CN114965768B - 一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，建立的莫诺苷、马钱苷和芒果苷的一测多评定量测定方法，采用双通道，莫诺苷和马钱苷在240nm、芒果苷在318nm检测，既解决了芒果苷阴性干扰问题，使各波峰大小适宜，互不干扰，一测三评，效率高，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法。快速定量方法是指用高效液相色谱方法，双通道不同检测波长，对莫诺苷、马钱苷、芒果苷的一测三评定量测定。
背景技术
本发明所涉及的中药组合物，由山萸肉、五味子、白芍、酸枣仁、牡丹皮、北柴胡、炒栀子、地黄、知母和莲子心，10味中药组成。具有治疗失眠、焦虑、抑郁和更年期综合征的作用。
中药及其复方制剂中，由于药味多，各药味的剂量低，众多的微量有效成分之间相互干扰，定量测定指标少，而众多的药材与有效成分是无法控制其投料情况与含量的，质量标准识别水平太低，无法给质量监督提供有力支撑。为更好的控制本药物的质量，稳定药物的疗效，需要对该中药组合物的质量指标和质量检测方法进行研究。
发明内容
本发明的原理如下。
通过调整流动相的组分、比例以及检测波长，使性质不同的有效成分能在同一流动相中，不同的检测波长下，都能呈现波峰分离良好、无干扰，峰面积适宜，而且其波峰面积与含量呈良好线性关系，而得以定量测定。
解决的技术问题。
建立的莫诺苷、马钱苷和芒果苷的一测三评定量方法，以双通道，芒果苷在318 nm、莫诺苷与马钱苷在240nm检测，既解决了芒果苷阴性干扰问题，使各波峰大小适宜，互不干扰，一测三评，效率高，成本低。
技术方案。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，包括以下步骤。
第一步：色谱柱为C18柱，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液（V/V）为流动相B，A+B=100%，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0~30min，A7%，B93%，流速1.0ml/min； 30~60min，A7%→10%，B93%→90%，流速0.5ml/min；60~62min，A10%→90%，B90%→10%，流速1.0ml/min；62~72min， A90%，B10%，流速1.0ml/min；72~73min，A90%→7%，B10%→93%，流速1.0ml/min，检测波长为：莫诺苷、马钱苷的检测波长为240nm，芒果苷的检测波长为318nm；柱温为35℃，进样量10μl。
第二步：对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、马钱苷、芒果苷对照品适量，加80%甲醇制成每1mL含莫诺苷100μg、马钱苷130μg、芒果苷48μg的混合对照品溶液。
第三步：供试品溶液制备：取该中药组合物，研细，取1.0g，精密称定，精密加入80%甲醇溶液25mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率20kHz）20分钟，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
第四步：分别制备缺山萸肉药材的制剂、缺知母药材的制剂，再根据第三步分别制备缺山萸肉阴性对照溶液；缺知母阴性对照溶液。
第五步：方法学考察，所述方法学考察包括线性关系考察、专属性试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收试验、耐用性试验，所述线性关系考察中的对照品溶液为：精密称取莫诺苷、马钱苷对照品适量，分别置于不同的25mL量瓶中，加80%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/mL的莫诺苷对照品储备液和浓度为0.6mg/mL的马钱苷对照品储备液；精密称取芒果苷对照品适量，置于25mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/mL的芒果苷对照品储备液；分别精密吸取上述对照品储备液适量置于10mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成35.70、52.29、79.53、106.04、132.56、159.70μg/mL莫诺苷系列浓度溶液；43.14、64.39、96.10、128.14、160.17、192.98μg/mL马钱苷系列浓度溶液和16.46、24.57、36.67、48.90、61.12、73.64μg/mL芒果苷系列浓度溶液，各进样10μL，以各对照品的浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。
所述专属性试验为分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl进样，记录色谱图。
所述精密度试验为精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，分别在所述第一步中的色谱条件下连续进样6次，测定莫诺苷、马钱苷、芒果苷的峰面积的RSD值。
