图4为实施例1中不同浓度黄嘌呤标准品的标准曲线及线性公式。
图5为实施例1中对照品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.01×105。
图6为实施例1中对照品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为7.84×103。
图7为实施例1中空白样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.03×105。
图8为实施例1中空白样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为1.20×106。
图9为实施例1中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.05×105。
图10为实施例1中样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为7.82×105。
图11为实施例2中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.04×105。
图12为实施例2中样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为7.76×105。
图13为实施例3中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.22×105。
图14为实施例3中样品黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为4.84×105。
图15为实施例4中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.16×105。
图16为实施例4中样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为1.12×105。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例来描述发明。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
实施例1
本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：
(1)酶促反应缓冲液的配制
酶促反应缓冲液包括50毫摩尔／升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔／升盐酸，1毫摩尔／升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；
(2)标准品的配制
用2摩尔／升的氨水溶液将标准品分别配成浓度为1微摩尔／升、2微摩尔／升、5微摩尔／升、10微摩尔／升、15微摩尔／升或20微摩尔／升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔／升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为黄嘌呤；黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶的底物；
(3)对照品、空白样品和样品的酶促反应
对照品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
空白样品的配制：反应总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
样品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测
对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取黄嘌呤和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以黄嘌呤与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔／升至20微摩尔／升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到黄嘌呤的线性方程：
y=ax+b
式中，y为所述的标准品A黄嘌呤与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔／升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2；
①超高效液相色谱的检测条件
超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50毫米，1.7微米)；
流动相：甲醇(A)和水(B)；
梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；
流速：0.2毫升／分钟；
进样量：5微升；
②质谱条件
质谱仪：Waters Xevo TQ；
离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；
毛细管电压：2000伏特；
去溶剂气氮气温度：350摄氏度；
去溶剂气氮气流速：800升／小时；
锥孔气氮气流速：50升／小时；
碰撞气氩气流速：0.15升／小时；
第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；
第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5；
以上所述质谱条件在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；
锥孔电压在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测黄嘌呤时锥孔电压是28伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；
碎裂能量和碎片离子在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测黄嘌呤时碎裂能量是20J，碎片离子是107.98；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30J，碎片离子是124.08；
对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；
(5)数据处理
分别根据对对照品，空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品，空白样品和样品中黄嘌呤浓度，黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式计算：
I样品=(C样品-C对照)／(C空白-C对照)×100％
式中，I样品为黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率；
C样品为根据线性方程求得的样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升；
C对照为根据线性方程求得的对照品中黄嘌呤的浓度，量纲为微摩尔／升；
C空白为根据线性方程求得的空白样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升。
经计算得到20微摩尔／升别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶的抑制率I为80％。结果参见图1到图10。
实施例2
所述的样品如下：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的异鼠李素于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
其余的同实施例1；
按照实施例1的检测步骤检测并计算得到20微摩尔／升异鼠李素标准品对黄嘌呤氧化酶的抑制率为73％。图11和图12为实施例2中样品的提取色谱图。
实施例3
所述的样品如下：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的染料木素于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
其余的同实施例1；
按照实施例1的检测步骤检测并计算得到20微摩尔／升染料木素标准品对黄嘌呤氧化酶的抑制率为50％。图13和图14为实施例3中样品的提取色谱图。
实施例4
所述的样品如下：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为0.1毫克／毫升的银杏水提物于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
其余的同实施例1；
按照实施例1的检测步骤检测并计算得到0.1毫克／毫升的银杏水提物对黄嘌呤氧化酶的抑制率为27％。图15和图16为实施例4中样品的提取色谱图。
Claims (5)
1.超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：
所述的超高效液相色谱，与高效液相色谱相比具有超高分离度，超高速度和超高灵敏度；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体；
(1)酶促反应缓冲液的配制
酶促反应缓冲液包括50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔/升盐酸，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；
(2)标准品的配制
用2摩尔/升的氨水溶液将标准品分别配成浓度为1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、15微摩尔/升和20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为黄嘌呤；黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶的底物；
(3)对照品、空白样品和样品的酶促反应
对照品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
空白样品的配制：反应总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
样品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔/升的黄嘌呤氧化酶抑制剂于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测
对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取黄嘌呤和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以黄嘌呤与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔/升至20微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到黄嘌呤的线性方程：
y＝ax+b
式中，y为所述的标准品黄嘌呤与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2；
①超高效液相色谱的检测条件
超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，规格为2.1×50毫米，1.7微米；
流动相：A为甲醇，B为水；
梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；
流速：0.2毫升/分钟；
进样量：5微升；
②质谱条件
质谱仪：Waters Xevo TQ；
离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；
毛细管电压：2000伏特；
去溶剂气氮气温度：350摄氏度；
去溶剂气氮气流速：800升/小时；
锥孔气氮气流速：50升/小时；
碰撞气氩气流速：0.15升/小时；
第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；
第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5；
以上所述质谱条件在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；
锥孔电压在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测黄嘌呤时锥孔电压是28伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；
碎裂能量和选择的碎片离子在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测黄嘌呤时碎裂能量是20J，碎片离子是107.98；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30J，碎片离子是124.08；
对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；
(5)黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率
黄嘌呤氧化酶抑制剂天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；所以抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率可以通过底物黄嘌呤含量或者产物尿酸含量的变化进行评价；
分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品、空白样品和样品中黄嘌呤浓度，利用底物黄嘌呤含量的变化进行计算，黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式计算：
I样品＝(C样品-C对照)/(C空白-C对照)×100％
式中，I样品为黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率；
C样品为根据线性方程求得的样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔/升；
C对照为根据线性方程求得的对照品中黄嘌呤的浓度，量纲为微摩尔/升；
C空白为根据线性方程求得的空白样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔/升。
2.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是别嘌呤醇。
3.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是异鼠李素。
4.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是染料木素。
5.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是银杏水提物。
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