CN111505190B - 同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法 - Google Patents

同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检验四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法，属于兽药检测技术领域。该方法以四黄止痢颗粒原标准及其有效成分为依据，对四黄止痢颗粒中的4种有效成分进行准确的分析检测，能进一步有效控制四黄止痢颗粒的质量，实现对制剂质量进行全面地评价，从而最大限度地保证产品质量的稳定性及兽用药的安全性、有效性，且该方法的专属性强、精密度高、稳定性好、准确度高，操作简便，试剂与耗材价廉易得，能够有效地控制产品生产质量及其稳定性，提升产品的品质及市场竞争力，在医药行业中具有推广实用价值。

Description

同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法
技术领域
本发明涉及兽药检测技术领域，具体涉及同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法。
背景技术
四黄止痢颗粒由黄连、黄柏、大黄、黄芩、板蓝根、甘草六味中药经两次水煎煮，浓缩后与辅料制粒干燥而成，具有清热泻火、止痢的功能，对鸡大肠杆菌病有很好的治疗效果，收录于2015版《中国兽药典》二部。
关于四黄止痢颗粒的专利国内也有较多，如中国专利200910066083.3专利公开了一种四黄止痢泡腾颗粒的制备方法，该四黄止痢泡腾颗粒由下述重量份的原料和辅料制备而成：原料：黄连200，黄柏200，大黄100，黄芩200，板蓝根200，甘草100；辅料：碳酸氢钠108～132，富马酸90～110，稀释剂549～671，矫味剂18～22。同时采用酸碱分开制粒的方法制备泡腾颗粒。本发明采用碳酸氢钠作为碱性剂，采用富马酸作为酸性剂，并添加其它辅料制备四黄止痢泡腾颗粒能减少辅料用量，制备工艺简单，易成型，不易吸湿，泡腾速度快，泡腾效果好，溶化性好，泡腾后药液澄清度好、无焦屑异物等。
之所以中药复方制剂能够发挥较好的疗效，是由于多种中药成分相互之间的协同作用，四黄止痢颗粒中黄芩主要成分是黄芩苷，黄连、黄柏主要成分为小檗碱，甘草的主要成分为甘草苷，大黄主要成分为大黄素，板蓝根的主要成分(R,S)-告依春。2015版《中国兽药典》二部中要求只测定黄芩苷的含量，以及对盐酸小檗碱、大黄对照药材进行薄层鉴别，其他几种成分未做检测要求，如此，有效物质在高温之后降解的很明显，使得对四黄止痢颗粒的质量难以全面控制。
小檗碱、大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷、甘草苷的含量测定方法，均有相关文献报道，如申请号为201310739482.8中公开了一种检验四黄止痢颗粒质量的方法，该方法是在四黄止痢颗粒原标准的基础上结合实际情况进行适当改进，对产品质量标准进行修订获得，其增加了黄芩的鉴别，同时提供一种盐酸小檗碱的高效液相色谱(HPLC)测定方法。该方法经方法学验证，能够更有效地控制产品的内在质量，并保证产品质量的稳定。该方法操作简单，达到了中药产品含量测定项要求对有效成分种类尽可能多地加以控制，使产品的质量水平提升，可以增加产品的市场竞争力。
但同时测定几种成分却鲜有报道。为了能够更有效地控制四黄止痢颗粒的质量，同时保证产品的安全、有效、稳定，建立同时测定四黄止痢颗粒中的大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷、甘草苷4种主要成分含量的方法显得非常重要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种操作简单，成本低的能同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法。
经研究，本发明提供以下技术方案：
同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法，该方法采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法，包括以下步骤：
1)色谱条件
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相及洗脱方式：以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按以下程序进行梯度洗脱，
0～5min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
5～10min：流动相为体积比85:15的流动相A-流动相B混合液；
10～20min：流动相为体积比80:20的流动相A-流动相B混合液；
20～30min：流动相为体积比75:25的流动相A-流动相B混合液；
30～45min：流动相为体积比65:35的流动相A-流动相B混合液；
45～65min：流动相为体积比35:65的流动相A-流动相B混合液；
65～70min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
70～75min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
流速：0.8mL/min；
检测器：DAD检测器；
2)供试品溶液的制备
取供试品，制成供试品溶液；
3)对照品溶液及混合对照品溶液的制备
精密称定大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷，分别用甲醇溶液溶解，依次制成4种对照品溶液，再分别精密量取4种对照品溶液混合，并用甲醇溶液稀释，得到混合对照品溶液；
4)测定
依次分别精密量取大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷对照品溶液，以及混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，另精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，同法测定，按外标法以峰面积计算供试品中各有效成分的含量。
优选的，所述磷酸水溶液为质量百分含量为0.1％的磷酸水溶液。
优选的，所述甲醇溶液为质量百分含量为75％的甲醇溶液。
更优选的，所述供试品溶液的制备方法如下：精密称取供试品，研细，置于100mL容量瓶中，加入75％甲醇溶液，超声处理20min，冷却至室温，再用75％甲醇溶液定溶于100mL，摇匀，滤过，取续滤液，即可。
更优选的，所述对照品溶液及混合对照品溶液的制备方法如下：分别精密称取大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷，加入75％甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.4mg/mL、0.03mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL的4种对照品溶液，再分别精密量取4种2.0mL对照品溶液置于25mL容器中，加入75％甲醇溶解并定容，得到混合对照品溶液。
本发明提供的同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法以四黄止痢颗粒原标准及其有效成分为依据，对四黄止痢颗粒中的4种有效成分进行准确的分析检测，能进一步有效控制四黄止痢颗粒的质量，实现对制剂质量进行全面地评价，从而最大限度地保证产品质量的稳定性及兽用药的安全性、有效性。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法，采用HPLC-DAD联用法，DAD检测器可对多个波长同时检测，从而实现同时对四黄止痢颗粒中的大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷4种有效成分进行准确的分析检测，能进一步有效控制四黄止痢颗粒的质量，实现对制剂质量进行全面地评价，从而最大限度地保证产品质量的稳定性及兽用药的安全性、有效性；
2)本发明提供的同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法的专属性强、精密度高、稳定性好、准确度高，操作简便，试剂与耗材价廉易得，能够有效地控制产品生产质量及其稳定性，提升产品的品质及市场竞争力，在医药行业中具有推广实用价值。
附图说明
图1为大黄素对照品溶液的色谱图；
图2为(R,S)-告依春对照品溶液的色谱图；
图3为黄芩苷对照品溶液的色谱图；
图4为甘草苷对照品溶液的色谱图；
图5为混合对照品溶液的色谱图；
图6为供试品溶液的色谱图；
图7为缺黄芩阴性混合样品溶液的色谱图；
图8为缺甘草阴性混合样品溶液的色谱图；
图9为缺大黄阴性混合样品溶液的色谱图；
图10为缺板蓝根阴性混合样品溶液的色谱图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法为HPLC-DAD法，该方法包括以下步骤：
1)色谱条件
色谱柱：SunFireTMC18(4.6mm×150mm，5μm)；
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相及洗脱方式：以0.1％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按以下程序进行梯度洗脱，
0～5min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
5～10min：流动相为体积比85:15的流动相A-流动相B混合液；
10～20min：流动相为体积比80:20的流动相A-流动相B混合液；
20～30min：流动相为体积比75:25的流动相A-流动相B混合液；
30～45min：流动相为体积比65:35的流动相A-流动相B混合液；
45～65min：流动相为体积比35:65的流动相A-流动相B混合液；
65～70min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
70～75min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
流速：0.8mL/min；
柱温：30℃；
检测器：DAD检测器；
2)供试品溶液的制备
精密称取供试品1g，研细，置于100mL容量瓶中，加入75％甲醇溶液，超声处理(功率300W，频率40kHz)20min，冷却至室温，再用75％甲醇溶液定溶于100mL，摇匀，滤过，取续滤液，即可；
3)对照品溶液及混合对照品溶液的制备
分别精密称取大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷适量，加入75％甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.4mg/mL、0.03mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL的4种对照品溶液，再分别精密量取4种2.0mL对照品溶液置于25mL容器中，加入75％甲醇溶解并定容，得到混合对照品溶液；
4)测定
依次分别精密量取10μL大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷对照品溶液，以及混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，另精密量取供试品溶液10μL注入液相色谱仪，同法测定，按外标法以峰面积计算供试品中各有效成分的含量。
其中，对照品中，(R,S)-告依春对照品购自中国食品药品检定研究院；黄芩苷对照品购自中国兽医药品检查所；甘草苷对照品购自中国药品生物制品检定所；大黄素对照品购自中国药品生物制品检定所。供试品为本厂生产的四黄止痢颗粒。
本实施例中，大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷对照品溶液的检测波长分别为254nm，245nm，276nm和276nm，大黄素、(R,S)-告依春、黄芩苷和甘草苷对照品溶液的色谱图，如图1～图4所示，混合对照品溶液和供试品溶液的检测波长为245nm；254nm；276nm；色谱图如图5和图6所示。
从图1～图4中分析可知，各阴性样项处无其他干扰峰，从图5和图6中分析可知，(R,S)-告依春对照和甘草苷对照峰型良好，分离度好，无干扰峰。
测定方法的验证
1、专属性
阴性样品的制备：分别取甘草、大黄和板蓝根的混合样品，黄芩、大黄和板蓝根的混合样品，黄芩、甘草和板蓝根的混合样品，黄芩、甘草和大黄的混合样品，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备成不同的混合样品溶液，并按实施例1中的色谱条件进行测定，色谱图结果如图7～10所示。
图7为缺黄芩阴性混合样品溶液的色谱图，图8为缺甘草阴性混合样品溶液的色谱图，图9为缺大黄阴性混合样品溶液的色谱图，图10为缺板蓝根阴性混合样品溶液的色谱图。将图1～图4与图7～图10对比分析可知，各混合样品色谱图中出现的色谱峰和对照品主峰的保留时间一致，而阴性对照在此保留时间无色谱峰，从而证明了各有效成分在保留时间位置上阴性样品无干扰。进一步证明了本发明方法的专属性。
2、线性关系
分别精密量取0.5、1、2、4、6、8mL实施例1中的混合对照品溶液置10mL量瓶中，加入75％甲醇溶液溶解并定容，制得一系列混合对照品溶液，避光保存。按实施例1中的色谱条件测定峰面积。以混合对照品溶液的进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。各组分线性范围及回归方程与相关系数(R)如表1所示：
表1各组分线性关系结果
Figure BDA0002507122230000071
从表1中分析可知，4种有效成分均在线性范围内，且相关系数值R均大于0.999，证明了4种有效成分均具有良好的线性关系。
3、精密度
精密量取实施例1中的4种对照品溶液10μL注入液相色谱仪，按实施例1中的色谱条件进行操作和测定，记录色谱图，重复6次，以各有效成分色谱峰的6次测得的峰面积计算相对标准偏差(RSD)，结果如表2所示：
表2精密度考察结果
Figure BDA0002507122230000072
从表2中结果分析可知，4种有效成分的RSD值均小于0.7，从而证明了本发明方法具有良好的精密度。
4、加样回收率测定
精密取6份已知含量的四黄止痢颗粒样品0.5g，研细，分别置50mL容量瓶中，分别精密加入适量各对照品溶液，按实施例1的步骤2)中方法制备平行供试品溶液，以实施例1中相同的色谱条件进行测定，各有效成分的平均回收率及其RSD的结果如表3所示：
表3加样回收率和RSD结果
Figure BDA0002507122230000073
从表3中结果分析可知，4种有效成分的回收率均大于98％，且RSD≤1.4％，从而证明了本发明方法具有较高的回收率。
本发明的上述实施例仅仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，本发明的保护范围不限于此。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (1)

1.同时测定四黄止痢颗粒中4种有效成分的方法，其特征在于，该方法采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法，包括以下步骤：
1）色谱条件
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相及洗脱方式：以质量百分含量为0.1%的磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按以下程序进行梯度洗脱，
0~5min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
5~10min：流动相为体积比85:15的流动相A-流动相B混合液；
10~20min：流动相为体积比80:20的流动相A-流动相B混合液；
20~30min：流动相为体积比75:25的流动相A-流动相B混合液；
30~45min：流动相为体积比65:35的流动相A-流动相B混合液；
45~65min：流动相为体积比35:65的流动相A-流动相B混合液；
65~70min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
70~75min：流动相为体积比92:8的流动相A-流动相B混合液；
流速：0.8mL/min；
柱温：30℃；
检测器：DAD检测器；
2）供试品溶液的制备
精密称取供试品，研细，置于100 mL容量瓶中，加入质量百分含量为75%的甲醇溶液，超声处理20 min，冷却至室温，再用质量百分含量为75%的甲醇溶液定容于100 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即可；
3）对照品溶液及混合对照品溶液的制备
分别精密称取大黄素、（R,S）-告依春、黄芩苷和甘草苷，加入质量百分含量为75%的甲醇溶液溶解并定容，制成质量浓度分别为0.4 mg/mL、0.03 mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL的4种对照品溶液，再分别精密量取4种对照品溶液2.0 mL置于25 mL容器中，加入质量百分含量为75%的甲醇溶液稀释并定容，得到混合对照品溶液；
4）测定
依次分别精密量取大黄素、（R,S）-告依春、黄芩苷和甘草苷对照品溶液，以及混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，另精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，同法测定，按外标法以峰面积计算供试品中各有效成分的含量；大黄素、（R,S）-告依春、黄芩苷和甘草苷对照品溶液的检测波长分别为254nm，245nm，276nm和276nm，混合对照品溶液和供试品溶液的检测波长为245nm，254nm，276nm。
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