所述稳定性试验为精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，每隔一定时间测定峰面积，考察了24h内的稳定性，测莫诺苷、马钱苷、芒果苷的峰面积的RSD值。
所述重复性试验为精密称取以高、中、低剂量9份样品，分别按所述第二步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
所述加样回收试验为精密称取已知含量的同一批样品9份，按高、中、低比例精密加入一定量的对照品，按所述第三步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
所述耐用性试验为考察了同一品牌不同批号的色谱柱，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
（三）有益效果。
本发明的创新点及有益效果如下。
(1) 本发明针对多药味组成的制剂其定量测定提高到3种成分，而且是以最常用的梯度洗脱的方式，同一流动相，不同检测波长下的同时测定。检测波长：莫诺苷、马钱苷240nm，芒果苷318nm。在不同的波长下检测不同的成分，各波峰大小适宜，互不干扰，一测三评，简便、快捷、准确，成本低、效率高，有利于市场监督。
（2）本发明提高了检测效率，降低检测成本，减少环境污染，形成了一套简便、快捷、高效、低耗、低污染、多指标控制药品质量的现代化标准。
附图说明
图1 莫诺苷对照品线性关系图。
图2 马钱苷对照品线性关系图。
图3 芒果苷对照品线性关系图。
图4莫诺苷、马钱苷对照品的HPLC色谱图。
图5芒果苷对照品的HPLC色谱图。
图6中药组合物样品莫诺苷、马钱苷HPLC色谱图。
图7中药组合物样品芒果苷HPLC色谱图。
图8缺山萸肉的空白样品HPLC色谱图。
图9缺知母的空白样品HPLC色谱图。
图10 Waters Symmetry C18（4.6×250mm）S.N.03253008313852中药组合物中莫诺苷和马钱苷HPLC色谱图。
图11 Waters Symmetry C18（4.6×250mm）S.N.03253008313852中药组合物中芒果苷HPLC色谱图。
图12Waters Symmetry C18（4.6×250mm）S.N.03333031512401中药组合物中莫诺苷和马钱苷HPLC色谱图。
图13 Waters Symmetry C18（4.6×250mm）S.N.03333031512401中药组合物中芒果苷HPLC色谱图。
图14 Waters Symmetry C18（4.6×250mm）S.N. 03333032932466中药组合物中莫诺苷和马钱苷HPLC色谱图。
图15 Waters Symmetry C18（4.6×250mm）S.N. 03333032932466中药组合物中芒果苷HPLC色谱图。
图1、图2、图3中，横坐标为进样量μg,纵坐标为峰面积。
图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15中，1.为莫诺苷，2.芒果苷 3.马钱苷。
本发明具体实施方式如下：
莫诺苷、马钱苷和芒果苷一测三评快速测定方法。
第一步：色谱柱为C18柱，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液（V/V）为流动相B，A+B=100%，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0~30min，A7%，B93%，流速1.0ml/min； 30~60min，A7%→10%，B93%→90%，流速0.5ml/min；60~62min，A10%→90%，B90%→10%，流速1.0ml/min；62~72min， A90%，B10%，流速1.0ml/min；72~73min，A90%→7%，B10%→93%，流速1.0ml/min，检测波长为：莫诺苷、马钱苷的检测波长为240nm，芒果苷的检测波长为318nm；柱温为35℃，进样量10μl。
第二步：对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、马钱苷、芒果苷对照品适量，加80%甲醇制成每1mL含莫诺苷100μg、马钱苷130μg、芒果苷48μg的混合对照品溶液。
第三步：供试品溶液制备：取该中药组合物，研细，取1.0g，精密称定，精密加入80%甲醇溶液25mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率20kHz）20分钟，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
第四步：分别制备缺山萸肉药材的制剂、缺知母药材的制剂，再根据第三步分别制备缺山萸肉阴性对照溶液；缺知母阴性对照溶液。
第五步：方法学考察，所述方法学考察包括线性关系考察、专属性试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收试验、耐用性试验，所述线性关系考察中的对照品溶液为：精密称取莫诺苷、马钱苷对照品适量，分别置于不同的25mL量瓶中，加80%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/mL的莫诺苷对照品储备液和浓度为0.6mg/mL的马钱苷对照品储备液；精密称取芒果苷对照品适量，置于25mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/mL的芒果苷对照品储备液；分别精密吸取上述对照品储备液适量置于10mL量瓶中，加80%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成35.70、52.29、79.53、106.04、132.56、159.70μg/mL莫诺苷系列浓度溶液；43.14、64.39、96.10、128.14、160.17、192.98μg/mL马钱苷系列浓度溶液和16.46、24.57、36.67、48.90、61.12、73.64μg/mL芒果苷系列浓度溶液，各进样10μL，以各对照品的浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。通过方法学考察，莫诺苷进样量在0.3570~1.5970μg，与峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为：Y=17357144X-112533(r=0.99987,n=6)（表1、图1）；马钱苷进样量在0.4314~1.9298μg，与峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为：Y=3199039X-253582(r=0.99978,n=6) （表2、图2）；芒果苷进样量在0.1647~0.7364μg，与峰面积呈现良好的线性关系，回归方程为：Y=4720572X-158941(r=0.99976,n=6)（表3、图3）。
所述专属性试验为分别量取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl进样，记录色谱图（图4、5、6、7、8、9），供试品与对照品在同一保留时间有相同的色谱峰出现，而阴性样品则没有相应的峰出现。
所述精密度试验为精密量取混合对照品溶液，分别在所述第一步中的色谱条件下连续进样6次，记录峰面积：莫诺苷、马钱苷、芒果苷对照品6次测定的峰面积平均值分别为1613588、3580945、1965209，RSD分别为0.61%、0.56%、0.63%；供试品中莫诺苷、马钱苷、芒果苷的平均值分别为1700339、3281806、1427129，RSD为0.27%、0.38%、0.23%。结果表明：本方法精密度较好（见表4）。
所述稳定性试验为取混合对照溶液和供试品溶液，每隔一定时间测定峰面积，考察了48h内的稳定性，对照品莫诺苷、马钱苷在30h内的RSD分别为1.65%、1.65%，芒果苷在20h内的RSD为1.72%；供试品莫诺苷、马钱苷、在48h内的RSD分别为0.30%、0.45%，芒果苷在24h内的RSD为1.85%。结果表明：对照品溶液在20h内、供试品溶液在24h内稳定。莫诺苷和马钱苷稳定性（表5）、芒果苷稳定性（表6）。
所述重复性实验为精密称取以高、中、低剂量9份样品，分别按所述第二步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定，莫诺苷、马钱苷、芒果苷的平均含量分别2.460mg/g、2.577mg/g、0.774mg/g，RSD分别为0.381%、0.373%、0.433%。结果表明：本方法的重现性良好（表7）。
所述加样回收试验为精密称取已知含量的同一批样品9份，按高、中、低比例精密加入一定量的对照品，按所述第三步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定，计算回收率。采用加样回收实验，结果表明：莫诺苷的平均回收率为101.94%，RSD为1.47%（表8）、马钱苷的平均回收率为101.25%，RSD为1.48%（表9）、芒果苷的平均回收率为96.67%，RSD为1.47%，RSD为1.84%（表10）。
所述耐用性试验为考察了不同品牌的色谱柱【waters Symmetry C18（4.6*250mm）、Agilent zorbax SB-Aq（4.6*250mm）、Thermo AcclaimC18（4.6*250mm）】，所得的检测结果没有明显的差异，且RSD值均在2%以下，且各色谱峰分离度较好，说明此方法耐用性良好
（表11、图10、11,图12、13，图14、15）。
表1莫诺苷进样量与峰面积
表 2 马钱苷进样量与峰面积
表 3 芒果苷进样量与峰面积
表 4 精密度实验结果
表 5 莫诺苷、马钱苷稳定性试验结果
表 6 芒果苷稳定性试验结果
表 7 重复性试验结果 ( mg/g )
表 8 样品中莫诺苷加样回收率试验结果
表 9 样品中马钱苷加样回收率试验结果
表 1 0 样品中芒果苷加样回收率试验结果
表 1 1 不同色谱柱耐用性试验结果 ( mg/g )
Claims (7)
1.一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，其特征在于，所述的该中药组合物由山萸肉、五味子、白芍、酸枣仁、牡丹皮、北柴胡、炒栀子、地黄、知母和莲子心，10味中药组成，采用高效液相色谱法对该中药组合物中的莫诺苷、马钱苷和芒果苷三种成分进行含量测定，测定的色谱条件为：
第一步：色谱柱为C18柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液V/V为流动相B，A+B＝100％，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～30min，A7％，B93％，流速1.0ml/min；30～60min，A7％→10％，B93％→90％，流速0.5ml/min；60～62min，A10％→90％，B90％→10％，流速1.0ml/min；62～72min，A90％，B10％，流速1.0ml/min；72～73min，A90％→7％，B10％→93％，流速1.0ml/min，检测波长为：莫诺苷、马钱苷的检测波长为240nm，芒果苷的检测波长为318nm；柱温为35℃，进样量10μl；
第二步：对照品溶液的制备：分别精密称取莫诺苷、马钱苷、芒果苷对照品适量，加80％甲醇制成每1mL含莫诺苷100μg、马钱苷130μg、芒果苷48μg的混合对照品溶液；
第三步：供试品溶液制备：取该中药组合物，研细，取1.0g，精密称定，精密加入80％甲醇溶液25mL，称定重量，以功率250W，频率20kHz超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；
第四步：分别制备缺山萸肉药材的制剂、缺知母药材的制剂，再根据第三步分别制备缺山萸肉阴性对照溶液；缺知母阴性对照溶液；
第五步：方法学考察，所述方法学考察包括线性关系考察、专属性试验、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收试验、耐用性试验，所述线性关系考察中的对照品溶液为：精密称取莫诺苷、马钱苷对照品适量，分别置于不同的25mL量瓶中，加80％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/mL的莫诺苷对照品储备液和浓度为0.6mg/mL的马钱苷对照品储备液；精密称取芒果苷对照品适量，置于25mL量瓶中，加稀乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.6mg/mL的芒果苷对照品储备液；分别精密吸取上述对照品储备液适量置于10mL量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制成35.70、52.29、79.53、106.04、132.56、159.70μg/mL莫诺苷系列浓度溶液；43.14、64.39、96.10、128.14、160.17、192.98μg/mL马钱苷系列浓度溶液和16.46、24.57、36.67、48.90、61.12、73.64μg/mL芒果苷系列浓度溶液，各进样10μL，以各对照品的浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。
2.根据权利要求1所述的一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，其特征在于：所述专属性试验为分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl进样，记录色谱图。
3.根据权利要求1所述的一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，其特征在于：所述精密度试验为精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，分别在所述第一步中的色谱条件下连续进样6次，测定莫诺苷、马钱苷、芒果苷的峰面积的RSD值。
4.根据权利要求1所述的一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，其特征在于：所述稳定性试验为精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，每隔一定时间测定峰面积，考察了24h内的稳定性，测莫诺苷、马钱苷、芒果苷的峰面积的RSD值。
5.根据权利要求1所述的一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，其特征在于：所述重复性实验为精密称取以高、中、低剂量9份样品，分别按所述第二步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
6.根据权利要求1所述的一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，其特征在于：所述加样回收试验为精密称取已知含量的同一批样品9份，按高、中、低比例精密加入一定量的对照品，按所述第三步中的方法制备供试品溶液，按所属第一步中的色谱条件进样测定。
7.根据权利要求1所述的一种中药组合物的一测三评快速定量检测方法，其特征在于：所述耐用性试验为考察了同一品牌不同批号的色谱柱对检测结果的影响。
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