CN102778516A - 一种大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法。它是将大黄蛰虫胶囊用体积分数50%的乙醇水溶液提取后，过滤取续滤液作为样品液，以黄芩苷和大黄酚为对照品，应用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，用ECOSIL C18 250mm×4.6mm，5.0μm柱为色谱柱；流动相：A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱，流速：1.0mL/min；柱温：35℃，紫外检测波长是：0~7min，210nm；7~18min，235nm；18~46min，254nm，其中梯度洗脱的程序以如下体积比浓度配置进行：0~8min，19%B；8~33min，19%~50%B；33~38min，50%~85%B；38~40min，85%~90%B；40~42min，90%~100%B；42~44min，100%B；44~45min，100%~19%B。本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高和重现性好等优点，可准确可靠的控制大黄蛰虫胶囊的质量。

Description

一种大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法

技术领域

本发明属于有机物分析检测领域，具体涉及一种大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法。

背景技术：

大黄蛰虫胶囊是一种复方中成药，由多味中药材组成，化学成分很复杂。其疗效是由各种化学成分协调作用的结果，大黄蛰虫胶囊质量的优劣与药材中化学成分的构成及其含量密切相关。但目前中国药典及文献中对大黄蛰虫胶囊产品的质量控制标准，仅局限于个别成分的检测，不能全面反映该产品的特性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法，利用该鉴别方法可以全面的反映大黄蛰虫胶囊中主要药味的主要有效成分，获得指纹图谱，用于评价和控制大黄蛰虫胶囊的质量，可以保证大黄蛰虫胶囊的质量稳定性、一致性和可控性，从而确保大黄蛰虫胶囊的安全性和有效性。

本发明通过提取出大黄蛰虫胶囊中的有效成分，高效液相色谱分离，得到大黄蛰虫胶囊的指纹图谱，基本涵盖了其处方的14种有效成分，能全面评价其产品质量，从而实现了本发明的目的。

本发明的大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法，其特征在于，大黄蛰虫胶囊用体积分数50%的乙醇水溶液提取后，过滤取续滤液作为样品液，以黄芩苷和大黄酚为对照品，应用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，用ECOSIL C18(250mm×4.6mm，5.0μm)柱为色谱柱；流动相：A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱，流速：1.0mL/min；柱温：35℃，紫外检测波长是：0~7min，210nm；7~18min，235nm；18~46min，254nm，其中梯度洗脱的程序以如下体积比浓度配置进行：0~8min，19%B；8~33min，19%~50%B；33~38min，50%~85%B；38~40min，85%~90%B；40~42min，90%~100%B；42~44min，100%B；44~45min，100%~19%B，再根据大黄蛰虫胶囊的指纹图谱中14个共有特征指纹峰与对照指纹图谱的相似度，鉴别并评价大黄蛰虫胶囊产品的真伪和质量。

所述的大黄蛰虫胶囊用体积分数50%的乙醇水溶液提取优选是将大黄蛰虫胶囊和体积分数50%的乙醇水溶液按照0.5g：25ml的用量比混合提取。

进一步优选，所述的混合提取是在功率250W，频率40kHz条件下超声波处理30分钟。

所述的对照品是通过以下方法制备的：取黄芩苷和大黄酚，用甲醇溶解，分别配制成每毫升含黄芩苷25μg和大黄酚9μg的标准溶液。

用本发明的方法建立的大黄蛰虫胶囊指纹图谱共有14个特征指纹峰，其归属为：1号峰为苦杏仁苷，为桃仁或苦杏仁的主要成分；2号峰为芍药苷，为白芍的主要成分；3号峰为甘草苷、9号峰为甘草酸，均来源于甘草；4号及6号峰来源于大黄；5号峰为黄芩苷、8号峰为黄芩素、7号峰及11号峰均来源于黄芩；10号峰为芦荟大黄素、12号峰为大黄素、13号峰为大黄酚、14号峰为大黄素甲醚均来源于大黄。各峰的平均保留时间如图3，具体为：1号峰苦杏仁苷5.3min，2号峰芍药苷8.5min，3号峰甘草苷13.2min，4号峰16.2min，5号峰黄芩苷20.6min，6号峰23.2min；7号峰24.8min，8号峰黄芩素29.8min，9号峰甘草酸30.6min，10号峰芦荟大黄素33.4min，11号峰36.2min；12号峰大黄素39.2min，13号峰大黄酚41.4min，14号峰大黄素甲醚42.4min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点和效果：

（1）本发明采用体积分数50%的乙醇水溶液作为提取剂，可以兼顾大黄蛰虫胶囊处方中的大多数有效成分。大黄蛰虫胶囊处方由多味中药组成，成分复杂，其有效成分的化学结构差异较大，需选择一种合适的提取剂，才能将各种有效成分从胶囊中提取出来。本发明比较了甲醇、乙醇及不同比例的甲醇-水、乙醇-水等作为提取剂的提取效率。结果表明，高比例有机溶剂适合提取极性较小的大黄蒽醌类成分(如大黄素等)，低比例有机溶剂对苷类成分(如苦杏仁苷及芍药苷等)有较高的提取率，但也引入了较多的强极性杂质，干扰测定。经反复试验，确定50%乙醇作为提取剂为最佳。

（2）由于大黄蛰虫胶囊中的指标成分化学结构不同，紫外吸收差别较大，如果在同一波长下检测将会损失某些成分的灵敏度。因此，本发明采用可变波长检测器，采用不同时间段选择不同波长进行分段检测的方法，分别在各成分的最大紫外吸收处检测，使各化合物在相应波长下获得最高的检测灵敏度。

（3）本方法选用乙腈流动相体系，截止波长较低，有利于在210nm低波长下的测定。比较了流动相为甲醇-水，乙腈-水，甲醇-0.1%磷酸水溶液(V/V)，乙腈-0.1%磷酸水溶液(V/V)，甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液(V/V)等体系，结果表明，甲醇体系有较好的分离能力，但要将所有成分分离开需要较长的分析时间，而且甲醇的截止波长较高，不利于在210nm低波长下的测定。在流动相中加入磷酸作为添加剂，可以很好地改善苦杏仁苷及芍药苷等的峰形，实验比较了不同体积比的磷酸水溶液，选用0.1%磷酸水溶液(V/V)可获得最佳效果。反复试验了流动相的梯度洗脱程序，最终确定的梯度程序对大黄蛰虫胶囊的有效成分可获得良好的色谱分离效果。

（4）本方法在上述优化的条件下，测得的大黄蛰虫胶囊指纹图谱，共有14个特征指纹峰，能全面地反映处方中主要药味的有效成分，表征其质量，有利于全面监控产品的质量，保证了产品质量的长期稳定性，疗效的安全性和可靠性。指纹图谱注重各特征峰的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，避免了现有技术中大黄蛰虫胶囊质量控制只能测定个别的成分的单一性和片面性，减少了人为处理产品质量达标的可能性。

本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高和重现性好等优点，可准确可靠的控制大黄蛰虫胶囊的质量。

附图说明：

图1是参照物溶液的高效液相色谱图，其中峰1：苦杏仁苷，峰2：芍药苷，峰3：甘草苷，峰4：黄芩苷，峰5：黄芩素，峰6：甘草酸，峰7：芦荟大黄素，峰8：大黄素，峰9：大黄酚，峰10：大黄素甲醚；

图2是10批次大黄蛰虫胶囊成品的指纹图谱叠加图；

图3是大黄蛰虫胶囊的对照指纹图谱，其中峰1：苦杏仁苷、峰2：芍药苷、峰3：甘草苷、峰5：黄芩苷、峰8：黄芩素、峰9：甘草酸、峰10：芦荟大黄素、峰12：大黄素、峰13：大黄酚、峰14：大黄素甲醚。

具体实施方式：

以下实施例是本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：大黄蛰虫胶囊指纹图谱的建立

1、色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Ecosil C18，250mm×4.6mm，5.0μm)；以0.1%磷酸溶液（V/V）为流动相A，乙腈为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；温度35℃；检测波长按表2的规定设置。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。

表1：梯度洗脱程序

表2：检测波长设置

2、参照物溶液的制备

精密称取黄芩苷及大黄酚等对照品适量，用甲醇溶解，配制成每1mL中含黄芩苷25μg和大黄酚9μg的标准溶液作为参照物溶液。

3、供试品溶液的制备

取大黄蛰虫胶囊内容物，研匀，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数50%的乙醇水溶液25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，温度为室温，再放冷，再称定重量，用50%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

供试品的大黄蛰虫胶囊为10个批次的大黄蛰虫胶囊，其批号分别为：101102，101201，101202，110201，110604，110603，110203，110501，110601，110602，分别进行实验。

4、测定方法

分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，按照步骤1的高效液相色谱条件测定，记录45分钟的色谱图，得到参照物溶液的高效液相色谱图（图1）和10批次大黄蛰虫胶囊成品的指纹图谱叠加图（图2）

通过10个批次大黄蛰虫胶囊成品的指纹图谱叠加图的比较（图2），不同批次产品所对应的同一共有峰紫外光谱一致，表明各批次产品均具有相似主要特征成份，且各共有峰相对含量较稳定，确定为大黄蛰虫胶囊的指标成分群。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004年A版）”，所得对照指纹图谱如图3所示，大黄蛰虫胶囊的指纹图谱共有14个特征指纹峰，其归属为：1号峰为苦杏仁苷，为桃仁或苦杏仁的主要成分；2号峰为芍药苷，为白芍的主要成分；3号峰为甘草苷、9号峰为甘草酸，均来源于甘草；4号及6号峰来源于大黄；5号峰为黄芩苷、8号峰为黄芩素、7号峰及11号峰均来源于黄芩；10号峰为芦荟大黄素、12号峰为大黄素、13号峰为大黄酚、14号峰为大黄素甲醚均来源于大黄，其平均保留时间如表3所示，对10批次大黄蛰虫胶囊进行相似度计算，参照参照物溶液的高效液相色谱图，10批次大黄蛰虫胶囊与对照指纹图谱（10批次大黄蛰虫胶囊生成的共有模式S1）相似度计算结果为如表4所示。

本发明的指纹图谱基本涵盖了大黄蛰虫胶囊处方的主要有效成分，能全面评价其产品质量。

表4 10批大黄蛰虫胶囊成品与对照指纹图谱的相似度测定结果

实施例2：某大黄蛰虫胶囊样品的鉴别

采用实施例1所述的方法测定某大黄蛰虫胶囊样品。

供试品指纹图谱中分别呈现相应的参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，同时，出现大黄蛰虫胶囊的对照指纹图谱中的14个特征指纹峰。该大黄蛰虫胶囊样品中的指纹图谱相似度为0.985，鉴定该大黄蛰虫胶囊样品为正品。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法，其特征在于，大黄蛰虫胶囊用体积分数50%的乙醇水溶液提取后，过滤取续滤液作为样品液，以黄芩苷和大黄酚为对照品，应用高效液相色谱法建立指纹图谱，高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，用ECOSIL C18 250mm×4.6mm，5.0μm柱为色谱柱；流动相：A为0.1%磷酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱，流速：1.0mL/min；柱温：35℃，紫外检测波长是：0~7min，210nm；7~18min，235nm；18~46min，254nm，其中梯度洗脱的程序以如下体积比浓度配置进行：0~8min，19%B；8~33min，19%~50%B；33~38min，50%~85%B；38~40min，85%~90%B；40~42min，90%~100%B；42~44min，100%B；44~45min，100%~19%B，再根据大黄蛰虫胶囊的指纹图谱中14个共有特征指纹峰与对照指纹图谱的相似度，鉴别并评价大黄蛰虫胶囊产品的真伪和质量。

2.根据权利要求1所述的大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法，其特征在于，所述的大黄蛰虫胶囊用体积分数50%的乙醇水溶液提取是将大黄蛰虫胶囊和体积分数50%的乙醇水溶液按照0.5g：25ml的用量比混合提取。

3.根据权利要求2所述的大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法，其特征在于，所述的混合提取是在功率250W，频率40kHz条件下超声波处理30分钟。

4.根据权利要求1所述的大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法，其特征在于，所述的大黄蛰虫胶囊指纹图谱中具有14个特征指纹峰，其归属为：1号峰为苦杏仁苷，为桃仁或苦杏仁的主要成分；2号峰为芍药苷，为白芍的主要成分；3号峰为甘草苷、9号峰为甘草酸，均来源于甘草；4号及6号峰来源于大黄；5号峰为黄芩苷、8号峰为黄芩素、7号峰及11号峰均来源于黄芩；10号峰为芦荟大黄素、12号峰为大黄素、13号峰为大黄酚、14号峰为大黄素甲醚均来源于大黄。

5.根据权利要求4所述的大黄蛰虫胶囊指纹图谱鉴别方法，其特征在于，所述的大黄蛰虫胶囊指纹图谱中具有的14个特征指纹峰的保留时间为：1号峰苦杏仁苷5.3min，2号峰芍药苷8.5min，3号峰甘草苷13.2min，4号峰16.2min，5号峰黄芩苷20.6min，6号峰23.2min；7号峰24.8min，8号峰黄芩素29.8min，9号峰甘草酸30.6min，10号峰芦荟大黄素33.4min，11号峰36.2min；12号峰大黄素39.2min，13号峰大黄酚41.4min，14号峰大黄素甲醚42.4min。

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