CN106290646A - 复方金银花颗粒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物的分析检测，特别是指一种采用高效液相色谱同时检测复方金银花颗粒中多种有效成分的检测方法。使用高效液相色谱法对复方金银花颗粒中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、松脂素、黄芩苷、汉黄芩素同时进行检测；包括对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、测定、结果计算等步骤。本发明有效解决了现有技术对于复方金银花颗粒的质量评价现多是单组分的含量测定等问题，具有能够全面表征复方金银花颗粒中的药物活性组分，检测方法重复性高、精确性好等优点。

Description

复方金银花颗粒的检测方法

技术领域

本发明属于药物的分析检测，特别是指一种采用高效液相色谱同时检测复方金银花颗粒中多种有效成分的检测方法。

背景技术

复方中药是中医临床用药的主要形式，是中医药学的特色与精髓。中药是由多成分、多因素构成的复杂体系，其化学成分的多样性与复杂性是其疗效的物质基础，建立符合中医药特点的现代质量控制体系，攻克中药质量分析与评价的难题，改进中药现有质量控制方法已成为人们积极研究的课题。

建立对中药的质量控制体系应立足于中药的特色。复方中药的整体作用特点决定了中药不同于西药。中药的质量控制方法必须能对起效的全部成分(有机成分、无机成分和络合物成分)进行控制，只有这样所建立的质量控制体系才能真正达到控制中药质量、保证中药用药安全有效的目的。中药质量控制正从简单的单一成分含量测定转向以先进技术为手段，多组分、多指标含量的测定。

目前多数中药标准还是采用光谱或色谱手段鉴别和测定某一种或几种有效成分或指标成分，以及药典规定的常规检查项目。对于化学药品而言，其药效成分为结构明确的单一化合物，构效关系明确，其含量和纯度直接表达其有效性及安全性。然而，中医用药的特点是复方配伍，任何单一的有效或活性成分的含量高低均不能表达其整体的疗效。因为有效指标成份的含量高低，可以体现其从相应药材中的转移率，通常情况下转移率越高，说明工艺提取和精制水平越高，有效指标成分损失越少，相应的疗效越好。可见药物中有效指标成分的含量测定，应用在工作生产的质量控制上，用于监控工业生产水平高低具有非常有意义。因此测定的有效指标成分越多，一是能够直观反映制剂中各类有效成份的含量水平高低；二是能够体现工艺水平的高低；三是能够有效判定制剂的质量水平和疗效高低。鉴于复方中药制剂中药效的发挥是多组分共同作用的结果，所以“多标多测”更能够全面评价产品质量，也更加科学。

复方金银花颗粒质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第10册，标准号为“WS₃-B-1985-95”，处方药材为金银花、连翘、黄芩，功能主治为清热解毒、凉血消肿的功效，用于风热感冒，咽炎，扁桃体炎，目痛，牙痛及痈肿疮疖等症。质量标准中仅收载了显色反应鉴别和TLC鉴别，没有含量测定，也就是说原国家标准未有任何定量数据作为评价产品质量的指标。

申请人查询近年来的复方金银花颗粒的相关含量检测的文献，基本为三味药材的单一含量检测。有的收载一味药材的含量检测，如《中国药学杂志》(作者：汪洪武；刘艳清)的HPLC测定复方金银花颗粒中绿原酸与黄芩苷含量；有的收载二味或者三味药材的含量检测，如《中国医院药学杂志》(作者：朱艳琴；殷勤红)的高效液相色谱法同时测定复方金银花颗粒中3种活性成分，基本上都是针对金银花中的指标成分绿原酸、连翘中的指标成分连翘苷、黄芩中的指标成分黄芩苷进行检测。针对三味药材中每一味药材的多指标质量控制的相关非专利文献未见报道。

