CN102830185B - 一种肺炎链球菌多糖溶液中脱氧胆酸钠的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肺炎链球菌多糖溶液中脱氧胆酸钠含量的测定方法，包括步骤：1）测定待检肺炎链球菌多糖溶液中的糖浓度，标记为C0；2）制取脱氧胆酸钠标准溶液作为样1，其脱氧胆酸钠的浓度标记为C1；3）取待检的肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；4）样1、样2分别上样于高效凝胶色谱柱，5）对色谱图进行积分，6）根据公式计算样2中脱氧胆酸钠的浓度。本发明提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的肺炎链球菌多糖原液中脱氧胆酸钠的测定方法，建立了评价肺炎链球菌多糖原液质量的新方法。
Description
技术领域
本发明属于测试分析领域，具体为一种利用色谱测定脱氧胆酸钠的方法。
背景技术
肺炎链球菌是诱发细菌性肺炎、脑膜炎、中耳炎等疾病的重要病原菌。据2005年WHO估计，每年有160万人死于肺炎链球菌感染，其中70万～100万是5岁以下儿童。尽管适当的抗菌治疗可以有效治疗肺炎链球菌疾病，但肺炎链球菌在发展中国家仍有很高的病死率。此外随着细菌耐药性的上升增加了治疗困难，因此通过接种安全有效的疫苗是预防和控制肺炎链球菌疾病的最理想措施。
在肺炎链球菌多糖的生产发酵工艺中，通常采用脱氧胆酸钠作为杀菌剂，脱氧胆酸钠具有毒性，且有着强烈刺激性，若不能有效去除造成残留量过高会对人体产生毒副作用，因此准确测定肺炎链球菌多糖原液中脱氧胆酸钠的残留量对疫苗生产有着重要影响，对疫苗产品质量控制具有重要的意义。
目前，国内黄百芬等人在《LC—MS／MS测定裂解流感疫苗中的去氧胆酸残留量》一文中介绍了一种利用液质联用系统，采用多反应监测定量测定流感裂解疫苗去氧胆酸的含量，但此方法步骤较多，且对仪器设备有较高要求，此外裂解流感疫苗属病毒类疫苗，与肺炎链球菌多糖疫苗有本质区别，性质差异较大，因此如何对肺炎链球菌多糖原液中的脱氧胆酸钠进行测定仍是一个技术难点。目前，国内外尚无文献报道肺炎链球菌多糖原液及肺炎多糖疫苗中脱氧胆酸钠残留量的测定方法。
发明内容
本发明是在本领域当前技术背景下，针对现有技术的不足，研究出一种肺炎链球菌多糖溶液中脱氧胆酸钠的测定方法。
实现本发明目的的技术方案为：
一种肺炎链球菌多糖溶液中脱氧胆酸钠的测定方法，包括步骤：
1）测定待检肺炎链球菌多糖溶液中的糖浓度，标记为C0；
2）制取脱氧胆酸钠标准溶液作为样1，其脱氧胆酸钠的浓度标记为C1；
3）取待检的肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
4）样1、样2分别上样于高效凝胶色谱柱，上样后进行洗脱，纪录色谱图：洗脱峰开始对应时间标记为t1，峰结束对应时间标记为t2；
5）对样1色谱图进行积分，积分窗口为从峰开始对应时间t1到峰结束对应时间t2，得到样1对应的峰面积为S1；
6）对样2色谱图进行积分，积分窗口为从峰开始对应时间t1到峰结束对应时间t2，得到样2对应的峰面积为S2；
7）根据公式（1）：
C2=（S2÷S1）×C1 （1）
计算样2中脱氧胆酸钠的浓度；
8）根据公式（2）：
F=（C2÷C0）×100% （2）
计算样2中脱氧胆酸钠的百分含量。
标准溶液是用基准物质配制的已知浓度的溶液，其浓度可按需确定。
其中，所述步骤4）中的高效凝胶色谱柱为ODS-C18色谱柱。其是根据样品分子大小不同进行分离，脱氧胆酸钠与肺炎多糖分子大小间存在差异，可被有效分离。ODS是英文octadecyl silane的缩写，即填料是十八(烷)基硅烷，适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。
其中，所述步骤4）中洗脱的流动相为乙腈-水溶液，乙腈-水溶液的质量比例为1:05-1.5。
其中，所述步骤4）中样1和样2的上样体积为20-100μl。
优选地，步骤4）中样1和样2的上样体积为30-60μl。
其中，所述步骤4）中样1和样2的洗脱流速为0.8-1.5ml/min.
其中，所述步骤4）中记录色谱图是在检测波长为200-220nm下记录。
其中，所述肺炎链球菌为下组中的一种：肺炎链球菌1型、肺炎链球菌2型、肺炎链球菌3型、肺炎链球菌4型、肺炎链球菌5型、肺炎链球菌6B型、肺炎链球菌7F型、肺炎链球菌8型、肺炎链球菌9N型、肺炎链球菌9V型、肺炎链球菌10A型、肺炎链球菌11A型、肺炎链球菌12F型、肺炎链球菌14型、肺炎链球菌15B型、肺炎链球菌17F型、肺炎链球菌18C型、肺炎链球菌19A型、肺炎链球菌19F型、肺炎链球菌20型、肺炎链球菌22F型、肺炎链球菌23F型、肺炎链球菌33F型。
本发明的有益效果为：
根据脱氧胆酸钠与肺炎多糖分子间大小存在差异，利用二者在凝胶层析时的保留时间不同，采用高效液相色谱法将脱氧胆酸钠与肺炎链球菌多糖分离，利用已知浓度的脱氧胆酸钠作为标准对照，从而准确测定肺炎链球菌多糖原液中脱氧胆酸钠含量。本发明提供了一种准确、重复性好、快速、便捷的肺炎链球菌多糖原液中脱氧胆酸钠的测定方法，建立了评价肺炎链球菌多糖原液质量的新方法。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不应用来限制本发明的范围。
实施例中，使用的高效凝胶过滤色谱柱ODS-C18（4.6mm×250mm，5μm），购自安捷伦科技有限公司。
实施例1
测定待检1型肺炎球菌多糖的糖浓度，为19.2mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的1型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm纪录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.892min，峰结束对应时间为15.917min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.892min到峰结束对应时间15.917，得到样1对应的峰面积为17862（S1）；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.892min到峰结束对应时间15.917min，得到样2对应的峰面积为1265（S2）；
根据公式（1）计算1型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度
C2=（S2÷S1）×C1=（1265÷17862）×100=7.08μg/ml
根据公式（2）计算1型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量
F=（C2÷C0）×100%=（7.08/19200）×100%=0.037%
对样品1连续进样5次，分别计算峰面积，5次测定的峰面积变异系数CV=0.93%；对样品2连续进样5次，分别计算峰面积，5次测定的峰面积变异系数CV=1.46%。
实施例2
测定待检2型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为20.2mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的2型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.815min，峰结束对应时间为15.903min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.903，得到样1对应的峰面积为17891（S1）；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.903min，得到样2对应的峰面积为1415（S2）；
则2型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1415÷17891）×100=7.91μg/ml；
2型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（7.91/20200）×100%=0.039%。
对样品1连续进样5次，分别计算峰面积，5次测定的峰面积变异系数CV=1.04%；对样品2连续进样5次，分别计算峰面积，5次测定的峰面积变异系数CV=1.15%。
实施例3
测定待检3型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.9mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的3型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.826min，峰结束对应时间为15.919min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.826min到峰结束对应时间15.919，得到样1对应的峰面积为17902；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.826min到峰结束对应时间15.919min，得到样2对应的峰面积为953；
根据公式计算3型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（953÷17902）×100=5.32μg/ml；
3型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.32/19900）×100%=0.027%。
实施例4
测定待检4型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.2mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的4型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.817min，峰结束对应时间为15.912min。
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.817min到峰结束对应时间15.912，得到样1对应的峰面积为17957；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.817min到峰结束对应时间15.912min，得到样2对应的峰面积为1039；
根据公式（1）计算4型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1039÷17957）×100=5.79μg/ml；
根据公式（2）计算4型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.79/19200）×100%=0.030%。
实施例5
测定待检5型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.7mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的5型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.825min，峰结束对应时间为15.921min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.825min到峰结束对应时间15.921，得到样1对应的峰面积为18034；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.825min到峰结束对应时间15.921min，得到样2对应的峰面积为1278；
根据公式计算5型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1278÷18034）×100=7.09μg/ml；
根据公式计算5型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F＝(C2÷C0）×100%=（7.09/19700）×100%=0.036%。
实施例6
测定待检6B型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为18.3mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的6B型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.816min，峰结束对应时间为15.929min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.816min到峰结束对应时间15.929，得到样1对应的峰面积为17986；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.816min到峰结束对应时间15.929min，得到样2对应的峰面积为1097；
根据公式计算：
6B型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1097÷17986）×100=6.10μg/ml；
根据公式计算：
6B型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（6.10/18300）×100%=0.033%。
实施例7
测定待检7F型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为18.9mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的7F型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.829min，峰结束对应时间为15.932min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.829min到峰结束对应时间15.932，得到样1对应的峰面积为17971；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.829min到峰结束对应时间15.932min，得到样2对应的峰面积为932；
根据公式：
7F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（932÷17971）×100=5.19μg/ml；
根据公式：
7F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.19/18900）×100%=0.027%。
实施例8
测定待检8型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.1mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的8型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长200nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.815min，峰结束对应时间为15.927min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.927，得到样1对应的峰面积为18012；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.927min，得到样2对应的峰面积为1015；
根据公式计算8型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1015÷18012）×100=5.64μg/ml；
8型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.64/19100）×100%=0.030%。
本实施例的样品共取样5次，5次检测的8型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度平均偏差为1.0%。
实施例9
测定待检9N型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.2mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的9N型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长220nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.815min，峰结束对应时间为15.918min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.918，得到样1对应的峰面积为17927；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.918min，得到样2对应的峰面积为981；
根据公式计算9N型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（981÷17927）×100=5.47μg/ml；
根据公式计算9N型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.47/19200）×100%=0.028%。
实施例10
测定待检9V型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.5mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的9V型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.827min，峰结束对应时间为15.931min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.827min到峰结束对应时间15.931，得到样1对应的峰面积为17956；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.827min到峰结束对应时间15.931min，得到样2对应的峰面积为872；
根据公式：
9V型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（872÷17956）×100=4.86μg/ml；
根据公式：
9V型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（4.86/19500）×100%=0.025%。
实施例11
测定待检10A型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为17.9mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的10A型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.823min，峰结束对应时间为15.926min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.823min到峰结束对应时间15.926，得到样1对应的峰面积为17998；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.823min到峰结束对应时间15.926min，得到样2对应的峰面积为1103；
根据公式计算10A型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1103÷17998）×100=6.13μg/ml；
根据公式计算10A型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（6.13/17900）×100%=0.034%。
实施例12
测定待检11A型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为18.6mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的11A型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.857min，峰结束对应时间为15.963min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.857min到峰结束对应时间15.963，得到样1对应的峰面积为18124；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.857min到峰结束对应时间15.963min，得到样2对应的峰面积为945；
根据公式：
11A型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（945÷18124）×100=5.21μg/ml；
根据公式：
11A型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.21/18600）×100%=0.028%。
实施例13
测定待检12F型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.8mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的12F型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.862min，峰结束对应时间为15.977min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.862min到峰结束对应时间15.977，得到样1对应的峰面积为18035；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.862min到峰结束对应时间15.977min，得到样2对应的峰面积为815；
根据公式计算12F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（815÷18035）×100=4.52μg/ml；
12F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（4.52/19800）×100%=0.023%。
实施例14
测定待检14型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.1mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的14型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.855min，峰结束对应时间为15.968min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.855min到峰结束对应时间15.968，得到样1对应的峰面积为18116；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.855min到峰结束对应时间15.968min，得到样2对应的峰面积为1017；
根据公式：
14型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1017÷18116）×100=5.61μg/ml；
根据公式：
14型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.61/19100）×100%=0.029%。
实施例15
测定待检15B型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为20.3mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的15B型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.873min，峰结束对应时间为15.991min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.873min到峰结束对应时间15.991，得到样1对应的峰面积为17976；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.873min到峰结束对应时间15.991min，得到样2对应的峰面积为1139；
根据公式：
15B型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1139÷17976）×100=6.34μg/ml；
根据公式：
15B型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（6.34/20300）×100%=0.031%。
实施例16
测定待检17F型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.4mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的17F型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.715min，峰结束对应时间为15.830min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.715min到峰结束对应时间15.830，得到样1对应的峰面积为18112；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.715min到峰结束对应时间15.830min，得到样2对应的峰面积为829；
根据公式：
17F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（829÷18112）×100=4.58μg/ml；
根据公式：
17F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（4.58/19400）×100%=0.024%。
实施例17
测定待检18C型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为18.6mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的18C型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.623min，峰结束对应时间为15.772min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.623min到峰结束对应时间15.772，得到样1对应的峰面积为18025；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.623min到峰结束对应时间15.772min，得到样2对应的峰面积为971；
根据公式计算18C型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（971÷18025）×100=5.39μg/ml；
18C型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.39/18600）×100%=0.029%。
实施例18
测定待检19A型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为18.2mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的19A型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.713min，峰结束对应时间为15.836min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.713min到峰结束对应时间15.836，得到样1对应的峰面积为17964；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.713min到峰结束对应时间15.836min，得到样2对应的峰面积为1205；
根据公式计算19A型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1205÷17964）×100=6.71μg/ml；
19A型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（6.71/18200）×100%=0.037%。
实施例19
测定待检19F型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为18.9mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的19F型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.755min，峰结束对应时间为15.871min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.755min到峰结束对应时间15.871，得到样1对应的峰面积为17893；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.755min到峰结束对应时间15.871min，得到样2对应的峰面积为997；
根据公式计算19F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（997÷17893）×100=5.57μg/ml；
19F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.57/18900）×100%=0.029%。
实施例20
测定待检20型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.7mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的20型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.793min，峰结束对应时间为15.902min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.793min到峰结束对应时间15.902，得到样1对应的峰面积为18006；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.793min到峰结束对应时间15.902min，得到样2对应的峰面积为1062；
根据公式计算20型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（1062÷18006）×100=5.90μg/ml；
20型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（5.90/19700）×100%=0.030%。
实施例21
测定待检22F型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.3mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的22F型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长210nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.749min，峰结束对应时间为15.862min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.749min到峰结束对应时间15.862，得到样1对应的峰面积为18041；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.749min到峰结束对应时间15.862min，得到样2对应的峰面积为817；
根据公式计算22F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（817÷18041）×100=4.53μg/ml；
22F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（4.53/19300）×100%=0.023%。
实施例22
测定待检23F型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为18.7mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的23F型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长200nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.761min，峰结束对应时间为15.879min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.761min到峰结束对应时间15.879，得到样1对应的峰面积为17981；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.761min到峰结束对应时间15.879min，得到样2对应的峰面积为736；
根据公式计算23F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（736÷17981）×100=4.09μg/ml；
23F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（4.09/18700）×100%=0.022%。
实施例23
测定待检33F型肺炎球菌多糖的多糖浓度，为19.1mg/ml（C0）；精密制取100μg/ml（C1）脱氧胆酸钠标准溶液作为样1；取待检的33F型肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
样1、样2分别上样于乙腈-水（50：50）充分平衡的高效凝胶色谱柱，上样体积为50μl，洗脱流速为1.0ml/min，于波长220nm记录色谱图：洗脱峰开始对应时间为14.815min，峰结束对应时间为15.930min；
对样1色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.930，得到样1对应的峰面积为17927；对样2色谱图进行积分，调节积分窗口为从峰开始对应时间14.815min到峰结束对应时间15.930min，得到样2对应的峰面积为843；
根据公式计算33F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的浓度C2=（S2÷S1）×C1=（843÷17927）×100=4.70μg/ml；
33F型肺炎链球菌多糖脱氧胆酸钠的百分含量F=（C2÷C0）×100%=（4.70/19100）×100%=0.025%。
Claims (4)
1.一种肺炎链球菌多糖溶液中脱氧胆酸钠含量的测定方法，包括步骤：
1）测定待检肺炎链球菌多糖溶液中的糖浓度，标记为C0；
2）制取脱氧胆酸钠标准溶液作为样1，其脱氧胆酸钠的浓度标记为C1；
3）取待检的肺炎链球菌多糖溶液，作为样2；
4）样1、样2分别上样于高效凝胶色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图：洗脱峰开始所对应时间标记为t1，洗脱峰结束所对应时间标记为t2；
其中，所述的高效凝胶色谱柱为ODS-C18色谱柱；
其中，所述洗脱的流动相为乙腈-水溶液，其中乙腈-水质量比例为1:05-1.5；
所述记录色谱图是在检测波长为200-220nm下记录；
5）对样1色谱图进行积分，积分窗口为从t1到t2，得到样1对应的峰面积为S1；
6）对样2色谱图进行积分，积分窗口为从t1到t2，得到样2对应的峰面积为S2；
7）根据公式：C2=（S2÷S1）×C1计算样2中脱氧胆酸钠的浓度；
8）根据公式：F=（C2÷C0）×100%计算样2中脱氧胆酸钠的百分含量。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤4）中样1和样2的上样体积为20-100μl。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤4）中样1和样2的洗脱流速为0.8-1.5ml/min。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述肺炎链球菌为下组中的一种：肺炎链球菌1型、肺炎链球菌2型、肺炎链球菌3型、肺炎链球菌4型、肺炎链球菌5型、肺炎链球菌6B型、肺炎链球菌7F型、肺炎链球菌8型、肺炎链球菌9N型、肺炎链球菌9V型、肺炎链球菌10A型、肺炎链球菌11A型、肺炎链球菌12F型、肺炎链球菌14型、肺炎链球菌15B型、肺炎链球菌17F型、肺炎链球菌18C型、肺炎链球菌19A型、肺炎链球菌19F型、肺炎链球菌20型、肺炎链球菌22F型、肺炎链球菌23F型、肺炎链球菌33F型。
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