CN107389838A

CN107389838A - 基于一测多评法的补骨脂药材检测方法

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Publication number: CN107389838A
Application number: CN201710650981.8A
Authority: CN
Inventors: 栾连军; 沈晓宇; 刘雪松; 吴永江
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-08-02
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明提供一种基于一测多评法的补骨脂有效成分的含量测定方法，首先建立补骨脂中10种主要药效成分的HPLC含量测定方法，以补骨脂素作为内标参照物，计算其他9种活性成分的相对校正因子，并考察相对校正因子的系统适用性和方法重现性，根据相对保留时间进行色谱峰定位，再结合相对校正因子计算各待测成分的含量，通过一测多评法与外标法的相互验证，证明结果无显著差异。本发明方法克服了对照品成本高、不易得等难题，通过相对校正因子及色谱峰定位计算指标成分含量，实现补骨脂中多种药效物质的同步测定既可节省成本、简化操作，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对补骨脂质量控制和临床疗效的保证具有重大意义。

Description

基于一测多评法的补骨脂药材检测方法

技术领域

本发明属于中药分析领域，涉及中药补骨脂药材的检测方法，具体涉及一种基于一测多评法的补骨脂药材检测方法。

背景技术

中药成分复杂多变，其药理活性和临床疗效往往是多种成分共同作用的结果。以单一成分或某一类成分的含量作为评价指标，通常无法全面、充分地反映中药的质量。而通过测定多种成分的含量来控制中药质量，则存在对照品稀缺、不稳定、成本高等诸多问题，给检测也造成较大困难，如果通过某一个成分的含量测定来同时测定多个或多种结构相似的药效物质的含量，可实现中药质量的有效控制。

一测多评法(QAMS)是中药领域多成分同步质量控制的新模式，通过测定某个稳定、廉价、易得的指标性成分，根据其与其他成分之间相关关系，计算各待测成分的含量，可有效解决中药多指标质量控制过程中对照品使用较多、成本高、难以供应等问题。一测多评法的原理为在一定线性范围内，特定成分的量(质量或浓度)与检测器的响应成正比，选用某一典型、易得、稳定的物质作为内参物(s)，建立该成分与其他待测成分(a，b，…，i，…)的相对校正因子(RCF，f_sa,f_sb,f_si)，计算公式为：(其中，A_s、A_i分别为内参物对照品s和待测成分对照品i的峰面积，W_s、W_i分别为内参物对照品s和待测成分对照品i的浓度)。根据QAMS进行含量测定时，先根据常规方法测定内参物(s)的浓度(C_s)，再结合相对校正因子(RCF)按下式计算待测成分的浓度：

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，具有纳气平喘、温肾助阳、温脾止泻等功效，可用于治疗肾阳不足、腰膝冷痛、肾虚作喘、五更泄泻、遗尿遗精，外用还可治疗白癜风、斑秃。目前，补骨脂中已分离鉴定出40余种化合物，主要为呋喃香豆素类、黄酮类、单萜酚类成分。《中国药典》2015版载补骨脂的含量测定项指标为补骨脂素和异补骨脂素总含量，而其他活性成分如补骨脂苷、异补骨脂苷等在水煎液中也有较高含量，且在体内可快速吸收，并转化为补骨脂素、异补骨脂素，对其药效的发挥有关键作用，因而也应作为评价补骨脂药材质量的重要指标性成分。补骨脂素、异补骨脂素分别为补骨脂苷、异补骨脂苷的水解产物，具有相似的结构骨架。目前，国内外研究中有通过外标法直接进行补骨脂苷和异补骨脂苷的含量测定，也有将一测多评法用于补骨脂中其他成分如黄酮类的含量测定，但尚未见补骨脂中苯并呋喃苷类(补骨脂苷、异补骨脂苷)成分一测多评法的相关报道。而补骨脂苷、异补骨脂苷对照品也不易获得，制备成本较高，以其苷元为参照物应用一测多评法可实现同时测定补骨脂中多个指标成分的含量测定。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的不足，提供一种基于一测多评模式的补骨脂药材检测方法，可较全面、系统地反映补骨脂药材中有效成分的含量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

采用一测多评法，以补骨脂素为内参物，检测补骨脂药材中补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚的含量，实现补骨脂药材的质量控制，具体包括以下步骤：

(1)对照品溶液的配制：

分别精密称定补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚、corylifol A、补骨脂酚对照品适量，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得各对照品储备溶液。分别移取适量储备液于另一容量瓶中，加甲醇定容后摇匀，即得补骨脂混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的配制：

称取一定量补骨脂药材粉末(过3号筛)，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入一定量溶剂提取。提取液离心后，过滤，取续滤液，即得。提取溶剂为甲醇。所述提取方式为超声40分钟。所述过滤采用的是0.45μm微孔滤膜。

(3)确定相对校正因子：

取步骤(1)中制备得的混合对照品溶液，分别进样2,4,6,8,10,20μl，进行色谱条件检测分析，得到各化合物的高效液相色谱图并计算各色谱峰的峰面积，选定补骨脂素为内参物(s)，分别计算其余9个待测物(i)的相对校正因子f_si，取平均值，即得。待测物为补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚。

其中，相对校正因子计算公式如下：

式中，A_s为补骨脂素色谱峰面积，W_s为补骨脂素的质量浓度，A_s为待测成分的色谱峰面积，W_s为待测成分的质量浓度，f_si为补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚的相对校正因子。

液相色谱条件如下：色谱柱：AkzoNobel Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)—0.1％磷酸溶液(B)梯度洗脱：0-5min，10％→18％A；5-20min，18→20％A；20-25min，20→46％A；25-35min，46％→54％A；35-48min，54％→58％A；48-55min，58％→65％A；55-65min，65％→70％A；65-75min，70％→85％A。

流动相流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为245nm；进样量10μL。

(4)样品的含量测定：

取步骤(2)制备得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，按步骤(3)所述条件进行检测分析，获得液相色谱图，根据相对保留时间进行峰定位，并结合相对校正因子计算各目标化合物的含量，与外标法测定结果进行比较分析。根据以下公式计算各物质的含量：

W_i＝(W_s×A_i)/(f_si×A_k)

本发明以补骨脂素为内参物，计算补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚在不同进样量下所得的相对校正因子，并在两台不同的色谱仪及三根不同型号的色谱柱上考察相对校正因子的重现性。

通过相关系数法、t检验法分别比较一测多评法计算值与外标法实测值，以评价本发明的方法所得结果是否可靠。

本发明的方法分析样品扩展为补骨脂药材、炮制品、提取物和相关制剂。

与现有补骨脂质量控制方法相比，本发明的有益效果是：以补骨脂素作为内标参照物，计算补骨脂中其他9种活性成分(补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚)的的相对校正因子，进而测定各有效成分的含量。与现有以补骨脂素、异补骨脂素总含量为单一指标的评价方法相比，本发明可得到补骨脂中各类成分的含量并客观、全面、准确地评价药材质量，可解决因对照品稀缺而无法对有效成分进行定量的问题，既可节省成本、简化操作，提高效率，且检测灵敏度高，稳定性好，测定结果准确可靠，对补骨脂质量控制和临床疗效的保证具有重大意义。

附图说明

图1为空白溶剂HPLC色谱图。

图2为混合对照品HPLC色谱图。

图3为供试品溶液HPLC色谱图。

图2和图3中：色谱峰归属：1——补骨脂苷；2——异补骨脂苷；3——补骨脂素；4——异补骨脂素；5——新补骨脂异黄酮；6——补骨脂甲素；7——补骨脂乙素；8——补骨脂二氢黄酮甲醚；9——corylifol A；10——补骨脂酚。

具体实施方式

结合以下实施例和附图对本发明作进一步说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明的补骨脂中多成分的检测方法，采用一测多评法，以补骨脂素作为内参物，测定补骨脂中补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚的含量，具体包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

精密称取适量对照品，分别溶于甲醇中，配置成不同浓度的对照品储备液，再按一定比例混合稀释后得到一系列混合标准品溶液，分别含补骨脂素6.82-218.18μg/mL、异补骨脂素7.02-224.78μg/mL、补骨脂苷11.99-383.77μg/mL、异补骨脂苷12.91-413.23μg/mL、新补骨脂异黄酮5.04-251.99μg/mL、补骨脂甲素6.61-330.26μg/mL、补骨脂乙素6.48-323.89μg/mL、补骨脂二氢黄酮甲醚5.13-256.27μg/mL、Corylifol A 3.98-198.88μg/mL、补骨脂酚26.62-851.78μg/mL。

(2)供试品溶液的制备：

称取1.0g补骨脂药材粉末(过3号筛)，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml后称重，超声40min，取出放冷，称重，补足失重。提取液离心后，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

(3)色谱条件：

高效液相色谱参数设置如下：

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱柱：AkzoNobel Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm)；

流动相：乙腈(A)—0.1％磷酸溶液(B)；

流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表1.流动相梯度洗脱时间程序

检测波长：245nm；

柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；

进样量：10μL；

停止时间：75min，后运行时间10min。

(4)含量测定方法学验证：

取步骤(1)中各浓度的混合对照品溶液，分别进样10μL，以各物质的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到10个化合物的线性方程及相关系数，结果表明，各对照品的进样量与峰面积均呈良好的线性关系(表2)。取同一供试品溶液，连续进样6次，记录峰面积，考察仪器精密度。取同一批样品，平行制备6份供试品溶液，分别测定各待测成分的含量，考察方法的重复性。取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24小时进样分析，测定各待测成分的含量，考察样品稳定性。取已知各成分含量的样品6份，分别精密加入对照品，按步骤(2)所述方法制备供试品溶液，测定各物质的含量，计算加样回收率。结果表明，该方法用于测定补骨脂中多个成分的含量重复性良好，准确性均符合要求。仪器精密度好，且供试品溶液在24小时内稳定(表3)。

(5)相对校正因子的计算：

取步骤(1)中的低浓度混合对照品溶液，进样2,4,6,8,10,20μL，根据各色谱峰的峰面积进行计算，选取补骨脂素为内参物，分别计算补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚的相对校正因子(见表4)。考察了对照品在两台色谱仪及三根不同色谱中的相对校正因子，结果RCF值的RSD均小于5％，表明使用色谱仪及色谱柱对相对校正因子的测定无显著差异(见表5)。

(6)色谱峰的定位：

以补骨脂素峰为参照峰，计算其他各色谱峰的相对保留时间，以对各化合物进行定位。考察了对照品溶液在两台色谱仪及三根不同色谱柱中的相对保留时间t_R，所得相对保留时间的RSD均小于5％(见表6)，说明该方法可准确地定位目标峰。

(7)样品的测定：

分别精密吸取供试品溶液和系列浓度的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪测定。分别采用一测多评法和外标法计算16批补骨脂药材中10种成分的含量。其中一测多评法计算公式为：W_i＝(W_s×A_i)/(f_si×A_k)(其中，A_s为补骨脂素色谱峰面积，W_s为补骨脂素的质量浓度，A_s为其余待测成分的色谱峰面积，W_s为各待测成分的质量浓度，f_si为各待测成分的相对校正因子)。

(8)含量测定结果的比较：

分别计算一测多评法与外标法所得结果的相关系数和P值，结果相关系数均大于0.99，P值均大于0.05％，说明二者之间无显著性差异(见表7-1、7-2)，本发明的方法可用于补骨脂多种有效成分的快速测定。

表2.线性范围考察结果

成分	回归方程	r²	线性范围(mg/mL)
				补骨脂苷	y＝31975.8x+85.1	0.9999	0.0120-0.384
异补骨脂苷	y＝34034.2x+104.7	0.9999	0.0129-0.413
				补骨脂素	y＝76917.4x+136.5	0.9999	0.00682-0.218
异补骨脂素	y＝77486.7x+149.7	0.9998	0.00702-0.225
				新补骨脂异黄酮	y＝46112.7x+19.5	0.9999	0.00504-0.252
补骨脂甲素	y＝25973.6x+18.0	1.0000	0.00661-0.330
				补骨脂乙素	y＝20167.8x-9.5	1.0000	0.00648-0.324
补骨脂二氢黄酮甲醚	y＝25281.5x+22.9	0.9999	0.00513-0.256
				Corylifol A	y＝36357.5x+7.7	1.0000	0.00398-0.199
补骨脂酚	y＝21998.4x+190.7	0.9998	0.0207-0.852

表3.含量测定精密度、重复性、稳定性、准确度

表4.相对校正因子计算结果

f₁＝f_{补骨脂素/补骨脂苷}；f₂＝f_{补骨脂素/异补骨脂苷}；f₃＝f_{补骨脂素/异补骨脂素}；f₄＝f_{补骨脂素/新补骨脂异黄酮}；f₅＝f_{补骨脂素/补骨脂甲素}；f₆＝f_{补骨脂素/补骨脂乙素}；f₇＝f_{补骨脂素/补骨脂二氢黄酮吉阿米}；f₈＝f_{补骨脂素/corylifol A}；f₉＝f_{补骨脂素/补骨脂酚}

表5.不同色谱仪及色谱柱的相对校正因子

表6各色谱峰的相对保留时间

表7-1.一测多评法与外标法结果比较(mg/g)

a*：外标法；b*：一测多评法。

表7-2.一测多评法与外标法结果比较(mg/g)

本发明基于HPLC技术，结合一测多评法，同时测定了16批补骨脂药材中补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚这10种主要成分的含量，且经过一测多评计算值与外标法测定值的相互验证，结果无明显差异，表明该方法准确、可靠，适用于补骨脂中多成分的含量测定，有利于补骨脂药材及相关制剂的全面质量控制。

本发明的方法可以较为全面、客观、准确地反映补骨脂药材的药效物质基础信息，解决了因对照品稀缺而无法准确测定有效成分含量的难题，有利于药材质量的整体控制，对中药的临床应用和疗效发挥具有重要作用。本方法检测灵敏度高，稳定性好，操作简便、快捷，易于掌握，可进一步推广应用。

最后应当说明的是，上述实例仅代表本发明的较优技术方案，说明较为详细、具体，但并非对本发明保护范围的限制。还应指出，凡在本发明的内容和思路基础上，对本发明技术方案作出修改、同等替换或改进，均属于本发明专利的保护范围。

Claims

1.基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)对照品溶液的配制：分别称定补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂二氢黄酮甲醚、corylifol A、补骨脂酚对照品，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，得各对照品储备液，并配制成补骨脂混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的配制：称取补骨脂药材粉末，过3号筛，置于具塞锥形瓶中，加入溶剂进行提取，提取液离心后，过滤，即得；

(3)确定相对校正因子：取步骤(1)中制备得的混合对照品溶液，分别进样2,4,6,8,10,20μl，进行色谱条件检测分析，得到高效液相色谱图并计算各色谱峰的峰面积，选定补骨脂素为内参物，分别计算补骨脂苷、异补骨脂苷、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂甲素、补骨脂乙素、corylifol A、补骨脂酚的相对校正因子，取平均值，即得；

(4)样品的含量测定：取步骤(2)中的供试品溶液进样高效液相色谱分析，获得液相色谱图，根据相对保留时间进行峰定位，并结合相对校正因子计算各目标化合物的含量，与外标法测定结果进行比较分析。

2.根据权利要求1所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，所采用的流动相为乙腈(A)—0.1％磷酸(B)系统，梯度洗脱时间程序为：0-5min，10％→18％A；5-20min，18→20％A；20-25min，20→46％A；25-35min，46％→54％A；35-48min，54％→58％A；48-55min，58％→65％A；55-65min，65％→70％A；65-75min，70％→85％A。

3.根据权利要求1所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，色谱条件为：流动相流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为245nm；进样量10μL。

4.根据权利要求1所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，所用高效液相色谱仪为Agilent 1260和SHIMADZU LC-20AD。

5.根据权利要求1所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，所用色谱柱选用AkzoNobel Kromasil 100-5-C18，4.6mm×250mm，5μm、XBridge C18，4.6mm×250mm，5μm和ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm。

6.根据权利要求1所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取溶剂为甲醇。

7.根据权利要求1所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取方式为超声40分钟。

8.根据权利要求1所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述过滤采用的是0.45μm微孔滤膜。

9.权利要求1-8任一所述的基于一测多评法的补骨脂药材检测方法，其特征在于，分析样品扩展为补骨脂药材、炮制品、提取物和相关制剂。