CN104897787B

CN104897787B - 一种同时测定牛黄宁宫片中六种活性成分的方法

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Publication number: CN104897787B
Application number: CN201410452554.5A
Authority: CN
Inventors: 孙艳涛; 姜大雨; 王良; 赵磊; 崔运成; 宋玉红
Original assignee: Jilin Normal University
Current assignee: Jilin Normal University
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-09-05
Also published as: CN104897787A

Abstract

本发明公开了一种HPLC法同时测定牛黄宁宫片中大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱六种活性成分含量的方法，该方法采用的色谱条件如下：色谱柱：TC‑C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；检测波长：280nm；流动相：甲醇‑0.05％磷酸；梯度洗脱：0‑35min 10％‑80％甲醇,35‑50min 80％‑80％甲醇,50‑60min 80％‑10％甲醇；流速：1.0mL·min^‑1；柱温：25℃；进样量：10μL。在此色谱条件下，色谱峰分离良好，大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系。本方法简单、快速、准确、重现性好，可为全面评价和控制牛黄宁宫片提供质量依据。

Description

一种同时测定牛黄宁宫片中六种活性成分的方法

技术领域

本发明涉及一种中成药牛黄宁宫片中活性成分检测方法，具体的说是一种同时测定牛黄宁宫片中六种活性成分的方法，属于医药技术领域。

背景技术

牛黄宁宫片用于外感热病，高热神昏，惊风抽搐，肝阳眩晕，耳鸣头痛，心烦不寐及癫痫狂燥，对精神分裂症有一定的抗复发作用。

牛黄宁宫片由牛黄、蒲公英、雄黄、连翘、大黄、冰片、金银花、甘草、黄连、黄芩、钩藤、大黄磁石(煅)、玄参、葛根等27味药经提取加工制成的药剂。该制剂收录于中国卫生部药品标准中药成方制剂第15册第36页WS3-B-2852-98。原质量标准中仅有简单的显微鉴别、砷量检测和胆酸含量检测。另外，“一种控制牛黄宁宫片质量的方法”专利中进行性状鉴别、显微及薄层色谱鉴别、三氧化二砷检验和黄芩含量测定。这些方法检测指标少，有可能导致其它组分不稳定或缺乏，难以全面准确控制药品质量。

中药作为一个整体，强调的是各味药的协同作用。目前，中成药中单一有效成分或指标成分控制，难以真正控制药品质量。有些药厂为了降低成本，利用药检质量标准不能完全控制所有药味的漏洞，非法生产。因此必需建立一种快速、准确、全面分离、检测牛黄宁宫片中多种活性成分的方法，以便更好地对该产品进行质量监控和用药安全。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时测定牛黄宁宫片中多种活性成分含量的高效液相色谱测定方法，该方法可同时测定牛黄宁宫片中大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，该方法简单、稳定、重现性好，可用于该药品的质量控制。

本发明的目的是这样实现的：该测定方法是利用高效液相色谱法(HPLC)在同一实验条件下同时分离并测定牛黄宁宫片中大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，具体步骤如下：

(1)、对照品溶液的制备：精密称取大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱对照品，分别置于5mL容量瓶中，加入3mL甲醇溶解，定容至刻度，制得浓度分别为0.20μg·mL^-1大黄酚、0.44μg·mL^-1大黄素、0.32μg·mL^-1甘草苷、0.20μg·mL^-1连翘苷、0.56μg·mL^-1黄芩苷和0.88μg·mL^-1盐酸小檗碱的单个对照品溶液，再分别精密吸取六种单个对照品储备液0.5mL，置于同一5mL容量瓶中，加入甲醇定容，即得混合对照品溶液；

(2)、供试品溶液的制备：取牛黄宁宫片样品，除去糖衣后显出棕褐色，研细，精密称取0.03814g，置于5mL容量瓶中，加入3mL的甲醇，超声溶解45min，加入甲醇至容量瓶刻线处，摇匀，静置24小时，过滤，即得供试品溶液。

(3)、分离检测：将上述混合对照品溶液和供试品溶液分别注入安捷伦1100液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱：TC-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A为甲醇，B为0.05％磷酸进行梯度洗脱；流速1.0mL·min^-1；检测器：VWD检测器；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：10μL，即可。

