JP4349669B2 - アンモニア測定用液状試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の生体物質に由来するアンモニアの測定用液状試薬に関する。本発明の試薬は耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含み、液体状であることを特徴とする。
【０００２】
本発明はさらに、前記測定試薬を用いることを特徴とする、生体物質に含まれるアンモニアの測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
例えば、尿素、クレアチン等のように、アンモニアを生成する生体物質の含有量を測定する場合に、先ず当該生体物質からアンモニアを発生させて、生じたアンモニアの量および／または当該生体物質の量を測定することができる。
【０００４】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＬＤＨ」と言う）は、以下の式（１）：
【０００５】
【化１】
で表される反応を触媒する酵素であり、動植物、微生物に広く分布している。プロテウス属、バチルス属、サーモコッカス属等の細菌を含む、種々の起源に由来するＧＬＤＨが知られてり、グルタミン酸の定量、臨床診断等への応用酵素として生化学的、医学的分野においても近年特に注目されている。ＧＬＤＨの酵素活性はアンモニアを反応成分の一つとするので、当該酵素を用いて生体物質から生じたアンモニアおよび／または当該生体物質の量の量を測定することが可能である。
【０００６】
近年、多くの臨床検査用測定試薬組成物が、凍結乾燥された粉末から溶液状のものに置き換えられる傾向にある。これは多忙な臨床検査業務の現場において、粉末状の測定試薬組成物を、使用の都度、溶液に溶かす作業過程が省略され、現場の負担が軽減されるからである。ＧＬＤＨに関しても簡便な液体状の試薬の開発が希求されている。
【０００７】
しかし、ＧＬＤＨを含む液状試薬を開発する場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸））の安定性のために要求されるアルカリ条件の溶液を使用すると、ＧＬＤＨの失活が早く長期保存が困難であるという問題を伴う。また、保存時の偶発的温度変化に対する安定性の面からも長期間保存に適したものが得られていなかった。
【０００８】
よって、本発明前には保存時の温度変化に対する安定性、アルカリｐＨ溶液中における反応性、安定性に優れたＧＬＤＨを含む液状試薬は得られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含む、アンモニアを生成する生体物質（以下、「アンモニアを反応生成物とする生体物質」と言う）に由来するアンモニアを測定するための液状試薬を提供する。
【００１０】
本発明のアンモニア測定用液状試薬は、一態様において、耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼがピロコッカス属、好ましくはピロコッカス・フリオザスに由来する。
【００１１】
本発明のアンモニア測定用液状試薬は、一態様において、アンモニアを反応生成物とする生体物質が尿素またはクレアチンである。
【００１２】
本発明は、また、アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアの測定方法であって、試料中の前記生体物質からアンモニアを生じさせ、そして当該アンモニアの量を上記アンモニア測定用液状試薬によって測定する、ことを含む前記方法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来の問題解決のために鋭意研究の努めた結果、耐熱性ＧＬＤＨが、保存時の温度変化に対する安定性、アルカリ溶液安定性を示し、溶液中で高い酵素活性を長期間維持することを見いだした。そして、アンモニアを反応生成物とする生体物質の測定系に、前記耐熱性ＧＬＤＨを採用することにより本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアを測定するための液状試薬として、耐熱性ＧＬＤＨを使用することを特徴とする。
【００１４】
一般にＧＬＤＨとは、グルタミン酸を酸化して２−オキソグルタル酸とアンモニアを生じる反応を触媒する酵素であり、酵素番号１.４.１.２.、１.４.１.３.、１.４.１.４.が挙げられ、前述した式（１）に示す反応を触媒する。酵素番号１.４.１.２.の酵素は、ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）に特異的で、動物組織、植物、細菌に分布している。酵素番号１.４.１.３.の酵素は、ＮＡＤ+とＮＡＤＰ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸る）の両方と反応性を有し、動物の肝・腎臓のミトコンドリアに局在している。酵素番号１.４.１.４.の酵素は、酵母、細菌中にありＮＡＤＰ+に特異的である。
【００１５】
本発明は、アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法において、このＧＬＤＨの活性を利用するものである。より詳細には、先ず、尿、血液、血清、血漿、膵液等の試料に存在する内因性アンモニアを、２−オキソグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを別々に任意の順序で、または同時に作用させることにより除去し、次に酵素反応等によって該試料に含まれる生体物質からアンモニアを生成させ、内因性アンモニアの場合と同様に２−オキソグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを別々に任意の順序で、または同時に作用させる。そして、例えば、ＮＡＤＰＨの減少速度を３４０ｎｍ付近における吸光度で測定することにより、生体物質由来のアンモニアの量を定量する。
【００１６】
本発明の対象となるアンモニアを反応生成物とする生体物質は、限定されるわけではないが、尿素、クレアチンなどが含まれる。例えば、尿素の場合、以下の式（２）ような反応によって尿素に由来するアンモニアの量を測定することができる。
【００１７】
【化２】
【００１８】
耐熱性ＧＬＤＨ
本発明は上記反応において耐熱性ＧＬＤＨを用いるものである。限定されるわけではないが、古細菌のピロコッカス属に由来するＧＬＤＨが好ましく、特に、超好熱菌として広く知られるようになった、ピロコッカス・フリオザス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）が好ましい。ピロコッカス・フリオザスは、９５℃、１０分間の熱処理を行っても酵素活性が保持される。また、アルカリ条件下（例えば、ｐＨ９−１１）で３７℃１週間保存後でも８０％以上安定である。具体的には、後述する実施例４では、例えば、ｐＨ９．３、３７℃の条件下で２週間保存した場合でも、９５％の活性が残存していた。
【００１９】
ピロコッカス・フリオザス由来の耐熱性ＧＬＤＨについては、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．１１２０（１９９２）ｐ．２６７−２７２；Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７（６），ｐ．９４５−９５１，１９９３；Ｇｅｎｅ １３２（１９９３） ｐ．１４３−１４８等に記載されている。また、ピロコッカス・フリオザスの代表的な菌株は、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３３００，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＦＤＲ）にブタペスト条約の下、寄託番号ＤＳＭ３６３８で国際寄託されている。さらに、工業技術院生命工学研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）にもＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１５９、１９９７年１１月６日）として寄託されている。
【００２０】
その他の耐熱性ＧＬＤＨ、例えばサーモコッカス属のサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＧＬＤＨ（特開平６−３２７４７１号公報、ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ Ｆｅｂ．１９９４ ｐ．５６２−５６８）も利用可能である。サーモコッカス・リトラリスのＧＬＤＨは、ｐＨ７．０−１１．０で安定で、ｐＨ７．８が至適ｐＨで高い活性が認められ、また９０℃付近に作用適温を有し、ｐＨ７のとき１０分間の熱処理で９５℃までは安定である。また、ピロコッカスの場合と同様にアルカリ条件下で長期保存しても安定である。具体的には、例えば、後述する実施例４では、例えば、３７℃で２週間保存した場合でも、９０％の活性が残存していた。
【００２１】
本発明の耐熱性ＧＬＤＨは、限定されるわけではないが、ピロコッカス属、サーモコッカス属などを含む好熱性細菌等から公知の方法によって、抽出、精製することができる。例えば、ピロコッカス・フリオザスは前述したＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７（６），ｐ．９４５−９５１に記載された方法に準じて行うことが出来る。また、本発明の耐熱性ＧＬＤＨは、遺伝子工学によって得られた組換え型ＧＬＤＨであっても良い。当業者は本明細書の開示に基づいて容易に耐熱性ＧＬＤＨを得ることができる。
【００２２】
耐熱性ＧＬＤを含む液状試薬
本発明の液状試薬は、水性媒体中に耐熱性ＧＬＤＨを含むことを特徴とする。耐熱性ＧＬＤＨは、１単位／ｍｌから１００単位／ｍｌ、好ましくは、５単位／ｍｌから２０単位／ｍｌの濃度で含まれる。この場合のＧＬＤＨの単位は、ＧＬＤＨの活性測定の標準的な条件下、例えば、３７℃、ｐＨ８．０で、１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰ+を生成する酵素の量を１単位とする。
【００２３】
本発明の液状試薬はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの保存中および／または反応中の安定性を保持するためアルカリ性、好ましくは、ｐＨ８−１１、より好ましくはｐＨ９−１０であることが必要である。そのため、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の塩基を含むことが望ましい。塩基は、例えば、炭酸水素ナトリウムの場合、５ｍＭ−５０ｍＭの濃度で含む。
【００２４】
本発明の液状試薬はさらに、所望により０．２ｍＭ−０．５ｍＭ、好ましくは０．３ｍＭ−０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、および１ｍＭ−２０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ−１０ｍＭの２−オキソグルタル酸を含む。これらは、液状試薬中に耐熱性ＧＬＤＨと共にあらかじめ含まれていても、あるいは反応時に加えるように、別々の容器に含まれていてもよい。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の液状試薬とともに、尿素、クレアチン等からアンモニアを生成させるための酵素、例えばウレアーゼを別の容器に含んだ、測定キットも提供する。
【００２６】
アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアの測定方法
本発明の試薬を用いて、アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアを測定することができる。具体的には、本発明の方法は、試料中の前記生体物質からアンモニアを生じさせ、そして当該アンモニアの量を本発明の液状試薬によって測定することを特徴とする。
【００２７】
本発明の対象となるアンモニアを反応生成物とする生体物質は、分解、変換等の反応によってアンモニアを発生する生体物質であり、限定されるわけではないが、尿素、クレアチンなどが含まれる。好ましくは尿素である。
【００２８】
本発明の試料は、前記生体物質を含む可能性のあるものであれば特に限定されず、尿、血液、血清、血漿、膵液等が含まれる。試料は、生体から得たものであっても、あるいは研究試薬等人為的に調製されたものであってもよい。
【００２９】
本発明においては、先ず酵素反応等によって生体物質からアンモニアを生成させる。アンモニアを発生させる方法は公知の方法に従って行うことができる。例えば、生体物質が尿素の場合にはウレアーゼを用いることができる。またクレアチンの場合には先ず、水酸化バリウムの作用により尿素（およびサルコシン）を生成させ、さらにウレアーゼを用いることができる。ウレアーゼは例えば、２５℃−４０℃で、５分−１時間反応させる。当業者は生体物質に応じて容易に反応を選択することが可能である。
【００３０】
次に、耐熱性ＧＬＤＨ、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む、本発明のアンモニア測定用液状試薬を作用させる。反応は、アルカリ条件下、ｐＨ８−１１、より好ましくはｐＨ９−１０において行う。反応は、好ましくは２５℃−４０℃で、５分−１時間行う。
【００３１】
上記反応により消費されたアンモニアの量は、公知の方法によって測定することができる。限定するわけではないが、例えば、ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍにおいて特異的な吸収特性を有するので、当該波長における吸光度をＧＬＤＨを反応させる前後で測定し、その変化を既知量のアンモニアおよび／または生体物質を使用して得られたデータと比較することにより、生体物質由来のアンモニア、および／または生体物質の量を測定することができる。
【００３２】
本発明の測定方法においては、生体物質からアンモニアを発生させる前に、試料中に既に存在する遊離のアンモニア（内因性アンモニア）をあらかじめ除去することが好ましい。内因性アンモニア除去のための前処理は、限定するわけではないが、本発明のアンモニア測定用液状試薬を、生体物質からアンモニアを発生させる反応の前に試料に添加することによって行うことができる。
【００３３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３４】
【実施例】
実施例１ ピロコッカス・フリオザスおよびサーモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＧＬＤＨの抽出および精製
好熱性細菌ピロコッカス・フリオザス（ＤＭＳ ３６３８）およびサーモコッカス・リトラリスから耐熱性ＧＬＤＨを以下のように抽出・精製した。
【００３５】
ａ．菌体培養
微生物の培養方法は、以下の表１に示す組成の培地を使用した。
【００３６】
【表１】
表１ 培地組成
（１Ｌ当り）
トリプトン ５ｇ
酵母エキス １ｇ
ＮａＣｌ ２４ｇ
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １１ｇ
Ｎａ2ＳＯ4 ４ｇ
ＣａＣｌ2 ２Ｈ2Ｏ １.５ｇ
ＫＣｌ ０.７ｇ
ＮａＨＣＯ3 ０.２ｇ
ＮａＢｒ（ＫＢｒ） ０.１ｇ
Ｈ3ＢＯ3 ０.０３ｇ
ＳｒＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.０２５ｇ
Ｎａ2ＷＯ4・２Ｈ2Ｏ １０μＭ
粉末硫黄 １０ｇ
Ｎａ 2 Ｓ・９Ｈ 2 Ｏ ０ . ５ｇ
硫化ナトリウムの添加混合前に、塩酸でｐＨ６．５±０．２に設定した。
【００３７】
上記培地を作成後、９５−９８℃付近に設定したオーブン庫内にガラスベッセルに分注した培地を入れ、１−２時間加温した（本加温時はガス発生を考慮し密栓はしない）。ついで、絶対嫌気性の雰囲気を調製するため、Ｎ2ガスを吹き込み窒素ガス置換を行った後、予め溶かしていた硫化ナトリウム水溶液を培地に注ぎ培地を調製した。該調製培地に対して、１／２０−１／１０容量の添加を目安に前培養液の接種を行った後、上記の培養温度で嫌気培養を１終夜行った。
【００３８】
ｂ．耐熱性ＧＬＤＨの抽出・精製
（１）抽出
培養終了後、遠心分離により微生物菌体を集菌した。その際、あらかじめ培地中に添加した粉末硫黄はナイロンメッシュにより取り除いた。集菌した菌体に、１００−１０００ｍＬ程度の抽出用緩衝液（１ｍＭ ２ＭＥ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＮａＮ3および０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ Ｋ-ＰＯ4緩衝液（ｐＨ ７．５））を添加しよく懸濁した。その後、短時間の超音波破砕処理を行いＧＬＤＨを抽出をした。遠心分離により上清を回収しＧＬＤＨ抽出液とした。
【００３９】
（２）イオン交換クロマトグラフィ
先のＧＬＤＨ抽出液を純水にて希釈し、そのイオン強度を平衡化用緩衝液（１ｍＭ ２ＭＥ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＮａＮ3を含む１０ｍＭ Ｋ-ＰＯ4緩衝液（ｐＨ ７．５））のイオン強度に調整した。次いで、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂカラム（ＤＩ ５ｃｍ×１０ｃｍＨ，２００ ｍＬｇｅｌ）に装填し、平衡化緩衝液にて充分に洗浄した。次いで、０−０．６ＭのＮａＣｌ溶液にて勾配溶出をおこなった。その結果、ＧＬＤＨは、０．５ＭＮａＣｌ付近に単一なピークとして回収された。
【００４０】
（３）疎水クロマトグラフィ
次いでイオン交換カラム溶出分画液中に１．５Ｍ硫安濃度になるようにｐＨを調整しながら粉末硫安を添加、溶解した。この時、生じた沈殿は遠心分離により除去した。上清をＰｈｅｎｙｌ-Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラム（ＤＩ３ｃｍ×１５ｃｍＨ，１００ｍＬｇｅｌ）に装填し、平衡化用緩衝液（１ｍＭ ２ＭＥ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＮａＮ3および１．５Ｍ硫安を含む１０ｍＭ Ｋ-ＰＯ4緩衝液（ｐＨ ７．５））にて充分に洗浄した。次いで、１．５−０Ｍの硫安溶液にて勾配溶出をおこなった。その結果、ＧＬＤＨは、１Ｍ硫安付近に単一なピークとして回収された。
【００４１】
（４）ゲル濾過クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
疎水クロマトグラフィ溶出分画液を限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，ＰＭ１０）を用いて濃縮試料を作製後、Ｔｓｋｇｅｌ Ｇ３,０００ＳＷ（１インチカラム）東ソー製上にてゲルろ過クロマトグラフィをおこなった。その結果、ＧＬＤＨは分子量３００ｋＤのところに単一なピークとしてアイソクラテック溶出された。
【００４２】
ＨＰＬＣ条件を以下の表２に示す。
【００４３】
【表２】
表２
ＨＰＬＣ装置 ：ＣＣＰＭ（東ソー製）
流速 ：３ｍＬ／分
検出 ：２８０ｎｍにおけるＵＶ （ＵＶ８０１０，東ソー製）
平衡化緩衝液 ：０．２ Ｍ ＮａＣｌおよび０．０２ ％ ＮａＮ3を含む１００ｍＭ Ｋ-ＰＯ4バッファー（ｐＨ ７．０）
【００４４】
ｃ．耐熱性ＧＬＤＨの活性
上記抽出・精製工程によって得られたピロコッカス・フリオザスおよびサーモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＧＬＤＨの酵素活性を以下の表３に示す条件で測定した。
【００４５】
【表３】
表３
測定温度；３７℃
測定波長；３４０ｎｍ
反応液ｐＨ；８．０
活性単位は１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰ+生成量を１単位と定めた。
【００４６】
その結果、上記の精製工程を通じて、４０Ｌの菌体培養より精製ＧＬＤＨがピロコッカス・フリオザス由来のものが５０００単位、サーモコッカス・リトラリス由来のものが１０，０００単位得られた。得られた２種類の耐熱性ＧＬＤＨの性質を以下の表４に示した。
【００４７】
【表４】
表４
サーモコッカス・リトラリス ピロコッカス・フリオザス
分子量 ３００ｋＤ ３００ｋＤ
サブユニット構造 ６×５０ｋＤ ６×５０ｋＤ
至適ｐＨ ｐＨ７．５ ｐＨ ８．０
作用適温 ９０℃付近 ９０℃付近
３７℃での作用反応性： 可能 可能
【００４８】
実施例２ 耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含む液状試薬を用いた尿素由来のアンモニアの測定
ａ．実施例１で得られた耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを種々の濃度で含む液状試薬を用いて、尿素由来のアンモニアの測定を行った。
【００４９】
アンモニア測定用液状試薬
各種濃度のピロコッカス・フリオザスまたはサーモコッカス・リトラリス由来のＧＬＤＨ
２０ｍＭ ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ ９．３）
７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ
０．０２％ ＮａＮ3
アンモニア生成用試薬
１００ｍＭ ＴＥＡ-ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）
０．１％ Ｂｒｉｊｉ−３５
１２５ｍＭ Ｂｏｒａｘ
６０単位／ｍＬ ウレアーゼ
（タチナタマメ（ｊａｃｋ ｂｅａｎ）由来，ＴＯＹＯＢＯ）
【００５０】
先ず、２１４ｍｇ／ｄｌの尿素を含む試料１５μｌに、実施例１で得られた各種濃度のピロコッカス・フリオザスまたはサーモコッカス・リトラリス由来のＧＬＤＨを含む上記アンモニア測定用液状試薬を３２０μｌ反応させることにより、試料中に含まれる可能性のあるアンモニアを予備的に除去した。反応は３７℃で５分間行った。次に、アンモニア生成用試薬を８０μｌ加え、アンモニアの生成反応、並びに生成したアンモニアを用いたＧＬＤＨ酵素反応を行った。反応は、３７℃で５分行った。
【００５１】
尿素に由来するアンモニアに対する応答性は、アンモニア生成用試薬を加える前後の吸光度変化量（△Ａ３４０／分）として求めた。測定は自動分析機 コーバスファラ（ロシュ社製）を用いて行った。
【００５２】
結果を図１に示す。その結果、ピロコッカス・フリオザス由来のＧＬＤＨは約１０単位／ｍｌ以上、サーモコッカス・リトラリス由来のものは約１００単位／ｍｌ以上の濃度でアンモニアを測定可能であることがわかった。
【００５３】
ｂ．また、耐熱性ＧＬＤＨを１０単位／ｍｌを含むアンモニア測定用液状試薬を用いて、各種濃度の尿素（４０ｍｇ／ｄｌ−４５０ｍｇ／ｄｌ）を含む試料を上記ａと同様に測定した。結果を図２に示す。図２より本発明の試薬は尿素に由来するアンモニアを用量依存的に測定可能であることが判明した。
【００５４】
実施例３ 生体物質に由来するアンモニアの測定における内因性アンモニアの影響
試料に４ｍｇ／ｄｌのアンモニアを加えた場合、生体物質に由来するアンモニアの測定に添加したアンモニア（内因性アンモニア）が影響を与えるか、否かについて検討した。
【００５５】
アンモニア測定用液状試薬は、実施例２ｂで用いたピロコッカス・フリオザス由来のＧＬＤＨを１０単位／ｍｌを含むものを使用した。試料は、２５ｍｇ／ｄｌの尿素を含む市販のコントロール血清（日水製薬製）を用いた。測定は、アンモニア測定用試薬を反応させる前に、先ず、４ｍｇ／ｄｌのアンモニアを試料に添加する点を除き、実施例２ｂと同様に行った。
【００５６】
アンモニア生成用試薬を加える前後の吸光度変化を、３０ｍｇ／ｄｌの尿素を含む標準液を用いて得られた吸光度変化量より換算した。その結果、４ｍｇ／ｄｌのアンモニアを加えた場合においても、加えない場合と同様に尿素の含有量２５ｍｇ／ｄｌと計測された。よって、アンモニア測定用液状試薬による前処理により、試料中にあらかじめ存在する内因性のアンモニアは完全に除去され、生体物質に由来するアンモニアの測定に影響を与えないことが示された。
【００５７】
実施例４ 耐熱性ＧＬＤＨを含むアンモニア測定用液状試薬の保存安定性
１０単位／ｍｌの耐熱性ＧＬＤＨを含む、実施例２のアンモニア測定用液状試薬の長期保存中の溶液安定性を、ＧＬＤＨ酵素活性の残存率として調べた。結果を以下の表５に示す。表５中のＧＬＤＨの残存活性率（％）はいずれも試薬調製時の活性を１００としたときの値である。
【００５８】
【表５】
【００５９】
実施例５ 組換え型耐熱性ＧＬＤＨを含む液状アンモニア測定試薬の調製、並びに当該試薬を用いたアンモニアの測定
ａ．組換え型ＧＬＤＨの調製
ピロコッカス・フリオザス由来の耐熱性ＧＬＤＨ遺伝子のクローニングおよび大腸菌での発現ならびに、発現された組換え型ＧＬＤＨの精製方法については、Diruggiero J とRobb FT (1995) Appl. Environ. Microbiol Vol.61 No.1 page 159ー164に記載の方法に従っておこなった。
【００６０】
得られた組換え型酵素標品の性質を、実施例１で調製した天然型ＧＬＤＨと対比させた結果を以下の表６に示す。
【００６１】
【表６】
【００６２】
表６に示されたように、組換え型耐熱性ＧＬＤＨは，その物理化学的および酵素的性状において天然型と同様なものであることが確かめられた。
【００６３】
ｂ．微量アンモニアに対する反応性
先ず、微量アンモニアに対する組換え型ＧＬＤＨの反応性を、天然型ＧＬＤＨと比較しながら検討した。反応液の組成は以下の通りである。
【００６４】
反応液組成 （ｐＨ８．０）
１−１０Ｕ／ｍｌ ＧＬＤＨ
１００μＭ ＮＨ4Ｃｌ
７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ
【００６５】
３７℃５分間、加温反応させアンモニアとオキソグルタル酸をグルタミン酸へ変換する際に生じたＮＡＤＰＨの減少量を吸光度変化量から求め、添加ＧＬＤＨ量に対してプロットした。その結果を図３に示す。図３より、組換え型ＧＬＤＨも天然型ＧＬＤＨも微量アンモニアに対する反応性を示し、組換え型ＧＬＤＨの方がより少量でも反応性を示すことが明らかとなった。
【００６６】
ｃ．尿素由来のアンモニアの測定
ａで得られた組換え型耐熱性ＧＬＤＨを含む液状試薬を用いて、尿素由来のアンモニアを測定した。測定は、実施例２と同様に、自動分析機 コーバスファラ（ロシュ社製）を用いて、３７℃で測定波長３４０ｎｍを用いて行った。
【００６７】
アンモニア測定用液状試薬
ＧＬＤＨ １０Ｕ／ｍｌ
２０ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．３）
７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ
０．０２％ ＮａＮ3
アンモニア生成用試薬
１００ｍＭ ＴＥＡ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１％ Ｂｒｉｊｉ−３５
５０ｍＭ ＣｙＤＴＡ
１０単位／ｍｌ ウレアーゼ（微生物（クレブシエラ属）由来)
【００６８】
試料、アンモニア測定用液状試薬およびアンモニア生成用試薬を各々１０μｌ：３２０μｌ：８０μｌの割合で用いて、実施例２と同様に試料中のアンモニアの測定を行った。
【００６９】
尿素に由来するアンモニア中の窒素の濃度換算は、３０ｍｇ／ｄＬ標準液の吸光度変化量より読み取り求めた。試料の希釈系列を作成して同様に窒素濃度を求める測定を行った。希釈系列の直線性度合いを、ａで調製した組換え型ＧＬＤＨと実施例１で調製した天然型ＧＬＤＨの双方について調べた。
【００７０】
結果を図４に示す。図４より組換え型および天然型のいずれも希釈系列を直線的に測定することが可能である。また本実施例では、天然型に比べて組換え耐熱性ＧＬＤＨの方が希釈直線性が若干優れていた。
【００７１】
【発明の効果】
上記の通り、本発明の液状試薬は、耐熱性ＧＬＤＨを用いることにより、耐熱性、アルカリ溶液安定性に優れ、溶液中で高い酵素活性を長期間維持する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、２１４ｍｇ／ｄｌの尿素を含む試料を用いた場合の、ＧＬＤＨ量と吸光度変化量との関係を示す。
【図２】 図２は、１０単位／ｍｌのＧＬＤＨを用いた場合の尿素の検量線である。
【図３】 図３は、組換え型および天然型のＧＬＤＨを用いた場合の、１００μｌのＮＨ4Ｃｌに対する反応性を示す。
【図４】 図４は、組換え型および天然型のＧＬＤＨを用いた場合の、尿素由来の窒素を含む試料の希釈系列の窒素濃度測定値を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の生体物質に由来するアンモニアの測定用液状試薬に関する。本発明の試薬は耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含み、液体状であることを特徴とする。
【０００２】
本発明はさらに、前記測定試薬を用いることを特徴とする、生体物質に含まれるアンモニアの測定方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
例えば、尿素、クレアチン等のように、アンモニアを生成する生体物質の含有量を測定する場合に、先ず当該生体物質からアンモニアを発生させて、生じたアンモニアの量および／または当該生体物質の量を測定することができる。
【０００４】
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＬＤＨ」と言う）は、以下の式（１）：
【０００５】
【化１】
【０００６】
近年、多くの臨床検査用測定試薬組成物が、凍結乾燥された粉末から溶液状のものに置き換えられる傾向にある。これは多忙な臨床検査業務の現場において、粉末状の測定試薬組成物を、使用の都度、溶液に溶かす作業過程が省略され、現場の負担が軽減されるからである。ＧＬＤＨに関しても簡便な液体状の試薬の開発が希求されている。
【０００７】
しかし、ＧＬＤＨを含む液状試薬を開発する場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸））の安定性のために要求されるアルカリ条件の溶液を使用すると、ＧＬＤＨの失活が早く長期保存が困難であるという問題を伴う。また、保存時の偶発的温度変化に対する安定性の面からも長期間保存に適したものが得られていなかった。
【０００８】
よって、本発明前には保存時の温度変化に対する安定性、アルカリｐＨ溶液中における反応性、安定性に優れたＧＬＤＨを含む液状試薬は得られていなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含む、アンモニアを生成する生体物質（以下、「アンモニアを反応生成物とする生体物質」と言う）に由来するアンモニアを測定するための液状試薬を提供する。
【００１０】
本発明のアンモニア測定用液状試薬は、一態様において、耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼがピロコッカス属、好ましくはピロコッカス・フリオザスに由来する。
【００１１】
本発明のアンモニア測定用液状試薬は、一態様において、アンモニアを反応生成物とする生体物質が尿素またはクレアチンである。
【００１２】
本発明は、また、アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアの測定方法であって、試料中の前記生体物質からアンモニアを生じさせ、そして当該アンモニアの量を上記アンモニア測定用液状試薬によって測定する、ことを含む前記方法を提供する。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来の問題解決のために鋭意研究の努めた結果、耐熱性ＧＬＤＨが、保存時の温度変化に対する安定性、アルカリ溶液安定性を示し、溶液中で高い酵素活性を長期間維持することを見いだした。そして、アンモニアを反応生成物とする生体物質の測定系に、前記耐熱性ＧＬＤＨを採用することにより本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアを測定するための液状試薬として、耐熱性ＧＬＤＨを使用することを特徴とする。
【００１４】
一般にＧＬＤＨとは、グルタミン酸を酸化して２−オキソグルタル酸とアンモニアを生じる反応を触媒する酵素であり、酵素番号１.４.１.２.、１.４.１.３.、１.４.１.４.が挙げられ、前述した式（１）に示す反応を触媒する。酵素番号１.４.１.２.の酵素は、ＮＡＤ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）に特異的で、動物組織、植物、細菌に分布している。酵素番号１.４.１.３.の酵素は、ＮＡＤ+とＮＡＤＰ+（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸る）の両方と反応性を有し、動物の肝・腎臓のミトコンドリアに局在している。酵素番号１.４.１.４.の酵素は、酵母、細菌中にありＮＡＤＰ+に特異的である。
【００１５】
本発明は、アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法において、このＧＬＤＨの活性を利用するものである。より詳細には、先ず、尿、血液、血清、血漿、膵液等の試料に存在する内因性アンモニアを、２−オキソグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを別々に任意の順序で、または同時に作用させることにより除去し、次に酵素反応等によって該試料に含まれる生体物質からアンモニアを生成させ、内因性アンモニアの場合と同様に２−オキソグルタル酸、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧＬＤＨを別々に任意の順序で、または同時に作用させる。そして、例えば、ＮＡＤＰＨの減少速度を３４０ｎｍ付近における吸光度で測定することにより、生体物質由来のアンモニアの量を定量する。
【００１６】
本発明の対象となるアンモニアを反応生成物とする生体物質は、限定されるわけではないが、尿素、クレアチンなどが含まれる。例えば、尿素の場合、以下の式（２）ような反応によって尿素に由来するアンモニアの量を測定することができる。
【００１７】
【化２】
耐熱性ＧＬＤＨ
本発明は上記反応において耐熱性ＧＬＤＨを用いるものである。限定されるわけではないが、古細菌のピロコッカス属に由来するＧＬＤＨが好ましく、特に、超好熱菌として広く知られるようになった、ピロコッカス・フリオザス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）が好ましい。ピロコッカス・フリオザスは、９５℃、１０分間の熱処理を行っても酵素活性が保持される。また、アルカリ条件下（例えば、ｐＨ９−１１）で３７℃１週間保存後でも８０％以上安定である。具体的には、後述する実施例４では、例えば、ｐＨ９．３、３７℃の条件下で２週間保存した場合でも、９５％の活性が残存していた。
【００１９】
ピロコッカス・フリオザス由来の耐熱性ＧＬＤＨについては、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．１１２０（１９９２）ｐ．２６７−２７２；Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７（６），ｐ．９４５−９５１，１９９３；Ｇｅｎｅ １３２（１９９３） ｐ．１４３−１４８等に記載されている。また、ピロコッカス・フリオザスの代表的な菌株は、ＤＳＭ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３３００，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，ＦＤＲ）にブタペスト条約の下、寄託番号ＤＳＭ３６３８で国際寄託されている。さらに、工業技術院生命工学研究所（〒３０５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）にもＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＳＭ３６３８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１５９、１９９７年１１月６日）として寄託されている。
【００２０】
その他の耐熱性ＧＬＤＨ、例えばサーモコッカス属のサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のＧＬＤＨ（特開平６−３２７４７１号公報、ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ Ｆｅｂ．１９９４ ｐ．５６２−５６８）も利用可能である。サーモコッカス・リトラリスのＧＬＤＨは、ｐＨ７．０−１１．０で安定で、ｐＨ７．８が至適ｐＨで高い活性が認められ、また９０℃付近に作用適温を有し、ｐＨ７のとき１０分間の熱処理で９５℃までは安定である。また、ピロコッカスの場合と同様にアルカリ条件下で長期保存しても安定である。具体的には、例えば、後述する実施例４では、例えば、３７℃で２週間保存した場合でも、９０％の活性が残存していた。
【００２１】
本発明の耐熱性ＧＬＤＨは、限定されるわけではないが、ピロコッカス属、サーモコッカス属などを含む好熱性細菌等から公知の方法によって、抽出、精製することができる。例えば、ピロコッカス・フリオザスは前述したＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７（６），ｐ．９４５−９５１に記載された方法に準じて行うことが出来る。また、本発明の耐熱性ＧＬＤＨは、遺伝子工学によって得られた組換え型ＧＬＤＨであっても良い。当業者は本明細書の開示に基づいて容易に耐熱性ＧＬＤＨを得ることができる。
【００２２】
耐熱性ＧＬＤを含む液状試薬
本発明の液状試薬は、水性媒体中に耐熱性ＧＬＤＨを含むことを特徴とする。耐熱性ＧＬＤＨは、１単位／ｍｌから１００単位／ｍｌ、好ましくは、５単位／ｍｌから２０単位／ｍｌの濃度で含まれる。この場合のＧＬＤＨの単位は、ＧＬＤＨの活性測定の標準的な条件下、例えば、３７℃、ｐＨ８．０で、１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰ+を生成する酵素の量を１単位とする。
【００２３】
本発明の液状試薬はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの保存中および／または反応中の安定性を保持するためアルカリ性、好ましくは、ｐＨ８−１１、より好ましくはｐＨ９−１０であることが必要である。そのため、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の塩基を含むことが望ましい。塩基は、例えば、炭酸水素ナトリウムの場合、５ｍＭ−５０ｍＭの濃度で含む。
【００２４】
本発明の液状試薬はさらに、所望により０．２ｍＭ−０．５ｍＭ、好ましくは０．３ｍＭ−０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、および１ｍＭ−２０ｍＭ、好ましくは５ｍＭ−１０ｍＭの２−オキソグルタル酸を含む。これらは、液状試薬中に耐熱性ＧＬＤＨと共にあらかじめ含まれていても、あるいは反応時に加えるように、別々の容器に含まれていてもよい。
【００２５】
本発明はさらに、本発明の液状試薬とともに、尿素、クレアチン等からアンモニアを生成させるための酵素、例えばウレアーゼを別の容器に含んだ、測定キットも提供する。
【００２６】
アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアの測定方法
本発明の試薬を用いて、アンモニアを反応生成物とする試料中の生体物質に由来するアンモニアを測定することができる。具体的には、本発明の方法は、試料中の前記生体物質からアンモニアを生じさせ、そして当該アンモニアの量を本発明の液状試薬によって測定することを特徴とする。
【００２７】
本発明の対象となるアンモニアを反応生成物とする生体物質は、分解、変換等の反応によってアンモニアを発生する生体物質であり、限定されるわけではないが、尿素、クレアチンなどが含まれる。好ましくは尿素である。
【００２８】
本発明の試料は、前記生体物質を含む可能性のあるものであれば特に限定されず、尿、血液、血清、血漿、膵液等が含まれる。試料は、生体から得たものであっても、あるいは研究試薬等人為的に調製されたものであってもよい。
【００２９】
本発明においては、先ず酵素反応等によって生体物質からアンモニアを生成させる。アンモニアを発生させる方法は公知の方法に従って行うことができる。例えば、生体物質が尿素の場合にはウレアーゼを用いることができる。またクレアチンの場合には先ず、水酸化バリウムの作用により尿素（およびサルコシン）を生成させ、さらにウレアーゼを用いることができる。ウレアーゼは例えば、２５℃−４０℃で、５分−１時間反応させる。当業者は生体物質に応じて容易に反応を選択することが可能である。
【００３０】
次に、耐熱性ＧＬＤＨ、２−オキソグルタル酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを含む、本発明のアンモニア測定用液状試薬を作用させる。反応は、アルカリ条件下、ｐＨ８−１１、より好ましくはｐＨ９−１０において行う。反応は、好ましくは２５℃−４０℃で、５分−１時間行う。
【００３１】
上記反応により消費されたアンモニアの量は、公知の方法によって測定することができる。限定するわけではないが、例えば、ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍにおいて特異的な吸収特性を有するので、当該波長における吸光度をＧＬＤＨを反応させる前後で測定し、その変化を既知量のアンモニアおよび／または生体物質を使用して得られたデータと比較することにより、生体物質由来のアンモニア、および／または生体物質の量を測定することができる。
【００３２】
本発明の測定方法においては、生体物質からアンモニアを発生させる前に、試料中に既に存在する遊離のアンモニア（内因性アンモニア）をあらかじめ除去することが好ましい。内因性アンモニア除去のための前処理は、限定するわけではないが、本発明のアンモニア測定用液状試薬を、生体物質からアンモニアを発生させる反応の前に試料に添加することによって行うことができる。
【００３３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を制限するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３４】
【実施例】
実施例１ ピロコッカス・フリオザスおよびサーモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＧＬＤＨの抽出および精製
好熱性細菌ピロコッカス・フリオザス（ＤＭＳ ３６３８）およびサーモコッカス・リトラリスから耐熱性ＧＬＤＨを以下のように抽出・精製した。
【００３５】
ａ．菌体培養
微生物の培養方法は、以下の表１に示す組成の培地を使用した。
【００３６】
【表１】
表１ 培地組成
（１Ｌ当り）
トリプトン ５ｇ
酵母エキス １ｇ
ＮａＣｌ ２４ｇ
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １１ｇ
Ｎａ2ＳＯ4 ４ｇ
ＣａＣｌ2 ２Ｈ2Ｏ １.５ｇ
ＫＣｌ ０.７ｇ
ＮａＨＣＯ3 ０.２ｇ
ＮａＢｒ（ＫＢｒ） ０.１ｇ
Ｈ3ＢＯ3 ０.０３ｇ
ＳｒＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.０２５ｇ
Ｎａ2ＷＯ4・２Ｈ2Ｏ １０μＭ
粉末硫黄 １０ｇ
Ｎａ 2 Ｓ・９Ｈ 2 Ｏ ０ . ５ｇ
硫化ナトリウムの添加混合前に、塩酸でｐＨ６．５±０．２に設定した。
【００３７】
上記培地を作成後、９５−９８℃付近に設定したオーブン庫内にガラスベッセルに分注した培地を入れ、１−２時間加温した（本加温時はガス発生を考慮し密栓はしない）。ついで、絶対嫌気性の雰囲気を調製するため、Ｎ2ガスを吹き込み窒素ガス置換を行った後、予め溶かしていた硫化ナトリウム水溶液を培地に注ぎ培地を調製した。該調製培地に対して、１／２０−１／１０容量の添加を目安に前培養液の接種を行った後、上記の培養温度で嫌気培養を１終夜行った。
【００３８】
ｂ．耐熱性ＧＬＤＨの抽出・精製
（１）抽出
培養終了後、遠心分離により微生物菌体を集菌した。その際、あらかじめ培地中に添加した粉末硫黄はナイロンメッシュにより取り除いた。集菌した菌体に、１００−１０００ｍＬ程度の抽出用緩衝液（１ｍＭ ２ＭＥ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＮａＮ3および０．１ｍＭ ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ Ｋ-ＰＯ4緩衝液（ｐＨ ７．５））を添加しよく懸濁した。その後、短時間の超音波破砕処理を行いＧＬＤＨを抽出をした。遠心分離により上清を回収しＧＬＤＨ抽出液とした。
【００３９】
（２）イオン交換クロマトグラフィ
先のＧＬＤＨ抽出液を純水にて希釈し、そのイオン強度を平衡化用緩衝液（１ｍＭ ２ＭＥ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＮａＮ3を含む１０ｍＭ Ｋ-ＰＯ4緩衝液（ｐＨ ７．５））のイオン強度に調整した。次いで、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ６Ｂカラム（ＤＩ ５ｃｍ×１０ｃｍＨ，２００ ｍＬｇｅｌ）に装填し、平衡化緩衝液にて充分に洗浄した。次いで、０−０．６ＭのＮａＣｌ溶液にて勾配溶出をおこなった。その結果、ＧＬＤＨは、０．５ＭＮａＣｌ付近に単一なピークとして回収された。
【００４０】
（３）疎水クロマトグラフィ
次いでイオン交換カラム溶出分画液中に１．５Ｍ硫安濃度になるようにｐＨを調整しながら粉末硫安を添加、溶解した。この時、生じた沈殿は遠心分離により除去した。上清をＰｈｅｎｙｌ-Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラム（ＤＩ３ｃｍ×１５ｃｍＨ，１００ｍＬｇｅｌ）に装填し、平衡化用緩衝液（１ｍＭ ２ＭＥ，０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０２％ ＮａＮ3および１．５Ｍ硫安を含む１０ｍＭ Ｋ-ＰＯ4緩衝液（ｐＨ ７．５））にて充分に洗浄した。次いで、１．５−０Ｍの硫安溶液にて勾配溶出をおこなった。その結果、ＧＬＤＨは、１Ｍ硫安付近に単一なピークとして回収された。
【００４１】
（４）ゲル濾過クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）
疎水クロマトグラフィ溶出分画液を限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ，ＰＭ１０）を用いて濃縮試料を作製後、Ｔｓｋｇｅｌ Ｇ３,０００ＳＷ（１インチカラム）東ソー製上にてゲルろ過クロマトグラフィをおこなった。その結果、ＧＬＤＨは分子量３００ｋＤのところに単一なピークとしてアイソクラテック溶出された。
【００４２】
ＨＰＬＣ条件を以下の表２に示す。
【００４３】
【表２】
表２
ＨＰＬＣ装置 ：ＣＣＰＭ（東ソー製）
流速 ：３ｍＬ／分
検出 ：２８０ｎｍにおけるＵＶ （ＵＶ８０１０，東ソー製）
平衡化緩衝液 ：０．２ Ｍ ＮａＣｌおよび０．０２ ％ ＮａＮ3を含む１００ｍＭ Ｋ-ＰＯ4バッファー（ｐＨ ７．０）
【００４４】
ｃ．耐熱性ＧＬＤＨの活性
上記抽出・精製工程によって得られたピロコッカス・フリオザスおよびサーモコッカス・リトラリス由来の耐熱性ＧＬＤＨの酵素活性を以下の表３に示す条件で測定した。
【００４５】
【表３】
表３
測定温度；３７℃
測定波長；３４０ｎｍ
反応液ｐＨ；８．０
活性単位は１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤＰ+生成量を１単位と定めた。
【００４６】
その結果、上記の精製工程を通じて、４０Ｌの菌体培養より精製ＧＬＤＨがピロコッカス・フリオザス由来のものが５０００単位、サーモコッカス・リトラリス由来のものが１０，０００単位得られた。得られた２種類の耐熱性ＧＬＤＨの性質を以下の表４に示した。
【００４７】
【表４】
表４
サーモコッカス・リトラリス ピロコッカス・フリオザス
分子量 ３００ｋＤ ３００ｋＤ
サブユニット構造 ６×５０ｋＤ ６×５０ｋＤ
至適ｐＨ ｐＨ７．５ ｐＨ ８．０
作用適温 ９０℃付近 ９０℃付近
３７℃での作用反応性： 可能 可能
【００４８】
実施例２ 耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含む液状試薬を用いた尿素由来のアンモニアの測定
ａ．実施例１で得られた耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを種々の濃度で含む液状試薬を用いて、尿素由来のアンモニアの測定を行った。
【００４９】
アンモニア測定用液状試薬
各種濃度のピロコッカス・フリオザスまたはサーモコッカス・リトラリス由来のＧＬＤＨ
２０ｍＭ ＮａＨＣＯ3 （ｐＨ ９．３）
７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ
０．０２％ ＮａＮ3
アンモニア生成用試薬
１００ｍＭ ＴＥＡ-ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）
０．１％ Ｂｒｉｊｉ−３５
１２５ｍＭ Ｂｏｒａｘ
６０単位／ｍＬ ウレアーゼ
（タチナタマメ（ｊａｃｋ ｂｅａｎ）由来，ＴＯＹＯＢＯ）
【００５０】
先ず、２１４ｍｇ／ｄｌの尿素を含む試料１５μｌに、実施例１で得られた各種濃度のピロコッカス・フリオザスまたはサーモコッカス・リトラリス由来のＧＬＤＨを含む上記アンモニア測定用液状試薬を３２０μｌ反応させることにより、試料中に含まれる可能性のあるアンモニアを予備的に除去した。反応は３７℃で５分間行った。次に、アンモニア生成用試薬を８０μｌ加え、アンモニアの生成反応、並びに生成したアンモニアを用いたＧＬＤＨ酵素反応を行った。反応は、３７℃で５分行った。
【００５１】
尿素に由来するアンモニアに対する応答性は、アンモニア生成用試薬を加える前後の吸光度変化量（△Ａ３４０／分）として求めた。測定は自動分析機 コーバスファラ（ロシュ社製）を用いて行った。
【００５２】
結果を図１に示す。その結果、ピロコッカス・フリオザス由来のＧＬＤＨは約１０単位／ｍｌ以上、サーモコッカス・リトラリス由来のものは約１００単位／ｍｌ以上の濃度でアンモニアを測定可能であることがわかった。
【００５３】
ｂ．また、耐熱性ＧＬＤＨを１０単位／ｍｌを含むアンモニア測定用液状試薬を用いて、各種濃度の尿素（４０ｍｇ／ｄｌ−４５０ｍｇ／ｄｌ）を含む試料を上記ａと同様に測定した。結果を図２に示す。図２より本発明の試薬は尿素に由来するアンモニアを用量依存的に測定可能であることが判明した。
【００５４】
実施例３ 生体物質に由来するアンモニアの測定における内因性アンモニアの影響
試料に４ｍｇ／ｄｌのアンモニアを加えた場合、生体物質に由来するアンモニアの測定に添加したアンモニア（内因性アンモニア）が影響を与えるか、否かについて検討した。
【００５５】
アンモニア測定用液状試薬は、実施例２ｂで用いたピロコッカス・フリオザス由来のＧＬＤＨを１０単位／ｍｌを含むものを使用した。試料は、２５ｍｇ／ｄｌの尿素を含む市販のコントロール血清（日水製薬製）を用いた。測定は、アンモニア測定用試薬を反応させる前に、先ず、４ｍｇ／ｄｌのアンモニアを試料に添加する点を除き、実施例２ｂと同様に行った。
【００５６】
アンモニア生成用試薬を加える前後の吸光度変化を、３０ｍｇ／ｄｌの尿素を含む標準液を用いて得られた吸光度変化量より換算した。その結果、４ｍｇ／ｄｌのアンモニアを加えた場合においても、加えない場合と同様に尿素の含有量２５ｍｇ／ｄｌと計測された。よって、アンモニア測定用液状試薬による前処理により、試料中にあらかじめ存在する内因性のアンモニアは完全に除去され、生体物質に由来するアンモニアの測定に影響を与えないことが示された。
【００５７】
実施例４ 耐熱性ＧＬＤＨを含むアンモニア測定用液状試薬の保存安定性
１０単位／ｍｌの耐熱性ＧＬＤＨを含む、実施例２のアンモニア測定用液状試薬の長期保存中の溶液安定性を、ＧＬＤＨ酵素活性の残存率として調べた。結果を以下の表５に示す。表５中のＧＬＤＨの残存活性率（％）はいずれも試薬調製時の活性を１００としたときの値である。
【００５８】
【表５】
実施例５ 組換え型耐熱性ＧＬＤＨを含む液状アンモニア測定試薬の調製、並びに当該試薬を用いたアンモニアの測定
ａ．組換え型ＧＬＤＨの調製
ピロコッカス・フリオザス由来の耐熱性ＧＬＤＨ遺伝子のクローニングおよび大腸菌での発現ならびに、発現された組換え型ＧＬＤＨの精製方法については、Diruggiero J とRobb FT (1995) Appl. Environ. Microbiol Vol.61 No.1 page 159ー164に記載の方法に従っておこなった。
【００６０】
得られた組換え型酵素標品の性質を、実施例１で調製した天然型ＧＬＤＨと対比させた結果を以下の表６に示す。
【００６１】
【表６】
表６に示されたように、組換え型耐熱性ＧＬＤＨは，その物理化学的および酵素的性状において天然型と同様なものであることが確かめられた。
【００６３】
ｂ．微量アンモニアに対する反応性
先ず、微量アンモニアに対する組換え型ＧＬＤＨの反応性を、天然型ＧＬＤＨと比較しながら検討した。反応液の組成は以下の通りである。
【００６４】
反応液組成 （ｐＨ８．０）
１−１０Ｕ／ｍｌ ＧＬＤＨ
１００μＭ ＮＨ4Ｃｌ
７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ
【００６５】
３７℃５分間、加温反応させアンモニアとオキソグルタル酸をグルタミン酸へ変換する際に生じたＮＡＤＰＨの減少量を吸光度変化量から求め、添加ＧＬＤＨ量に対してプロットした。その結果を図３に示す。図３より、組換え型ＧＬＤＨも天然型ＧＬＤＨも微量アンモニアに対する反応性を示し、組換え型ＧＬＤＨの方がより少量でも反応性を示すことが明らかとなった。
【００６６】
ｃ．尿素由来のアンモニアの測定
ａで得られた組換え型耐熱性ＧＬＤＨを含む液状試薬を用いて、尿素由来のアンモニアを測定した。測定は、実施例２と同様に、自動分析機 コーバスファラ（ロシュ社製）を用いて、３７℃で測定波長３４０ｎｍを用いて行った。
【００６７】
アンモニア測定用液状試薬
ＧＬＤＨ １０Ｕ／ｍｌ
２０ｍＭ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ９．３）
７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
０．３ｍＭ ＮＡＤＰＨ
０．０２％ ＮａＮ3
アンモニア生成用試薬
１００ｍＭ ＴＥＡ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
０．１％ Ｂｒｉｊｉ−３５
５０ｍＭ ＣｙＤＴＡ
１０単位／ｍｌ ウレアーゼ（微生物（クレブシエラ属）由来)
【００６８】
試料、アンモニア測定用液状試薬およびアンモニア生成用試薬を各々１０μｌ：３２０μｌ：８０μｌの割合で用いて、実施例２と同様に試料中のアンモニアの測定を行った。
【００６９】
尿素に由来するアンモニア中の窒素の濃度換算は、３０ｍｇ／ｄＬ標準液の吸光度変化量より読み取り求めた。試料の希釈系列を作成して同様に窒素濃度を求める測定を行った。希釈系列の直線性度合いを、ａで調製した組換え型ＧＬＤＨと実施例１で調製した天然型ＧＬＤＨの双方について調べた。
【００７０】
結果を図４に示す。図４より組換え型および天然型のいずれも希釈系列を直線的に測定することが可能である。また本実施例では、天然型に比べて組換え耐熱性ＧＬＤＨの方が希釈直線性が若干優れていた。
【００７１】
【発明の効果】
上記の通り、本発明の液状試薬は、耐熱性ＧＬＤＨを用いることにより、耐熱性、アルカリ溶液安定性に優れ、溶液中で高い酵素活性を長期間維持する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、２１４ｍｇ／ｄｌの尿素を含む試料を用いた場合の、ＧＬＤＨ量と吸光度変化量との関係を示す。
【図２】 図２は、１０単位／ｍｌのＧＬＤＨを用いた場合の尿素の検量線である。
【図３】 図３は、組換え型および天然型のＧＬＤＨを用いた場合の、１００μｌのＮＨ4Ｃｌに対する反応性を示す。
【図４】 図４は、組換え型および天然型のＧＬＤＨを用いた場合の、尿素由来の窒素を含む試料の希釈系列の窒素濃度測定値を示す。
Claims (4)
- ピロコッカス・フリオザスに由来する、組換え型耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼを含む、アンモニアを生成する試料中の生体物質に由来するアンモニアを測定するための液状試薬であって、
１００μＭまたはそれ以下の濃度のアンモニアを測定可能であり、そして、
組換え型耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼの使用濃度が、１−１０Ｕ／ｍＬの範囲である、
ここにおいて、組換え型耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼは大腸菌を宿主として発現させたものであり、そして、以下の性質を有するものである：
分子量 ３００ｋＤ
サブユニット構造 ６ｘ５０ｋＤ
至適ｐＨ ｐＨ７．５
作用適温 ９０℃付近
３７℃での作用反応性 可能
ｐＨ安定性 ３−１１
熱安定性 ８０℃ｘ２０分間の熱処理でも失活せず
前記アンモニア測定用液状試薬。 - アンモニアを生成する生体物質が試料中の尿素またはクレアチンである、請求項１に記載のアンモニア測定用液状試薬。
- 組換え型耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼの使用濃度が、１−５Ｕ／ｍＬの範囲である、請求項１又は２に記載のアンモニア測定用液状試薬。
- アンモニアを生成する試料中の生体物質に由来するアンモニアの測定方法であって、該試料中の前記生体物質からアンモニアを生じさせ、そして当該アンモニアの量を請求項１ないし３のいずれか１項に記載されたアンモニア測定用液状試薬によって測定する、ことを含む
ここにおいて、
前記アンモニア測定用液状試薬は１００μＭまたはそれ以下の濃度のアンモニアを測定可能であり、そして、
組換え型耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼの使用濃度が、１−１０Ｕ／ｍＬの範囲である、
前記方法。
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