JP5688163B2 - エタノールアミンリン酸の測定方法 - Google Patents
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Description
最初の副工程として、前記第1の工程後の測定サンプルに、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)と酸化型ニコチンアミドデヒドロゲナーゼ(NAD+)を添加し、サンプル中のアセトアルデヒドを酸化して酢酸とする(式(2)参照)。
後述の実施例で明らかにするとおり、本発明者らは古細菌、原核生物並びに植物、動物等の真核生物を含む幅広い生物種で、γ−アミノブチルアミノ基転移酵素のGabTドメインが90%以上の高い相同性を有していることを見出した。このため、前記式(1)の反応を触媒する酵素活性を有し、上記第1の工程に好適に用いることのできる酵素の例として、GabTドメインとの相同性が90%以上のアミノ酸配列領域を有するタンパク質を挙げることができる。
エタノールアミンリン酸リアーゼ活性を持つ菌株として、エルウィニア3株(エルウィニア・カルトボーラ(Erwinia carotovora)、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)LMG 20103株およびエルウィニア・ミレチアエ(Erwinia milletiae))を選定し、独立行政法人農業生物資源研究所より購入した。前記3株を、単一窒素源としてエタノールアミンを含む貧栄養合成培地中で液体培養し、得られたコロニーをLBプレートに塗布して30℃で一晩培養し、それぞれのプレートでコロニーを得た。
得られた菌株をBuffer A(2−メルカプトエタノール(終濃度1mM)を含むトリス塩酸緩衝液(終濃度50mM)、pH7.5)に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行い、遠心分離後に上清を回収し、破砕液(以下、Pan破砕液と略す。)を調製した。
[参考例1]
反応基質としてのエタノールアミンリン酸(終濃度2mM)と補酵素としてのピリドキサールリン酸(終濃度2mM)を含む反応液1mLにPan破砕液を加えて(終容量比5%)30℃にて静置した。1時間後サンプル200μLをフィルトレーション(Microcon(登録商標) Mw:5k)により除タンパクし、反応を停止した後、四重極型質量分析計(Agilent製Quadropole LC/MS 6140)を用いて濾液中のエタノールアミンリン酸の濃度を測定した。同様に実験開始から4時間後、20時間後のサンプルについても同様の測定を行った。結果を図1に黒丸(●)で示す。
Pan破砕液に代えて、Pan破砕液をBuffer Aで10倍に希釈したものを用いたこと以外は参考例1と同様にして測定を行った。結果を図1に黒三角(▲)で示す。
Pan破砕液に代えて、Pan破砕液をBuffer Aで100倍に希釈したものを用いたこと以外は参考例1と同様にして測定を行った。結果を図1に黒ひし形(◆)で示す。
ネガティブコントロールとして、Pan破砕液に代えて、Buffer Aを用いたこと以外は参考例1と同様にして測定を行った。結果を図1に黒四角(■)で示す。
図1に示す結果から、測定サンプル中のエタノールアミンリン酸が、Pan破砕液中の酵素により時間の経過とともに分解され、減少することが明らかである。すなわち、Pan破砕液中にエタノールアミンリン酸分解酵素が含まれることが示された。
上記<1>と同じ培地・条件にてパントエア・アナナティスを液体培地で大量培養した。得られた菌体をBuffer B(塩化マグネシウム(終濃度10mM)を含むトリス塩酸緩衝液(終濃度20mM)、pH7.5)に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行い、遠心分離して上清画分を得た。この画分をまず陰イオンクロマトグラフィー(GEヘルスケア・ジャパン株式会社製DE−52)により、100〜500mM塩化ナトリウムのグラジェント下で溶出分画し、各フラクションについてSDS−PAGEを行った。また、上記各フラクションを、エタノールアミンリン酸(終濃度1mM)とピリドキサールリン酸(終濃度1mM)を含むトリス塩酸緩衝液(終濃度20mM;pH7.5)に終容量比30%となるように加えてそれぞれ30℃で反応させた後、市販のアセトアルデヒド定量キット(Roche社製F−キット アセトアルデヒド)のマニュアルに従って、反応後の各サンプルにアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)と酸化型ニコチンアミドデヒドロゲナーゼ(NAD+)を添加し、式(2)の反応をさせてから340nmの吸光度を測定した。この吸光度から上記式(1)の反応後のサンプル中のアセトアルデヒドを定量し、式(1)の反応前のサンプル中のエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。SDS−PAGEの結果を図2の上側に、エタノールアミンリン酸分解酵素活性の測定結果を図2の下側に、両方の図のフラクションが同じ列となるように示す。最下行の数字が回収フラクション番号である。ftはフロースルー、wは100mM塩化ナトリウムを含むBuffer B(Buffer C−1)による洗浄液、woは500mM塩化ナトリウムを含むBuffer(Buffer C−2)による洗浄液を示す。図2に示されるとおり、番号12から18の回収フラクションで強いエタノールアミンリン酸分解酵素活性が確認された。また、SDS−PAGEの結果から、75kDa、45kDa及び40kDa付近のバンドがエタノールアミンリン酸分解酵素である可能性が高いと考えられた。
また、上記の実験では、エタノールアミンリン酸を含む溶液にパントエア・アナナティスの細胞破砕液を添加することによりアセトアルデヒドが発生したことから、上記エタノールアミンリン酸分解酵素が式(1)の反応を触媒する酵素であることが確認された。
上記<3>で選出した3つのバンドをSDS−PAGEゲルから回収し、アミノ酸シークエンスの解析を業者(北海道システムサイエンス株式会社)に委託した。その結果、それぞれのバンドは以下のタンパク質との高い相同性が認められ、分子量やN末端アミノ酸配列からも以下のタンパク質と一致する可能性が高いことを確認した。
75kDa:フェニルアラニル−tRNA合成酵素、βサブユニット[パントエア・バガンス(Pantoea vagans)C9−1]
45kDa:GabT(パントエア・アナナティスLMG20103)
25kDa:WrbA(パントエア・アナナティスLMG20103)
残るGabTの遺伝子は、比較的少数種の微生物、及び、植物やヒトを含む動物のゲノムに存在することが確認されており、動物では脳での発現が報告されている。GabTの機能としては、γ−アミノブチル酸(GABA)を基質として有機酸との間でピリドキサールリン酸依存的にアミノ基を交換することが知られている。
また、GabTは、GABA以外の比較的幅広い基質に対してもアミノ基転移(脱アミノ基)活性を持つことが報告されており、大腸菌由来GabTではエタノールアミンリン酸と構造が類似する3−アミノプロピル(メチル)ホスフィン酸のアミノ基転移活性が報告されている。式(1)のエタノールアミンリン酸分解反応は脱リン酸基を伴うため、GabTの既知反応様式とは違いがあるものの、上記類似点を考慮するとGabTが式(1)の反応を触媒する酵素である可能性が高いと判断した。
パントエア・アナナティスのゲノムからPCRによる周知のクローニング方法によりgabT遺伝子に一致するバンドを得、これをpUC18にライゲーションして増幅した。業者(北海道システムサイエンス株式会社)によるDNAシークエンス解析を委託し、目的のgabT遺伝子が得られたことを確認した。得られたパントエア・アナナティス由来GabTのアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号1として示す。
[参考例5]
パントエア・アナナティス由来gabT遺伝子(発現産物をP−GabTと略す)を発現ベクターpET23aに組み込み、大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。形質転換した大腸菌をLB培地で培養し、前定常期にIPTGを添加しP−GabTの発現を誘導した。誘導から5時間後に遠心分離して集菌し、得られた菌体を、ピリドキサールリン酸を含む溶菌バッファー(10mMピリドキサールリン酸、100mM塩化カリウム、1mMエチレンジアミン4酢酸、100mM塩化カリウム、1mMジチオトレイトール、50mMトリス塩酸、pH7.5)に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行った。
パントエア・アナナティス由来gabT遺伝子に代えて、大腸菌E.coli由来gabT遺伝子(発現産物をE−GabTと略す)を用いたこと以外は参考例5と同様の方法・手順にて実験を行い、菌体破砕液と上清画分を得、それぞれについてエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。結果を図5中にE−で示す。
ネガティブコントロールとしてpET23aのみで形質転換を行ったこと以外は参考例5と同様の方法・手順にて実験を行い、菌体破砕液と上清画分のそれぞれについてエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。結果を図5中にNCで示す。
[参考例8]
参考例5〜7で使用したパントエア・アナナティス及び大腸菌に加え、古細菌のスルホロバス(スルホロバス・トコダイイ種7;配列番号4)、哺乳類のヒト(ホモ・サピエンス;配列番号5)及びマウス(Mus musculus;配列番号6)並びに植物のシロイヌナズナ(アラビドプシス・タリアナ;配列番号7)由来のGabT(哺乳類ではアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ)のアミノ酸配列を市販のプログラム(CLCバイオ社製CLC Sequence Viewer)を用いてアライメントした。結果を図6に示す。図6中、太線で囲った301番目から317番目のアミノ酸を含む領域を保存性が高い領域として抽出した。なお、図中“consensus”の行に示されたアミノ酸は、60%以上保存された残基である。
前記6種の生物のGabT配列に加えて、サルモネラ菌(サルモネラ・エンテリカ 亜種enterica serovar Typhi CT18株)、クロストリジウム(クロストリジウム・アセトブチリクムATCC 824)、シュードモナス(シュードモナス・プチダKT2440)、ロドコッカス(ロドコッカス・エクイ103S)、アシネトバクター(アシネトバクター・バウマニACICU)、マイコバクター(マイコバクテリウム・アビウム亜種paratuberculosis K−10)、ウシ(ボス・タウラス)、ホヤ(Oikopleura dioica)、トウモロコシ(ゼア・マイス)及びトウガラシ(Capsicum annuum)についても、参考例8で特定したドメイン領域の保存性を検証した。上記301番目から317番目のアミノ酸配列は上記16種の生物種において90%以上の相同性が保たれていたため、この領域をGabTドメインと定義した。
GXXXBADEBQXGFZRXG
(ただし、Xは任意のアミノ酸を意味し、BはI、LおよびVからなる群より選ばれるいずれかの分岐鎖アミノ酸を意味し、ZはGまたはAを意味する。)からなるアミノ酸配列領域である。各生物種のGabTドメイン配列を表1に示す。表1の配列中、GabTドメインと異なる塩基に下線を付して示した。
Claims (14)
- 測定サンプルに、エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を添加し、アセトアルデヒド、リン酸、及びアンモニアを生成させる第1の酵素反応を行う第1の工程と、
生成した前記アセトアルデヒド、前記リン酸、及び前記アンモニアの少なくともいずれかを定量して、前記測定サンプル中のエタノールアミンリン酸量を決定する第2の工程と、を含み、
前記酵素が、(1)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(2)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列のうち、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
(3)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であるエタノールアミンリン酸の測定方法。 - 前記第2の工程が、前記第1の酵素反応後の測定サンプルに、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)を添加し、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を生成させる第2の酵素反応を行う副工程と、
生成した前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を分光化学的に定量して、前記第1の酵素反応後の測定サンプル中の前記アセトアルデヒドを定量する副工程と、を含む請求項1に記載の測定方法。 - 前記第1の工程において、前記測定サンプルに補酵素をさらに添加する請求項1又は2に記載の測定方法。
- 前記補酵素がピリドキサールリン酸である請求項3に記載の測定方法。
- コンピュータに、請求項1〜4のいずれか1項に記載のエタノールアミンリン酸の測定方法を実行させるためのプログラム。
- 前記測定サンプル中のエタノールアミンリン酸の測定値に基づいて、前記測定サンプルを提供した被験者がうつ病患者であるか否かを判定する工程、および、
得られた判定結果を出力する工程をさらに含む請求項5に記載のプログラム。 - 請求項5又は6に記載のプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体。
- 請求項5又は6に記載のプログラムが組み込まれた測定装置。
- エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を含み、
前記酵素が、(1)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(2)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列のうち、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
(3)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であるエタノールアミンリン酸測定用試薬。 - 前記酵素の補酵素をさらに含む請求項9に記載のエタノールアミンリン酸測定用試薬。
- 前記補酵素がピリドキサールリン酸である請求項10に記載のエタノールアミンリン酸測定用試薬。
- 請求項9〜11のいずれか1項に記載のエタノールアミンリン酸測定用試薬を含有するうつ病診断薬。
- エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を個別に収納した容器を含み、
前記酵素が、(1)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(2)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列のうち、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
(3)配列番号1若しくは2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であるエタノールアミンリン酸測定用キット。 - 前記酵素の補酵素を個別に収容した容器をさらに含む請求項13に記載のエタノールアミンリン酸測定用キット。
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