所述流动相为如下的梯度洗脱条件：

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明所述方法简单、准确、重现性和稳定性好，可为全面评价和控制牛黄宁宫片质量提供理论基础和科学依据。

2、本发明方法采用高效液相色谱法，利用梯度洗脱方式，实现了同时测定牛黄宁宫片中6种有效成分的含量，本发明建立的色谱法能够较好的分离、测定牛黄宁宫片中大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱有效成分的含量，色谱峰峰形好，分离度较高，在此色谱条件下大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，各种成分回收率均在95％以上。

3、本发明方法操作简单、精密度、重现性和稳定性良好。为牛黄宁宫片有效成分质量控制和药效评价的进一步研究奠定了理论基础和科学依据。

附图说明

图1是本发明混合标准品溶液的色谱图。

图2是本发明供试品溶液的色谱图。

图3是本发明大黄素的色谱图。

图4是本发明大黄素的标准曲线图。

图5是本发明大黄酚的色谱图及标准曲线。

图6是本发明大黄酚的标准曲线图。

图7是本发明甘草苷的色谱图及标准曲线。

图8是本发明甘草苷的标准曲线图。

图9是本发明连翘苷的色谱图及标准曲线。

图10是本发明连翘苷的标准曲线图。

图11是本发明黄芩苷的色谱图及标准曲线。

图12是本发明黄芩苷的标准曲线图。

图13是本发明盐酸小檗碱的色谱图及标准曲线。

图14是本发明盐酸小檗碱的标准曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

仪器与试药

仪器：美国安捷伦1100高效液相色谱仪；日本岛津紫外分光光度计UV2550；GWA-UN4系列超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)；FA1104N万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造)；SK5200H超声波清洗器(200W 59Hz上海科导仪器有限公司)。

试药：大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱对照品(中国生物药品检定所)；牛黄宁宫片(沈阳红药制药有限公司)；甲醇为色谱纯，水为超纯水。

具体步骤如下：

对照品溶液的制备：精密称取大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱对照品，分别置于5mL容量瓶中，加入3mL甲醇溶解，定容至刻度，制得浓度分别为0.20μg·mL^-1大黄酚、0.44μg·mL^-1大黄素、0.32μg·mL^-1甘草苷、0.20μg·mL^-1连翘苷、0.56μg·mL^-1黄芩苷和0.88μg·mL^-1盐酸小檗碱的单个对照品溶液。再分别精密吸取六种单个对照品储备液0.5mL，置于同一5mL容量瓶中，加入甲醇定容，即得混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取牛黄宁宫片样品，除去糖衣后显出棕褐色，研细，精密称取0.03814g，置于5mL容量瓶中，加入3mL的甲醇，超声溶解45min，加入甲醇至容量瓶刻线处，摇匀，静置24小时，过滤，即得供试品溶液。

流动相的选择：实验分别选用甲醇﹕水(70:30)；甲醇﹕水梯度洗脱(0-30min 20％-80％甲醇，30-40min 80％-80％甲醇，40-50min 80％-20％甲醇)；甲醇﹕水梯度洗脱(0-20min50％-80％甲醇，20-30min 80％-80％甲醇，30-40min 80％-50％甲醇)；甲醇﹕水梯度洗脱(0-30min 40％-80％甲醇，30-40min 80％-80％甲醇，40-50min 80％-40％甲醇)；乙腈﹕水(80:20)；甲醇﹕0.05％磷酸溶液梯度洗脱(0-35min 10％-80％甲醇，35-50min 80％-80％甲醇，50-60min 80％-10％甲醇)，发现在甲醇﹕0.05％磷酸水溶液(0-35min 10％-80％甲醇，35-50min 80％-80％甲醇，50-60min 80％-10％甲醇)进行梯度洗脱的时候，色谱峰能够很好地分离，并且峰形很好，可以有效地缩短分析时间，满足分析的要求。

最终色谱条件确定为：色谱柱：TC-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.05％磷酸；流速1.0mL·min^-1；检测器：VWD检测器；检测波长：280nm；梯度洗脱：0-35min 10％-80％甲醇，35-50min 80％-80％甲醇，50-60min 80％-10％甲醇；柱温：25℃；进样量：10μL。