目前有关复方金银花颗粒检验方法的专利文献报道较少，相关专利多集中在金银花药材的检验上，如：

公开号CN104297374A的专利文献中公告了一种金银花的质量检测方法，其主要技术解决方案是：采用梯度洗脱程序对其活性成分进行检测，本发明建立的金银花检测方法对其大部分药理活性物质进行了有效表征，实现了对其化学成分的较全面表征，避免了只测定其中几个化学成分就对金银花整体质量判断的片面性，各有效成分的峰分离性好，主要活性成分的峰在35分钟内出峰，检测时间合理，并且重复性和稳定性好。

公开号CN103820530A的专利文献中公告了一种金银花的质量检测方法，其主要技术解决方案是：一种金银花检测用引物，能扩增目标核酸序列的特异碱基，所述目标核酸序列为叶绿体序列trnL-trnF。所述引物与所述目标核酸序列的582-661位核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对金银花特定位点具有特异性的引物组，及其用含有上述引物组的试剂盒检测样本中是否存在金银花特定位点，进而确定样本中是否存在正品金银花。

以上专利文献资料多集中在金银花药材的检验上，对于复方金银花颗粒的质量评价现多是单组分的含量测定。

发明内容

本发明的目的是提供一种复方金银花颗粒的检测方法，该方法能够较为全面地分析药物活性组分及其含量，从而表征和控制其内在质量。

本发明的技术构思是：

复方金银花颗粒的检测方法，使用高效液相色谱法对复方金银花颗粒中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、松脂素、黄芩苷、汉黄芩素同时进行检测；包括如下工艺步骤：

A、对照品溶液的制备

取绿原酸、连翘苷、黄芩苷对照品，加质量百分比为50％甲醇分别制成每1ml含绿原酸50μg、连翘苷20μg、黄芩苷0.25mg的溶液；

B、供试品溶液的制备

取复方金银花颗粒2g，研细，精密称定，置具塞锥瓶中，加入质量百分比为50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用质量百分比为50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得；

C、测定

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：以乙腈为流动相A，0.4％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比；

0-10分钟，流动相A为8％，流动相B为92％；

10-25分钟，流动相A为8％-10％，流动相B为92％-90％；

25-40分钟，流动相A为10％-19％，流动相B为90％-81％；

40-55分钟，流动相A为19％-29％，流动相B为81％-77％；

55-60分钟，流动相A为29％，流动相B为71％；

60-65分钟，流动相A为29％-60％，流动相B为71％-40％；

65-75分钟，流动相A为60％，流动相B为40％；

75-80分钟，流动相A为60％-70％，流动相B为40％-30％；

80-85分钟，流动相A为70％-8％，流动相B为30％-92％；

所述高效液相色谱法的条件还包括：

流速为1.0ml/min，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸检测波长为326nm，连翘酯苷A、连翘苷、松脂素、黄芩苷、汉黄芩素检测波长为278nm，理论塔板数按黄芩苷计，不得低于60000。

D、结果计算参照《中国药典》2015年版四部(通则0512)高效液相色谱方法进行。

D1、金银花中有效成分计算

以绿原酸对照品为参照，以其相应的峰为S1峰，计算新绿原酸、隐绿原酸的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

新绿原酸：相对保留时间0.51，校正因子1.19；

绿原酸：相对保留时间1，校正因子1；

隐绿原酸：相对保留时间1.18，校正因子1.22；

以绿原酸的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量；

D2、连翘中有效成分计算

以连翘苷对照品为参照，以其相应的峰为S2峰，计算连翘酯苷A、松脂素的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

连翘酯苷A：相对保留时间0.80，校正因子0.78；

松脂素：相对保留时间0.84，校正因子1.02；

连翘苷：相对保留时间1，校正因子1；

以连翘苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算连翘酯苷A、松脂素、连翘苷的含量；

D3、黄芩中有效成分计算

以黄芩苷对照品为参照，以其相应的峰为S3峰，计算汉黄芩素的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

