CN111122487A - 一种马桑药材中槲皮素的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种马桑药材中槲皮素的含量测定方法，利用紫外分光光度法测定，重复性好，灵敏度高，实验结果可靠，为马桑药材中槲皮素的含量检测提供了一种新的检测方法，进一步为研究马桑药材的质量标准提供可靠的实验数据。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种马桑药材中槲皮素的含量测定方法。
马桑来源于马桑科马桑属马桑(Coriaria sinica Maxim)多年生落叶小乔木或灌木植物，又称醉鱼草、扶桑。马桑多为灌木，一般高1.5-2.5米不等，其研究中主要发现它具有一定的药用价值,马桑具有清热解毒、活血、祛风通络的功效，叶用于烫伤、黄水疮，肿毒等。在中国,马桑主要分布在河南、四川、贵州、云南、湖南、陕西、甘肃等地。
2006年3月第38卷第1期，中图分类号:R 284.1；文章编号:1671-6841(2006)01-0070-04，艾国民,张雁冰,王克让,刘宏民,卢宏涛，公开了高效液相色谱法测定马桑叶中总黄酮含量，首次采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了马桑叶中总黄酮含量.马桑叶样品提取物用盐酸水解,以槲皮素为对照品外标法定量,测定了马桑叶提取液中总黄酮含量。
DOI:10.15933/j.cnki.1004-3268.2005.09.019，中图分号:S482.2+92,O657.7+2文献标识码:A文章编号:1004-3268(2005)09-0055-03；艾国民,张雁冰,王克让,刘宏民,卢宏涛，公开了高效液相色谱法测定马桑叶中游离黄酮苷元，用反相高效液相色谱法，Shim-pack ODS柱,流动相为乙腈∶水(冰乙酸调pH值为3.0)＝35∶65,v/v,流速1.0ml/min,检测波长为360nm,进样量15μl，以槲皮素为对照品,外标法定量,首次测定了马桑叶提取液中2种游离苷元—槲皮素、山奈酚在不同提取条件下的总含量。
以上两个方案均阐述了马桑药材中含有槲皮素，检测方法均为反相高效液相色谱法，操作复杂。为构建一种简便、高效的槲皮素含量的测定方法，本发明采用了紫外分光光度法测定槲皮素含量方法,并进行方法学考察，结果表明,有良好的线性关系,其精密度较好,符合方法学要求.说明该法适用于马桑中槲皮素含量测定,是一种经济、简便与高效的质量分析方法。
动物医学进展,Progress in Veterinary Medicine2016,37(1)，陈志刚,山光强,谭玉琴,李啟皓,雷红宇,苏建明。公开了紫外分光光度法测定槲皮素含量方法的建立，该法适用于槲皮素原料药含量测定。主要步骤为：槲皮素标准品溶液制备：精密称量槲皮素标准品0.0208g，以700mL/L乙醇溶液溶解，定容于100mL容量瓶，得浓度为208ug/mL槲皮素标准品溶液，冰箱4℃保存，备用；槲皮素原料药供试品溶液的制备：称取0.0200g槲皮素原料药，加入700mL/L的乙醇溶液，搅拌均匀，定容至100mL，得槲皮素原料药供试品溶液，保存备用。标准曲线的绘制依次吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4mL和0.5mL槲皮素标准品溶液10mL容量瓶中，700mL/L乙醇溶液加至10mL，700mL/L乙醇溶液为调零溶液，在确定的最大吸收波长下，测定吸光度。
该方案与本发明均是用紫外分光光度法测定槲皮素含量，但该方案主要用于含槲皮素原料药含量的测定，供试品处理直接用700mL/L的乙醇溶液作提取液，对于马桑中的槲皮素用700mL/L的乙醇溶液作提取液，导致槲皮素提取不完全，含量结果偏低，本发明为了解决该问题，发明人大量的实验研究，经过方差分析，各因素无显著差异，得出了马桑药材中最佳提取工艺为：供试品用60％乙醇，超声提取1h，料液比为1:12，该方法首次提出利用紫外分光光度法检测马桑中槲皮素的含量，该方法简单易行，线性关系良好，精密度高，重现性好,回收率高，该实验以测定马桑中槲皮素的含量为实验基础，为马桑药材中槲皮素的含量测定提供真实可靠的实验依据，进一步为研究马桑药材的质量标准提供可靠的实验方法。
发明内容
本发明的目的提供一种马桑药材中槲皮素的含量测定方法。
本发明所述含量测定方法为紫外分光光度法，具体步骤为：
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.1～1.0g，加50～70％乙醇料液，超声提取0.5～1.5h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加50～70％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入50～70％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在240～270nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在240～270nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
优选的，
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.2～0.9g，加52～68％乙醇料液，超声提取0.6～1.4h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加52～68％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入52～68％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在243～267nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在243～267nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
进一步优选的，
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.3～0.8g，加54～66％乙醇料液，超声提取0.7～1.3h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加54～66％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入54～66％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在246～265nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在246～265nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
更进一步优选的，
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.4～0.7g，加58～62％乙醇料液，超声提取0.8～1.2h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加58～62％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入58～62％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在250～260nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在250～260nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
最优选的，
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇料液，超声提取1h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加60％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
本发明供试品溶液的制备中所述料液的比例为0.6～1.5:9～15。
优选的，
供试品溶液的制备中所述料液的比例为0.8～1.3:10～14。
进一步优选的，
供试品溶液的制备中所述料液的比例为0.9～1.1:11～13。
更进一步优选的，
供试品溶液的制备中所述料液的比例为1:12。
本发明所述槲皮素的含量为0.202～0.350％。
本发明的有益效果
1、本发明首次采用紫外分光光度法测定马桑药材中黄酮类成分槲皮素含量，该方法槲皮素成分提取完全，含量结果高，数据准确。
2、本发明以马桑中槲皮素的含量为测定指标，采用采用紫外分光光度法测定方法测定槲皮素，通过正交试验筛选出了提取马桑中槲皮素最佳方法为：用60％乙醇，超声提取1h，料液比为1:12。为马桑药材的检测方法研究提供了一定的实验依据。
3、采用本发明的检测方法，槲皮素的线性范围在浓度在0.0016-0.0128mg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系，线性方程为:y＝61.631x+0.0867(R2＝0.9995)；仪器精度高，RSD％值为0.34％,重复性RSD值为2.32％,采用本发明方法处理的供试品溶液的稳定性RSD％为0.25％，加样回收率回收平均值为97.63％，RSD＝2.01％，表明该加样回收率结果良好。
4、采用本发明方法供试品结果准确可靠，重现性好、精密度高且方法简便,可有效地控制马桑药材的质量，十批不同产地所述物中槲皮素含量最低含量为0.2020％，最高含量为0.350％，为制定马桑药材的质量标准提供一定的参考数据。
说明书附图
图1非腺毛粉末显微鉴定图。
图2非腺毛粉末显微鉴定图。
图3细胞粉末显微鉴定图。
图4气孔粉末显微鉴定图。
图5导管粉末显微鉴定图。
图6薄层鉴定图。
图7供试品紫外吸收曲线。
图8对照品紫外吸收曲线。
图9马桑槲皮素标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇料液比为1：12超声提取1h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加60％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例2
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.1g，加50％乙醇料液比为0.6：8超声提取0.5h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加50％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入50％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在240nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在240nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例3
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.2g，加51％乙醇料液比为0.7：9超声提取0.6h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加52％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入52％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在243nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在243nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例4
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.3g，加54％乙醇料液比为0.8：10超声提取0.7h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加54％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入54％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在245nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在245nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例5
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.4g，加56％乙醇料液比为0.9：11超声提取0.8h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加56％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入56％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在248nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在248nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例6
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加56％乙醇料液比为1：11超声提取0.9h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加58％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入58％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在250nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在250nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例7
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.6g，加60％乙醇料液比为1.2：12超声提取1.2h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加60％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入58％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在253nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在253nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例8
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.7g，加62％乙醇料液比为1.3：13超声提取1.3h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加62％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入62％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在256nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在256nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例9
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.8g，加62％乙醇料液比为1.4：14超声提取1.4h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加65％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入65％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在260nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在260nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例10
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.9g，加62％乙醇料液比为1.5：15超声提取1.5h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加68％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入68％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在265nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在265nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例11
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末1g，加62％乙醇料液比为1：12超声提取1h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加70％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入70％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在270nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在270nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例12
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加50％乙醇料液比为1：12超声提取1h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加50％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入70％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例13
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇料液比为0.8：12超声提取1h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加60％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例14
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇料液比为1.1：12超声提取0.5h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加70％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入70％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例15
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇料液比为1：12超声提取0.5h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加50％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入50％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实施例16
供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇料液比为0.6：12超声提取1h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加60％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
实验例：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：
1仪器与试剂、标准品
1.1仪器：
UV-2700紫外可见分光光度计(岛津仪器有限公司)；千分之一电子分析天平(上海箐海仪器有限公司)；万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；纯水机(四川宜科纯水设备有限公司)
1.2试剂：
无水甲醇(批号:20180601重庆川东化工(集团)有限公司)；无水乙醇(批号：20190406天津市武清区大良镇工业园)；
1.3标准品：
槲皮素标准品(上海源叶生物科技有限公司，批号：C09S8Y43412)
2药材
2.1来源
马桑来源于马桑科马桑属马桑(Coriaria sinica Maxim)多年生落叶小乔木或灌木植物，又称醉鱼草、扶桑。采于贵州省部分区域。
2.2显微鉴别
马桑叶粉末过四号筛为浅绿色，在体视显微镜下可观察到大量气孔，组织细胞以及非腺毛,见附图1、图2、图3、图4、图5。
2.3薄层色谱鉴别
2.3.1样品溶液的制备
分别取不同产地的马桑粉末5g，加60ml 60％乙醇，加热回流提取两次，每次1h，过滤，合并滤液，作为样品溶液。
2.3.2标准品溶液的制备
称取对照品槲皮素适量，加60％乙醇溶液制成1ml含0.5mg的对照品溶液，即的对照品溶液。
2.3.3展开剂的选择
吸取上述溶液，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:4:1)为展开剂，饱和后分别展开，取出晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置于365nm紫外光灯下检视。硅胶板上，槲皮素对照品溶液与不同产地的马桑样品在相应位置显示清晰颜色相同的荧光斑点。见图6。
3检查
3.1水分测定
按照2015版《中国药典》四部(通则0832)的水分测定第二法(烘干法)，测定不同产地马桑药材中水分的含量。结果见表1。
表1不同产地马桑水分测定结果
3.2总灰分含量测定
按照2015版中国药典四部(通则2302)灰分测定法中总灰分测定法，测定不同产地三棱粉末中总灰分的含量。结果如表2
表2不同产地马桑总灰分测定结果
3.3酸不溶性含量测定
按照2015版中国药典四部(通则2302)灰分测定法中的酸不溶灰分测定法，测定不同产地马桑粉末中酸不溶灰分的含量。结果见下表3：
表3不同产地马桑酸不溶灰分测结果
3.4浸出物含量测定
依照2015版中国药典四部(通则2201)浸出物测定中的醇溶性浸出物测定法中热浸法测定不同产地三棱粉末中醇浸出物的含量。结果见表4。
表4不同产地马桑浸出物含量测定结果
4槲皮素的含量检测
4.1检测波长的选择
4.1.1对照品溶液的制备：取槲皮素对照品适量，精密称定，加60％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液。
4.1.2供试品溶液的制备：精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇超声0.5h，冷却补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中，定容，既可得到供试品溶液。
4.1.3测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在400～700nm范围内扫描，绘制吸收图谱，即得。见图7，图8。
结果：由图7、图8可看出供试品在274nm处的吸收峰与对照品在257nm处吸收峰的峰形相似，结合所查文献资料与对照品紫外吸收曲线，故选择257nm作为马桑槲皮素含量测定的波长。
4.2方法学的考察
4.2.1标准曲线的制备
精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶解，定容至刻度摇匀。分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度。照紫外分光光度法(《中国药典》2015年版四部)。在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。结果见表5。
图9。
表5标准曲线的制备
结果表明:槲皮素浓度在0.0016-0.0128mg/ml内，吸收度与浓度呈良好的线性关系。
4.2.2槲皮素提取工艺正交实验
以三个因素提取浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)为考察因素，各设置三水平，利用L9(3)4正交表进行实验。实验结果见表6、表7、表8。
表6因素水平表
表7正交直观分析表
表8方差分析表
结果：通过直观分析，各因素影响大小为B>C>A，提取时间影响最大，提取溶剂浓度影响最小，槲皮素提取的最佳工艺为A2B1C2,经过方差分析，各因素无显著差异，最佳提取工艺为60％乙醇，60分钟，料液比为1:12，该方法为本实验提取槲皮素的工艺。
4.2.3精密度的考察
精密称定马桑粉末一份0.5g,加60％乙醇料液比为1：12超声提取1h，补重，过滤，移取0.1ml滤液置25ml容量瓶中定容，移取1ml置10ml容量瓶定容，既得供试品溶液。取马桑供试品溶液3ml，连续测定6次，测定结果见表9。
表9精密度考察结果(n＝6)
由上述实验数据表明:供试品RSD为0.34％，小于5％，说明仪器精密度合格。
4.2.4重复性考察
取同一马桑粉末(过二号筛)6份，按照4.2.2的方法制备供试品，分别测定吸光度，RSD值为2.32％，结果见表10。
表10重复性实验结果(n＝6)
4.2.5稳定性考察
按照上述4.2.2的方法提取供试品，取同一供试品溶液分别在10min、20min、30min、40min、50min、60min内测定吸光度，RSD值为1.20％，小于3％，表明槲皮素在60分钟内稳定，结果见表11。
表11稳定性实验结果(n＝7)
4.2.6加样回收实验
精密称取已知槲皮素含量的马桑粉末0.25g6份，置于锥形瓶中，分别加入槲皮素对照品0.7mg，按照上述4.2.2方法提取，测定其吸光度，计算槲皮素含量及回收率，RSD％<3％,回收率合格，结果见表12。
表12槲皮素回收率结果
4.2.7样品槲皮素含量测定
精密称取各产地马桑粉末0.5g,按4.2.2的方法操作，测其吸光度，计算槲皮素含量，结果见表13。
表13不同产地槲皮素含量测定结果(n＝3)
结论：由整个实验可知，该测定一种马桑植物中槲皮素的测定方法，重复性好，灵敏度高，实验结果可靠。本发明以马桑植物中槲皮素的含量为测定指标，采用紫外分光光度法的含量测定方法测定黄酮类成分槲皮素，为马桑药材的质量标准研究提供了一定的实验依据，该方法可以为马桑药材中槲皮素的含量测定提供真实可靠的实验依据，进一步为研究马桑药材的质量标准提供可靠的实验方法。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种马桑药材中槲皮素的含量测定方法，其特征在于所述含量测定方法为紫外分光光度法，具体步骤为：
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.1～1.0g，加50～70％乙醇料液，超声提取0.5～1.5h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加50～70％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入50～70％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在240～270nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法：分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在240～270nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述含量测定方法为紫外分光光度法，具体步骤为：
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.2～0.9g，加52～68％乙醇料液，超声提取0.6～1.4h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加52～68％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入52～68％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在243～267nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在243～267nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于所述含量测定方法为紫外分光光度法，具体步骤为：
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.3～0.8g，加54～66％乙醇料液，超声提取0.7～1.3h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加54～66％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入54～66％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在246～265nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在246～265nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
4.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于所述含量测定方法为紫外分光光度法，具体步骤为：
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.4～0.7g，加58～62％乙醇料液，超声提取0.8～1.2h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加58～62％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入58～62％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在250～260nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在250～260nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
5.根据权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于所述含量测定方法为紫外分光光度法，具体步骤为：
1)供试品溶液的制备:精密称取马桑粉末0.5g，加60％乙醇料液，超声提取1h，冷却，补重，过滤，移取0.1ml置25ml的容量瓶中定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备:取槲皮素对照品适量，精密称定，加60％乙醇溶液制成每1ml中含3.2ug槲皮素对照品溶液；
3)标准曲线的制备:精密称取槲皮素标准品2mg，置于100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶解，定容至刻度摇匀，分别取2ml、3ml、5ml、10ml、12ml、16ml置于25ml容量瓶定容至刻度，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
4)测定法:分别取对照品溶液和供试品溶液，照中国药典2015年版四部紫外分光光度法，在257nm范围内扫描，绘制吸收图谱，计算，即得。
6.根据权利要求1至5任一项所述的含量测定方法，其特征在于：步骤1)供试品溶液的制备中所述料液的比例为0.6～1.5:9～15。
7.根据权利要求6所述的含量测定方法，其特征在于：步骤1)供试品溶液的制备中所述料液的比例为0.8～1.3:10～14。
8.根据权利要求7所述的含量测定方法，其特征在于：步骤1)供试品溶液的制备中所述料液的比例为0.9～1.1:11～13。
9.根据权利要求8所述的含量测定方法，其特征在于：步骤1)供试品溶液的制备中所述料液的比例为1:12。
10.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述槲皮素的含量为0.202～0.350％。
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