JP5688163B2 - エタノールアミンリン酸の測定方法 - Google Patents
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
本発明は、サンプル中に存在するエタノールアミンリン酸の測定方法に関する。
うつ病は気分障害の一種であり、「抑うつ気分」と「興味・喜びの喪失」を主な症状とする。日本の医療機関に対する調査によると、２００８年のうつ病の患者数は７０万人以上とされている。しかし、うつ病の診断は、患者の精神面についての医師や心理士の主観、または患者自身の主観や申告に依存する面が大きく、客観的な判断がなされているとは言い難い。そこで、うつ病を客観的に診断するために、近年、患者の体液中の成分をうつ病の診断の目安として用いる試みがなされている。
従来、うつ病の予測マーカーとして、体液中のトリプトファンまたはその分解物、特定の遺伝子の発現量などを用いることが報告されていたが（特許文献１、２）、本発明者らは血液中のエタノールアミンリン酸がうつ病を診断するためのバイオマーカーとして有用であることを見出した（特許文献３）。
エタノールアミンリン酸はうつ病のバイオマーカーとして信頼性が高く優れているが、その測定は、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ（キャピラリー電気泳動時間飛行型質量分析）装置を用いる測定方法に限られていた。しかし、ＣＥ−ＴＯＦＭＳでの測定は長時間（３０〜４０分）かかり、また装置が高価で精密な分析機器のため限られた大学や分析機関などが所有するにとどまっており、地方の病院や診療所などでも、エタノールアミンリン酸をうつ病のバイオマーカーとして利用するためのより短時間かつ簡便な測定方法が求められている。
従って、本発明の目的は、サンプル中のエタノールアミンリン酸を簡便に測定するための方法、及びその方法に用いる試薬、キット、プログラム等を提供することにある。
前記目的は、以下の本発明によって達成される。すなわち、本発明は、測定サンプルに、エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を添加し、アセトアルデヒド、リン酸、及びアンモニアを生成させる第１の酵素反応を行う第１の工程と、生成した前記アセトアルデヒド、前記リン酸、及び前記アンモニアの少なくともいずれかを定量して、前記測定サンプル中のエタノールアミンリン酸量を決定する第２の工程と、を含むエタノールアミンリン酸の測定方法を提供する。
前記酵素は、ＧａｂＴドメインを有する酵素であることが好ましい。
本発明によれば、サンプル中のエタノールアミンリン酸を簡便に測定するための方法、及びその方法に用いる試薬、うつ病を簡便に診断できる診断薬が提供される。
本発明のエタノールアミンリン酸の測定方法では、第１の工程においてエタノールアミンリン酸（ＣＡＳ登録番号：１０７１−２３−４）を加水分解してアセトアルデヒド、リン酸およびアンモニアを生成させる下記式（１）で示される反応（以下、「第１の酵素反応」と呼ぶことがある）を触媒する酵素（以下、「第１酵素」と呼ぶことがある）を使用する。
本発明の測定方法では、第２工程において、前記酵素反応により生成したアセトアルデヒド、リン酸及びアンモニアの少なくともいずれかを定量することにより、前記サンプル中のエタノールアミンリン酸量を決定する。定量の対象は１種類でもよいが、２種以上を定量することにより、測定誤差を低減することができる。
前記第２工程でアセトアルデヒドを定量する場合、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が波長３４０ｎｍの紫外線をよく吸収する性質を利用することにより、感度よく定量することができる。具体的には、下記の２つの副工程からなる方法が挙げられる。
最初の副工程として、前記第１の工程後の測定サンプルに、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）と酸化型ニコチンアミドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ+）を添加し、サンプル中のアセトアルデヒドを酸化して酢酸とする（式（２）参照）。
最初の副工程として、前記第１の工程後の測定サンプルに、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）と酸化型ニコチンアミドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ+）を添加し、サンプル中のアセトアルデヒドを酸化して酢酸とする（式（２）参照）。
この反応でＮＡＤ+は還元されてＮＡＤＨとなるが、ＮＡＤＨのみが３４０ｎｍの紫外線を強く吸収するため、次の副工程として前記反応後の測定サンプルの３４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、前記第１工程後の測定サンプルのアセトアルデヒド生成量を定量でき、この値から測定サンプル中のエタノールアミンリン酸量を決定することができる。第２工程でアセトアルデヒドを定量する場合、市販のアセトアルデヒド定量キット（例えば、Ｒｏｃｈｅ社製Ｆ−キット アセトアルデヒド）を利用することができる。
前記第１の工程においては、酵素反応の効率をいっそう高めるために補酵素を併用することが好ましく、好ましい補酵素としてピリドキサールリン酸が挙げられる。
上記第１の工程に用いる酵素は、エタノールアミンリン酸を加水分解して、１段階の反応でアセトアルデヒド、リン酸およびアンモニアを生成する前記式（１）の反応を触媒しうる酵素であれば、特に制限はないが、当該酵素活性を持つ酵素の例としてＧａｂＴドメインを有する酵素を挙げることができる。ＧａｂＴドメインとはＧＸＸＸＢＡＤＥＢＱＸＧＦＺＲＸＧ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を意味し、ＢはＩ、ＬおよびＶからなる群より選ばれるいずれかの分岐鎖アミノ酸を意味し、ＺはＧまたはＡを意味する。）で定義されるアミノ酸配列領域である。
後述の実施例で明らかにするとおり、本発明者らは古細菌、原核生物並びに植物、動物等の真核生物を含む幅広い生物種で、γ−アミノブチルアミノ基転移酵素のＧａｂＴドメインが９０％以上の高い相同性を有していることを見出した。このため、前記式（１）の反応を触媒する酵素活性を有し、上記第１の工程に好適に用いることのできる酵素の例として、ＧａｂＴドメインとの相同性が９０％以上のアミノ酸配列領域を有するタンパク質を挙げることができる。
後述の実施例で明らかにするとおり、本発明者らは古細菌、原核生物並びに植物、動物等の真核生物を含む幅広い生物種で、γ−アミノブチルアミノ基転移酵素のＧａｂＴドメインが９０％以上の高い相同性を有していることを見出した。このため、前記式（１）の反応を触媒する酵素活性を有し、上記第１の工程に好適に用いることのできる酵素の例として、ＧａｂＴドメインとの相同性が９０％以上のアミノ酸配列領域を有するタンパク質を挙げることができる。
また、前記式（１）の反応を触媒する酵素活性を有し、ＧａｂＴドメインを有する酵素の具体例として、本発明者らが同定したパントエア・アナナティス由来のＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列表の配列番号１）や大腸菌由来のＧａｂＴドメインを有するタンパク質（配列番号２）が挙げられる。本発明に係る測定方法の第１の工程に用いる場合、前記式（１）の反応を触媒する活性を有していれば、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうち、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。上記酵素は精製されたものでなくてもよく、上記酵素活性を有していれば、粗精製物や上記酵素を含む細胞破砕液であっても利用できる。細胞破砕液の例としては、パントエア・アナナティスの細胞破砕液を遠心分離して得られる上清が挙げられる。
本発明のエタノールアミンリン酸の測定方法は、手順が非常にシンプルであり、既存の生化学検査装置に組み込むことが可能である。具体的には、測定サンプルを測定装置にセットし、測定サンプルに第１酵素を添加し、アセトアルデヒド、リン酸及びアンモニアを生成させた後、前記アセトアルデヒド、リン酸及びアンモニアの少なくともいずれかを定量する。この方法は人の主観に依存する面がないので、測定装置によるルーチン処理に適し、迅速かつ簡便に、大量のサンプルを測定することができる。このような処理は、測定サンプルに酵素を添加する前記第１の工程とアセトアルデヒド、リン酸及びアンモニアの少なくともいずれかを定量する前記第２の工程を測定装置に実行させるプログラムを、測定装置に内蔵されたコンピュータに読み込ませることにより行うこともできる。
前記の通り、血漿中のエタノールアミンリン酸の濃度とうつ病との間には有意な相関がある（特許文献３参照）。このため、前記プログラムに、測定サンプル中のエタノールアミンリン酸の測定値に基づいて、測定サンプルを提供した被験者がうつ病患者であるか否かを判定する工程と、得られた判定結果を出力する工程をさらに追加することにより、サンプルを提供した被験者がうつ病であるか否かを判定することが可能となる。
上記プログラムはコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録させてもよく、測定装置に付属するコンピュータの記録媒体に記録してもよい。記録媒体は，ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ＵＳＢメモリ、フロッピー（登録商標）ディスクなど、特に限定されない。
また、本発明によれば、エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を含むエタノールアミンリン酸測定用試薬が提供される。エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素は上記エタノールアミンリン酸の測定方法の第１の工程で用いられる酵素と同様のものを用いることができ、具体的には、配列表の配列番号１及び配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。
前記エタノールアミンリン酸測定用試薬は、前記酵素の反応効率をいっそう向上させるため、当該酵素の補酵素をさらに含むことが好ましく、補酵素の具体例としてピリドキサールリン酸を挙げることができる。前記酵素は、エタノールアミンリン酸を加水分解して、１段階の反応でアセトアルデヒド、リン酸およびアンモニアを生成する前記式（１）の反応を触媒しうる酵素であれば、特に制限はなく、当該酵素活性を持つ酵素の例としてＧａｂＴドメインを有する酵素を挙げることができる。また、上記ＧａｂＴドメインとの相同性が９０％以上のアミノ酸配列領域を有するタンパク質であってもよい。
また、上記した通り、血漿中のエタノールアミンリン酸の濃度とうつ病との間には有意な相関があることから、前記エタノールアミンリン酸測定用試薬はうつ病診断薬として用いることができる。
また、本発明によれば、エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を個別に収納した容器を含むエタノールアミンリン酸測定用キットが提供される。上記の通り、血漿中のエタノールアミンリン酸濃度からうつ病の罹患を判定できるため、本発明のエタノールアミンリン酸測定用キットを用いることにより、健康診断や社内検診において受診者の中からうつ病患者のスクリーニングを行う、または専門医以外の医師がうつ病の疑いがある患者の診断を行う、または専門医が問診と併せて診断を行う、治療効果を判定する、治療方針を決定することが可能になる。
前記エタノールアミンリン酸測定用キットは、前記酵素の補酵素を個別に収容した容器をさらに含むことが好ましく、補酵素の例としてピリドキサールリン酸を挙げることができる。また、前記酵素は、エタノールアミンリン酸を加水分解して、１段階の反応でアセトアルデヒド、リン酸およびアンモニアを生成する前記式（１）の反応を触媒しうる酵素であれば、特に制限はなく、当該酵素活性を持つ酵素の例としてＧａｂＴドメインを有する酵素を挙げることができる。また、上記ＧａｂＴドメインとの相同性が９０％以上のアミノ酸配列領域を有するタンパク質であってもよい。
＜１． エタノールアミンリン酸分解酵素を含む細胞破砕液の調製＞
エタノールアミンリン酸リアーゼ活性を持つ菌株として、エルウィニア３株（エルウィニア・カルトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）ＬＭＧ ２０１０３株およびエルウィニア・ミレチアエ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｍｉｌｌｅｔｉａｅ））を選定し、独立行政法人農業生物資源研究所より購入した。前記３株を、単一窒素源としてエタノールアミンを含む貧栄養合成培地中で液体培養し、得られたコロニーをＬＢプレートに塗布して３０℃で一晩培養し、それぞれのプレートでコロニーを得た。
エタノールアミンリン酸リアーゼ活性を持つ菌株として、エルウィニア３株（エルウィニア・カルトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）ＬＭＧ ２０１０３株およびエルウィニア・ミレチアエ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｍｉｌｌｅｔｉａｅ））を選定し、独立行政法人農業生物資源研究所より購入した。前記３株を、単一窒素源としてエタノールアミンを含む貧栄養合成培地中で液体培養し、得られたコロニーをＬＢプレートに塗布して３０℃で一晩培養し、それぞれのプレートでコロニーを得た。
各プレートについて２〜３個のコロニーを採取し、それを２〜５ｍＬの液体培地に懸濁し、３０℃、１７０ｒｐｍで培養した。上記３株のうちパントエア・アナナティスのみで顕著な増殖が見られたので、この菌株をＯＤ600＝１．０となるまで培養し、培養後遠心分離をして集菌した。
得られた菌株をＢｕｆｆｅｒ Ａ（２−メルカプトエタノール（終濃度１ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（終濃度５０ｍＭ）、ｐＨ７．５）に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行い、遠心分離後に上清を回収し、破砕液（以下、Ｐａｎ破砕液と略す。）を調製した。
得られた菌株をＢｕｆｆｅｒ Ａ（２−メルカプトエタノール（終濃度１ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（終濃度５０ｍＭ）、ｐＨ７．５）に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行い、遠心分離後に上清を回収し、破砕液（以下、Ｐａｎ破砕液と略す。）を調製した。
＜２． Ｐａｎ破砕液のエタノールアミンリン酸分解酵素活性の測定＞
［参考例１］
反応基質としてのエタノールアミンリン酸（終濃度２ｍＭ）と補酵素としてのピリドキサールリン酸（終濃度２ｍＭ）を含む反応液１ｍＬにＰａｎ破砕液を加えて（終容量比５％）３０℃にて静置した。１時間後サンプル２００μＬをフィルトレーション（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） Ｍｗ：５ｋ）により除タンパクし、反応を停止した後、四重極型質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳ ６１４０）を用いて濾液中のエタノールアミンリン酸の濃度を測定した。同様に実験開始から４時間後、２０時間後のサンプルについても同様の測定を行った。結果を図１に黒丸（●）で示す。
［参考例１］
反応基質としてのエタノールアミンリン酸（終濃度２ｍＭ）と補酵素としてのピリドキサールリン酸（終濃度２ｍＭ）を含む反応液１ｍＬにＰａｎ破砕液を加えて（終容量比５％）３０℃にて静置した。１時間後サンプル２００μＬをフィルトレーション（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標） Ｍｗ：５ｋ）により除タンパクし、反応を停止した後、四重極型質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ製Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳ ６１４０）を用いて濾液中のエタノールアミンリン酸の濃度を測定した。同様に実験開始から４時間後、２０時間後のサンプルについても同様の測定を行った。結果を図１に黒丸（●）で示す。
［参考例２］
Ｐａｎ破砕液に代えて、Ｐａｎ破砕液をＢｕｆｆｅｒ Ａで１０倍に希釈したものを用いたこと以外は参考例１と同様にして測定を行った。結果を図１に黒三角（▲）で示す。
Ｐａｎ破砕液に代えて、Ｐａｎ破砕液をＢｕｆｆｅｒ Ａで１０倍に希釈したものを用いたこと以外は参考例１と同様にして測定を行った。結果を図１に黒三角（▲）で示す。
［参考例３］
Ｐａｎ破砕液に代えて、Ｐａｎ破砕液をＢｕｆｆｅｒ Ａで１００倍に希釈したものを用いたこと以外は参考例１と同様にして測定を行った。結果を図１に黒ひし形（◆）で示す。
Ｐａｎ破砕液に代えて、Ｐａｎ破砕液をＢｕｆｆｅｒ Ａで１００倍に希釈したものを用いたこと以外は参考例１と同様にして測定を行った。結果を図１に黒ひし形（◆）で示す。
［参考例４］
ネガティブコントロールとして、Ｐａｎ破砕液に代えて、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを用いたこと以外は参考例１と同様にして測定を行った。結果を図１に黒四角（■）で示す。
図１に示す結果から、測定サンプル中のエタノールアミンリン酸が、Ｐａｎ破砕液中の酵素により時間の経過とともに分解され、減少することが明らかである。すなわち、Ｐａｎ破砕液中にエタノールアミンリン酸分解酵素が含まれることが示された。
ネガティブコントロールとして、Ｐａｎ破砕液に代えて、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを用いたこと以外は参考例１と同様にして測定を行った。結果を図１に黒四角（■）で示す。
図１に示す結果から、測定サンプル中のエタノールアミンリン酸が、Ｐａｎ破砕液中の酵素により時間の経過とともに分解され、減少することが明らかである。すなわち、Ｐａｎ破砕液中にエタノールアミンリン酸分解酵素が含まれることが示された。
＜３． パントエア・アナナティス由来エタノールアミンリン酸リアーゼの単離＞
上記＜１＞と同じ培地・条件にてパントエア・アナナティスを液体培地で大量培養した。得られた菌体をＢｕｆｆｅｒ Ｂ（塩化マグネシウム（終濃度１０ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（終濃度２０ｍＭ）、ｐＨ７．５）に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行い、遠心分離して上清画分を得た。この画分をまず陰イオンクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製ＤＥ−５２）により、１００〜５００ｍＭ塩化ナトリウムのグラジェント下で溶出分画し、各フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。また、上記各フラクションを、エタノールアミンリン酸（終濃度１ｍＭ）とピリドキサールリン酸（終濃度１ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（終濃度２０ｍＭ；ｐＨ７．５）に終容量比３０％となるように加えてそれぞれ３０℃で反応させた後、市販のアセトアルデヒド定量キット（Ｒｏｃｈｅ社製Ｆ−キット アセトアルデヒド）のマニュアルに従って、反応後の各サンプルにアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）と酸化型ニコチンアミドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ+）を添加し、式（２）の反応をさせてから３４０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度から上記式（１）の反応後のサンプル中のアセトアルデヒドを定量し、式（１）の反応前のサンプル中のエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２の上側に、エタノールアミンリン酸分解酵素活性の測定結果を図２の下側に、両方の図のフラクションが同じ列となるように示す。最下行の数字が回収フラクション番号である。ｆｔはフロースルー、ｗは１００ｍＭ塩化ナトリウムを含むＢｕｆｆｅｒ Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｃ−１）による洗浄液、ｗｏは５００ｍＭ塩化ナトリウムを含むＢｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｃ−２）による洗浄液を示す。図２に示されるとおり、番号１２から１８の回収フラクションで強いエタノールアミンリン酸分解酵素活性が確認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、７５ｋＤａ、４５ｋＤａ及び４０ｋＤａ付近のバンドがエタノールアミンリン酸分解酵素である可能性が高いと考えられた。
上記＜１＞と同じ培地・条件にてパントエア・アナナティスを液体培地で大量培養した。得られた菌体をＢｕｆｆｅｒ Ｂ（塩化マグネシウム（終濃度１０ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（終濃度２０ｍＭ）、ｐＨ７．５）に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行い、遠心分離して上清画分を得た。この画分をまず陰イオンクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製ＤＥ−５２）により、１００〜５００ｍＭ塩化ナトリウムのグラジェント下で溶出分画し、各フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。また、上記各フラクションを、エタノールアミンリン酸（終濃度１ｍＭ）とピリドキサールリン酸（終濃度１ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（終濃度２０ｍＭ；ｐＨ７．５）に終容量比３０％となるように加えてそれぞれ３０℃で反応させた後、市販のアセトアルデヒド定量キット（Ｒｏｃｈｅ社製Ｆ−キット アセトアルデヒド）のマニュアルに従って、反応後の各サンプルにアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）と酸化型ニコチンアミドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ+）を添加し、式（２）の反応をさせてから３４０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度から上記式（１）の反応後のサンプル中のアセトアルデヒドを定量し、式（１）の反応前のサンプル中のエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２の上側に、エタノールアミンリン酸分解酵素活性の測定結果を図２の下側に、両方の図のフラクションが同じ列となるように示す。最下行の数字が回収フラクション番号である。ｆｔはフロースルー、ｗは１００ｍＭ塩化ナトリウムを含むＢｕｆｆｅｒ Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｃ−１）による洗浄液、ｗｏは５００ｍＭ塩化ナトリウムを含むＢｕｆｆｅｒ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｃ−２）による洗浄液を示す。図２に示されるとおり、番号１２から１８の回収フラクションで強いエタノールアミンリン酸分解酵素活性が確認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、７５ｋＤａ、４５ｋＤａ及び４０ｋＤａ付近のバンドがエタノールアミンリン酸分解酵素である可能性が高いと考えられた。
次に、上記番号１２から１８のフラクションを回収し、それを疎水クロマトグラフィー（東ソー株式会社製Ｅｔｈｅｒ−６５０）により、１〜０Ｍ硫酸アンモニウム下での溶出分画に供した。溶離液としては、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂと１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＢｕｆｆｅｒ Ｂ（Ｂｕｆｆｅｒ Ｄ−１）を使用した。上記陰イオンクロマトグラフィーと同様に各フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥとアセトアルデヒド定量キットを用いた吸光度測定を行った。結果を図３に示す。図３に示されるとおり、番号７から１０の回収フラクションで強いエタノールアミンリン酸分解酵素活性が確認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、７５ｋＤａ、４５ｋＤａ及び２５ｋＤａ付近のバンドがエタノールアミンリン酸分解酵素である可能性が高いと考えられた。
上記疎水クロマトグラフィーの番号７から１０のフラクションを回収し、それをハイドロキシアパタイトカラム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製ＨＴ−Ｇｅｌ）を用いた分画に供した。溶離液としては、１０ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ９．０）（Ｂｕｆｆｅｒ Ｅ−１）と３００ｍＭリン酸カリウム溶液（ｐＨ９．０）（Ｂｕｆｆｅｒ Ｅ−２）を使用した。上記陰イオンクロマトグラフィーと同様に各フラクションについてＳＤＳ−ＰＡＧＥとアセトアルデヒド定量キットを用いた吸光度測定を行った。結果を図４に示す。図４から明らかなとおり、番号ｗおよび１の回収フラクションで強いエタノールアミンリン酸分解酵素活性が確認された。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、４５ｋＤａ及び２５ｋＤａ付近のバンドがエタノールアミンリン酸分解酵素である可能性が高いと考えられた。
上記３種のクロマトグラフィーによる分画の結果から、エタノールアミンリン酸分解酵素の候補として、７５ｋＤａ、４５ｋＤａおよび２５ｋＤａの３つのバンドを選出した。
また、上記の実験では、エタノールアミンリン酸を含む溶液にパントエア・アナナティスの細胞破砕液を添加することによりアセトアルデヒドが発生したことから、上記エタノールアミンリン酸分解酵素が式（１）の反応を触媒する酵素であることが確認された。
また、上記の実験では、エタノールアミンリン酸を含む溶液にパントエア・アナナティスの細胞破砕液を添加することによりアセトアルデヒドが発生したことから、上記エタノールアミンリン酸分解酵素が式（１）の反応を触媒する酵素であることが確認された。
＜４． パントエア・アナナティス由来エタノールアミンリン酸リアーゼの同定＞
上記＜３＞で選出した３つのバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから回収し、アミノ酸シークエンスの解析を業者（北海道システムサイエンス株式会社）に委託した。その結果、それぞれのバンドは以下のタンパク質との高い相同性が認められ、分子量やＮ末端アミノ酸配列からも以下のタンパク質と一致する可能性が高いことを確認した。
７５ｋＤａ：フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素、βサブユニット［パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）Ｃ９−１］
４５ｋＤａ：ＧａｂＴ（パントエア・アナナティスＬＭＧ２０１０３）
２５ｋＤａ：ＷｒｂＡ（パントエア・アナナティスＬＭＧ２０１０３）
上記＜３＞で選出した３つのバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから回収し、アミノ酸シークエンスの解析を業者（北海道システムサイエンス株式会社）に委託した。その結果、それぞれのバンドは以下のタンパク質との高い相同性が認められ、分子量やＮ末端アミノ酸配列からも以下のタンパク質と一致する可能性が高いことを確認した。
７５ｋＤａ：フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素、βサブユニット［パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）Ｃ９−１］
４５ｋＤａ：ＧａｂＴ（パントエア・アナナティスＬＭＧ２０１０３）
２５ｋＤａ：ＷｒｂＡ（パントエア・アナナティスＬＭＧ２０１０３）
上記タンパク質のうち、フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素とＷｒｂＡは、脱アミノ基、脱リン酸基とは異なる反応を触媒することが報告されているため、エタノールアミンリン酸分解酵素の候補から除外した。
残るＧａｂＴの遺伝子は、比較的少数種の微生物、及び、植物やヒトを含む動物のゲノムに存在することが確認されており、動物では脳での発現が報告されている。ＧａｂＴの機能としては、γ−アミノブチル酸（ＧＡＢＡ）を基質として有機酸との間でピリドキサールリン酸依存的にアミノ基を交換することが知られている。
また、ＧａｂＴは、ＧＡＢＡ以外の比較的幅広い基質に対してもアミノ基転移（脱アミノ基）活性を持つことが報告されており、大腸菌由来ＧａｂＴではエタノールアミンリン酸と構造が類似する３−アミノプロピル（メチル）ホスフィン酸のアミノ基転移活性が報告されている。式（１）のエタノールアミンリン酸分解反応は脱リン酸基を伴うため、ＧａｂＴの既知反応様式とは違いがあるものの、上記類似点を考慮するとＧａｂＴが式（１）の反応を触媒する酵素である可能性が高いと判断した。
残るＧａｂＴの遺伝子は、比較的少数種の微生物、及び、植物やヒトを含む動物のゲノムに存在することが確認されており、動物では脳での発現が報告されている。ＧａｂＴの機能としては、γ−アミノブチル酸（ＧＡＢＡ）を基質として有機酸との間でピリドキサールリン酸依存的にアミノ基を交換することが知られている。
また、ＧａｂＴは、ＧＡＢＡ以外の比較的幅広い基質に対してもアミノ基転移（脱アミノ基）活性を持つことが報告されており、大腸菌由来ＧａｂＴではエタノールアミンリン酸と構造が類似する３−アミノプロピル（メチル）ホスフィン酸のアミノ基転移活性が報告されている。式（１）のエタノールアミンリン酸分解反応は脱リン酸基を伴うため、ＧａｂＴの既知反応様式とは違いがあるものの、上記類似点を考慮するとＧａｂＴが式（１）の反応を触媒する酵素である可能性が高いと判断した。
＜５． パントエア・アナナティスｇａｂＴ遺伝子及び大腸菌ｇａｂＴ遺伝子のクローニング＞
パントエア・アナナティスのゲノムからＰＣＲによる周知のクローニング方法によりｇａｂＴ遺伝子に一致するバンドを得、これをｐＵＣ１８にライゲーションして増幅した。業者（北海道システムサイエンス株式会社）によるＤＮＡシークエンス解析を委託し、目的のｇａｂＴ遺伝子が得られたことを確認した。得られたパントエア・アナナティス由来ＧａｂＴのアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号１として示す。
パントエア・アナナティスのゲノムからＰＣＲによる周知のクローニング方法によりｇａｂＴ遺伝子に一致するバンドを得、これをｐＵＣ１８にライゲーションして増幅した。業者（北海道システムサイエンス株式会社）によるＤＮＡシークエンス解析を委託し、目的のｇａｂＴ遺伝子が得られたことを確認した。得られたパントエア・アナナティス由来ＧａｂＴのアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号１として示す。
同様に、ゲノム中にｇａｂＴ遺伝子の存在が確認されている大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ｗｔ）からゲノムを抽出し、周知のクローニング方法によりｇａｂＴ遺伝子に一致するバンドを得、これをｐＵＣ１８にライゲーションして増幅した。ＤＮＡシークエンス解析の結果、目的のｇａｂＴ遺伝子が得られたことを確認した。得られたＥ．ｃｏｌｉ由来ＧａｂＴのアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号２として、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｇａｂＴ遺伝子の塩基配列を配列番号３として示す。
＜６． ＧａｂＴ発現系の構築と酵素活性の確認＞
［参考例５］
パントエア・アナナティス由来ｇａｂＴ遺伝子（発現産物をＰ−ＧａｂＴと略す）を発現ベクターｐＥＴ２３ａに組み込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。形質転換した大腸菌をＬＢ培地で培養し、前定常期にＩＰＴＧを添加しＰ−ＧａｂＴの発現を誘導した。誘導から５時間後に遠心分離して集菌し、得られた菌体を、ピリドキサールリン酸を含む溶菌バッファー（１０ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸、１００ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５）に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行った。
［参考例５］
パントエア・アナナティス由来ｇａｂＴ遺伝子（発現産物をＰ−ＧａｂＴと略す）を発現ベクターｐＥＴ２３ａに組み込み、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。形質転換した大腸菌をＬＢ培地で培養し、前定常期にＩＰＴＧを添加しＰ−ＧａｂＴの発現を誘導した。誘導から５時間後に遠心分離して集菌し、得られた菌体を、ピリドキサールリン酸を含む溶菌バッファー（１０ｍＭピリドキサールリン酸、１００ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸、１００ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５）に懸濁し、ソニケーションによる菌体破砕を行った。
この菌体破砕液を遠心分離して上清画分を回収し、遠心分離前の菌体破砕液（ｔｏｔａｌと略す）と上清画分（ｓｕｐと略す）のそれぞれを、エタノールアミンリン酸（終濃度１ｍＭ）とピリドキサールリン酸（終濃度１ｍＭ）を含むトリス塩酸緩衝液（終濃度２０ｍＭ；ｐＨ７．５）に終容量比３０％となるように加えてそれぞれ３０℃で反応させた後、市販のアセトアルデヒド定量キット（Ｒｏｃｈｅ社製Ｆ−キット アセトアルデヒド）のマニュアルに従って、反応後の各サンプルにアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）と酸化型ニコチンアミドデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ+）を添加し、式（２）の反応をさせてから３４０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度から上記式（１）の反応後のサンプル中のアセトアルデヒドを定量し、式（１）の反応前のサンプル中のエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。結果を図５中にＰ−で示す。図中、縦軸は３４０ｎｍの吸光度、エラーバーは３回の繰り返し測定から得られた標準偏差を示す。
［参考例６］
パントエア・アナナティス由来ｇａｂＴ遺伝子に代えて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｇａｂＴ遺伝子（発現産物をＥ−ＧａｂＴと略す）を用いたこと以外は参考例５と同様の方法・手順にて実験を行い、菌体破砕液と上清画分を得、それぞれについてエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。結果を図５中にＥ−で示す。
パントエア・アナナティス由来ｇａｂＴ遺伝子に代えて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｇａｂＴ遺伝子（発現産物をＥ−ＧａｂＴと略す）を用いたこと以外は参考例５と同様の方法・手順にて実験を行い、菌体破砕液と上清画分を得、それぞれについてエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。結果を図５中にＥ−で示す。
［参考例７］
ネガティブコントロールとしてｐＥＴ２３ａのみで形質転換を行ったこと以外は参考例５と同様の方法・手順にて実験を行い、菌体破砕液と上清画分のそれぞれについてエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。結果を図５中にＮＣで示す。
ネガティブコントロールとしてｐＥＴ２３ａのみで形質転換を行ったこと以外は参考例５と同様の方法・手順にて実験を行い、菌体破砕液と上清画分のそれぞれについてエタノールアミンリン酸分解酵素活性を測定した。結果を図５中にＮＣで示す。
参考例５〜７の結果から、図５左側の菌体破砕液では、Ｐ−ＧａｂＴとＥ−ＧａｂＴの両方とも、ネガティブコントロールと比較して高いエタノールアミンリン酸分解酵素活性を確認できた。一方、図５右側の上清画分では、Ｐ−ＧａｂＴとＥ−ＧａｂＴの両方とも、酵素活性はネガティブコントロールと同程度であった。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも、菌体破砕液ではＰ−ＧａｂＴ、Ｅ−ＧａｂＴともに４５ｋＤａに濃いバンドが確認されたが、上清画分ではコントロールと同程度であった（不図示）。以上の結果から、Ｐ−ＧａｂＴとＥ−ＧａｂＴはともに、封入体として沈殿画分に存在すると考えられる。
＜７． ＧａｂＴドメイン配列の決定＞
［参考例８］
参考例５〜７で使用したパントエア・アナナティス及び大腸菌に加え、古細菌のスルホロバス（スルホロバス・トコダイイ種７；配列番号４）、哺乳類のヒト（ホモ・サピエンス；配列番号５）及びマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；配列番号６）並びに植物のシロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアナ；配列番号７）由来のＧａｂＴ（哺乳類ではアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ）のアミノ酸配列を市販のプログラム（ＣＬＣバイオ社製ＣＬＣ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｉｅｗｅｒ）を用いてアライメントした。結果を図６に示す。図６中、太線で囲った３０１番目から３１７番目のアミノ酸を含む領域を保存性が高い領域として抽出した。なお、図中“ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ”の行に示されたアミノ酸は、６０％以上保存された残基である。
［参考例８］
参考例５〜７で使用したパントエア・アナナティス及び大腸菌に加え、古細菌のスルホロバス（スルホロバス・トコダイイ種７；配列番号４）、哺乳類のヒト（ホモ・サピエンス；配列番号５）及びマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ；配列番号６）並びに植物のシロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアナ；配列番号７）由来のＧａｂＴ（哺乳類ではアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ）のアミノ酸配列を市販のプログラム（ＣＬＣバイオ社製ＣＬＣ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖｉｅｗｅｒ）を用いてアライメントした。結果を図６に示す。図６中、太線で囲った３０１番目から３１７番目のアミノ酸を含む領域を保存性が高い領域として抽出した。なお、図中“ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ”の行に示されたアミノ酸は、６０％以上保存された残基である。
［参考例９］
前記６種の生物のＧａｂＴ配列に加えて、サルモネラ菌（サルモネラ・エンテリカ 亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ＣＴ１８株）、クロストリジウム（クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ ８２４）、シュードモナス（シュードモナス・プチダＫＴ２４４０）、ロドコッカス（ロドコッカス・エクイ１０３Ｓ）、アシネトバクター（アシネトバクター・バウマニＡＣＩＣＵ）、マイコバクター（マイコバクテリウム・アビウム亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｋ−１０）、ウシ（ボス・タウラス）、ホヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ ｄｉｏｉｃａ）、トウモロコシ（ゼア・マイス）及びトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）についても、参考例８で特定したドメイン領域の保存性を検証した。上記３０１番目から３１７番目のアミノ酸配列は上記１６種の生物種において９０％以上の相同性が保たれていたため、この領域をＧａｂＴドメインと定義した。
前記６種の生物のＧａｂＴ配列に加えて、サルモネラ菌（サルモネラ・エンテリカ 亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ ＣＴ１８株）、クロストリジウム（クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ ８２４）、シュードモナス（シュードモナス・プチダＫＴ２４４０）、ロドコッカス（ロドコッカス・エクイ１０３Ｓ）、アシネトバクター（アシネトバクター・バウマニＡＣＩＣＵ）、マイコバクター（マイコバクテリウム・アビウム亜種ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｋ−１０）、ウシ（ボス・タウラス）、ホヤ（Ｏｉｋｏｐｌｅｕｒａ ｄｉｏｉｃａ）、トウモロコシ（ゼア・マイス）及びトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）についても、参考例８で特定したドメイン領域の保存性を検証した。上記３０１番目から３１７番目のアミノ酸配列は上記１６種の生物種において９０％以上の相同性が保たれていたため、この領域をＧａｂＴドメインと定義した。
ＧａｂＴドメインは、以下のアミノ酸配列：
ＧＸＸＸＢＡＤＥＢＱＸＧＦＺＲＸＧ
（ただし、Ｘは任意のアミノ酸を意味し、ＢはＩ、ＬおよびＶからなる群より選ばれるいずれかの分岐鎖アミノ酸を意味し、ＺはＧまたはＡを意味する。）からなるアミノ酸配列領域である。各生物種のＧａｂＴドメイン配列を表１に示す。表１の配列中、ＧａｂＴドメインと異なる塩基に下線を付して示した。
ＧＸＸＸＢＡＤＥＢＱＸＧＦＺＲＸＧ
（ただし、Ｘは任意のアミノ酸を意味し、ＢはＩ、ＬおよびＶからなる群より選ばれるいずれかの分岐鎖アミノ酸を意味し、ＺはＧまたはＡを意味する。）からなるアミノ酸配列領域である。各生物種のＧａｂＴドメイン配列を表１に示す。表１の配列中、ＧａｂＴドメインと異なる塩基に下線を付して示した。
Claims (14)
- 測定サンプルに、エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を添加し、アセトアルデヒド、リン酸、及びアンモニアを生成させる第１の酵素反応を行う第１の工程と、
生成した前記アセトアルデヒド、前記リン酸、及び前記アンモニアの少なくともいずれかを定量して、前記測定サンプル中のエタノールアミンリン酸量を決定する第２の工程と、を含み、
前記酵素が、（１）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
（３）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であるエタノールアミンリン酸の測定方法。 - 前記第２の工程が、前記第１の酵素反応後の測定サンプルに、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）及び酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）を添加し、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を生成させる第２の酵素反応を行う副工程と、
生成した前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を分光化学的に定量して、前記第１の酵素反応後の測定サンプル中の前記アセトアルデヒドを定量する副工程と、を含む請求項１に記載の測定方法。 - 前記第１の工程において、前記測定サンプルに補酵素をさらに添加する請求項１又は２に記載の測定方法。
- 前記補酵素がピリドキサールリン酸である請求項３に記載の測定方法。
- コンピュータに、請求項１〜４のいずれか１項に記載のエタノールアミンリン酸の測定方法を実行させるためのプログラム。
- 前記測定サンプル中のエタノールアミンリン酸の測定値に基づいて、前記測定サンプルを提供した被験者がうつ病患者であるか否かを判定する工程、および、
得られた判定結果を出力する工程をさらに含む請求項５に記載のプログラム。 - 請求項５又は６に記載のプログラムを保存したコンピュータで読み取り可能な記録媒体。
- 請求項５又は６に記載のプログラムが組み込まれた測定装置。
- エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を含み、
前記酵素が、（１）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
（３）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であるエタノールアミンリン酸測定用試薬。 - 前記酵素の補酵素をさらに含む請求項９に記載のエタノールアミンリン酸測定用試薬。
- 前記補酵素がピリドキサールリン酸である請求項１０に記載のエタノールアミンリン酸測定用試薬。
- 請求項９〜１１のいずれか１項に記載のエタノールアミンリン酸測定用試薬を含有するうつ病診断薬。
- エタノールアミンリン酸からアセトアルデヒドを生成する反応を触媒しうる酵素を個別に収納した容器を含み、
前記酵素が、（１）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（２）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、
（３）配列番号１若しくは２で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であるエタノールアミンリン酸測定用キット。 - 前記酵素の補酵素を個別に収容した容器をさらに含む請求項１３に記載のエタノールアミンリン酸測定用キット。
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