CN102095825B - 超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法 - Google Patents
超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102095825B CN102095825B CN201010577534.2A CN201010577534A CN102095825B CN 102095825 B CN102095825 B CN 102095825B CN 201010577534 A CN201010577534 A CN 201010577534A CN 102095825 B CN102095825 B CN 102095825B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xanthine
- xanthine oxidase
- sample
- liquid chromatography
- performance liquid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000003064 xanthine oxidase inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 229940123769 Xanthine oxidase inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 claims abstract description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 11
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 claims abstract description 6
- GQODBWLKUWYOFX-UHFFFAOYSA-N Isorhamnetin Natural products C1=C(O)C(C)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 GQODBWLKUWYOFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229940045109 genistein Drugs 0.000 claims abstract description 5
- TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N genistein Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=COC2=CC(O)=CC(O)=C2C1=O TZBJGXHYKVUXJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 235000006539 genistein Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N genistein 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C2C(=O)C(C=3C=CC(O)=CC=3)=COC2=C1 ZCOLJUOHXJRHDI-CMWLGVBASA-N 0.000 claims abstract description 5
- IZQSVPBOUDKVDZ-UHFFFAOYSA-N isorhamnetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 IZQSVPBOUDKVDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 235000008800 isorhamnetin Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 152
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 80
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 claims description 76
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 53
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 28
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 26
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 claims description 25
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 13
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 10
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 claims description 10
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 9
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000003643 water by type Substances 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 claims 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 claims 1
- 239000004047 hole gas Substances 0.000 claims 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 claims 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 16
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 abstract description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 abstract description 4
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 abstract description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000001946 ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 2
- 244000194101 Ginkgo biloba Species 0.000 abstract 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 abstract 1
- BHTRKEVKTKCXOH-LBSADWJPSA-N tauroursodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 BHTRKEVKTKCXOH-LBSADWJPSA-N 0.000 description 37
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 31
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 235000011201 Ginkgo Nutrition 0.000 description 2
- 241000218628 Ginkgo Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 1
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明提供了一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，用于分析天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性。将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到酶抑制剂筛选中，样品检测快速、准确，线性方程相关系数达到0.998，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，可用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，并且可用于黄嘌呤氧化酶的动力学研究。得到20微摩尔/升浓度别嘌呤醇的抑制率I为80％。得到20微摩尔/升异鼠李素的抑制率为73％。得到20微摩尔/升染料木素的抑制率为50％。得到0.1毫克/毫升银杏水提物的抑制率为27％。
Description
发明领域
本发明属于分析化学领域，涉及超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，具体而言，涉及天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。
技术背景
黄嘌呤氧化酶是生物体内广泛存在的一种黄素蛋白酶，它属于钼蛋白酶家族，是体内核酸代谢途径的关键酶。黄嘌呤氧化酶催化底物黄嘌呤和次黄嘌呤氧化成尿酸，并产生超氧阴离子(O- 2·)和过氧化氢(H2O2)。尿酸浓度过高会导致高尿酸血症，并且随着尿酸在关节处的沉积结晶可引起痛风发作。超氧阴离子自由基则与炎症，癌变和衰老相关。近几年的研究还发现黄嘌呤氧化酶在缺血再灌注组织和血管损伤，炎症疾病和慢性心力衰竭中也起着重要的作用。而作为临床应用的黄嘌呤氧化酶抑制剂药物只有上世纪60年代上市的别嘌呤醇，但是它有很多副作用，应用后病人可有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚至有肝功能损害等副作用。所以寻找黄嘌呤氧化酶抑制剂和研究黄嘌呤氧化酶抑制剂在临床中的应用对于开发新药有着非常重要的意义。
黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选一般使用光谱法，其不足之处在于光谱法易受到背景干扰，可能得到假阳性或假阴性结果(Akihiko Nagao，Michiko Sehi，Hidetaka Kobayashi，Biosci.Biotechnol.Biochem63(1999)1787-1790；ChunmaoLin，Chienshu Chen，Chientsu Chen，Yuchih Liang,and Jenkun Lina，Biochemicaland Biophysical Research Communications294(2002)167-172)；也曾有人为了克服光谱法中的缺点而采用液相色谱法进行黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，但是液相色谱方法所需的样品用量大，耗费的时间长(Akihiko Nagao，Michiko Sehi，Hidetaka Kobayashi，Biosci.Biotechnol.Biochem63(1999)1787-1790)。质谱方法最大的优势在于它的检测本质是基于一个分子的质荷比。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分(Gejing Deng，Gautam Sanyal.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis40(2006)528-538)。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相色谱进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R.de Boer，Thomas Letzel，Danny A.van Elswijk，HenkLingeman,Wilfried M.A.Niessen，and Hubertus Irth.Anal.Chem.2004，76，3155-3161)。
发明内容
本发明的目的是提供超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。本发明可用于分析天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性的超高效液相色谱和质谱联用的方法。
本发明所述的天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶的体外抑制是指天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；
本发明所述的黄嘌呤氧化酶催化活性是指在37℃，黄嘌呤氧化酶催化底物生成尿酸的量，也可以用底物黄嘌呤减少的量来表示。
本发明包括以下内容：以黄嘌呤为底物，黄嘌呤氧化酶在37℃催化底物生成尿酸，用超高效液相色谱和质谱联用对黄嘌呤进行定量，通过计算底物黄嘌呤含量的变化得到黄嘌呤氧化酶的活性，进一步计算出黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率。
本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：
所述的超高效液相色谱，与高效液相色谱相比具有超高分离度，超高速度和超高灵敏度；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体；本发明优选别嘌呤醇、异鼠李素、染料木素或银杏水提物；
(1)酶促反应缓冲液的配制
酶促反应缓冲液包括50毫摩尔／升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔／升盐酸，1毫摩尔／升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；
(2)标准品的配制
用2摩尔／升的氨水溶液将标准品分别配成浓度为1微摩尔／升、2微摩尔／升、5微摩尔／升、10微摩尔／升、15微摩尔／升或20微摩尔／升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔／升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为黄嘌呤；黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶的底物；
(3)对照品、空白样品和样品的酶促反应
对照品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
空白样品的配制：反应总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
样品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的黄嘌呤氧化酶抑制剂于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测
对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取黄嘌呤和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以黄嘌呤与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔／升至20微摩尔／升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到黄嘌呤的线性方程：
y=ax+b
式中，y为所述的标准品黄嘌呤与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔／升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2；
①超高效液相色谱的检测条件
超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50毫米，1.7微米)；
流动相：甲醇(A)和水(B)；
梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；
流速：0.2毫升／分钟；
进样量：5微升；
②质谱条件
质谱仪：Waters Xevo TQ；
离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；
毛细管电压：2000伏特；
去溶剂气氮气温度：350摄氏度；
去溶剂气氮气流速：800升／小时；
锥孔气氮气流速：50升／小时；
碰撞气氩气流速：0.15升／小时；
第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；
第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5；
以上所述质谱条件在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；
锥孔电压在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测黄嘌呤时锥孔电压是28伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；
碎裂能量和选择的碎片离子在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测黄嘌呤时碎裂能量是20J，碎片离子是107.98；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30J，碎片离子是124.08；
对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；
(5)黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率
黄嘌呤氧化酶抑制剂天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；所以抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率可以通过底物黄嘌呤含量或者产物尿酸含量的变化进行评价；本发明是利用底物黄嘌呤含量的变化进行计算的；
分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品、空白样品和样品中黄嘌呤浓度，黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式计算：
I样品=(C样品-C对照)／(C空白-C对照)×100％
式中，I样品为黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率；
C样品为根据线性方程求得的样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升；
C对照为根据线性方程求得的对照品中黄嘌呤的浓度，量纲为微摩尔／升；
C空白为根据线性方程求得的空白样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升。
有益效果：本发明提供了超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体。本发明用超高效液相色谱和质谱联用的方法，用于分析天然产物提取物或单体对黄嘌呤氧化酶体外抑制率以及黄嘌呤氧化酶催化活性。本发明将超高效液相色谱和质谱联用方法应用到酶抑制剂筛选中，样品检测快速、准确，线性方程相关系数高于0.998，质谱针对化合物质量电荷比进行检测，精确度高，特异性好，避免了光谱法筛选中的假阳性和假阴性结果，可用于黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选，并且可用于黄嘌呤氧化酶的动力学研究。
附图说明
图1为实施例1中10微摩尔／升的标准品黄嘌呤(峰1)和1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠(峰2)的多反应检测负离子模式的总离子流色谱图，信号强度为1.41×105。
图2为实施例1中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.10×105。
图3为实施例1中10微摩尔／升的标准品黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为1.41×105。
图4为实施例1中不同浓度黄嘌呤标准品的标准曲线及线性公式。
图5为实施例1中对照品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.01×105。
图6为实施例1中对照品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为7.84×103。
图7为实施例1中空白样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.03×105。
图8为实施例1中空白样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为1.20×106。
图9为实施例1中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.05×105。
图10为实施例1中样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为7.82×105。
图11为实施例2中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.04×105。
图12为实施例2中样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为7.76×105。
图13为实施例3中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.22×105。
图14为实施例3中样品黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为4.84×105。
图15为实施例4中样品中1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子498.08和碎片离子124.08，信号强度为1.16×105。
图16为实施例4中样品中黄嘌呤的多反应检测负离子模式的提取色谱图，提取所用离子对为母离子150.85和碎片离子107.98，信号强度为1.12×105。
具体实施方式
以下将通过具体的实施例来描述发明。另外，实施例中所使用的材料除有特别说明外，均可通过商业途径从市场上购买。
实施例1
本发明提供的超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：
(1)酶促反应缓冲液的配制
酶促反应缓冲液包括50毫摩尔／升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔／升盐酸，1毫摩尔／升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；
(2)标准品的配制
用2摩尔／升的氨水溶液将标准品分别配成浓度为1微摩尔／升、2微摩尔／升、5微摩尔／升、10微摩尔／升、15微摩尔／升或20微摩尔／升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔／升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为黄嘌呤；黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶的底物；
(3)对照品、空白样品和样品的酶促反应
对照品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
空白样品的配制：反应总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
样品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测
对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取黄嘌呤和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以黄嘌呤与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔／升至20微摩尔／升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到黄嘌呤的线性方程：
y=ax+b
式中，y为所述的标准品A黄嘌呤与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔／升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2；
①超高效液相色谱的检测条件
超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50毫米，1.7微米)；
流动相：甲醇(A)和水(B)；
梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；
流速：0.2毫升／分钟；
进样量：5微升；
②质谱条件
质谱仪：Waters Xevo TQ；
离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；
毛细管电压：2000伏特；
去溶剂气氮气温度：350摄氏度；
去溶剂气氮气流速：800升／小时；
锥孔气氮气流速：50升／小时；
碰撞气氩气流速：0.15升／小时；
第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；
第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5；
以上所述质谱条件在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；
锥孔电压在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测黄嘌呤时锥孔电压是28伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；
碎裂能量和碎片离子在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测黄嘌呤时碎裂能量是20J，碎片离子是107.98；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30J，碎片离子是124.08；
对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；
(5)数据处理
分别根据对对照品，空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品，空白样品和样品中黄嘌呤浓度，黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式计算：
I样品=(C样品-C对照)／(C空白-C对照)×100％
式中，I样品为黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率；
C样品为根据线性方程求得的样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升；
C对照为根据线性方程求得的对照品中黄嘌呤的浓度，量纲为微摩尔／升；
C空白为根据线性方程求得的空白样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔／升。
经计算得到20微摩尔／升别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶的抑制率I为80％。结果参见图1到图10。
实施例2
所述的样品如下：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的异鼠李素于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
其余的同实施例1；
按照实施例1的检测步骤检测并计算得到20微摩尔／升异鼠李素标准品对黄嘌呤氧化酶的抑制率为73％。图11和图12为实施例2中样品的提取色谱图。
实施例3
所述的样品如下：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔／升的染料木素于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
其余的同实施例1；
按照实施例1的检测步骤检测并计算得到20微摩尔／升染料木素标准品对黄嘌呤氧化酶的抑制率为50％。图13和图14为实施例3中样品的提取色谱图。
实施例4
所述的样品如下：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔／升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为0.1毫克／毫升的银杏水提物于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔／升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔／升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
其余的同实施例1；
按照实施例1的检测步骤检测并计算得到0.1毫克／毫升的银杏水提物对黄嘌呤氧化酶的抑制率为27％。图15和图16为实施例4中样品的提取色谱图。
Claims (5)
1.超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其包括以下步骤：
所述的超高效液相色谱，与高效液相色谱相比具有超高分离度，超高速度和超高灵敏度；
所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是天然产物提取物或单体；
(1)酶促反应缓冲液的配制
酶促反应缓冲液包括50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，7毫摩尔/升盐酸，1毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，pH值为8.9；
(2)标准品的配制
用2摩尔/升的氨水溶液将标准品分别配成浓度为1微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、15微摩尔/升和20微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含1微摩尔/升的牛磺熊去氧胆酸钠作为内标；所述的标准品为黄嘌呤；黄嘌呤是黄嘌呤氧化酶的底物；
(3)对照品、空白样品和样品的酶促反应
对照品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶，在37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为对照品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
空白样品的配制：反应总体积200微升，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为空白样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
样品的配制：反应总体积200微升，终浓度100纳摩尔/升的黄嘌呤氧化酶与终浓度为20微摩尔/升的黄嘌呤氧化酶抑制剂于37℃孵育30分钟，加入终浓度100微摩尔/升的底物黄嘌呤，37℃反应5分钟后，加入800微升的甲醇终止反应，加入终浓度为1微摩尔/升的内标牛磺熊去氧胆酸钠，作为样品；供超高效液相色谱和质谱联用测定；
(4)标准品、对照品、空白样品和样品的检测
对标准品检测：采用牛磺熊去氧胆酸钠为内标，以内标法定量，对步骤(2)的系列标准品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取黄嘌呤和牛磺熊去氧胆酸钠的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以黄嘌呤与牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为1微摩尔/升至20微摩尔/升范围内，用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到黄嘌呤的线性方程：
y＝ax+b
式中，y为所述的标准品黄嘌呤与内标牛磺熊去氧胆酸钠峰面积比值；x为标准品的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为软件计算得到的常数；同时该软件计算得到相关系数R2；
①超高效液相色谱的检测条件
超高效液相色谱仪：Waters ACQUITY；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，规格为2.1×50毫米，1.7微米；
流动相：A为甲醇，B为水；
梯度洗脱程序：0～1分钟，20％A～60％A；1～2分钟，60％A～100％A；2～3分钟，100％A～20％A；3～5分钟，20％A；所指的百分比均为体积百分比；
流速：0.2毫升/分钟；
进样量：5微升；
②质谱条件
质谱仪：Waters Xevo TQ；
离子源：电喷雾(ESI)电离源负离子模式；
毛细管电压：2000伏特；
去溶剂气氮气温度：350摄氏度；
去溶剂气氮气流速：800升/小时；
锥孔气氮气流速：50升/小时；
碰撞气氩气流速：0.15升/小时；
第一个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为15.0；离子能量为：0.5；
第二个四极杆的低端分辨率为：3.0；高端分辨率为13.5；离子能量为：0.5；
以上所述质谱条件在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是相同的；
锥孔电压在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时是不同的：检测黄嘌呤时锥孔电压是28伏特；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时锥孔电压是30伏特；
碎裂能量和选择的碎片离子在检测黄嘌呤和内标牛磺熊去氧胆酸钠时也是不同的：检测黄嘌呤时碎裂能量是20J，碎片离子是107.98；检测内标牛磺熊去氧胆酸钠时碎裂能量是30J，碎片离子是124.08；
对照品，空白样品和样品检测均按上述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测；
(5)黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率
黄嘌呤氧化酶抑制剂天然产物提取物或单体抑制黄嘌呤氧化酶的活性从而导致酶促反应底物黄嘌呤的剩余量增加，产物尿酸的量减少；所以抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率可以通过底物黄嘌呤含量或者产物尿酸含量的变化进行评价；
分别根据对对照品、空白样品和样品测得的峰面积比值在线性方程中求得对照品、空白样品和样品中黄嘌呤浓度，利用底物黄嘌呤含量的变化进行计算，黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率按照以下公式计算：
I样品＝(C样品-C对照)/(C空白-C对照)×100％
式中，I样品为黄嘌呤氧化酶抑制剂对黄嘌呤氧化酶的抑制率；
C样品为根据线性方程求得的样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔/升；
C对照为根据线性方程求得的对照品中黄嘌呤的浓度，量纲为微摩尔/升；
C空白为根据线性方程求得的空白样品中黄嘌呤浓度，量纲为微摩尔/升。
2.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是别嘌呤醇。
3.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是异鼠李素。
4.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是染料木素。
5.如权利要求1所述的一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的黄嘌呤氧化酶抑制剂是银杏水提物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010577534.2A CN102095825B (zh) | 2010-12-08 | 2010-12-08 | 超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201010577534.2A CN102095825B (zh) | 2010-12-08 | 2010-12-08 | 超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102095825A CN102095825A (zh) | 2011-06-15 |
| CN102095825B true CN102095825B (zh) | 2014-07-23 |
Family
ID=44129005
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201010577534.2A Active CN102095825B (zh) | 2010-12-08 | 2010-12-08 | 超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102095825B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102796805B (zh) * | 2012-08-10 | 2013-11-27 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 筛选细胞周期素依赖性激酶5抑制剂的方法 |
| CN102830185B (zh) * | 2012-08-29 | 2013-12-11 | 北京民海生物科技有限公司 | 一种肺炎链球菌多糖溶液中脱氧胆酸钠的测定方法 |
| CN103558306B (zh) * | 2013-10-31 | 2015-08-19 | 中南大学 | 一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法 |
| CN106814153B (zh) * | 2017-01-16 | 2020-06-16 | 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司 | 基于凝血酶和凝血因子的双靶点抗凝活性物质的液相色谱-质谱筛选方法 |
| CN113447579A (zh) * | 2021-05-25 | 2021-09-28 | 中国农业科学院茶叶研究所 | 一种茶叶黄嘌呤氧化酶拮抗剂高通量筛选方法 |
| CN113304139B (zh) * | 2021-06-30 | 2022-04-29 | 贵州医科大学 | Viniferifuran在制备黄嘌呤氧化酶抑制药物中的应用 |
| CN113304140A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-08-27 | 贵州医科大学 | Caraphenol A在制备黄嘌呤氧化酶抑制药物中的应用 |
| CN113304138B (zh) * | 2021-06-30 | 2022-04-29 | 贵州医科大学 | Vitisinol D在制备黄嘌呤氧化酶抑制药物中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002121145A (ja) * | 2000-10-16 | 2002-04-23 | Fancl Corp | キサンチンオキシダーゼ阻害剤 |
| CN1615299A (zh) * | 2001-11-16 | 2005-05-11 | 日本化学医药株式会社 | 黄嘌呤氧化酶抑制剂 |
| JP2005350375A (ja) * | 2004-06-09 | 2005-12-22 | Kikkoman Corp | 血中尿酸値低下剤 |
-
2010
- 2010-12-08 CN CN201010577534.2A patent/CN102095825B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002121145A (ja) * | 2000-10-16 | 2002-04-23 | Fancl Corp | キサンチンオキシダーゼ阻害剤 |
| CN1615299A (zh) * | 2001-11-16 | 2005-05-11 | 日本化学医药株式会社 | 黄嘌呤氧化酶抑制剂 |
| JP2005350375A (ja) * | 2004-06-09 | 2005-12-22 | Kikkoman Corp | 血中尿酸値低下剤 |
Non-Patent Citations (14)
| Title |
|---|
| Akihiko NAGAO et al..Inhibition of Xanthine Oxidase by Flavonoids.《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》.1999,第63卷(第10期),1787-1790. |
| Arjen R.de Boer et al..On-Line Coupling of High-Performance Liquid Chromatography to a Continuous-Flow Enzyme Assay Based on Electrospray Ionization Mass Spectrometry.《Anal. Chem.》.2004,第76卷(第11期),3155-3161. |
| Gerald J. Putterman et al..Simultaneous analysis of substrates, products, and inhibitors of xanthine oxidase by high-pressure liquid chromatography and gas chromatography.《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》.1979,第98卷(第1期),18-26. |
| HPLC法测定海马中次黄嘌呤、黄嘌呤的含量;赵晓莉等;《中药材》;20021031;第25卷(第10期);716-717 * |
| Inhibition of Xanthine Oxidase by Flavonoids;Akihiko NAGAO et al.;《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》;19991031;第63卷(第10期);1787-1790 * |
| On-Line Coupling of High-Performance Liquid Chromatography to a Continuous-Flow Enzyme Assay Based on Electrospray Ionization Mass Spectrometry;Arjen R.de Boer et al.;《Anal. Chem.》;20040601;第76卷(第11期);3155-3161 * |
| Patrick L.Owen et al..Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern North American plant remedies used for gout.《Journal of Ethnopharmacology》.1999,第64卷(第2期),149-160. |
| Simultaneous analysis of substrates, products, and inhibitors of xanthine oxidase by high-pressure liquid chromatography and gas chromatography;Gerald J. Putterman et al.;《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》;19790915;第98卷(第1期);18-26 * |
| Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern North American plant remedies used for gout;Patrick L.Owen et al.;《Journal of Ethnopharmacology》;19990201;第64卷(第2期);149-160 * |
| 中药提取物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选;黎莉等;《武汉工程大学学报》;20100315;第32卷(第3期);44-46 * |
| 朱深银等.黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用.《中国药学杂志》.2007,第42卷(第3期),187-190. |
| 赵晓莉等.HPLC法测定海马中次黄嘌呤、黄嘌呤的含量.《中药材》.2002,第25卷(第10期),716-717. |
| 黄嘌呤氧化酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用;朱深银等;《中国药学杂志》;20070208;第42卷(第3期);187-190 * |
| 黎莉等.中药提取物中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选.《武汉工程大学学报》.2010,第32卷(第3期),44-46. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102095825A (zh) | 2011-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102095825B (zh) | 超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法 | |
| Wu et al. | Detection of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) as a biomarker of oxidative damage in peripheral leukocyte DNA by UHPLC–MS/MS | |
| Guo et al. | A novel malic acid-enhanced method for the analysis of 5-methyl-2′-deoxycytidine, 5-hydroxymethyl-2′-deoxycytidine, 5-methylcytidine and 5-hydroxymethylcytidine in human urine using hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
| Zhang et al. | Liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of olanzapine, risperidone, 9‐hydroxyrisperidone, clozapine, haloperidol and ziprasidone in rat plasma | |
| Kanaly et al. | Application of the adductome approach to assess intertissue DNA damage variations in human lung and esophagus | |
| WO2010105112A1 (en) | Detection of short-chain fatty acids in biological samples | |
| Wang et al. | Quantification of folate metabolites in serum using ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
| Cadet et al. | Measurement of oxidatively generated base damage to nucleic acids in cells: facts and artifacts | |
| CN113341012B (zh) | 一种同时检测同型半胱氨酸代谢通路上多种代谢物的方法、试剂盒及其应用 | |
| Cho et al. | Direct determination of nucleosides in the urine of patients with breast cancer using column‐switching liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
| Sabatini et al. | A method for routine quantitation of urinary 8‐hydroxy‐2′‐deoxyguanosine based on solid‐phase extraction and micro‐high‐performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry | |
| Allegri et al. | Determination of six pterins in urine by LC–MS/MS | |
| Tomšíková et al. | Determination of pteridines in biological samples with an emphasis on their stability | |
| Yang et al. | Rapid assay of neopterin and biopterin in urine by wooden-tip electrospray ionization mass spectrometry | |
| Rodríguez-Gonzalo et al. | Development, validation and application of a fast analytical methodology for the simultaneous determination of DNA-and RNA-derived urinary nucleosides by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry | |
| Jones et al. | HPLC analysis of asymmetric dimethylarginine, symmetric dimethylarginine, homoarginine and arginine in small plasma volumes using a Gemini-NX column at high pH | |
| WO2010075044A1 (en) | Mass spectrometry assay for thiopurine-s-methyl transferase activity and products generated thereby | |
| CN108072712A (zh) | 一种sd大鼠血浆中新化合物wsj-557的血药浓度定量分析方法 | |
| Martens-Lobenhoffer et al. | Fast and precise quantification of L-homoarginine in human plasma by HILIC-isotope dilution-MS–MS | |
| CN102128884B (zh) | 超高效液相色谱和质谱联用筛选超氧阴离子清除剂的方法 | |
| Wang et al. | Simultaneous quantification of 11 pivotal metabolites in neural tube defects by HPLC–electrospray tandem mass spectrometry | |
| Swann et al. | Determination of amino acids and amines in mammalian decomposition fluid by direct injection liquid chromatography-electrospray ionisation-tandem mass spectrometry | |
| CN103822981B (zh) | 一种液质联用测定内源性氨基酸门冬酰胺和谷氨酰胺浓度的方法 | |
| Hu et al. | Comprehensive analysis of the formation and stability of peroxynitrite-derived 8-nitroguanine by LC-MS/MS: Strategy for the quantitative analysis of cellular 8-nitroguanine | |
| Yang et al. | An improved LC–MS/MS method for determination of docetaxel and its application to population pharmacokinetic study in Chinese cancer patients |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |