CN104614481B - 中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法 - Google Patents

中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104614481B
CN104614481B CN201510079136.0A CN201510079136A CN104614481B CN 104614481 B CN104614481 B CN 104614481B CN 201510079136 A CN201510079136 A CN 201510079136A CN 104614481 B CN104614481 B CN 104614481B
Authority
CN
China
Prior art keywords
component
radical scavenging
scavenging activity
rsa
dpph
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510079136.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104614481A (zh
Inventor
杨静
江振作
朱彦
王琰
王跃飞
张蕾
柴欣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority to CN201510079136.0A priority Critical patent/CN104614481B/zh
Publication of CN104614481A publication Critical patent/CN104614481A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104614481B publication Critical patent/CN104614481B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明实施例公开了中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法，包括：通过制备液相色谱获得目标中药复方的各组分，并将各组分制备成干粉；确定各组分的自由基清除活性RSA的值a、各组分自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果b及各组分固含物重量的归一化结果c，进而得到各组分的三元网络回归面积A；并根据所述三元网络回归面积A的大小来确定各组分在目标中药复方中的抗氧化活性贡献程度。

Description

中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法
技术领域
本发明涉及中药复方质量控制领域，特别涉及中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法。
背景技术
传统中医理论认为，活血化瘀类中药复方具有顺畅血行、消散瘀血、活血通络的功效；现代药理研究表明，活血化瘀类中药复方具有很强的抗氧化、抗血小板聚集、血管内皮保护、及改善血流变等作用。其中，抗氧化是活血化瘀类中药能够发挥疾病治疗作用的重要机制之一。
中药复方抗氧化能力的大小一般通过其抗氧化活性来体现。目前，对活血化瘀类中药复方抗氧化活性的研究对象主要是单一成分，通过试验筛选出具有抗氧化活性的单一成分，并以此单体化合物的抗氧化活性的高低来确定其在活血化瘀类中药复方中的抗氧化活性贡献程度。
然而，活血化瘀类中药复方是通过多成分协同作用发挥药效，任何单一成分都无法全面表征中药复方的药效物质基础，其抗氧化活性强弱也无法代表其对活血化瘀类中药复方的抗氧化活性贡献程度。抗氧化活性贡献程度确定不仅与抗氧化活性大小有关，还与浓度、固含物重量等参数有关，因此，只是依据抗氧化活性大小来确定抗氧化活性贡献程度是不合理的。
发明内容
为解决上述问题，本发明实施例公开了中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法。技术方案如下：
中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法，包括：
通过制备液相色谱获得目标中药复方的各组分，并将各组分制备成干粉；
通过预先设定的自由基清除活性实验，确定各组分在指定浓度下的自由基清除活性RSA的值a；
根据所述预先设定的自由基清除活性实验，确定各组分中每一组分的n个指定浓度C1、C2、C3……Cn-1、Cn分别对应的自由基清除活性RSA1、RSA2、RSA3……RSAn-1、RSAn，计算得到各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积AUC；通过将所得到各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积除以其中的最大值进行归一化处理，得到各组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果b；
其中，各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积AUC的计算方法为：
AUC＝(RSA1+RSA2)×(C2-C1)/2+(RSA2+RSA3)×(C3-C2)/2+……+(RSAn-1+RSAn)×(Cn-Cn-1)/2；
精密称定所制备的各组分干粉重量，得到各组分固含物重量，通过将所得到各组分固含物重量除以其中的最大值进行归一化处理，得到各组分固含物重量的归一化结果c；
根据已确定的各组分的自由基清除活性RSA的值a、各组分自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果b及各组分固含物重量的归一化结果c，得到各组分的三元网络回归面积A，所述三元网络回归面积A的计算公式为：
A = s 2 × ( s 2 - a 2 + b 2 ) × ( s 2 - b 2 + c 2 ) × ( s 2 - a 2 + c 2 ) , 其中：
s = a 2 + b 2 + b 2 + c 2 + a 2 + c 2 ;
并根据所述三元网络回归面积A的大小来确定各组分在目标中药复方中的抗氧化活性贡献程度，即组分的三元网络回归面积A越大，其在目标中药复方中的抗氧化活性贡献程度越大。
在本发明的一种优选实施方式中，通过制备液相色谱获得目标中药复方的各组分，并将各组分制备成干粉，包括：
将V1体积的目标中药复方的提取液置于V2体积的容量瓶中，加入体积分数为0～100％甲醇稀释并定容至刻度，超声混匀，离心后得到供试品溶液。
在预设的制备液相色谱条件下，取V3体积的供试品溶液注入制备液相色谱中，采用自动收集装置，每t分钟收集一次组分，收集N个组分，反复进样M次，收集合并相同组分，浓缩、干燥优选冻干，得到各组分干粉，其中，M≥1。
在本发明的一种优选实施方式中，所述预设的制备液相色谱条件还包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；
流动相：0.01～1％的甲酸水溶液-甲醇，优选0.05～0.5％的甲酸水溶液-甲醇，更优选0.1％的甲酸水溶液-甲醇；
流速：5～20mL/分钟；
柱温：室温；
进样量：1～5mL；
检测波长：254和286nm。
在本发明的一种优选实施方式中，所述预先设定的自由基清除活性实验为DPPH自由基清除活性实验。
在本发明的一种优选实施方式中，根据DPPH自由基清除活性实验确定各组分自由基清除活性的方法，包括：
用指定溶剂分别制备已知浓度为C样品的各组分样品溶液；
向体积为V4的各组分样品溶液中分别加入体积为V5浓度为CDPPH的DPPH溶液，并设置空白对照组及DPPH对照组，所述空白对照组包含V4体积的供试品溶液及V5体积的指定溶剂；所述DPPH对照组包括V4体积的指定溶剂及V5体积CDPPH浓度的DPPH溶液；
记录每个组分样品溶液的吸光度值OD样品、空白对照组的吸光度值OD空白及DPPH对照组的吸光度值ODDPPH，并根据公式：
DPPH自由基清除活性＝1-(OD样品-OD空白)/ODDPPH
确定各组分在浓度为C样品的情况下的自由基清除活性。
在本发明的一种优选实施方式中，采用多功能读板机在预设条件下记录每个组分样品溶液的吸光度值OD样品、空白对照组的吸光度值OD空白及DPPH对照组的吸光度值ODDPPH；所述预设条件包括：试验温度：20～50℃，优选的30～40℃，更优选37℃；读板速度：45s/次；采集时间：45min；检测波长：517nm。
在本发明的一种优选实施方式中，所述目标中药复方为丹红注射液。
本发明提供了一种中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法，通过确定中药复方中各组分的自由基清除活性、各组分自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果及各组分固含物重量的归一化结果，得到各组分的三元网络回归面积，并根据所述三元网络回归面积的大小来确定各组分在目标中药复方中的抗氧化活性贡献程度，可以快速筛选出活血化瘀类中药复方中抗氧化活性贡献程度最大的组分，该方法具有简便易行、科学严谨、直观明确、可操作性强等特点，并为进一步研究中药复方抗氧化活性提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为丹红注射液制备色谱图和对应的27个流分的超高效液相分析色谱图；
图2为丹红注射液27个流分的自由基清除活性、活性-浓度曲线下面积、固含物重量结果柱状图；
图3为丹红注射液27个流分低、中、高浓度的自由基清除活性结果柱状图；
图4为丹红注射液流分活性-浓度曲线下面积图；
图5为丹红注射液3～27个流分的三元网络图；
图6为丹红注射液制备色谱图和27个流分三元网络回归面积对比图。
具体实施方式
活血化瘀类中药复方是通过多成分协同作用发挥药效，任何单一成分都无法全面表征中药复方的药效物质基础，因此以单一成分为药效物质基础来研究中药复方的抗氧化活性是不合理的，基于此，本发明以包含有多种单一成分的集合-组分作为药效物质基础来研究中药复方的抗氧化活性，并在考虑到与组分实际抗氧化能力有关的抗氧化活性大小、浓度、固含物重量等参数的情况下，通过自由基清除活性(RadicalScavengingActivity，RSA)、各组分自由基清除活性-浓度曲线下面积(areaunderthecurve,AUC)、固含物重量(Content)这三个维度指标，得到与各组分相对应的三元网络回归面积，探寻活血化瘀类中药复方中各组分抗氧化活性的贡献程度，可以快速筛选出活血化瘀类中药复方中抗氧化活性贡献程度最大的组分，并为进一步研究中药复方抗氧化活性提供基础。
需要说明的是，本发明中所述的术语“组分”指的是通过制备液相分离目标中药复方时，在指定时间段内所收集的目标中药复方成分的集合。术语“活血化瘀类中药复方”与术语“中药复方”可以相互替换。
进一步需要说明的是，中药复方的具体制剂形式并不影响本发明技术方案的实施，具体的，中药复方的制剂形式可以包括：片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、颗粒剂、注射液等。当然，当中药复方的制剂形式为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、颗粒剂时，首先要对中药复方进行提取操作，从而获得中药复方的提取液，而当中药复方的制剂形式为注射液时，该注射液可视为提取液。获得中药复方的提取液的方法为本领域的公知技术，本领域技术人员可以根据中药复方的具体形式来确定，本发明在此不作具体限定。
在本发明的技术方案中，首选要通过制备液相色谱获得目标中药复方的各组分，并将各组分制备成干粉；
制备液相色谱的相关技术也是本领域的常用的分离技术，本发明在此不作具体描述。本领域技术人员可以根据实际情况来确定其操作流程。
具体的，在一些实施方式中，可以将V1体积的目标中药复方的提取液置于V2体积的容量瓶中，加入体积分数为0～100％甲醇稀释并定容至刻度，超声混匀，离心后得到供试品溶液。
在预设的制备液相色谱条件下，取V3体积的供试品溶液注入制备液相色谱中，采用自动收集装置，每t分钟收集一次组分，收集N个组分；反复进样M次、收集合并相同组分，浓缩、干燥优选冻干，得到各组分干粉，其中，M≥1。需要说明的是，上述的时间间隔t的具体值可以由本领域技术人员根据具体实验情况来确定，但是在一些实施方式中，发明人意外的发现，当2≤t≤5时，既可以保证所收集的各组分之间达到完全的分离，又能分离出相对较多的组分，即各组分中包含相对较少的成分，这样可以使得所分离的组分更有使用价值。
对于预设的制备液相色谱条件，本发明是不需要进行限定的，具体的，在一些实施方式中，预设的制备液相色谱条件还包括：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：0.01～1％的甲酸水溶液-甲醇，优选0.05～0.5％的甲酸水溶液-甲醇，更优选0.1％的甲酸水溶液-甲醇；流速：5～20mL/min；柱温为室温，进样量：1～5mL；检测波长：254和286nm。
在得到各组分干粉后，就可以通过预先设定的自由基清除活性实验，确定各组分在指定浓度下的自由基清除活性的值a；
根据所述预先设定的自由基清除活性实验，确定各组分中每一组分的n个指定浓度C1、C2、C3……Cn-1、Cn分别对应的自由基清除活性RSA1、RSA2、RSA3……RSAn-1、RSAn，计算得到各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积AUC；通过将所得到各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积除以其中的最大值进行归一化处理，得到各组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果b；
其中，各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积AUC的计算方法为：
AUC＝(RSA1+RSA2)×(C2-C1)/2+(RSA2+RSA3)×(C3-C2)/2+……+(RSAn-1+RSAn)×(Cn-Cn-1)/2；
C1＜C2＜C3＜……＜Cn-1＜Cn。
本发明中所采用的自由基清除活性实验可以由本领域技术人员根据本领域通用的自由基清除活性实验来实现，具体的，在一些方式中，根据文献(熊双丽,卢飞,史敏娟,等.DPPH自由基清除活性评价方法在抗氧化剂筛选中的研究进展[J].食品工业科技,2012,33(8):380-383.)记载的DPPH自由基清除活性方法来实现。
当采用DPPH自由基清除活性方法时，具体可以采用DPPH微孔定量法确定各组分在已知浓度下的自由基清除活性，该方法可以包括：
用指定溶剂分别制备已知浓度为C样品的各组分样品溶液；
将体积为V4的各组分样品溶液加入96孔板，并加入体积为V5浓度为CDPPH的DPPH溶液，并在96孔板中设置空白对照组及DPPH对照组，所述空白对照组包含V4体积的各组分样品溶液及V5体积的指定溶剂；所述DPPH对照组包括V4体积的指定溶剂及V5体积CDPPH浓度的DPPH溶液；
将96孔板置于多功能读板机中，在预设的多功能读板机条件下，记录每个组分样品溶液的吸光度值OD样品、空白对照组的吸光度值OD空白及DPPH对照组的吸光度值ODDPPH，并根据公式：
DPPH自由基清除活性＝1-(OD样品-OD空白)/ODDPPH
确定各组分在浓度为C1的情况下的自由基清除活性。
上述提到的指定溶剂在本领域中一般采用甲醇或其不同浓度的水溶液来实现，当然，本领域技术人员也可以根据实际需要采用其它的溶剂，这都是可以的。
发明人意外的发现，当各组分样品溶液的浓度C1在0.01～0.02mg/mL之间时，所测得的样品溶液的吸光度值OD样品更准确，从而可以保证所计算的DPPH自由基清除活性的准确性。
在采用上述的DPPH微孔定量法时，预设的多功能读板机条件是由本领域技术人员来确定的，具体的的，可以包括：试验温度：20～50℃，优选的30～40℃，更优选37℃；读板速度：45s/次；采集时间：45min；检测波长：517nm。
丹红注射液是一种由丹参、红花两味传统活血化瘀中药经科学配伍并采用现代制剂工艺制成的中药复方注射剂，具有活血化瘀、通脉舒络之功效。下面就以丹红注射液为例，对本发明的技术方案进行描述。需要说明的是，虽然本发明的技术方案是以丹红注射液为例进行说明的，但是其它的中药复方采用本发明的技术方案也可以同样实现本发明的目的，本发明只是限于篇幅，不一一举例进行说明。
仪器与试药
WatersUPLC超高效液相色谱仪，配有二元梯度溶剂泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器；Waters制备液相色谱仪(美国，Waters公司)配有二元梯度溶剂泵、紫外检测器、手动进样器、全自动流分收集装置；Flex3多功能读板机(美国MolecularDevices公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；TGL-16C台式离心机(中国，上海安亭科学仪器厂)；SCIENTZ25-12超声仪(中国，宁波新芝生物技术股份有限公司)。
甲酸购自MREDA(美国，MREDA公司)；甲醇、乙腈购自SigmaAldrich(美国，Sigma公司)；丹红注射液由山东丹红制药有限公司提供。
实施例
1实验方法
1.1制备液相色谱条件
色谱柱：ZORBAXSB-C18column(21.2×250mm,7μm)；流动相：甲醇(A)～0.1％甲酸水溶液(B)；柱温：室温；检测波长254、286nm；进样量2mL；流速：10mL/min。梯度洗脱程序：0～6min，5％A；6～81min，5％～70％A；81～87min，70％～90％A。
1.2超高效液相色谱条件
色谱柱：AcquityUPLCHSST3column(2.1×100mm,1.8μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)～乙腈(B)；柱温：40℃；检测波长254、286nm；进样量2μL；流速：0.4mL/min。梯度洗脱程序：0～7min，3～19％B；7～13min，19％B；13～18min，19％～25％B，18-25min，25％-90％B；25-35min，90％B。
1.3DPPH微孔定量法测定自由基清除活性实验条件
试验温度：37℃；读板速度：45s/次；采集时间：45min；检测波长：517nm。
2.丹红注射液组分干粉制备
准确量取丹红注射液原液50mL置于100mL容量瓶中，加入甲醇稀释并定容至刻度线，超声摇匀。14000rpm离心10min，即得供试品溶液。
在“1.1”项所述的制备液相色谱条件下，取2mL供试品溶液注入制备液相色谱中，采用自动收集装置收集流分，除前6min采用5％甲醇洗脱为一个流分(除去单糖、多糖、氨基酸等大极性化合物)，最后6min从70％的甲醇洗脱到90％的甲醇为一个流分(保证所有化合物完全洗脱)，其余每3min收集一次流分。反复进样5次、收集合并相同时间段的组分，浓缩、冻干，按保留时间顺序依次编号，得到27份丹红注射液组分干粉。
3.丹红注射液组分样品处理
3.1超高效液相色谱样品处理
精密称取1～27个组分适量，分别置于10mL容量瓶中，加入30％甲醇水溶液溶解并定容至刻度，制成每1mL含1～27组分分别为17.80、8.54、3.78、4.44、6.04、4.24、2.85、4.88、4.05、0.27、4.33、5.58、4.22、4.38、2.81、2.79、4.29、3.34、3.35、2.96、3.37、8.73、2.40、5.30、3.33、5.07、3.48mg的供试品溶液。
3.2抗氧化活性试验样品处理
精密称取1～27个组分2.4mg，分别置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，超声溶解，取5mL上述液体转移至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即为抗氧化试验高浓度样品溶液(C3＝0.120mg/mL)，用甲醇依次稀释3倍，得到中浓度(C2＝0.040mg/mL)和低浓度样品溶液(C1＝0.013mg/mL)。
4.丹红注射液组分样品测试
4.1超高效液相色谱测试
将“3.1”项下制备好的1～27个供试品溶液注入到超高效液相色谱仪中，按“1.2”项下色谱条件洗脱，记录1～27个供试品溶液色谱图，如图1所示。从图1中可以看出，各组分分离比较完全，可以用于后续的实验。
4.2抗氧化活性试验
精密吸取“3.2”项下制备好的低、中、高浓度供试品溶液50μL置于96孔板中，加入150μL0.25mmol/LDPPH溶液，立即置于Flex3型台式多功能读板机按“1.3”项下条件记录每个组分的吸光度值(OD值)，每个样品3个复孔，并设置空白对照组(50μL组分样品+150μL甲醇)和DPPH对照组(50μL甲醇+150μLDPPH溶液)。所述Flex3型台式多功能读板机预设条件包括：试验温度：37℃；读板速度：45s/次；采集时间：45min；检测波长：517nm。
5.三元网络回归面积的确定
基于各组分自由基清除活性、自由基清除活性-浓度曲线下面积、固含物重量这三个维度指标，计算与组分对应的三元网络回归面积，用于确定各组分对丹红注射液抗氧化活性的贡献程度。
5.1自由基清除活性(RadicalScavengingActivity，RSA)
将“4.2”项下测得的27个组分最高浓度(C3＝0.120mg/mL)的吸光度值按下列公式计算出各组分的自由基清除活性的值a，结果如表1、图2所示：
DPPH自由基清除活性＝1-(OD样品-OD空白)/ODDPPH
其中，OD空白为空白对照组的吸光度值；ODDPPH为DPPH对照组的吸光度值。
表127个组分最高浓度的自由基清除活性
组分 自由基清除活性 组分 自由基清除活性 组分 自由基清除活性
1 0.0589 10 0.9549 19 0.9665
2 0.1478 11 0.3931 20 0.8867
3 0.5154 12 0.4020 21 0.8709
4 0.9568 13 0.5148 22 0.7999
5 0.9647 14 0.6256 23 0.5348
6 0.9671 15 0.7275 24 0.4338
7 0.9648 16 0.7953 25 0.3835
8 0.4889 17 0.9533 26 0.2910
9 0.3428 18 0.9580 27 0.1670
5.2自由基清除活性-浓度曲线面积(areaunderthecurve,AUC)
将“4.2”项下获得的各组分低、中、高浓度样品吸光度值按“5.1”项下公式，计算出各组分低、中、高浓度样品的自由基清除活性RSA1、RSA2及RSA3(如图3所示)；将自由基清除活性设为Y轴，对应的低、中、高浓度为X轴，绘制自由基清除活性-浓度曲线，按下列公式计算自由基清除活性-浓度曲线下面积(如图4所示)，结果如表2所示：
AUC＝(RSA1+RSA2)×(0.04-0.013)/2+(RSA2+RSA3)×(0.12-0.04)/2
表227个组分活性-浓度曲线下面积
组分 曲线下面积 组分 曲线下面积 组分 曲线下面积
1 0.0072 10 0.0618 19 0.0710
2 0.0116 11 0.0255 20 0.0550
3 0.0335 12 0.0268 21 0.0485
4 0.0639 13 0.0341 22 0.0517
5 0.0694 14 0.0388 23 0.0331
6 0.0671 15 0.0455 24 0.0277
7 0.0684 16 0.0484 25 0.0245
8 0.0315 17 0.0628 26 0.0193
9 0.0240 18 0.0620 27 0.0128
5.3组分固含物重量
精密称定“2”项下所得到的27个丹红注射液组分干粉的重量，由于第1、2个组分含单糖、多糖等大极性化合物，水分较多难以冻干，无法获得准确的固含量重量，故不用于三元网络评价体系分析。因此，只记录3-27组分样品的重量，结果如表3所示。
表33～27组分固含物重量结果
组分 固含物重量/mg 组分 固含物重量/mg 组分 固含物重量/mg
1 – 10 119.5 19 397.9
2 – 11 87.1 20 163.8
3 164.3 12 116.9 21 146.0
4 111.5 13 115.8 22 95.3
5 120.9 14 136.2 23 88.3
6 136.5 15 144.2 24 59.2
7 114.9 16 168.2 25 28.6
8 61.5 17 258.3 26 20.7
9 69.8 18 303.4 27 31.9
5.4三元网络回归面积的计算
在构建三元网络回归面积前，为消除三个指标取值范围不一致，需对自由基清除活性-浓度曲线下面积和固含物重量的数据进行“归一化”处理，即各指标下各组分所测得的数值除以该指标的最大测量值，“归一化”处理后结果如表4、5和图2所示。
表427个组分活性-浓度曲线下面积“归一化”处理结果
组分 曲线下面积 组分 曲线下面积 组分 曲线下面积
1 0.1017 10 0.8707 19 1.0000
2 0.1630 11 0.3591 20 0.7746
3 0.4727 12 0.3782 21 0.6836
4 0.9007 13 0.4808 22 0.7291
5 0.9785 14 0.5471 23 0.4668
6 0.9457 15 0.6407 24 0.3906
7 0.9634 16 0.6817 25 0.3454
8 0.4445 17 0.8855 26 0.2718
9 0.3383 18 0.8739 27 0.1806
表53～27组分固含物重量“归一化”处理结果
组分 固含物重量 组分 固含物重量 组分 固含物重量
1 – 10 0.3003 19 1.000
2 – 11 0.2189 20 0.4117
3 0.4129 12 0.2938 21 0.3669
4 0.2802 13 0.2910 22 0.2395
5 0.3037 14 0.3423 23 0.2219
6 0.3431 15 0.3624 24 0.1488
7 0.2888 16 0.4227 25 0.07198 -->
8 0.1546 17 0.6492 26 0.0520
9 0.1754 18 0.7625 27 0.0802
根据“5.1”项下的数据确定的各组分的自由基清除活性RSA的值a、及根据“5.4”项下的数据确定的各组分自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果b及各组分固含物重量的归一化结果c，得到各组分的三元网络回归面积A，结果如表6、图5所示。
所述三元网络回归面积A的计算公式为：
A = s 2 × ( s 2 - a 2 + b 2 ) × ( s 2 - b 2 + c 2 ) × ( s 2 - a 2 + c 2 ) , 其中：
s = a 2 + b 2 + b 2 + c 2 + a 2 + c 2 ;
表63～27组分三元网络回归面积
组分 三元网络回归面积 组分 三元网络回归面积 组分 三元网络回归面积
1 – 10 0.4588 19 0.8468
2 – 11 0.0915 20 0.4203
3 0.1889 12 0.1111 21 0.3604
4 0.4686 13 0.1607 22 0.3191
5 0.5161 14 0.2225 23 0.1476
6 0.5128 15 0.2918 24 0.0952
7 0.5047 16 0.3500 25 0.0688
8 0.1200 17 0.5971 26 0.0409
9 0.0717 18 0.6478 27 0.0180
根据三元网络回归面积的大小，评价丹红注射液组分抗氧化活性的强弱、筛选丹红注射液抗氧化活性组分。图6为丹红注射液制备色谱图和27个组分三元网络回归面积对比图，可以直观地看出5-7、17-19组分的综合抗氧化活性较好(回归面积≥0.5)，其中组分19对丹红注射液抗氧化活性贡献最大(回归面积为0.8468)。因此，本发明所建的活血化瘀类中药复方中各组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法，可以快速筛选出活血化瘀类中药复方中抗氧化活性贡献程度最大的组分，并为进一步的研究中药复方抗氧化活性提供了研究基础。

Claims (12)

1.中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法，其特征在于，包括：
通过制备液相色谱获得目标中药复方的各组分，并将各组分制备成干粉；
通过预先设定的自由基清除活性实验，确定各组分在指定浓度下的自由基清除活性RSA的值a；
根据所述预先设定的自由基清除活性实验，确定各组分中每一组分的n个指定浓度C1、C2、C3……Cn-1、Cn分别对应的自由基清除活性RSA1、RSA2、RSA3……RSAn-1、RSAn，计算得到各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积AUC；通过将所得到各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积除以其中的最大值进行归一化处理，得到各组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果b；
其中，各组分中每一组分的自由基清除活性-浓度曲线下面积AUC的计算方法为：
AUC＝(RSA1+RSA2)×(C2-C1)/2+(RSA2+RSA3)×(C3-C2)/2+……+(RSAn-1+RSAn)×(Cn-Cn-1)/2；
精密称定所制备的各组分干粉重量，得到各组分固含物重量，通过将所得到各组分固含物重量除以其中的最大值进行归一化处理，得到各组分固含物重量的归一化结果c；
根据已确定的各组分的自由基清除活性RSA的值a、各组分自由基清除活性-浓度曲线下面积的归一化结果b及各组分固含物重量的归一化结果c，得到各组分的三元网络回归面积A，所述三元网络回归面积A的计算公式为：
A = s 2 × ( s 2 - a 2 + b 2 ) × ( s 2 - b 2 + c 2 ) × ( s 2 - a 2 + c 2 ) , 其中：
s = a 2 + b 2 + b 2 + c 2 + a 2 + c 2 ;
并根据所述三元网络回归面积A的大小来确定各组分在目标中药复方中的抗氧化活性贡献程度，即组分的三元网络回归面积A越大，其在目标中药复方中的抗氧化活性贡献程度越大；其中，
所述组分指的是通过制备液相分离目标中药复方时，在指定时间段内所收集的目标中药复方成分的集合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过制备液相色谱获得目标中药复方的各组分，并将各组分制备成干粉，包括：
将V1体积的目标中药复方的提取液置于V2体积的容量瓶中，加入体积分数为0～100％甲醇稀释并定容至刻度，超声混匀，离心后得到供试品溶液；
在预设的制备液相色谱条件下，取V3体积的供试品溶液注入制备液相色谱中，采用自动收集装置，每t分钟收集一次组分，收集N个组分，反复进样M次，收集合并相同组分，浓缩、干燥，得到各组分干粉，其中，M≥1。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述干燥为冻干。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预设的制备液相色谱条件还包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；
流动相：0.01～1％的甲酸水溶液-甲醇；
流速：5～20mL/分钟；
柱温：室温；
进样量：1～5mL；
检测波长：254和286nm。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，流动相为0.05～0.5％的甲酸水溶液-甲醇。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，流动相为0.1％的甲酸水溶液-甲醇。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预先设定的自由基清除活性实验为DPPH自由基清除活性实验。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，根据DPPH自由基清除活性实验确定各组分自由基清除活性的方法，包括：
用指定溶剂分别制备已知浓度为C样品的各组分样品溶液；
向体积为V4的各组分样品溶液中分别加入体积为V5浓度为CDPPH的DPPH溶液，并设置空白对照组及DPPH对照组，所述空白对照组包含V4体积的供试品溶液及V5体积的指定溶剂；所述DPPH对照组包括V4体积的指定溶剂及V5体积CDPPH浓度的DPPH溶液；
记录每个组分样品溶液的吸光度值OD样品、空白对照组的吸光度值OD空白及DPPH对照组的吸光度值ODDPPH，并根据公式：
DPPH自由基清除活性＝1-(OD样品-OD空白)/ODDPPH
确定各组分在浓度为C样品的情况下的自由基清除活性。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，采用多功能读板机在预设条件下记录每个组分样品溶液的吸光度值OD样品、空白对照组的吸光度值OD空白及DPPH对照组的吸光度值ODDPPH；所述预设条件包括：试验温度：20～50℃；读板速度：45s/次；采集时间：45min；检测波长：517nm。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，试验温度为30～40℃。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，试验温度为37℃。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标中药复方为丹红注射液。
CN201510079136.0A 2015-02-13 2015-02-13 中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法 Active CN104614481B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510079136.0A CN104614481B (zh) 2015-02-13 2015-02-13 中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510079136.0A CN104614481B (zh) 2015-02-13 2015-02-13 中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104614481A CN104614481A (zh) 2015-05-13
CN104614481B true CN104614481B (zh) 2016-04-20

Family

ID=53149023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510079136.0A Active CN104614481B (zh) 2015-02-13 2015-02-13 中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104614481B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106596432A (zh) * 2016-12-26 2017-04-26 天津中医药大学 活血化瘀类中药中化合物的活性贡献程度的确定方法
CN110441456A (zh) * 2019-06-06 2019-11-12 天津宏仁堂药业有限公司 一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108303485A (zh) * 2018-01-30 2018-07-20 中国中医科学院中药研究所 一种冬梨茶质量一致性评估的方法
CN108918437A (zh) * 2018-05-16 2018-11-30 天津中医药大学 一种活血化瘀中药制剂的抗氧化活性检测方法及应用
CN110376312B (zh) * 2019-08-20 2022-03-04 陕西中医药大学 中药质量等级检测方法
CN112326568B (zh) * 2020-10-20 2022-08-30 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 一种高抗氧化性鱼露生产原料的判定方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4837816B2 (ja) * 2000-07-14 2011-12-14 株式会社ポッカコーポレーション フリーラジカル消去剤
KR101147847B1 (ko) * 2010-06-02 2012-05-24 건국대학교 산학협력단 패류 유래 기능성 펩티드의 분리 정제 방법 및 기능성 펩티드의 용도
CN102269702A (zh) * 2011-05-05 2011-12-07 江苏省农业科学院 一种测定小浆果orac的检测试剂盒及其检测方法
KR101481758B1 (ko) * 2013-02-26 2015-01-12 전북대학교산학협력단 멍게먹물버섯 균사 배양액으로부터 분리한 신규한 항산화 활성을 갖는 화합물 및 이를 포함하는 항산화용 조성물
CN103760144A (zh) * 2014-01-17 2014-04-30 深圳职业技术学院 一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106596432A (zh) * 2016-12-26 2017-04-26 天津中医药大学 活血化瘀类中药中化合物的活性贡献程度的确定方法
CN110441456A (zh) * 2019-06-06 2019-11-12 天津宏仁堂药业有限公司 一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法
CN110441456B (zh) * 2019-06-06 2022-04-15 天津宏仁堂药业有限公司 一种基于量稳活多维网络模式的血府逐瘀胶囊质控标志物发现方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104614481A (zh) 2015-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104614481B (zh) 中药复方中组分的抗氧化活性贡献程度的确定方法
CN111624271A (zh) 检测芍药甘草汤对应实物的液相色谱方法、标准指纹图谱和应用
CN106770865B (zh) 一种银杏叶提取物中有机酸含量测定方法
CN106124639A (zh) 杜仲药材的多成分含量测定方法
CN101028388B (zh) 一种治疗眼疾近视及视疲劳中药制剂的质量检测方法
CN106290599B (zh) 一种中药组合物的含量测定方法
CN104391072A (zh) 一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂的质量控制方法
CN108205022B (zh) 颐和春制剂中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定方法
CN106370739A (zh) 康复新液制剂指纹图谱的质量测定方法及标准指纹图谱
CN106324167B (zh) 一种uplc测定黄芪提取物中黄酮类成分的方法
CN107315058A (zh) 一种检测银杏叶提取液中总银杏酸的方法
CN101029889A (zh) 一种治疗中老年眼部疾病中药制剂的质量检测方法
CN107688072A (zh) 一种醒脑静注射液的检测方法
CN103323558A (zh) 一种基于固相提取技术的银杏叶制剂分析样品快速制备方法
CN102068656A (zh) 一种中药制剂羊痫疯癫丸的质量控制方法
CN105675734A (zh) 一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法
CN107389827A (zh) 益母草或其复方制剂中盐酸水苏碱含量的测定方法
CN103822993B (zh) 一种含有兔耳草制剂的含量检测方法
CN108593794B (zh) 一种多指标成分uplc检测红花中有效成分含量方法
CN103235055B (zh) 双三元二维柱高效色谱法测定牙膏中三七皂苷r1和人参皂苷含量的方法
CN103115976A (zh) 金铁锁药材中入血化学成分尿囊素的含量测定方法
CN110967415B (zh) 一种养血清脑水提浸膏中毛蕊花糖苷的测定方法
CN106610406A (zh) 一种金银花的微量提取方法
CN105168612A (zh) 一种治疗仔猪腹泻的药物及其制法与检测方法及用途
CN110215494B (zh) 一种调节睡眠的中药颗粒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant