KR101402607B1 - 여러 크기의 알로에 베라의 질량 분광법 기반 대사체 프로파일링 및 그 바이오마커 - Google Patents

여러 크기의 알로에 베라의 질량 분광법 기반 대사체 프로파일링 및 그 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여러 크기의 알로에 베라의 질량 분광법 기반 대사체 프로파일링 및 그 바이오마커에 관한 발명이다.

Description

여러 크기의 알로에 베라의 질량 분광법 기반 대사체 프로파일링 및 그 바이오마커{Mass Spectrometry-Based Metabolite Profiling of Different Sizes of Aloe vera and biomarker thereof}
본 발명은 여러 크기의 알로에 베라의 질량 분광법 기반 대사체 프로파일링 및 그 바이오마커에 관한 발명이다.
Aloe (Aloeaceae) 속은 북 아메리카, 유럽 및 아시아에서 재배되는 360 종 이상의 다른 종을 가진다. 그들 중에서, Aloe vera L. (A. barbadensis Miller)는 건강 식품 및 화장료 제품에 오랫동안 사용되어 왔다(Grindlay, D.; Reynolds, T., The Aloe vera phenomenon: A review of the properties and modern uses of the leaf parenchyma gel. J. Ethnopharmacol . 1986, 16,(2-3),117-151).
A. vera 젤 및 그 산물들은 크림, 요구르트, 음료 및 디저트로 상업적으로 사용된다. A. vera 추출물의 항산화, 함염증 및 항균 효과와 같은 생물학적 활성에 대한 연구들은 많이 보고되었다. 심지어 암, AIDS,및 궤양성 대장염을 포함하는 넓은 범위의 인간 질환에 대한 약리학적 기능도 논의되었다. 알로에 추출물은 강한 자유기 소거 활성을 가지고 항산화 화합물들이 보고되었다. 특히, anthraquinones 및 chromone과 같은 다양한 폴리페놀의 항산화 활성이 보고되었다. 대사체학 기술은 다변량 데이터 분석과 함께, 바이오마커 스크리닝, 품질 관리, 생물활성, 독성, 화학적분류 및 환경적 대사를 포함하는 여러 생명의학 및 파이토케미컬 연구에서 중요한 역할을 한다. 기존 mass spectrometry (MS)-기반 대사체 연구들은 이 기술이 Angelica acutiloba, Arabidopsis thaliana, Artemisia annua L., 및 Camellia 1 sinensis을 포함하는 식물들의 정성적 평가에 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 보여주었다.
관련 선행특허로 대한민국 특허공개번호 제1020090050916호는 알로에 발효물과 이의 제조방법 및 이를 이용한 기능성식품에 대해서 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 성장과 발달에 관련이 있는 바이오마커로 샘플의 크기에 따라서 대사체 차이를 규명하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다른 크기의 알로에 베라를 고분해능질량분석기/액체크로마토그래피(UPLC-Q-TOF-MS)를 사용하여 대사체 프로파일에 기초하여 분류하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 다른 크기는 10cm 미만, 10-20cm, 20-30cm 및 50cm 초과인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 알로에 베라를 고분해능질량분석기/액체크로마토그래피를 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 알로에신(aloesin), 호모나타로사이드(homonataloside) B , 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin), 7-하이드록시알로인(hydroxyaloin) B, 나타알로에에모딘(nataloeemodin), 및 알로에레진(aloeresin) A가 상대적으로 높게 검출되는 경우에 10cm 미만인 알로에 베라로 동정하는 것을 특징으로 하는 알로에 베라 크기를 분류하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 알로에신(aloesin), 호모나타로사이드(homonataloside) B , 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin), 7-하이드록시알로인(hydroxyaloin) B, 나타알로에에모딘(nataloeemodin), 및 알로에레진(aloeresin) A로 구성된 10cm 미만 알로에 베라 동정용 마커 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 알로에 베라를 고분해능질량분석기/액체크로마토그래피를 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 알로인(aloin) B, 알로인(aloin) A, 및 이소알로에레진(isoaloeresin)이 상대적으로 높게 검출되는 경우에 20-30cm 사이인 알로에 베라로 동정하는 것을 특징으로 하는 알로에 베라 크기를 