黄芩苷：相对保留时间1，校正因子1；

汉黄芩素：相对保留时间1.28，校正因子0.59；

以黄芩苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算黄芩苷、汉黄芩素的含量。

测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

申请人需要说明的是，本发明中所涉及的校正因子概念来源于中国药典，在《中国药典》2015年版四部，校正因子收载在“通则0512高效液相色谱法”的测定法中，其实质是同一色谱系统中的两种不同物质，其峰面积和质量的比值是呈一定系数关系的，这个系数就是校正因子。本发明中引用的校正因子类似于测定法中的内标法中的校正因子。

优选的技术方案是，所述的步骤B中超声处理的条件为功率250w，频率35kHz。

优选的技术方案是，所述的步骤B中色谱柱型号为华谱unitary C18，色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm。

本发明采用多指标质量控制的“多标多测”方法对复方金银花颗粒中金银花的有机酸类、连翘的木脂素类、黄芩的黄酮类成份进行全面的控制，通过对一个易得对照品成分的测定，实现多个成分的同步监控，尤其是可以从根本上改善目前中国药品生物制品检定所尚无新绿原酸、隐绿原酸、松脂素等对照品供应的现状。

金银花中的有机酸类成份具有抗血小板聚集作用、对过氧化内皮细胞具有抗损伤作用，其中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸是其中的典型代表成份；连翘的木脂素类成份具有抗菌抗病毒、降血脂、降氧化作用，其中连翘酯苷A、连翘苷、松脂素是此类别的典型代表成份；黄芩的黄酮类成份具有抗炎、抗病毒以及解热和保肝作用，其中黄芩苷、汉黄芩素是此类别的典型代表成份；以上活性成份药理作用显著，研究比较充分，通过“多标多测”方法对以上八种成份的定量测定，基本能够全面评价复方金银花的产品质量。

申请人通过以下实验选择本发明中工艺条件：

1、提取方法的选择

取本品适量，研细、称取2份，分别置具塞锥瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，一份超声30分钟、另一份回流30分钟，样品分别处理后按照上述提取方法检测，综合8个成分的含量测定结果，两种方法无明显区别，故选取较简单的超声提取作为本方案的提取方法。

2、提取溶剂的选择

取本品适量，研细、称取4份，分别置具塞锥瓶中，加入20％甲醇、50％甲醇、80％甲醇、甲醇25ml，称定重量，超声提取30min处理该溶液后测定其含量，综合8个成分的含量测定结果来看，50％甲醇含量较高，故选择50％甲醇方便操作。

3、提取时间的选择

取本品适量，研细、称取3份，分别置具塞锥瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，分别超声(功率250w，频率35kHz)提取15min、30min、45min。相应处理后，检测结果为超声30min含量较高，增加提取时间含量无明显变化，超声提取30min操作方便、提取完全，确定选择提取时间为30min。

4、校正因子和相对保留时间的测定

检测方法中的“校正因子”的计算公式为：Fsi＝(As/Cs)/(Ai/Ci)，式中Fsi为其它组分的校正因子，As为参照物峰面积，Ai为其他组分峰面积，Cs参照物浓度，Ci为其他组分浓度。校正因子的来源是用混合对照品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算而得。以精密度结果计算校正因子和相对保留时间，RSD均小于5.0％，说明本方法校正因子稳定。

检测方法中的“相对保留时间”的计算公式为：Tsi＝Ti/Ts，式中Tsi为其它组分的相对保留时间，Ts为参照物保留时间，Ti为其他组分保留时间。相对保留时间的来源同上述校正因子来源一致，是用混合对照品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算而得。以精密度结果计算相对保留时间，RSD均小于5.0％，说明本方法相对保留时间稳定。

5、不同流速对校正因子和相对保留时间的影响

精密吸取同一混合对照品溶液，以流速为0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD均小于5.0％，检测结果表明，流速对校正因子无明显影响，流速对新绿原酸的相对保留时间有一定影响，故规定流速为1.0ml/min。

6、不同柱温对校正因子和相对保留时间的影响

精密吸取同一混合对照品溶液，以柱温20℃、30℃、40℃分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD均小于5.0％，检测结果表明，不同柱温对校正因子和相对保留时间无影响。

