CN103558306B

CN103558306B - 一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法

Info

Publication number: CN103558306B
Application number: CN201310529115.5A
Authority: CN
Inventors: 陈晓青; 刘亮亮; 施树云
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2033-10-31
Also published as: CN103558306A

Abstract

本发明公开了一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法。利用受体-配体亲和反应原理，将中草药样品与黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子混合孵育，使中草药样品中活性成分的混合物与黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子混合，得到活性成分与酶负载的磁性纳米粒子复合物。通过外界磁场作用进行磁分离，将复合物采用甲醇-水的混合溶液脱附，收集脱附液，运用液相色谱-质谱联用技术对得到的活性成分进行分离和鉴定。该方法避免了传统筛选方法筛选时间较长且有机溶剂消耗大的问题，其操作简便、迅速、酶负载的磁性纳米粒子复合物可重复使用，适于快速筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂，为寻找高活性的新型抗痛风药物奠定基础。

Description

一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法

技术领域

本发明属于中药成分筛选领域，涉及一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法。

背景技术

痛风是由于嘌呤代谢紊乱导致血尿酸水平增高，或尿酸排泄减少而导致尿酸盐在组织沉积的疾病，为临床难治性疾病之一。其临床特点是高尿酸血症，尿酸盐沉积所导致反复发作的急、慢性关节炎和软组织损伤，尿酸性肾结石所致的痛风性肾病。痛风是一种非常古老的疾病，七千多年前出土的埃及木乃尹上就已发现尿酸盐性肾结石。并且随着现代经济发展，人们生活水平的提高以及生活方式的改变，蛋白类食品成倍增加，痛风及高尿酸血症的患病率在全球范围内呈上升趋势。我国痛风发病形势尤其严峻，以增长速度快、患者绝对数量庞大为特点，己有趋势成为拥有世界上最多痛风病患者的国家。

高尿酸血症是痛风的生化标志。尿酸的产生与排出之间的平衡关系决定了尿酸在细胞外液的浓度。尿酸生成量超过其排泄，就会产生尿酸累积，进而出现血尿酸增高。在人体内尿酸的生成过程中黄嘌呤氧化酶起着非常重要的作用。通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，可降低体内的尿酸生成量，从而缓解高尿酸血症而减少痛风的发生。并且，黄嘌呤氧化酶在催化反应过程中，还会产生大量的自由基，对人体造成更广泛的损害。为了减少人体内尿酸及自由基的形成，可通过抑制剂对黄嘌呤氧化酶的活力进行抑制来实现。目前在临床上使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂只有别嘌醇，但是别嘌醇具有很多的毒副作用。因此发现和寻找新的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有十分重要的意义。

传统的从中草药或天然药物中筛选活性成分，往往首先通过柱层析、萃取、制备色谱等各种分离手段对复杂体系的化学成分进行系统分离与结构鉴定，再对得到的单体成分进行活性测试，最终寻找到活性成分。但这种方法在操作过程中存在操作繁琐、工作量大、周期长、目标不明确、活性成分在分离过程中易丢失等不足，且大量的时间与精力花费在已知物质的分离鉴定上。随着对中草药的研究越发深入，对微量活性成分分析需求的增加，如何从中草药等复杂体系中快速、高效地筛选出活性成分，成为现代药物研究的重要课题之一。

四氧化三铁磁性纳米粒子不仅具有磁性材料的磁分离效应，还具备纳米材料的量子尺寸效应、小尺寸效应和表面效应等性质，广泛应用于冶金、磁学和生物学等领域。磁性纳米粒子具有超顺磁性，易在外加磁场作用下从反应体系中分离和回收，被广泛用作制备固定化酶的载体材料。相比于游离酶在分离和重复使用上的不足，磁性材料固定化酶具有快速与反应物分离、较长时间内重复使用、提高酶的稳定性、提高酶的使用效率、降低成本等优点。本发明利用四氧化三铁磁性纳米粒子的特点，将其用黄嘌呤氧化酶修饰，制备筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物，取得了很好的效果。

发明内容：

本发明的目的是基于现有中草药中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选步骤较为繁琐，时间较长且耗费有机溶剂的问题，提供一种用于筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物及其应用方法。本发明以黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子为筛选载体，利用受体-配体亲和反应原理，从中草药样品中筛选到与受体黄嘌呤氧化酶结合的配体，再经过脱附、高效液相色谱-质谱联用技术检测，能够实现快速筛选鉴定中草药中的黄嘌呤氧化酶抑制剂。该复合物制备过程简单、安全无毒、成本低廉，可重复使用。用于筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法过程简单、安全可靠、能高效快速的筛选出黄嘌呤氧化酶抑制剂，并能够为寻找新型抗痛风药物奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物，是通过戊二醛作为交联剂，将黄嘌呤氧化酶固定在氨基化的四氧化三铁纳米粒子表面，得到的黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子。

所述的氨基化是将四氧化三铁纳米粒子分散在乙醇溶液中，通过3-氨丙基三乙氧基硅烷进行表面氨基化处理。

上述复合物具体是将粒径在30～220nm的四氧化三铁纳米粒子分散在乙醇溶液中形成浓度为0.1-2mg/mL的四氧化三铁纳米粒子分散液，取50-200mL分散液，并向溶液中逐滴滴加0.4-8mL3-氨丙基三乙氧基硅烷；室温下搅拌4-8小时后过滤用乙醇溶液洗涤三次，置于50℃真空干燥箱中干燥；1-10mg氨基化的四氧化三铁纳米粒子分散在1-10mL的5wt%的戊二醛溶液中并搅拌0.5-2小时，反应后通过磁分离去除上清溶液，将1-4mL浓度为180μg/mL的黄嘌呤氧化酶的pH值为7的10mM的磷酸盐缓冲液溶液，加入到磁性纳米粒子中振荡反应0.5-4小时；得到的黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子用磷酸盐缓冲液洗涤后待用。

所述的筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物的应用方法，

将黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子与中草药提取液孵育，再通过外界磁场进行磁分离得到活性成分与黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子复合物，将复合物采用甲醇-水的混合溶液脱附，收集脱附液，运用液相色谱-质谱联用技术对得到的活性成分进行分离和鉴定，得到黄嘌呤氧化酶抑制剂。

所述孵育是将10-40mg黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子复合物加入到1-4mL中草药提取液中，在25℃下振荡0.5-3小时，之后磁分离收集磁性纳米粒子，并用磷酸盐缓冲液洗涤后，加入1-4mL80%的甲醇溶液并振荡1-10min脱附已结合的活性成分。

中药提取液的制备：将原料按照固液质量比为1：10的比例，用95%的乙醇溶液在85℃回流提取3小时，减压蒸馏至95%的乙醇溶剂全部蒸除得到浸膏；将上述浸膏按照固液质量比为1：100的比例用二次蒸馏水溶解，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分别通过减压蒸馏蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位样品；将各部位样品按照固液质量比为1：100用100%甲醇溶液溶解，分别过0.45μm滤膜备用。

所述的中药提取液选自葛花提取物或甘草提取物。

在从中草药样品葛花提取液中筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂时，高效液相色谱的检测条件为：

色谱柱：Waters SunFire^TM C₁₈色谱柱规格为250mm×4.6mm i.d.,5μm；流动相：A相：含0.4%醋酸的水，B相：含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脱程序：t=0～12min，25%B相+75%A相；t＝12～15min，25～30%B相+75～70%A相；t＝15～30min，30～38%B相+70～62%A相；t＝30～33min，38～75%B相+62～25%A相；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；

在从中草药样品甘草提取液中筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂时，高效液相色谱的检测条件为：

色谱柱：Waters SunFire^TM C₁₈色谱柱规格为250mm×4.6mm i.d.,5μm；流动相：A相：含0.4%醋酸的水，B相：含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脱程序：t=0～10min，25%B相+75%A相；t＝10～20min，25～30%B相+75～70%A相；t＝20～35min，30～50%B相+70～50%A相；t＝35～45min，50%B相+50%A相；t＝45～60min，50～80%B相+50～20%A相；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。

所述的筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物还可以用于制备筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的制剂。

本发明的中草药样品可以包含天然产物提取物或中药复方提取物。

作为优选，孵育条件为在25℃下孵育1小时。

作为优选，脱附条件为在25℃下反应1min。

作为优选，本发明中孵育和脱附时振荡的条件为50～200转/min。

进一步优选的孵育和脱附时振荡的条件为100转/min。

作为优选，活性成分与黄嘌呤氧化酶负载的磁性纳米粒子复合物在孵育后用pH值为7的10mM的磷酸盐缓冲液清洗。

进一步优选，孵育后，活性成分与黄嘌呤氧化酶负载的磁性纳米粒子复合物用pH值为7的10mM的磷酸盐缓冲液清洗三次，每次用2mL的10mM的磷酸盐缓冲液洗去表面非特异性吸附的小分子物质。

从中草药样品葛花提取物中筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂时，质谱的检测条件为：

采用负离子电离模式，流速为0.2mL/min，扫描范围：m/z100-1200，实验前质量数均经过校正。喷雾电压为3.5kV，金属加热毛细管温度350℃，金属毛细管电压5V，壳气流速为300mL/min，辅助气流速为50mL/min。

从中草药样品甘草提取物中筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂时，质谱的检测条件可以为：

电喷雾负离子模式，流速为0.2mL/min，喷雾电压4.0kV，金属毛细管电压5V，金属毛细管加热温度350℃，壳气流速为300mL/min，辅助气流速为50mL/min，扫描范围m/z100～1000。

本发明的优点在于：

1）本发明首次制备出黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子的复合物用于筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂；该复合物制备过程简单、安全无毒、成本低廉，可重复使用；

2）本发明打破黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选技术领域的常规思路，首次以黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子为筛选载体，利用受体-配体亲和反应原理，从中草药样品中筛选到与受体黄嘌呤氧化酶结合的配体，再经过脱附、高效液相色谱-质谱联用技术检测，能够实现快速筛选鉴定中草药中的黄嘌呤氧化酶抑制剂。该方法过程简单、安全可靠、能高效快速的筛选出黄嘌呤氧化酶抑制剂，并能够为寻找新型抗痛风药物奠定基础。克服了传统筛选方法步骤繁琐、耗时长，有机溶剂耗量大，且工作量大等问题；

3）此外，本发明用于筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物还可以通过进一步研究用于制备出其他多样化的用于筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的制剂产品，为推广使用奠定基础。

附图说明：

图1为实施例1中葛花提取物的高效液相色谱图；其中，峰1为鸢尾苷，峰2为葛根素，峰3为大豆苷，峰4为3’-甲氧基大豆苷，峰5为鸢尾黄素；

图2为实施例1中葛花提取物与黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子孵育、脱附后的脱附液的高效液相色谱图；其中，峰1为鸢尾苷，峰2为葛根素，峰3为大豆苷，峰4为3’-甲氧基大豆苷，峰5为鸢尾黄素；

图3为实施例2中甘草提取物的高效液相色谱图；其中，峰1为异甘草苷，峰2为甘草素，峰3为甘草皂苷G2，峰4为二氢7-羟基-3-(4-羟苯基)-4-苯并吡喃酮，峰5为甘草酸，峰6为甘草香豆素；

图4为实施例2中甘草提取物与黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子孵育、脱附后的脱附液的高效液相色谱图；其中，峰1为异甘草苷，峰2为甘草素，峰3为甘草皂苷G2，峰4为二氢7-羟基-3-(4-羟苯基)-4-苯并吡喃酮，峰5为甘草酸，峰6为甘草香豆素。

具体实施方式：

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：

100mg粒径在30～220nm的四氧化三铁纳米粒子分散在200mL乙醇溶液中，向溶液中逐滴滴加2mL3-氨丙基三乙氧基硅烷。室温下搅拌6小时后用乙醇溶液洗涤三次，至于50℃真空干燥箱中干燥。2mg氨基化的四氧化三铁纳米粒子分散在2mL的戊二醛溶液中(5%w/v)并搅拌1小时，反应后将磁分离得到的磁性纳米粒子加入到4mL的黄嘌呤氧化酶溶液中(浓度为180μg/mL，并采用pH值为7的10mM的磷酸盐缓冲液配制)振荡反应2小时。得到黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子用磷酸盐缓冲液洗涤后待用。

将20mg黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子加入到2mL葛花提取液中，在25℃下振荡1小时。磁分离收集磁性纳米粒子，并用磷酸盐缓冲液洗涤三遍后，加入2mL80%的甲醇溶液并振荡5min脱附已结合的活性成分，将脱附液收集并进行高效液相色谱-质谱分析。

葛花中药提取液的制备：将原料按照固液质量比为1：10的比例，用95%的乙醇溶液在85℃回流提取3小时，减压蒸馏至95%的乙醇溶剂全部蒸除得到浸膏；将上述浸膏按照固液质量比为1：100的比例用二次蒸馏水溶解，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分别通过减压蒸馏蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位样品；将乙酸乙酯部位样品按照固液质量比为1：100用100%甲醇溶液溶解，过0.45μm滤膜备用。

用Dionex UltiMate3000型高效液相色谱仪进行高效液相色谱检测，条件如下：

色谱柱：Waters SunFire^TM C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm)；流动相：水(含0.4%醋酸，A)和乙腈(含0.4%醋酸，B)；梯度洗脱程序：t=0min，25%B(75%A)；t=0～12min，25%B(75%A)；t＝12～15min，25～30%B(75～70%A)；t＝15～30min，30～38%B(70～62%A)；t＝30～33min，38～75%B(62～25%A)；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。

质谱条件如下：

A Finnigan LCQ^deca plus离子肼质谱仪，采用负离子电离模式，流速为0.2mL/min，扫描范围：m/z100-1200，实验前质量数均经过校正。喷雾电压为3.5kV，金属加热毛细管温度350℃，金属毛细管电压5V，壳气流速为300mL/min，辅助气流速为50mL/min。

葛花提取物乙酸乙酯部位样品中黄嘌呤氧化酶抑制剂质谱鉴定信息见表1。

表1葛花提取物乙酸乙酯部位样品中黄嘌呤氧化酶抑制剂质谱鉴定

以黄嘌呤为底物，通过紫外分光光度法，测定一定时间内吸光值在波长为295nm处的变化，通过对比空白样品与待测样品吸光值变化程度，确定待测样品是否具有酶抑制性。实验测定葛花提取物及所得配体对黄嘌呤氧化酶的抑制活性，结果显示，葛花提取物及所得配体对黄嘌呤氧化酶均具有抑制活性。

实施例2：

将20mg黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子加入到2mL甘草提取液中，在25℃下振荡1小时。磁分离收集磁性纳米粒子，并用磷酸盐缓冲液洗涤三遍后，加入2mL80%的甲醇溶液并振荡5min脱附已结合的活性成分，将脱附液收集并进行高效液相色谱-质谱分析。

甘草中药提取液的制备：将原料按照固液质量比为1：10的比例，用95%的乙醇溶液在85℃回流提取3小时，减压蒸馏至95%的乙醇溶剂全部蒸除得到浸膏；将上述浸膏按照固液质量比为1：100的比例用二次蒸馏水溶解，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分别通过减压蒸馏蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位样品；将乙酸乙酯部位样品按照固液质量比为1：100用100%甲醇溶液溶解，过0.45μm滤膜备用。

色谱柱：Waters SunFire^TM C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm)；流动相：水(含0.4%醋酸，A)和乙腈(含0.4%醋酸，B)；梯度洗脱程序：t=0min，25%B(75%A)；t=0～10min，25%B(75%A)；t＝10～20min，25～30%B(75～70%A)；t＝20～35min，30～50%B(70～50%A)；t＝35～45min，50%B(50%A)；t＝45～60min，50～80%B(50～20%A)；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。

质谱条件如下：

A Finnigan LCQ^deca plus离子肼质谱仪，负离子模式，流速为0.2mL/min，喷雾电压4.0kV，金属毛细管电压5V，金属毛细管加热温度350℃，壳气流速为300mL/min，辅助气流速为50mL/min，扫描范围m/z100～1000。

甘草提取物乙酸乙酯部位样品中黄嘌呤氧化酶抑制剂质谱鉴定信息见表2。

表2甘草提取物乙酸乙酯部位样品中黄嘌呤氧化酶抑制剂质谱鉴定

以黄嘌呤为底物，通过紫外分光光度法，测定一定时间内吸光值在波长为295nm处的变化，通过对比空白样品与待测样品吸光值变化程度，确定待测样品是否具有酶抑制性。实验测定甘草提取物及所得配体对黄嘌呤氧化酶的抑制活性，结果显示，甘草提取物及所得配体对黄嘌呤氧化酶均具有抑制活性。

Claims

1.一种筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的复合物的应用方法，其特征在于，

100mg粒径在30～220nm的四氧化三铁纳米粒子分散在200mL乙醇溶液中，向溶液中逐滴滴加2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷；室温下搅拌6小时后用乙醇溶液洗涤三次，置于50℃真空干燥箱中干燥；2mg氨基化的四氧化三铁纳米粒子分散在2mL 5％w/v的戊二醛溶液中，并搅拌1小时，反应后将磁分离得到的磁性纳米粒子加入到4mL的黄嘌呤氧化酶溶液中，该溶液浓度为180μg/mL，并采用pH值为7的10mM的磷酸盐缓冲液配制，振荡反应2小时；得到黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子用磷酸盐缓冲液洗涤后待用；

将20mg黄嘌呤氧化酶修饰的磁性纳米四氧化三铁粒子加入到2mL葛花提取液中，在25℃下振荡1小时；磁分离收集磁性纳米粒子，并用磷酸盐缓冲液洗涤三遍后，加入2mL 80％的甲醇溶液并振荡5min脱附已结合的活性成分，将脱附液收集并进行高效液相色谱-质谱分析；

葛花中药提取液的制备：将原料按照固液质量比为1：10的比例，用95％的乙醇溶液在85℃回流提取3小时，减压蒸馏至95％的乙醇溶剂全部蒸除得到浸膏；将上述浸膏按照固液质量比为1：100的比例用二次蒸馏水溶解，分别用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；分别通过减压蒸馏蒸除其中的有机溶剂，得到干膏状石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位样品；将乙酸乙酯部位样品按照固液质量比为1：100用100％甲醇溶液溶解，过0.45μm滤膜备用；

用Dionex UltiMate 3000型高效液相色谱仪进行高效液相色谱检测，条件如下：

色谱柱：Waters SunFire^TM C₁₈色谱柱规格为250mm×4.6mm i.d.,5μm；流动相：A相：含0.4％醋酸的水，B相：含0.4％醋酸的乙腈；梯度洗脱程序：t＝0～12min，25％B相+75％A相；t＝12～15min，25～30％B相+75～70％A相；t＝15～30min，30～38％B相+70～62％A相；t＝30～33min，38～75％B相+62～25％A相；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；

质谱条件如下：

A Finnigan LCQ^deca plus离子肼质谱仪，采用负离子电离模式，流速为0.2mL/min，扫描范围：m/z 100-1200，实验前质量数均经过校正；喷雾电压为3.5kV，金属加热毛细管温度350℃，金属毛细管电压5V，壳气流速为300mL/min，辅助气流速为50mL/min。