분류하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 알로인(aloin) B, 알로인(aloin) A, 및 이소알로에레진(isoaloeresin)으로 구성된 20-30cm 사이 알로에 베라 동정용 마커 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 알로에 베라를 고분해능질량분석기/액체크로마토그래피를 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin) A, 6'-말로닐나타로인(malonylnataloin) B 및 6'-말로닐나타로인 A가 상대적으로 높게 검출되는 경우에 50cm 초과인 알로에 베라로 동정하는 것을 특징으로 하는 알로에 베라 크기를 분류하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin) A, 6'-말로닐나타로인(malonylnataloin) B 및 6'-말로닐나타로인 A로 구성된 50cm 초과 알로에 베라 동정용 마커 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서, 본 발명자들은 A. vera의 대사체 프로파일링을 위하여 PCA(principal component analysis), PLS DA(partial least squares discriminant analysis), 및 OPLS-DA(orthogonal projection to latent structures discriminate analysis)을 포함하는 다변량 분석과 결합한 GC-IT-MS(gas chromatography-ion trap-mass spectrometry) 및 UPLC-Q-TOF-MS(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry)를 사용하였다.
본 발명은 네 종의 다른 크기의 Aloe vera의 대사체 프로파일링을 다변량 분석을 가지고 GC-IT-MS(gas chromatography-ion trap-mass spectrometry) 및 UPLC-Q-TOF-MS(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry)를 사용하여 수행하였다. 성장 및 발달과 관련된 아미노산, 당 및 유기산을 GC-MS 분석에서 크기에 의하여 동정하였다. 특히, 알로에 샘플의 크기가 증가함에 따라서 포도당, 과당, 알라닌, 발린 및 아스파트산의 상대적인 양은 점차적으로 증가하였다. 9 anthraquinone 유도체 및 4 chromone 유도체가 UPLC-Q-TOF MS 분석에서 크기에 따라서 분리된 주된 대사체이었고 알로에의 항산화 성분일 것으로 시사한다. 알로에 샘플의 크기가 증가함에 따라서 7-hydroxy-8-O-methlyaloin, 7-hydroxyaloin A, 6'-malonylnataloin A, 및 6'-malonylnataloin B와 같은 anthraquinone 유도체는 점차적으로 증가한 반면에 chromone 유도체들은 계속적으로 감소하였다. A30 알로에 샘플(크기, 20-30 cm)은 상대적으로 높은 양의 aloin A 및 B를 가지며 네 종의 다른 크기의 알로에 추출물 중에서 가장 높은 항산화 활성을 나타내었다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
GC - IT - MS 및 UPLC -Q- TOF - MS 에 의한 Aloe vera 의 대사체 프로파일링
다른 크기의 알로에는 GC-IT-MS 및 UPLC-Q-TOF-MS에 의한 대사체 분석을 수행하였다. PCA, PLS-DA, 및 OPLS-DA는 다른 크기에 따라서 알로에 샘플에서 대사체 차이의 패턴 인식 및 육안화를 지지하기 위하여 MS 스펙트럼 데이터에 적용하였다. 다른 크기의 알로에 샘플의 분리를 GC-IT-MS 및 UPLC-Q-TOF-MS 데이터세트로부터 PLS-DA 스코어 도에서 볼 수 있었다(도 1). 유사한 패턴을 PCA 분석에서 보여준다. 또한, OPLS-DA를 A10 및 A30 샘플 사이에서 차별적인 대사체 조성을 예측하기 위하여 UPLC-Q-TOF-MS 데이터세트에 대해서 수행하였다. GC-IT-MS 분석에서, PLS-DA 스코어 플롯은 다른 크기의 알로에 샘플 중에서 구별되고 이것은 성장 및 발달과 관련된 1차 대사체가 식물 크기에 의하여 영향을 받는다는 것을 시사한다. 도 1a에 나타낸 것과 같이, 스코어 플롯은 38%의 전체 변이성을 설명한다. PLS로 작은 크기의 알로에 샘플(A10 및 A20, < 20 cm)은 더 큰 크기(A30 및 A50, > 30 cm)로부터 분리된 반면 PLS2로 A10 및 A50 (네가티브 PLS2 차원)은 A20 및 A30 (포지티브 PLS2 차원)으로부터 분리되었다. 표 1에서, 13 대사체를 VIP 값 (VIP > 0.7) 및 p-값(p < 0.05)을 사용하여 차별적인 변량들로 선택하였다. alanine, valine, succinic acid, arabitol, malic acid, pyroglutamic acid, aspartic acid, 감마-aminobutyric acid (GABA), arabinose, fructose, glucose, glucuronic acid, 및 sucrose를 포함하는 13종의 대사체를 동정하고 레퍼런스 표준물질을 사용하여 확인하였다.
본 발명에서, 포도당, 과당과 같은 당과 알라닌, 발린, 및 아스파트산과 같은 아미노산의 상대적인 양은 크기가 증가함에 따라서 점차적으로 증가하였다. 이들 대사체는 알로에 샘플의 성장 및 발달에 따라 샘플 크기에서 변화와 관련이 있는 것 같다.
UPLC-Q-TOF-MS 분석에 대한 도 1b에서 나타낸 것과 같이, A50 및 다른 크기의 알로에 샘플을 PLS1 (47.1%) 에 의하여 명확하게 분리되었고, A30 및 다른 것은 PLS2 (14.8%)에 의하여 구별되었다. aloesin (1), homonataloside B (2), 7-hydroxy-8-O-methylaloin (3), 7-hydroxyaloin B (4), 7- hydroxyaloin A (5), nataloeemodin (6), aloeresin A (7), aloin B (8), isoaloeresin D (9), 7-O-methylaloeresin A (10), aloin A (11), 6'-malonylnataloin B (12), 및 6'-malonylnataloin A (13)과 같은 13종의 2차 대사체들은 크기에 의한 알로에 샘플을 분리하기 위한 유의적인 대사체이었다(표 2). OPLS-DA를 PLS-DA 분석에서 PLS2에 의하여 분리된 유의적으로 차별성이 있는 대사체를 동정하고 항산화 활성과 관련된 대사체를 예측하기 위하여 UPLC-Q-TOF-MS 데이터세트에 적용하였다. 도 2에서 나타낸 것과 같이, 스코어 프롯 및 S-플롯은 R2 = 0.993 및 Q2 = 0.969를 가지는 OPLS1을 구별하는 A10 및 A30의 분리를 나타내었다(도 2). 로딩 S-플롯 (도 2b) 및 박스 위스커 플롯(도 2c)은 aloesin (1), homonatalosideB (2), 7-hydroxy-8-O-methylaloin (3), nataloeemodin (6), aloeresin A (7), isoaloeresin D (9), 및 7-O-methylaloeresin A (10)는 A10과 관련이 있고, aloin B (8), aloin A (11), 및 6'-malonylnataloin B (12), 및 6'-malonylnataloin A (13)는 A30과 관련이 있다는 것을 나타내었다.
A30 및 A50 사이에서 7-hydroxy-8-Omethylaloin A (3), 6'-malonylnataloin B (12), 및 6'-malonylnataloin A (13)의 상대적인 양은 크게 증가한 반면에, 7-hydroxyaloin B (4), 7-O-methylaloeresin A (10), isoaloeresin D (9), 및 aloin A (11)은 크게 감소하였다. 이 결과는 A30 및 A50 사이에 긴 성장 기간에 관련될 수 있고, 이들 대사체들은 장시간 성장 및 발달의 효과로 간주되었다.
UPLC -Q- TOF - MS 분석에서 다른 크기의 알로에 베라에서 항산화 활성 및 관련 대사체
DPPH 및 ABTS 항산화 활성을 도 5에서 나타내었다. 비공유 전자를 잡는 것을 수반하는 탈색 활성으로 측정될 수 있는 알로에 추출물의 자유기 소거 활성을 항산화 능력을 측정하는데 사용하였다. 두 분석으로부터 유사한 결과에 기반하여,알로에 추출물의 항산화 활성은 A30 > A50 > A20 > A10 순서이었다. 두 어세이 모두에서, A30은 여러 크기의 알로에 중에서 가장 높은 항산화활성을 나타내었고, 이것은 여러 크기으 알로에는 다른 활성 화합물을 가지고 다른 양의 항산화활성을 가진다는 것을 시사한다. 다른 크기의 알로에 샘플에서 동일하지 않은 활성 성분의 양은 그들의 다른 항산화 활성을 야기한다는 것을 추측한다.
Figure 112012068801910-pat00001
표 1은 알로에 샘플의 크기 차이에 기여하는 GC-IT-MS에 의하여 동정된 차별적인 대사체를 나타낸 표
Figure 112012068801910-pat00002
표 2는 알로에 샘플의 크기 차이에 기여하는 UPLC-Q-TOF-MSS에 의하여 동정된 차별적인 대사체를 나타낸 표
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 결과들은 MS-기반 대사체 접근은 식물에서 성장 및 발달과 관련된 크기와 관련한 대사체 변화를 조명할 수 있고 항산화 활성과 그들의 관계를 설명할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 1은 여러 알로에 샘플의 크기의 GC-IT-MS (a) 및 UPLC-Q-TOF-MS (b)에 의하여 분석된 PLS-DA 스코어 플롯을 나타낸 그림. A10: < 10 cm, A20: 10-20 cm, A30: 20-30 cm, A50: >50 cm.
도 2는 A10 및 A30 샘플 사이에 UPLC-Q-TOF-MS에 의하여 분석된 OPLS-DA 스코어 플롯 (a), S-플롯 (b), 및 박스-위스커 플롯 (c) (S-플롯 변량 넘버는 표 2에 나타낸 것과 동일한 대사체 넘버임).
도 3은 여러 알로에 샘플의 크기에서 UPLC-Q-TOF-MS에 의하여 분석된 유의적으로 차별성있는 대사체의 구조를 나타낸 그림.
도 4는 여러 알로에 샘플의 크기에서 UPLC-Q-TOF-MS에 의하여 분석된 유의적으로 차별성있는 대사체의 박스 및 위스커 플롯을 나타낸 그림. 이들 대사체들은 PLS-DA 모델에서 차별성에 기여함, VIP > 0.7 및 p < 0.05 (Line, mean; box, standard error; whisker, standard deviation).
도 5는 ABTS (mM GAE/g 전체 중량) 및 DPPH (mM Trolox equivalent/g 건체 중량) 자유기 소거 활성에 의하여 결정된 여러 알로에 샘플의 크기에서 항산화 활성을 나타낸 그림.
도 6은 알로에 크기에 따른 사진과 관련 데이터를 나타낸 그림.
이하 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
본 발명에 사용된 메탄올, acetonitrile, 및 물은 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)로부터 구입하였고, Methoxyamine hydrochloride, 및 N-methyl- N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA), gallic acid, potassium persulfate, 2,2"- azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), formic acid, pyridine, 및 표준 화합물들은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 모든 다른 화합물들은 분석등급이었다.
본 발명의 알로에 베라 샘플은 대한민국, 제주도(N 33 20' 36.62'', E 126°46' 11.63'')에서 재배하였다. 그들은 네 다른 크기(길이)로 모양에 의하여 랜덤하게 분류하였다; A10: < 10 cm, A20: 10-20 cm, A30: 20-30 cm, 및 A50: > 50 cm. A50 은 산업적으로 통상적으로 사용되는 성숙된 샘플이었다. 모든 A. vera 샘플들을 세척하고 균질기(NUC Electronic, Seoul, Korea)로 균질화하였다. 그들을 5일 동안 동결건조하고 추출 전에 -70 ℃에 보관하였다.
실시예 1: 샘플 조제
건조된 샘플(0.1 g)을 Twist Shaker (BioFree, Seoul, Korea)를 사용하여 12시간 동안 8 mL 메탄올로 추출하였다. 추출 후에, 그 추출물을 10분 동안 4 ℃에서 3000 rpm으로 원심분리하였다. 1 밀리리터의 그 상등액을 스피드 진공 농축기(Biotron, Seoul, Korea)를 사용하여 12시간 동안 완전하게 건조하였다. Oximation 및 유도화를 GC-MS 분석을 위하여 수행하였다. 55ml의 methoxyamine hydrochloride (20 mg/mL) in pyridine를 그 건조된 추출물에 첨가하고 90분 동안 30 ℃에서 옥시메이트(oximate)하였다. 그 다음, 그 옥시메이트된 샘플을 30분 동안 37 ℃에서 50μL의 MSTFA로 실릴레이트하였다. 건조된 샘플들을 메탄올로 재용해하고 LC-MS 분석을 위하여 0.2μm PTFE 필터를 통하여 여과하였다.
실시예 2: GC - IT - MS 분석
Varian CP-8400 오토샘플러를 구비한 Varian CP-3800 GC 시스템을 Varian 4000 ion-trap EI MS 디텍터 시스템 (Varian, Palo Alto, CA, USA)과 연결하였다. VF-1MS capillary 컬럼(30 m length x0.25 mm i.d.x 0.25μm 필름 두께)을 1.0 mL/min의 일정 유속에서 헬륨을 가지고 사용하였다. 오븐 온도는 2분 동안 100 ℃를 유지한 후 300 ℃로 5 ℃/min로 구배를 주고 10분을 유지하였다. 70 eV 이온화 에너지를 가지는 EI모드에서 수집된 질량 데이터는 m/z 50-1000에서 풀 스캔을 위하여 사용되었다. 그 주사기 및 트랜스퍼 라인 온도는 각각 200 ℃ 및 250 ℃이었다. 그 반응 혼합물을 2 mL GC-오토샘플러 병으로 옮기고 1μL 의 반응물을 25:1의 스필트 비율로 GC-IT-MS로 주사하였다.
실시예 3: UPLC -Q- TOF - MS 분석
UPLC를 바이너리 용매 운반 시스템, 오토샘플로 및 UV 디텍터가 구비된 Waters ACQUITY UPLC 시스템(Waters Corp., Milford, MA, USA) 상에서 수행하였다. 크로마토그래피적 분리는 Waters Acquity 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) BEH C18 컬럼(100 mm x2.1 mm i.d. x1.7 μm 입자 크기) 상에서 수행하였다. 그 용리는 0.1% 포름산을 포함하는 acetonitrile/water 구배로 수행하였다. 그 구배는 12분 내에 0에서 90% acetonitrile로 선형적으로 증가한 후 3분 동안 0%로 감소하였다. 초기 조건으로 컬럼의 재평형화를 포함한 전체 런 타임은 17분이었다. 주사 부피는 5 μL이었고, 그 유속은 0.3 ml/min이었다. Waters Q-TOF Premier (Micromass MS Technologies, Manchester, UK)는 MS 실험을 위하여 넓은 pass quadrupole 모드에서 작동하였고, 그 TOF 데이터는 음 (-) 및 양 (+) 이온에서 m/z 100 및 1,500 사이에서 수집하였다. 탈용매 가스(nitrogen)를 200 ℃의 온도에서 600 L/h로 세팅하였고; 콘 가스(nitrogen)는 50 L/h로 세팅하고, 소스 온도는 100 ℃이었다. 모세관 및 콘 전압은 각각 3.0 kV 및 40 V로 세팅하였다. 데이터는 센트로이드 모드에서 0.2 s의 스캔 축적 시간을 가지고 수집하였다. 모든 분석은 정확성 및 재생산성을 담보하기 위하여 LockSpray interference를 통하여 독립적인 레퍼런스 스프레이를 사용하여 얻었다; leucine enkephalin 이온을 10 μL/min 유속에서 lock mass (m/z 554.2615 (-) 및 556.2771 (+))로 사용하였다. 전구체 이온 및 생성물 이온에 대한 정확한 질량 및 조성은 장비가 구비된 MassLynx software (Waters Corp.)를 사용하여 계산하였다. 그 Masslynx 소프트웨어는 정확한 질량으로부터 모든 가능한 성분 조성을 계산할 수 있는 구성을 가진다. MSn 분석은 대사체 전체 스캐닝에 사용된 것과 동일한 조건 하에서 수행하였다. 그 다음 최종 동정은 MS/MS 실험에서 얻은 원 이온 및 절편이 정확한 질량 측정에 기반하여 수행하였다.
실시예 4;데이터 가공 및 다변량 데이터 분석
GC-IT-MS 원 데이터를 MS Workstation 6.9 software (Varian)로 얻어서 Vx capture version 2.1 (Adron Systems, Laporte, MN, USA)를 사용하여 netCDF format으로 전환하였다. UPLC-Q-TOF-MS 분석을 위한 데이터 전가공(preprocessing)은 MassLynx software를 사용하여 수행하였고 원 데이터 파일을 Waters DataBridge version 2.1 software를 사용하여 netCDF (*.cdf) format으로 전환하였다.. 변환 후, 그 MS 데이터를 잔류 시간, 정확한 질량 및 표준화된 피크 강도를 얻기 위하여 Metalign software package (http://www.metalign.nl)를 사용하여 가공하였다. 결과 데이터를 Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA)로 보내서, SIMCA-P+ 12.0 software (Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 통계분석을 수행하였다. Unsupervised PCA 및 supervised PLS-DA를 여러 크기의 A. vera 샘플을 비교하고 크기에 의한 주요 대사체를 동정하기 위하여 사용하였다. 그 데이터세트는 PCA 및 PLS-DA 모델링 전에 컬럼방향 형태에서 UV 스케일하였다. 모델에서 가장 큰 variable importance in the projection (VIP) 값을 가지는 대사체를 잠재적인 바이오마커로 간주하였다. VIP 값 > 0.7 및 p- 값 < 0.05을 가지는 대사체를 적당한 바이오마커로 선택하였다. OPLS-DA를 두 (A10 및 A30) 샘플의 대사체 조성에서 차이에 대한 정보를 얻기 위하여 수행하였다. 변수는 평균 중심화되고 열별(columnwise) 형태에서 OPLS-DA에 대한 파레토 분산으로 스케일되었다. A10 및 A30 사이에 차이에 대한 바이오마커를 추후에 공분산 (p) 및 상관관계(pcorr)로 선언하는 S-플롯을 분석하여 동정하였다. 유의적으로 차별적인 대사체를 STATISTICA, version 7.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA)을 사용한 박스 위스커 플롯으로 표현하였고, DPPH 및 ABTS 자유기 소거 활성에서 차이는 SPSS version 12.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용한 Duncan's 다중 범위 테스트 및 분산의 분석에 의하여 테스트하였다.
실시예 5: 바이오마커 동정
다변량 통계분석 후, 주된 대사체를 질량 스펙트럼 및 잔류 시간 모두를 비교하여서 표준 화합물을 사용하여 포지티브하게 동정하였다. 표준 화합물이 입수불가능 한 경우에 NIST05 MS Library (NIST, 2005), 레퍼런스, 조합된 chemical dictionary version 7.2 (Chapman & Hall/CRC), 및 인 하우스 라이브러리를 사용하여 MS 스펙트럼 상에서 기반하여 동정하였다.
실시예 6: ABTS 및 DPPH 자유기 소거 활성에 의한 항산화 활성의 결정
ABTS 어세이 방법은 Re, R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M.; Rice-Evans, C.,Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay.Free Radical Bio . Med . 1999, 26, 1231-1237.에 기재된 방법을 일부 변형하였다. 스톡 용액은 7 mM ABTS 용액 및 2.45 mM potassium persulfate 용액을 포함한다. 실행 용액은 2 스톡 용액을 동량 혼합하여서 그것을 암 조건하 상온에서 12 시간 동안 반응하였다. 그 후 그 용액을 분광계 (Spectronic Genesys 6, Thermo Electron, Madison, WI, USA)를 사용하여 734 nm에서 흡광도가 0.7 ±0.02에 도달할 때까지 희석하였다. 각 알로에 추출물(10 μL, 3 mg/mL)을 암 조건에서 7분 동안 190 μL ABTS와 반응하였다. 그 다음, 분광계를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 표준 곡선은 0.0625 및 1 mM trolox equivalents 사이에서 선형이었다. 결과들을 mM trolox equivalents (TE)/g 건체 중량(dw)으로 나타내었다. DPPH 어세이는 Dietz, B. M.; Kang, Y. H.; Liu, G.; Eggler, A. L.; Yao, P.; Chadwick, L. R.;Chem . Res . Toxicol. 2005, 18, 1296-1305.를 일부 변형하여 수행하였다. A. vera 추출물 (20 μL, 3 mg/mL)을 상온에서 20분 동안 180 μM DPPH 에탄올 용액으로 반응하였다. 그 다음, 흡광도를 515 nm에서 측정하였다. 표준 곡선은 0.0625 및 1 mM gallic acid (GA) equivalents 사이에서 선형이었다. 결과를 mM GA/g dw로 표현하였다. 실험은 3 회반복 수행하였다.

Claims (8)

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  4. 알로에신(aloesin), 호모나타로사이드(homonataloside) B , 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin), 7-하이드록시알로인(hydroxyaloin) B, 나타알로에에모딘(nataloeemodin), 및 알로에레진(aloeresin) A로 구성된 10cm 미만 알로에 베라 동정용 마커 조성물.
  5. 알로에 베라를 고분해능질량분석기/액체크로마토그래피를 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 알로인(aloin) B, 알로인(aloin) A, 및 이소알로에레진(isoaloeresin)이 호모나타로사이드(homonataloside) B , 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin), 7-하이드록시알로인(hydroxyaloin) B, 나타알로에에모딘(nataloeemodin), 알로에레진(aloeresin) A7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin) A, 6'-말로닐나타로인(malonylnataloin) B 및 6'-말로닐나타로인 A보다 높게 검출되는 경우에 20-30cm 사이인 알로에 베라로 동정하는 것을 특징으로 하는 알로에 베라 크기를 분류하는 방법.
  6. 알로인(aloin) B, 알로인(aloin) A, 및 이소알로에레진(isoaloeresin)으로 구성된 20-30cm 사이 알로에 베라 동정용 마커 조성물.
  7. 알로에 베라를 고분해능질량분석기/액체크로마토그래피를 사용하여 대사체 프로파일을 수행한 결과, 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin) A, 6'-말로닐나타로인(malonylnataloin) B 및 6'-말로닐나타로인 A가 알로인(aloin) B, 알로인(aloin) A, 및 이소알로에레진(isoaloeresin), 호모나타로사이드(homonataloside) B , 7-하이드록시알로인(hydroxyaloin) B, 나타알로에에모딘(nataloeemodin), 및 알로에레진(aloeresin)보다 높게 검출되는 경우에 50cm 초과인 알로에 베라로 동정하는 것을 특징으로 하는 알로에 베라 크기를 분류하는 방법.
  8. 7-하이드록시-8-O-메틸알로인(methylaloin) A, 6'-말로닐나타로인(malonylnataloin) B 및 6'-말로닐나타로인 A로 구성된 50cm 초과 알로에 베라 동정용 마커 조성물.
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