7、不同时间对校正因子和相对保留时间的影响

精密吸取同一混合对照品溶液，以不同时间分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，考察稳定性，RSD均小于5.0％，检测结果表明，不同时间对校正因子和相对保留时间无影响。

8、不同色谱柱对校正因子和相对保留时间的影响

精密吸取同一混合对照品溶液，使用不同色谱柱分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD均小于5.0％，检测结果表明，不同色谱柱对校正因子和相对保留时间无影响。

9、不同仪器对校正因子和相对保留时间的影响

精密吸取同一混合对照品溶液，使用不同仪器分别进行测定，记录色谱图，计算校正因子和相对保留时间，RSD均小于5.0％，检测结果表明，不同仪器对校正因子和相对保留时间无影响。

申请人采用如下方法对本申请中的检测方法及结果进行验证：

一、线性关系及线性范围的研究

(一)对照品溶液的制备：

混合对照①：

新绿原酸对照品：8.065mg→25ml，取5ml→100ml；

绿原酸对照品：5.270mg→100ml；

隐绿原酸对照品：5.430mg→10ml，取5ml→100ml；

连翘酯苷A对照品：3.566mg→10ml，取5ml→100ml；

(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖对照品：3.292mg→100ml；

连翘苷对照品：4.440mg→10ml，取5ml→100ml；

汉黄芩素对照品：4.269mg→100ml，取3ml→100ml；

混合对照②：取混合对照①1ml→10ml，即得；

黄芩苷对照品①：3.177mg→10ml；

黄芩苷对照品②：取黄芩苷对照品①1ml→10ml；

(二)精密吸取上述对照品溶液，按下表进样量分别注入液相色谱仪，记录色谱图，得到绿原酸、连翘苷、黄芩苷的线性范围，结果如下：

表1绿原酸、连翘苷线性关系考察

绿原酸：以峰面积A对质量数(μg)进行线性回归计算，得线性回归方程为：y＝21391.3282x+100.2784，r＝0.9996。

结果见图1，说明绿原酸在0.0051μg-1.5209μg线性范围内关系良好。

连翘苷：以峰面积A对质量数(μg)进行线性回归计算，得线性回归方程为：y＝10697.8455x-12.2462，r＝0.9999。

结果见图2，说明连翘苷在0.0021μg-0.6347μg线性范围内关系良好。

表2黄芩苷线性关系考察

黄芩苷：以峰面积A对质量数(μg)进行线性回归计算，得线性回归方程为：y＝56340.1881x+1602.8809，r＝0.9998。

结果见图3，说明黄芩苷在0.1077μg-8.0779μg线性范围内关系良好。

以绿原酸、连翘苷、黄芩苷为S峰，其余5个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，计算不同浓度时校正因子的偏差，应在校正因子的±5％以内。结果见表3-5不同浓度时校正因子的偏差。

表3不同浓度时校正因子的偏差(金银花)

表4不同浓度时校正因子的偏差(连翘)

进样量	连翘酯苷A	(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷	连翘苷
				混和对照②1μl	0.751	1.026	1
混和对照②2μl	0.756	1.069	1
				混和对照②5μl	0.779	1.052	1
混和对照②10μl	0.746	1.039	1
				混和对照①2μl	0.742	1.049	1
混和对照①5μl	0.744	1.045	1
				混和对照①10μl	0.745	1.046	1
混和对照①15μl	0.745	1.048	1
				混和对照①20μl	0.745	1.047	1
混和对照①25μl	0.744	1.047	1
				混和对照①30μl	0.746	1.051	1
校正因子±5％范围	0.741-0.819	0.969-1.071	-

表5不同浓度时校正因子的偏差(黄芩)

(三)结果表明：隐绿原酸、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和汉黄芩素在不同进样体积和不同浓度时所计算的校正因子均能达到要求，故可通过以确定的校正因子计算出隐绿原酸、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和汉黄芩素的线性范围。

通过校正因子和相对保留时间计算可知：

隐绿原酸在0.0027μg-0.7955μg线性范围内关系良好。

连翘酯苷A在0.0017μg-0.5247μg线性范围内关系良好。

(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷在0.0032μg-0.9496μg线性范围内关系良好。

汉黄芩素在0.0005μg-0.0366μg线性范围内关系良好。

新绿原酸在进样体积为25μl和30μl时校正因子较高，超过了校正因子的±5％，故舍掉这两个高浓度点后通过校正因子计算出新绿原酸的线性范围。新绿原酸结果见下：

新绿原酸在0.0017μg-0.3071μg线性范围内关系良好。

经对照品验证，本发明公开的检测方法线性良好。

二、重复性

取第一条第(一)项下对照品溶液为对照品溶液，取复方金银花颗粒样品(规格：每袋装10g(相当于总药材3.5g)，批号：3411132，河北国金药业有限责任公司)，按拟定含量测定方法，重复测定6次，以绿原酸、连翘苷、黄芩苷为S峰，其余5个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和汉黄芩素的含量，结果见表6。

表6根据校正因子计算重复性试验

结果表明：通过应用该检测方法，对复方金银花颗粒的多组分的含量测定重复性试验，各检测结果的相对标准偏差均小于2％，说明该检测方法重复性良好。

三、准确度

采用加样回收率试验法。取第一条第(一)项下对照品溶液为对照品溶液，取已知含量的样品(批号：3411132，平均含量：含新绿原酸1.306mg/袋、绿原酸5.767mg/袋、隐绿原酸1.815mg/袋、连翘酯苷A1.292mg/袋、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷0.907mg/袋、连翘苷2.922mg/袋、黄芩苷42.360mg/袋、汉黄芩素0.126mg/袋)6份，每份1g，置具塞锥瓶中，精密加入1.1项下对照品溶液的制备项下混合溶液10ml，再精密加入1.1项下对照品溶液的制备项下黄芩对照品溶液15ml，称定重量，自“超声处理……”起按检验方案(一)中制备供试品溶液。

以绿原酸、连翘苷、黄芩苷为S峰，其余5个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和汉黄芩素的回收率，并与实测值相比，结果见表7：

表7根据校正因子计算回收率试验

本发明所载的方法，校正因子经过实测值和计算值的比较，和加样回收率实验对比，说明该检测方法准确度高。

四、限度的确定

按拟完善质量标准对本次样品进行检验，8个成分全部检出，本发明拟定取中位数的80％作为含量测定的限度，每袋含金银花以新绿原酸(C16H18O9)、绿原酸(C16H18O9)和隐绿原酸(C16H18O9)的总量计，不得少于5.0mg/袋；含连翘以连翘酯苷A(C29H36O15)、连翘苷(C27H34O11)和(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷计(C26H32O11)的总量计，不得少于4.0mg/袋；含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)、汉黄芩素(C16H12O5)的总量计，不得少于9.0mg/袋。

五、方法验证

(一)样品来源

“多标多测”方法学验证，测定样品应≥30批，把我公司样品30批进行多标多测测定。

(二)样品测定

以拟定方法对样品进行测定，以绿原酸、连翘苷、黄芩苷为S峰，其余5个成分的实际保留时间均在以S峰与相对保留时间所计算的时间范围内，故可通过校正因子计算出新绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷和汉黄芩素的含量，得到结果与实测结果作比较，RSD应小于5.0％，测定结果见表8-10。

表8 30批样品测定结果(金银花)

表9 30批样品测定结果(连翘)

表10 30批样品测定结果(黄芩)

结果表明：30批样品的实测结果与通过校正因子所计算的结果相差不大，偏差均在5.0％以内，结果可信。典型图谱见图4-7，其中图4、图5为对照品溶液图谱，图6、图7为供试品溶液图谱。

经过严格的试验验证，证明该发明中的方法准确、可靠，可以作为评价复方金银花颗粒质量情况的检验方法，是一种准确稳定可靠的检验途径。

本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：

1、申请人经过大量科学实验后证实，只有采用本发明经过大量实验所得到的切实可行的、特定的色谱条件，才能得到复方金银花颗粒中的有效成分的特征峰，从而实现了特征峰的有效分离。

2、本发明能够对复方金银花颗粒中的主要有效成分新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、松脂素、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩素进行含量检测，从而尽可能实现对复方金银花颗粒的化学成分进行检测，便于定量评价药物质量，有利于对其质量的全方面监控，以使复方金银花颗粒的质量控制方法更加完善。

3、通过校正因子的科学校正，采用三个对照品就可以实现复方金银花颗粒所含8种成分的测定，降低了中药对照品的采购成本。

4、本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。在同一测试条件下，使用一种流动相体系实现了对8种成分的分离和定量检测，节约了检测时间、流动相，可以实现相对节约资源、绿色环保的良好效果，从根本上改善目前新绿原酸、隐绿原酸、松脂素等对照品缺乏的现状。

附图说明

图1是采用本发明的方法所得到的绿原酸线性图。

图2是采用本发明的方法所得到的连翘苷线性图。

图3是采用本发明的方法所得到的黄芩苷线性图。

图4是波长326nm检测绿原酸、连翘苷、黄芩苷的混合对照图谱。

图5是波长278nm检测绿原酸、连翘苷、黄芩苷的混合对照图谱。

图6是申请人的样品图谱1。

图6中是波长为326nm下检测新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的图谱。

图7是申请人的样品图谱2。

图7中是波长278nm检测连翘酯苷A、(+)松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、连翘苷、黄芩苷和汉黄芩素的图谱。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

复方金银花颗粒的检测方法，使用高效液相色谱法对复方金银花颗粒中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、松脂素、黄芩苷、汉黄芩素同时进行检测；包括如下工艺步骤：

A、对照品溶液的制备

取绿原酸、连翘苷、黄芩苷对照品，加质量百分比为50％甲醇分别制成每1ml含绿原酸50μg、连翘苷20μg、黄芩苷0.25mg的溶液；

B、供试品溶液的制备

取复方金银花颗粒2g，研细，精密称定，置具塞锥瓶中，加入质量百分比为50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用质量百分比为50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得；

C、测定

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：以乙腈为流动相A，0.4％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比；

0-10分钟，流动相A为8％，流动相B为92％；

10-25分钟，流动相A为8％-10％，流动相B为92％-90％；

25-40分钟，流动相A为10％-19％，流动相B为90％-81％；

40-55分钟，流动相A为19％-29％，流动相B为81％-77％；

55-60分钟，流动相A为29％，流动相B为71％；

60-65分钟，流动相A为29％-60％，流动相B为71％-40％；

65-75分钟，流动相A为60％，流动相B为40％；

75-80分钟，流动相A为60％-70％，流动相B为40％-30％；

80-85分钟，流动相A为70％-8％，流动相B为30％-92％；

所述高效液相色谱法的条件还包括：

流速为1.0ml/min；新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸检测波长为326nm，连翘酯苷A、连翘苷、松脂素、黄芩苷、汉黄芩素检测波长为278nm，理论塔板数按黄芩苷计，不得低于60000。

D、结果计算参照《中国药典》2015年版四部(通则0512)高效液相色谱方法进行。

D1、金银花中有效成分计算

以绿原酸对照品为参照，以其相应的峰为S1峰，计算新绿原酸、隐绿原酸的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

新绿原酸：相对保留时间0.51，校正因子1.19；

绿原酸：相对保留时间1，校正因子1；

隐绿原酸：相对保留时间1.18，校正因子1.22；

以绿原酸的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量；

D2、连翘中有效成分计算

以连翘苷对照品为参照，以其相应的峰为S2峰，计算连翘酯苷A、松脂素的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

连翘酯苷A：相对保留时间0.80，校正因子0.78；

松脂素：相对保留时间0.84，校正因子1.02；

连翘苷：相对保留时间1，校正因子1；

以连翘苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算连翘酯苷A、松脂素、连翘苷的含量。

D3、黄芩中有效成分计算

以黄芩苷对照品为参照，以其相应的峰为S3峰，计算汉黄芩素的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内。相对保留时间及校正因子如下：

黄芩苷：相对保留时间1，校正因子1；

汉黄芩素：相对保留时间1.28，校正因子0.59；

以黄芩苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算黄芩苷、汉黄芩素的含量。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

本实施例中所涉及的校正因子概念来源于中国药典，在《中国药典》2015年版四部，校正因子收载在“通则0512高效液相色谱法”的测定法中，其实质是同一色谱系统中的两种不同物质，其峰面积和质量的比值是成一定系数关系的，这个系数就是校正因子。本实施例中引用的校正因子类似于测定法中的内标法中的校正因子。

所述的步骤B中超声处理的条件为功率250w，频率35kHz。

所述的步骤B中色谱柱型为华谱unitary C18，色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm。

Claims (3)

1.复方金银花颗粒的检测方法，使用高效液相色谱法对复方金银花颗粒中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、松脂素、黄芩苷、汉黄芩素同时进行检测；其特征在于包括如下工艺步骤：

A、对照品溶液的制备

取绿原酸、连翘苷、黄芩苷对照品，加质量百分比为50％甲醇分别制成每1ml含绿原酸50μg、连翘苷20μg、黄芩苷0.25mg的溶液；

B、供试品溶液的制备

取复方金银花颗粒2g，研细，精密称定，置具塞锥瓶中，加入质量百分比为50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用质量百分比为50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得；

C、测定

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，根据以下色谱条件进行测定；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：以乙腈为流动相A，0.4％磷酸为流动相B，进行梯度洗脱；

所述梯度洗脱程序如下，其中流动相比例均为体积百分比；

0-10分钟，流动相A为8％，流动相B为92％；

10-25分钟，流动相A为8％-10％，流动相B为92％-90％；

25-40分钟，流动相A为10％-19％，流动相B为90％-81％；

40-55分钟，流动相A为19％-29％，流动相B为81％-77％；

55-60分钟，流动相A为29％，流动相B为71％；

60-65分钟，流动相A为29％-60％，流动相B为71％-40％；

65-75分钟，流动相A为60％，流动相B为40％；

75-80分钟，流动相A为60％-70％，流动相B为40％-30％；

80-85分钟，流动相A为70％-8％，流动相B为30％-92％；

所述高效液相色谱法的条件还包括：

流速为1.0ml/min，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸检测波长为326nm，连翘酯苷A、连翘苷、松脂素、黄芩苷、汉黄芩素检测波长为278nm，理论塔板数按黄芩苷计，不得低于60000；

D、结果计算

D1、金银花中有效成分计算

以绿原酸对照品为参照，以其相应的峰为S1峰，计算新绿原酸、隐绿原酸的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

新绿原酸：相对保留时间0.51，校正因子1.19；

绿原酸：相对保留时间1，校正因子1；

隐绿原酸：相对保留时间1.18，校正因子1.22；

以绿原酸的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量；

D2、连翘中有效成分计算

以连翘苷对照品为参照，以其相应的峰为S2峰，计算连翘酯苷A、松脂素的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

连翘酯苷A：相对保留时间0.80，校正因子0.78；

松脂素：相对保留时间0.84，校正因子1.02；

连翘苷：相对保留时间1，校正因子1；

以连翘苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算连翘酯苷A、松脂素、连翘苷的含量；

D3、黄芩中有效成分计算

以黄芩苷对照品为参照，以其相应的峰为S3峰，计算汉黄芩素的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，相对保留时间及校正因子如下：

黄芩苷：相对保留时间1，校正因子1；

汉黄芩素：相对保留时间1.28，校正因子0.59；

以黄芩苷的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算黄芩苷、汉黄芩素的含量；

测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

2.根据权利要求1所述的复方金银花颗粒的检测方法，其特征在于所述的步骤B中超声处理的条件为功率250w，频率35kHz。

3.根据权利要求1所述的复方金银花颗粒的检测方法，其特征在于所述的步骤B中色谱柱型号为Agilent ZORBAX SB，色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm。