CN102539363B - 一种艾纳香总黄酮含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定艾纳香或艾纳香提取物或艾纳香总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法，系紫外-可见分光光度法。用芦丁或艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)对照品配制成梯度标准溶液，艾纳香药材或艾纳香提取物配制成待测溶液，在271nm波长下，直接测定梯度标准溶液吸光度，建立标准曲线；再测定待测溶液吸光度，从标准曲线查出待测溶液浓度，最后根据配制溶液时的稀释倍数计算出艾纳香药材或提取物的总黄酮含量。本发明采用等吸光点吸收波长测定两类不同紫外吸收的物质总含量，具有检测方法针对性强，结果准确可靠，精密度、稳定性、重复性良好，准确度高，易于控制、操作简便。可用于艾纳香药材或提取物的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于中药分析领域，涉及一种中药材或提取物的质量控制方法，具体涉及一种含两类黄酮的总黄酮含量测定方法，特别涉及一种测定艾纳香类药材或艾纳香提取物或艾纳香总黄酮成分相同的物质中总黄酮含量的方法。
背景技术
艾纳香为菊科植物艾纳香Blumea balsamifera(L.)DC.干燥地上部分。中药又称大风艾。主产于广西、贵州。据《广西中药材标准》(1990年版)记载，艾纳香(大风艾)性“辛、苦、温”，具“温中活血、调经、祛风除湿”之功效。现代药效学研究表明，艾纳香中的黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗辐射和急性肝损伤保护等多种作用[段震，周英.艾纳香化学成分及药理研究进展[J].中华现代临床医学杂志，2006，4(21)：1941-1945.]。
黄酮是自然界中广泛存在的一大类物质，包括黄酮、二氢黄酮、异黄酮、查耳酮等多种类型。很多植物所含有的黄酮并不是单一的某一类黄酮，如：黄芪同时含有黄酮和异黄酮两类黄酮；麦冬同时含有黄烷酮和高异黄酮两类黄酮等。因此，总黄酮的概念是指物质中所有不同类型的黄酮类化合物之和。艾纳香中的黄酮类化学成分主要有两种：二氢黄酮，如艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)、艾纳香素等；黄酮，如芦丁、槲皮素等。两类黄酮结构的主要区别在于：二氢黄酮中C-2和C-3之间为单键，而黄酮中C-2和C-3之间为双键。由于两类黄酮结构的差异导致其紫外吸收图谱也完全不同。两类黄酮的代表化合物艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)和芦丁的紫外扫描图谱如附图1。
目前，有很多关于中药材或提取物中总黄酮含量测定的文献报道，其中也包括艾纳香[黄永林，赵志国，文永新.不同部位艾纳香中总黄酮的含量测定[J].广西植物，2006，26(4)：453-455.]及滇桂艾纳香[姜建萍，杜秀，邱琴，蓝仁青，李生茂，甄汉深.不同产地滇桂艾纳香中总黄酮的含量测定[J].广西中医学院学报，2009，12(4)：44-46.]中总黄酮的含量测定方法。现有测定总黄酮含量的方法中多以芦丁或其它黄酮类成分(如柚皮苷[李江平，万云鹏，王建勇，曾文辉.总黄酮含量的测定方法[P].中国专利：03114240.0，2003-09-17.])为对照品，直接或通过加入铝盐显色后在最大吸收波长测定吸光度的方法得以实现。文献中，黄永林等[黄永林，赵志国，文永新.不同部位艾纳香中总黄酮的含量测定[J].广西植物，2006，26(4)：453-455.]测定艾纳香中的总黄酮，姜建萍等[姜建萍，杜秀，邱琴，蓝仁青，李生茂，甄汉深.不同产地滇桂艾纳香中总黄酮的含量测定[J].广西中医学院学报，2009，12(4)：44-46.]测定滇桂艾纳香总黄酮含量就是采用芦丁作为对照品，加硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠溶液显色后测定的。但是显色后测定总黄酮的方法步骤较为繁琐，仅显色反应就需30分钟；稳定性也较差，如上述测定艾纳香及滇桂艾纳香总黄酮的两篇文献中最大吸收波长就不一致，一篇为500nm，另一篇为505nm。不显色直接测定总黄酮的方法相对较为简单，对于含有单一一类黄酮或以单一一类黄酮为主的药材或提取物，这种测定方法是误差也较小；但是，对于同时含有两类黄酮的药材或提取物(如艾纳香)，由于在黄酮的最大吸收波长254nm，恰好是二氢黄酮紫外吸收的波谷，同样在二氢黄酮的最大吸收波长289nm，又恰好是黄酮紫外吸收的波谷(如附图1)，此时，采用一种黄酮最大吸收波长直接测定总黄酮所得结果将小于样品实际含量，并且因受到另一类黄酮的干扰而使得测定结果产生很大的误差。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确、快捷测定艾纳香或艾纳香提取物或艾纳香总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种测定艾纳香或艾纳香提取物或艾纳香总黄酮相同的物质中总黄酮含量的方法。该方法系用芦丁或艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)对照品配制成梯度标准溶液，艾纳香药材或艾纳香提取物配制成供试品溶液，照紫外-可见分光光度法，直接测定梯度标准溶液吸光度，建立标准曲线；再测定供试品溶液吸光度，从标准曲线读出供试品溶液浓度，最后根据配制溶液时的稀释倍数计算出艾纳香药材或提取物的总黄酮含量，具体操作步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：精密称取一定量芦丁或艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)对照品，置容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品标准母液；
(2)标准曲线的建立：分别吸取不同体积的对照品标准母液，置容量瓶中，加甲醇定容，得到一系列不同浓度的标准溶液；分别取上述标准溶液，以甲醇为空白溶剂，照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)供试品溶液的制备与测定法：将艾纳香药材或其提取物，配制成供试品溶液，照紫外-可见分光光度法，测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
上述总黄酮的含量测定方法的优选为：
(1)对照品溶液的制备：取芦丁或艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)适量，加甲醇制成1ml中含0.2～0.5mg的溶液，即得；
(2)标准曲线的建立：量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在260～280nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)供试品溶液制备与测定法：取艾纳香提取物，研细，约取5～30mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在260～280nm处测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
上述总黄酮的含量测定方法的优选为：
(1)对照品溶液的制备：精密称取艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)适量，加甲醇制成1ml中含0.4mg的溶液，即得；
(2)标准曲线的建立：精密量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)供试品溶液制备与测定法：取艾纳香提取物，研细，精密称取20mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
(4)测定结果：艾纳香药材提取物按干燥品计算，含总黄酮以艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)计，不得少于55.0％。
对上述测定方法的研究与说明：
1、测定条件的考察：
(1)仪器与试药：紫外分光光度计，艾纳香提取物，艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)对照品(纯度99.8％)，分析纯甲醇。
(2)测定方法的选择：根据化学成分研究结果，采用芦丁与艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)的等吸光点波长，测定艾纳香提取物中总黄酮的含量。
(3)对照品的选择：选择艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)作为本品含量测定的对照品。
(4)供试品制备方法与测定方法：经研究，确定供试品制备及测定方法为：取艾纳香提取物，研细，精密称取20mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
2、艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)线性关系
(1)对照品溶液的制备：精密称取艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)适量，加甲醇制成1ml中含0.4mg的溶液，即得。
(2)标准曲线的建立：精密量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；测定结果见表1，标准曲线见附图2。
回归方程：y＝24.293x-0.0005
其中x为浓度(μg/ml)，y为吸收度
相关系数：r＝1，线性范围为：0～64.896μg/ml
表1.艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)标准曲线
3、精密度试验
取同一份艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)对照品溶液，照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，连续测定6次，结果见表2，结果表明仪器精密度良好。
表2.仪器精密度考察数据
4、稳定性试验
取艾纳香提取物，按上述供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别在不同时间测定其吸收度，结果见表3，结果表明样品在24hr内稳定。
表3.样品稳定性考察数据
5、重复性试验
取同一批艾纳香提取物6份，按上述含量测定方法测定，结果见表4，结果表明样品测定方法重现性好。
表4.重复性考察数据
6、加样回收试验
取同一批艾纳香提取物(含量为79.0％)9份，精密称定，置量瓶中，分别按提取物中总黄酮含量的80％、100％、120％加入艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)对照品，按上述含量测定方法测定，计算总黄酮的含量和加样回收率，结果见表5。
表5.加样回收考察数据
7、样品含量测定
取6批艾纳香提取物，按上述含量测定方法测定，计算总黄酮的含量，结果见表5。
表6.样品含量测定结果
根据样品测定结果，规定：本品按干燥品计算，含总黄酮以艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)计，不得少于55.0％。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了针对艾纳香或艾纳香总黄酮相同的物质中总黄酮含量的测定方法。艾纳香中含有两类黄酮：二氢黄酮(代表成分：艾纳香甲素)和黄酮(代表成分：芦丁)，通过研究，发现两类黄酮紫外吸光有很大差异，但在271nm波长附近，两类黄酮具有等吸光点(见附图1)。通过对不同方法测定已知含量的芦丁及艾纳香甲素对照品混合溶液的结果比较(见表7)，证明采用等吸光点波长测定同时含有二氢黄酮和黄酮类成分物质中总黄酮含量的结果最为准确。因此，本发明可以用来测定艾纳香中总黄酮的含量，从而更有效地控制艾纳香或艾纳香提取物或艾纳香总黄酮相同物质的质量。
表7.不同总黄酮含量测定方法比较
注：①采用本发明方法测定结果；②采用芦丁最大吸收波长直接测定结果；③采用艾纳香甲素最大吸收波长直接测定结果；④采用文献中芦丁显色后最大吸收波长测定结果。
2、本发明正被申请人用于原料质量控制，如艾纳香药材总黄酮的含量测定；半成品质量控制，如艾纳香提取物中总黄酮的含量测定；以及成品质量控制，如艾纳香中成药制剂中总黄酮的含量测定。
由于采用黄酮和二氢黄酮的等吸光点波长直接测定艾纳香提取物中的总黄酮含量，有效地解决了两类黄酮紫外吸收不一致带来的总黄酮含量测定困难。经检索，未发现有采用等吸光点测定物质中含有不同类型黄酮的总黄酮含量的相关报道，也未发现有采用等吸光点测定其它不同类型成分总含量的相关报道。
附图说明
图1为相近浓度艾纳香甲素与芦丁的紫外扫描图。
图中：虚线为芦丁(40.76μg/ml)紫外扫描图，实线为艾纳香甲素(40.56μg/ml)紫外扫描图。
图2总黄酮含量测定中的艾纳香甲素标准曲线。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步说明，下述实例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实例1：艾纳香提取物中总黄酮的含量测定方法：
(1)对照品溶液的制备：精密称取艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)适量，加甲醇制成1ml中含0.4mg的溶液，即得；
(2)标准曲线的建立：精密量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)供试品溶液制备与测定法：取批号为20101022的艾纳香提取物，研细，精密称取19.58mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
(4)测定结果：艾纳香药材提取物按干燥品计算，含总黄酮以艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)计，为79.0％。
实例2：艾心酮片(艾纳香总黄酮制剂)中总黄酮的含量测定方法：
(1)对照品溶液的制备：精密称取艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)适量，加甲醇制成1ml中含0.4mg的溶液，即得；
(2)标准曲线的建立：精密量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)供试品溶液制备与测定法：取批号为20101029的艾心酮片20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于艾纳香总黄酮提取物20mg)，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
(4)测定结果：艾心酮片按干燥品计算，含总黄酮以艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)计，为17.2％。
实例3：艾纳香药材中总黄酮的含量测定方法：
(1)对照品溶液的制备：精密称取艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)适量，加甲醇制成1ml中含0.4mg的溶液，即得；
(2)标准曲线的建立：精密量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，以第一份为空白；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)供试品溶液制备与测定法：精密称取批号为20091015的艾纳香药材粉末0.25g，置索式提取器中，加乙醚抽提1小时，将药物残渣晾干，置圆底烧瓶中，加甲醇50ml回流1小时，放冷，滤过，精密量取续滤液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
(4)测定结果：艾纳香药材按干燥品计算，含总黄酮以艾纳香甲素(3，3’，5，7-四甲基-4’-甲氧基二氢黄酮)计，为8.1％。
Claims (2)
1.一种艾纳香总黄酮含量的测定方法，是一种测定艾纳香提取物中总黄酮含量的方法；该方法系用芦丁或艾纳香甲素对照品配制成梯度标准溶液，艾纳香提取物配制成供试品溶液，照紫外-可见分光光度法，直接测定梯度标准溶液吸光度，建立标准曲线；再测定供试品溶液吸光度，从标准曲线读出供试品溶液浓度，最后根据配制溶液时的稀释倍数计算出艾纳香提取物的总黄酮含量，具体操作步骤如下：
(1)对照品溶液的制备：精密称取一定量芦丁或艾纳香甲素对照品，加甲醇制成1ml中含0.2～0.5mg的溶液定容于容量瓶中，作为对照品标准母液；
(2)标准曲线的建立：量取对照品溶液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、8ml，分别置50ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得到一系列不同浓度的标准溶液；分别取上述标准溶液，以甲醇为空白溶剂，照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)供试品溶液的制备与测定法：取艾纳香提取物，研细，取5～30mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得供试品溶液；照紫外-可见分光光度法，在271nm处测定吸光度，从标准曲线上读取浓度，计算，即得。
2.如权利要求1所述艾纳香总黄酮的含量测定方法，其特征在于：
所述的步骤(1)对照品溶液的制备：精密称取艾纳香甲素适量，加甲醇制成1ml中含0.4mg的溶液；
所述的步骤(3)供试品溶液制备与测定法：取艾纳香提取物，研细，精密称取20mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
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