在此色谱条件下，大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的出峰时间分别是44.28、43.20、21.73、25.96、27.74和23.05min，见图1和图2。

方法学考查

线性关系：分别精密吸取单个对照品溶液0.1、0.5、1、2、4、5、6、7、8、9、10μL，注入液相色谱仪，按照上述色谱条件对样品进行测定，以峰面积为纵坐标，质量为横坐标，峰面积对质量作线性回归方程。各线性关系见图3-图14，得各组分回归方程结果见表1。

表1线性关系方程

Table 1Linear relationship between area and concertration

成分	回归方程	相关系数	线性范围(μg/mL)
				大黄酚	Y＝-3.447+1313.30X	0.9997	2-200
大黄素	Y＝-11.25+7428.21X	0.9999	4.4-440
				甘草苷	Y＝15.553+2024.65X	0.9999	3.2-320
连翘苷	Y＝-4.55+1341.94X	0.9999	2-200
				黄芩苷	Y＝27.988+4679.9X	0.9995	5.6-560
盐酸小檗碱	Y＝134.78+2687.37X	0.9998	8.8-880

精密度实验：精密吸取混合对照品溶液，连续进样5次，测定其峰面积大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱，RSD分别为1.41％、2.80％、2.87％、2.11％、1.02％和1.45％(n＝5)，结果表明仪器精密度良好。

重现性实验：取同一供试品溶液，按照上述色谱条件分别在0、2、4、8和12h的时候进样，测定其稳定性，大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的峰面积的RSD分别为0.76％，1.56％，2.56％，2.09％，4.96％和5.68％，由实验数据说明供试品溶液在12h内基本稳定。

稳定性试验：取同一批号的供试品5份，按照供试品溶液的制备方法制备溶液，并依照上述色谱条件测定，结果大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱含量的RSD分别为1.51％、1.46％、6.44％、2.46％、1.54％和1.98％，表明方法重复性良好。

回收率试验：精密称取已知含量的供试品5份，分别加入一定量的大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱对照品，按供试品制备和测定方法操作，计算其加标回收率，结果见表2。

表2加样回收率实验结果

Table 2Result of recovery test

甘草苷的回收率为97.40％，连翘苷的回收率为99.27％，黄芩苷的回收率为98.18％，大黄素的回收率为97.12％，大黄酚的回收率为95.43％，盐酸小檗碱的回收率为97.58％。结果表明该方法准确率高。

样品含量测定：按上述色谱条件测定供试品溶液，结果每片牛黄宁宫片中含大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱分别为1.136、0.1622、1.614、0.1940、0.4672和0.2203mg。

综上，本发明所建立的高效液相色谱法同时测定牛黄宁宫片中的含量，具有操作简便、精密度好、重复性高的特点，可全面、更有效地控制该药的质量。

Claims

1.一种牛黄宁宫片中六种活性成分含量的测定方法，其特征在于：该方法利用高效液相色谱法(HPLC)在同一实验条件下同时分离并测定牛黄宁宫片中大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱的含量，具体步骤如下：

(1)对照品溶液的制备：精密称取大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱对照品，分别置于5mL容量瓶中，加入3mL甲醇溶解，定容至刻度，制得浓度分别为0.20μg·mL^-1大黄酚、0.44μg·mL^-1大黄素、0.32μg·mL^-1甘草苷、0.20μg·mL^-1连翘苷、0.56μg·mL^-1黄芩苷和0.88μg·mL^-1盐酸小檗碱的单个对照品溶液，再分别精密吸取六种单个对照品储备液0.5mL，置于同一5mL容量瓶中，加入甲醇定容，即得混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取牛黄宁宫片样品，除去糖衣后显出棕褐色，研细，精密称取0.03814g，置于5mL容量瓶中，加入3mL的甲醇，超声溶解45min，加入甲醇至容量瓶刻线处，摇匀，静置24小时，过滤，即得供试品溶液；

(3)分离检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入安捷伦1100液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱：TC-C₁₈ 4.6mm×250mm，5μm；流动相A为甲醇，B为0.05％磷酸进行梯度洗脱，流速1.0mL·min^-1；检测器：VWD检测器；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：10μL；

所述流动相为如下的梯度洗脱条件：