CN104215589A - 一种脱氧胆酸钠的分光光度检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种适用面广,准确度高的脱氧胆酸钠的分光光度检测方法。所述检测方法包括:(1)绘制标准曲线:制备脱氧胆酸钠标准工作液,用所述的标准工作液配制一系列不同浓度的脱氧胆酸钠标准品,与硫酸溶液进行反应,分光光度计测定吸光值,作出标准曲线;(2)对待测样品进行采样,制备加标样品;(3)检测加标样品;(4)计算检测结果、分析样品脱氧胆酸钠的含量。本发明方法简单、易实施,且检测灵敏度高,检测设备成本低,在一般实验室普遍适用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法,具体地说,涉及一种脱氧胆酸钠的检测方法。
背景技术
脱氧胆酸钠,分子式:C24H39O4Na,中文别名:3α,12α-二羟-5β-胆烷酸钠、去氧胆酸钠,分子量:414.55。脱氧胆酸钠是白色粉末或结晶性粉末。易溶于水,微溶于无水乙醇,不溶于乙醚。比旋光度约+42.5°(c=2,水中)。低毒,半数致死量(大鼠,经口)为1370mg/kg。
脱氧胆酸钠分子能够改变磷脂酰基链的排列,影响其协同性,同时能够降低磷脂脂质体的稳定性。脱氧胆酸钠与磷脂双层膜作用后不仅仅是简单地镶嵌在磷脂膜上,而且能够使磷脂膜形成孔洞或缺陷。由于脱氧胆酸钠的上述特性,可以用于病毒或者细菌类疫苗生产过程中的细胞消化,抗原纯化与灭活,这些反应是一个复杂的生物物理变化过程,反应前后脱氧胆酸钠的结构和性质不发生变化。
生产上,在细菌类疫苗的生产过程中,发酵液采用脱氧胆酸钠进行灭活,而在病毒类疫苗的生产过程中也需要添加脱氧胆酸钠进行前期预处理。脱氧胆酸钠作为一种外源物质,自身具有一定的毒性。因此,在上述生物制剂有效成分的纯化过程中需对其进行去除,而若不能有效去除脱氧胆酸钠,可能造成脱氧胆酸钠含量过高从而导致对人体的毒副作用。因此为了有效控制产品质量,在生产过程有效地监控脱氧胆酸钠的去除趋势,检测纯化样品与终产品的含量或者含量,对疫苗的质控起着至关重要的作用。因而建立一种准确地测定生物制品中脱氧胆酸钠含量的方法对疫苗质量控制意义深远。
目前对生物制品中的脱氧胆酸钠含量的检测尚未有纳入到《中华人民共和国药典》2010年版三部的通用方法。根据《中华人民共和国药典》2010年版三部第124页甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)附录1《脱氧胆酸钠残留量测定法》的方法进行多糖等样品中的脱氧胆酸钠含量测定时发现试验方法具有不适用性,不同样品的检测结果不同,添加的标准物质的检测结果普遍偏低,说明检测结果不准确。
因此,需要建立一种可以在普通实验室广泛使用,能够适用于不同样品,且检测灵敏度高的脱氧胆酸钠的检测方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种可以在普通实验室广泛使用,且检测灵敏度高的脱氧胆酸钠的检测方法。
为了实现本发明目的,本发明提供了一种脱氧胆酸钠的分光光度检测方法,所述分光光度检测方法的步骤为:
(1)绘制标准曲线:制备脱氧胆酸钠标准工作液,用所述的标准工作液配制一系列不同浓度的脱氧胆酸钠标准品,与硫酸溶液进行反应,分光光度计测定吸光值,以标准品中脱氧胆酸钠含量(μg/ml)为横坐标,以吸光值为纵坐标,作出标准曲线;列出线性方程及相关系数,要求相关系数R2≥0.98;
(2)对待测样品进行采样,制备加标样品;
(3)检测加标样品:步骤(2)所述加标样品与硫酸溶液进行反应,反应条件与步骤(1)相同,分光光度计测定吸光值;
(4)计算检测结果、分析样品脱氧胆酸钠的含量。
将各样品的吸光值代入脱氧胆酸钠标准曲线方程,计算待测样品中的脱氧胆酸钠含量,再乘以待测样品的稀释倍数即为该样本的脱氧胆酸钠的含量。
计算公式1:脱氧胆酸钠标准品以及样本脱氧胆酸钠浓度计算
y=ax+b,式中,
y——稀释后标准系列及样本在387nm处的吸光值;
x——稀释后标准系列及样本的脱氧胆酸钠浓度,μg/ml;
a——标准曲线的斜率;
b——标注曲线的截距;
计算公式2:样本脱氧胆酸钠含量计算
C=d×x,式中,
C——样本的脱氧胆酸钠含量,μg/ml;
d——样本的稀释倍数。
其中,步骤(1)的具体步骤为:1)配制浓度为1mg/ml脱氧胆酸钠标准溶液,将1mg/ml的脱氧胆酸钠标准溶液采用醋酸溶液稀释配制成100μg/ml的脱氧胆酸钠标准工作液。精确量取稀释后的100μg/ml的脱氧胆酸钠标准工作液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml分别置于试管中,补醋酸至0.5ml,获得脱氧胆酸钠标准品,同时制备空白对照管。2)各管中分别加入7ml43.5%硫酸溶液,混匀,盖上试管塞,于70℃以上放置时间在20min以上进行反应,然后将反应后的溶液置于室温冷却,冷却后在波长387nm处测定吸光值。以脱氧胆酸钠标准品的含量(μg/ml)为横坐标,以吸光值为纵坐标,作标准曲线。列出线性方程及相关系数,要求相关系数R2≥0.98;
优选地,所述步骤(1)中不同浓度的脱氧胆酸钠标准品与硫酸溶液进行反应的反应条件为70℃水浴90min,置于室温冷却,将反应后的各溶液在波长387nm处测定吸光值。
本发明还提供了所述分光光度检测方法在检测生物制品脱氧胆酸钠含量中的应用。
所述生物制品包括疫苗生产中的工序产品、原液、半成品和成品。
所述疫苗包括肺炎球菌、b型流感嗜血杆菌、流脑、伤寒、副伤寒、甲型肝炎、乙型肝炎和EV71的疫苗。
本发明检测方法的原理为脱氧胆酸钠和硫酸在一定温度下形成黄色复合物,此复合物在387nm处的吸光值与去氧胆酸含量成正比。用读取的吸光值与脱氧胆酸钠含量绘制曲线,将样本读取的吸光值代入曲线,计算样本脱氧胆酸钠含量。本发明经过试验研究发现,酸反应条件调整为70℃以上、反应时间20min以上,可将溶液中脱氧胆酸钠和硫酸结合的更充分,使反应更加彻底,在提高反应条件后,脱氧胆酸钠标准品的吸光值有显著提高,标准曲线相关系数明显提高,样本加标回收率可提高至80%~120%,依据《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》,本发明所述检测方法可准确有效检测样本的脱氧胆酸钠含量,从而更客观准确的评价制品质量。
本发明建立的分光光度检测方法简单、快速、易实施,避免了高端、精密、昂贵、操作复杂、试验周期较长的设备与方法的引入,又克服了原有的比色方法对某些生物制品水解不充分、测定结果不准确的问题。本发明采用简单的方式解决了脱氧胆酸钠含量的检测问题,检测灵敏度与高效液相方法基本一致,建立了一种一般实验室普遍适用的脱氧胆酸钠含量检测方法。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
采用《中华人民共和国药典》2010年版三部第124页甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)附录1《脱氧胆酸钠残留量测定法》,对肺炎球菌多糖中的脱氧胆酸钠含量进行加标回收试验。取供试品0.25ml,分别加入浓度20μg/ml、60μg/ml、80μg/ml的脱氧胆酸钠标准品0.25ml,作为样品,检测其中的脱氧胆酸钠含量。计算添加标准品后样品中的脱氧胆酸钠含量及加标回收率,详见表1。
表1肺炎多糖脱氧胆酸钠含量药典方法加标回收结果
结果可见,肺炎多糖采用《中华人民共和国药典》2010年版三部中的脱氧胆酸钠含量测定法的试验条件下,添加低、中、高三种浓度的脱氧胆酸钠标准品后,不同样品的回收率各不相同,同一样品不同的添加量的回收率也各不相同,同时没有明显的规律可循。上述结果的回收率在8.6%~240.8%之间,远远超出±20%的范围,说明已知浓度的脱氧胆酸钠处于肺炎多糖中,检出的结果不准确,时高时低,进而说明样品中在上述条件下检测脱氧胆酸钠含量时,检测结果不可靠,因此用《中华人民共和国药典》2010年版三部的试验方法或者试验条件不能用来检测肺炎球菌多糖原液中的脱氧胆酸钠残留量。
实施例2
试验条件调试:配制浓度为1mg/ml脱氧胆酸钠标准溶液,将1mg/ml的脱氧胆酸钠标准溶液采用醋酸溶液稀释配制成100μg/ml的脱氧胆酸钠标准工作液。取脱氧胆酸钠标准工作液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml分别置于试管中,补醋酸至0.5ml,制得不同浓度(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml)的脱氧胆酸钠标准品,各管中分别加入7ml43.5%硫酸溶液,将反应条件设置为:温度为50℃、70℃、80℃、90℃、100℃,反应时间分别为5min、10min、20min、25min、30min、40min、60min、90min、120min、180min时,进行试验,反应后检测吸光值,80μg/ml标准品的反应吸光值结果见表2。
表2不同条件下80μg/ml标准品溶液试验结果
试验表明,反应温度不同时,80μg/ml浓度的标准品的反应的极值所需要的时间也不同;进而表明,不同温度下,试验达到反应终点的所需要的时间不同。70℃时反应20min试验不充分。50℃时,180min不能达到试验的上限;70℃时需要60-90min才能达到反应;80℃时需要10-20min才能达到反应终点;90℃时需要5-10min才能达到反应终点;100℃时需要5min以内就能达到反应极值。
不同温度与不同反应时间下的标准曲线结果见表3。
表3不同条件下标准品试验结果
上述试验条件下,标准曲线的R2均大于0.999,线性良好。在70℃时随着反应时间的延长,相同浓度的脱氧胆酸钠标准品的吸光值呈上升趋势,90min的吸光值最高;当反应条件提高到80℃、30min和100℃、30min时脱氧胆酸钠标准品各浓度吸光值与70℃90min的吸光值几乎一致,但反应时间仅为前者的四分之一。说明在该反应条件下,脱氧胆酸钠与硫酸的反应更加充分;在药典基础上提高反应温度或者延长温浴的时间,其实验的灵敏度均较药典方法高。
实施例3
取肺炎球菌血清型1型多糖原液为待检样本1,肺炎球菌血清型2型多糖原液为待检样本2,23价肺炎球菌多糖疫苗为待检样本3,b型流感嗜血杆菌多糖疫苗为待检样本4,A、C、W135、Y型流脑多糖疫苗为待检样本5,伤寒、副伤寒多糖等多糖疫苗为待检样本6,甲肝灭活原液为待检样本7,乙肝病毒为待检样本8,EV71病毒等病毒为待检样本9,将其2倍稀释,作为待检样品;
同时,用100μg/ml脱氧胆酸钠标准工作液分别配制浓度20μg/ml、40μg/ml、100μg/ml的脱氧胆酸钠标准品,取稀释后的三个浓度的标准品0.25ml,并取样品0.25ml混合,作为加标样品。
标准曲线的制备:配制浓度为1mg/ml标准脱氧胆酸钠标准溶液为贮备液,精密量取1mg/ml脱氧胆酸钠标准溶液1ml于10ml容量瓶中,用醋酸溶液稀释定容至刻度,即为100μg/ml的脱氧胆酸钠标准工作液。
精确量取稀释后的标准脱氧胆酸钠工作液(100μg/ml)0ml(空白对照)、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml分别置于试管中,补醋酸至0.5ml,按表4数据配制一系列不同浓度的脱氧胆酸钠标准品溶液:
表4脱氧胆酸钠标准曲线制备
加入7ml硫酸溶液,混匀,盖上试管塞,于80℃水浴30min,置于室温冷却,在波长387nm处测定吸光值。以脱氧胆酸钠标准品中脱氧胆酸钠含量(μg/ml)为横坐标,以吸光值为纵坐标,作出标准曲线。列出线性方程及相关系数,要求相关系数R2≥0.98;本实验的标准曲线方程为y=0.00226x+0.00209,相关系数为R2=0.99887。
精确量取0.25ml20μg/ml、40μg/ml、100μg/ml的脱氧胆酸钠标准品以及0.25ml上述1-9待测样本,混合于试管中,加入7ml43.5%的硫酸溶液,混匀,盖上试管塞;将各支试管置于与标准品相同的反应条件下,水解完成后取出,室温冷却;将冷却后的各管溶液在波长387nm处测定吸光值;结果见表5。
结果分析:将样本各管的吸光值代入脱氧胆酸钠标准曲线方程,计算样品中的脱氧胆酸钠浓度。
计算公式1:脱氧胆酸钠标准品及样本脱氧胆酸钠浓度计算
y=a×x+b,式中,
y——稀释后系列标准品及样本在387nm处的吸光值;
x——稀释后系列标准品及样本的脱氧胆酸钠浓度,μg/ml;
a——标准曲线的斜率;
b——标准曲线的截距;
计算公式2:回收率计算
加标样品反应后测定吸光值,代入标准曲线计算脱氧胆酸钠的含量。检测结果分别记为Aμg/ml、Bμg/ml、Eμg/ml,回收率计算方法:
理论浓度差1=20-10=10μg/ml;
理论浓度差2=50-20=30μg/ml;
理论浓度差3=50-10=40μg/ml。
回收率r1=(B-A)/10×100%;
回收率r2=(E-B)/30×100%;
回收率r3=(E-A)/40×100%。
计算结果见表5。
表5肺炎球菌多糖原液脱氧胆酸钠含量改变试验条件加标回收结果
结果显示,上述肺炎球菌多糖、23价肺炎球菌多糖疫苗、b型流感嗜血杆菌多糖、流脑多糖疫苗、副伤寒多糖等多糖、甲肝原液、乙肝病毒、EV71病毒,添加不同浓度的脱氧胆酸钠标准品,回收率在93.8%~106.4%之间,说明在该反应条件下,上述样品中的脱氧胆酸钠可以被准确检出。
实施例4
采用70℃90min的反应条件,检测23价肺炎球菌多糖疫苗、b型流感嗜血杆菌疫苗、流脑多糖疫苗、甲肝原液、EV71原液,分别编号1-5,检测该反应条件下各样品添加10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的脱氧胆酸钠标准品时的脱氧胆酸钠回收率。结果见表6。
表6脱氧胆酸钠含量适用性验证结果
结果可见,在70℃90min的反应条件下各样品的加标回收率均83.1%-101.2%之间,处于80%-120%之间,说明体系中的标准物质检测结果准确可靠;该反应条件下,上述样品中的脱氧胆酸钠可以被准确检出。
实施例5
采用80℃20min的反应条件,检测肺炎球菌多糖添加10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的脱氧胆酸钠标准品时的脱氧胆酸钠回收率。结果见表7。
表7脱氧胆酸钠含量适用性验证结果
标准曲线方程为y=0.00241x+0.00321,相关系数为R2=0.99949
结果可见,在80℃20min的反应条件下各样品的加标回收率在87.5%-107.7%之间,处于80%-120%范围内,说明体系中的标准物质检测结果准确可靠;该反应条件下,上述样品中的脱氧胆酸钠可以被准确检出。
实施例6
采用90℃10min的反应条件,检测肺炎球菌多糖添加10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的脱氧胆酸钠标准品时的脱氧胆酸钠回收率。结果见表8。
表8脱氧胆酸钠含量适用性验证结果
标准曲线方程为y=0.00238x+0.00121,相关系数为R2=0.99957
结果可见,在90℃10min的反应条件下各样品的加标回收率在87.5%-107.7%之间,均处于80%-120%范围内,说明体系中的标准物质检测结果准确可靠;说明该反应条件下,上述样品中的脱氧胆酸钠可以被准确检出。
实施例7
采用100℃5min的反应条件,检测肺炎球菌多糖添加10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml的脱氧胆酸钠标准品时的脱氧胆酸钠回收率。结果见表9。
表9脱氧胆酸钠含量适用性验证结果
标准曲线方程为y=0.00226x+0.00209,相关系数为R2=0.99887
结果可见,在100℃、5min的反应条件下各样品的加标回收率在87.5%-107.7%之间,均处于80%-120%范围内,依据《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》,说明体系中的标准物质检测结果准确可靠;说明该反应条件下,上述样品中的脱氧胆酸钠可以被准确检出。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种脱氧胆酸钠的分光光度检测方法,其特征在于,所述分光光度检测方法的步骤为:
(1)绘制标准曲线:制备脱氧胆酸钠标准工作液,用所述的标准工作液配制一系列不同浓度的脱氧胆酸钠标准品,与硫酸溶液进行反应,分光光度计测定吸光值,作出标准曲线;
(2)对待测样品进行采样,制备加标样品;
(3)检测加标样品:步骤(2)所述加标样品与硫酸溶液进行反应,反应条件与步骤(1)相同,分光光度计测定吸光值;
(4)计算检测结果、分析样品脱氧胆酸钠的含量。
2.根据权利要求1所述的分光光度检测方法,其特征在于,步骤(1)中将不同浓度的脱氧胆酸钠标准品分别取0.5ml与7ml43.5%(质量百分比)的硫酸溶液进行反应。
3.根据权利要求1或2所述的分光光度检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中不同浓度的脱氧胆酸钠标准品与硫酸溶液进行反应的反应条件为70℃以上水浴,反应20min以上,置于室温冷却,将反应后的各溶液在波长387nm处测定吸光值。
4.根据权利要求3所述的分光光度检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中不同浓度的脱氧胆酸钠标准品与硫酸溶液进行反应的反应条件为70℃水浴90min,置于室温冷却,将反应后的各溶液在波长387nm处测定吸光值。
5.权利要求1所述的分光光度检测方法在检测生物制品脱氧胆酸钠含量中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述生物制品包括疫苗生产中的工序产品、原液、半成品和成品。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述疫苗包括肺炎球菌、b型流感嗜血杆菌、流脑、伤寒、副伤寒、甲型肝炎、乙型肝炎和EV71的疫苗。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141217 |