JP3051881B2 - Ｂｏｄの測定方法、測定装置及びそれらに用いる微生物 - Google Patents
Ｂｏｄの測定方法、測定装置及びそれらに用いる微生物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＢＯＤの測定方法、測定
装置及びそれらに用いる新菌株に関する。更に詳しく
は、酸素電極とクレブシエラ属に属する微生物を固定化
した微生物膜とからなる微生物電極を装着したフローセ
ルを具備したＢＯＤ測定装置を使用して、ＢＯＤを測定
する方法、装置及びそれらに用いる新菌株に関する。
装置及びそれらに用いる新菌株に関する。更に詳しく
は、酸素電極とクレブシエラ属に属する微生物を固定化
した微生物膜とからなる微生物電極を装着したフローセ
ルを具備したＢＯＤ測定装置を使用して、ＢＯＤを測定
する方法、装置及びそれらに用いる新菌株に関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、ＢＯＤの測定は日本工業規格に定
められた方法 (工業排水試験法ＪＩＳＫ−０１０２−１
９７２) に従って行われているが、この方法は測定に５
日間を要するなどの問題点があり、このため、従来より
ＢＯＤを測定する技術として微生物電極を使用する試み
が種々検討されてきた。その中でも微生物電極の微生物
膜に固定化する微生物としてはトリコスポロン・クタネ
ウムや活性汚泥等が良く用いられている (特公昭61-725
8号公報；鈴木周一編著、バイオセンサー 135〜136頁、
140〜142頁 (1989) 講談社発行所) 。また、測定する装
置に関しては、微生物電極をフローセルに装着して使用
する装置等が知られている (特開平3-123851号公報) 。
められた方法 (工業排水試験法ＪＩＳＫ−０１０２−１
９７２) に従って行われているが、この方法は測定に５
日間を要するなどの問題点があり、このため、従来より
ＢＯＤを測定する技術として微生物電極を使用する試み
が種々検討されてきた。その中でも微生物電極の微生物
膜に固定化する微生物としてはトリコスポロン・クタネ
ウムや活性汚泥等が良く用いられている (特公昭61-725
8号公報；鈴木周一編著、バイオセンサー 135〜136頁、
140〜142頁 (1989) 講談社発行所) 。また、測定する装
置に関しては、微生物電極をフローセルに装着して使用
する装置等が知られている (特開平3-123851号公報) 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
でＢＯＤ測定用として固定化微生物膜に使用されてきた
微生物は、例えばトリコスポロン・クタネウムでは各種
有機物質に対する資化スペクトルが狭く、二糖類等応答
しない成分が存在することや、逆に、エチルアルコール
等特定な物質に対して高感度に応答するなど、ＪＩＳ規
格によるＢＯＤ値との相関性が低い場合が多くあった。
又、最初にＢＯＤを測定する際、固定化微生物膜が正常
な応答をするようになるまでに１〜３日間のいわゆる活
性化処理が必要であるなど、実用性に欠ける点があっ
た。一方、活性汚泥を使用する場合は固定化した活性汚
泥を常に安定に管理することが困難であり、また微生物
膜を交換する度に固定化操作を行う必要があるなどの問
題点があった。尚、いずれの微生物を使用する場合も測
定試料中に砒素等いわゆる微生物に害作用を示す物質が
高濃度で存在すると微生物が死滅し測定ができなくなる
などの問題が一面あった。
でＢＯＤ測定用として固定化微生物膜に使用されてきた
微生物は、例えばトリコスポロン・クタネウムでは各種
有機物質に対する資化スペクトルが狭く、二糖類等応答
しない成分が存在することや、逆に、エチルアルコール
等特定な物質に対して高感度に応答するなど、ＪＩＳ規
格によるＢＯＤ値との相関性が低い場合が多くあった。
又、最初にＢＯＤを測定する際、固定化微生物膜が正常
な応答をするようになるまでに１〜３日間のいわゆる活
性化処理が必要であるなど、実用性に欠ける点があっ
た。一方、活性汚泥を使用する場合は固定化した活性汚
泥を常に安定に管理することが困難であり、また微生物
膜を交換する度に固定化操作を行う必要があるなどの問
題点があった。尚、いずれの微生物を使用する場合も測
定試料中に砒素等いわゆる微生物に害作用を示す物質が
高濃度で存在すると微生物が死滅し測定ができなくなる
などの問題が一面あった。
【０００４】一方、装置に関しては、これまでのフロー
セルを用いた方法では、試料中に混入した気泡が排出さ
せずにセル中に残留して測定値に影響を与えたり、１試
料当たり測定に要する時間が20分程度必要であり、正確
でかつリアルタイムにＢＯＤを測定するという期待には
充分答えられるものではなかった。本発明のクレブシエ
ラ属に属する菌株を固定化した微生物膜を使用した微生
物電極は種々の有機化合物に対して幅広く応答を示し、
ＪＩＳ法によるＢＯＤ値と高い相関性を示す測定値が得
られることや縦型微小容量フローセルを使用することで
短時間に測定できる等、優れた効果がある。
セルを用いた方法では、試料中に混入した気泡が排出さ
せずにセル中に残留して測定値に影響を与えたり、１試
料当たり測定に要する時間が20分程度必要であり、正確
でかつリアルタイムにＢＯＤを測定するという期待には
充分答えられるものではなかった。本発明のクレブシエ
ラ属に属する菌株を固定化した微生物膜を使用した微生
物電極は種々の有機化合物に対して幅広く応答を示し、
ＪＩＳ法によるＢＯＤ値と高い相関性を示す測定値が得
られることや縦型微小容量フローセルを使用することで
短時間に測定できる等、優れた効果がある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述した
種々の問題を解決すべく鋭意研究した結果、クレブシエ
ラ属に属する微生物が広く種々の有機物に対して資化性
を示し、かつ、短時間の活性化処理で安定した活性を示
す等、ＢＯＤ測定に関して優れた性質を有することを見
い出した。
種々の問題を解決すべく鋭意研究した結果、クレブシエ
ラ属に属する微生物が広く種々の有機物に対して資化性
を示し、かつ、短時間の活性化処理で安定した活性を示
す等、ＢＯＤ測定に関して優れた性質を有することを見
い出した。
【０００６】また、フローセルを使用しないバッチ型測
定法を利用することができるが、これらの微生物の性質
を生かし、より迅速で、正確なＢＯＤ測定を可能とする
ためには、試料の滞留時間が短く、試料室 (フローセ
ル) の溶液交換が容易で温度制御も簡単に行える構造を
有する微小容量フローセルを組み合わせて測定すること
等が有効であることを見い出した。
定法を利用することができるが、これらの微生物の性質
を生かし、より迅速で、正確なＢＯＤ測定を可能とする
ためには、試料の滞留時間が短く、試料室 (フローセ
ル) の溶液交換が容易で温度制御も簡単に行える構造を
有する微小容量フローセルを組み合わせて測定すること
等が有効であることを見い出した。
【０００７】即ち、本発明の第１は、クレブシエラ属に
属する微生物を固定化した微生物膜を使用することを特
徴とするＢＯＤの測定方法であり、本発明の第２は、酸
素電極とクレブシエラ属に属する微生物を固定化した微
生物膜とからなる微生物電極であり、本発明の第３は、
前記微生物電極を装着したフローセルを具備したＢＯＤ
測定装置であり、本発明の第４は、クレブシエラ・オキ
シトカに属する微生物で資化性が広く、砒素耐性を有す
る新菌株クレブシエラ・オキシトカ 12092株である。
属する微生物を固定化した微生物膜を使用することを特
徴とするＢＯＤの測定方法であり、本発明の第２は、酸
素電極とクレブシエラ属に属する微生物を固定化した微
生物膜とからなる微生物電極であり、本発明の第３は、
前記微生物電極を装着したフローセルを具備したＢＯＤ
測定装置であり、本発明の第４は、クレブシエラ・オキ
シトカに属する微生物で資化性が広く、砒素耐性を有す
る新菌株クレブシエラ・オキシトカ 12092株である。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
用いる微生物としては、クレブシエラ属に属する微生物
であれば特に制限はなく、例えば、クレブシエラ・オキ
シトカ ＪＣＭ１６６５ (Klebsiella oxytoca JCM1665)
、クレブシエラ・プランティコラ ＪＣＭ７２５１ (K
lebsiella planticola JCM7251)、クレブシエラ・オザ
エナエ ＪＣＭ１６６３ (Klebsiella ozaenae JCM166
3) 、クレブシエラ・テリゲナ ＪＣＭ１６８７ (Klebs
iella terrigena JCM1687) などが挙げられる。更に、
本発明者らはＢＯＤ測定に適した微生物を広く自然界よ
り検索した結果、鹿児島県の土壌より分離した１菌株が
広い資化性を有し、短時間の活性化処理でＢＯＤの測定
ができるなどの実用的に優れた性質を持っていることを
見い出した。
用いる微生物としては、クレブシエラ属に属する微生物
であれば特に制限はなく、例えば、クレブシエラ・オキ
シトカ ＪＣＭ１６６５ (Klebsiella oxytoca JCM1665)
、クレブシエラ・プランティコラ ＪＣＭ７２５１ (K
lebsiella planticola JCM7251)、クレブシエラ・オザ
エナエ ＪＣＭ１６６３ (Klebsiella ozaenae JCM166
3) 、クレブシエラ・テリゲナ ＪＣＭ１６８７ (Klebs
iella terrigena JCM1687) などが挙げられる。更に、
本発明者らはＢＯＤ測定に適した微生物を広く自然界よ
り検索した結果、鹿児島県の土壌より分離した１菌株が
広い資化性を有し、短時間の活性化処理でＢＯＤの測定
ができるなどの実用的に優れた性質を持っていることを
見い出した。
【０００９】本菌株の菌学的性質を以下に記載する。 Ａ. 形態学的性質 (１) 細胞の形及び大きさ： 桿菌で大きさは0.８〜1.
２μm ×３〜６μm (２) 細胞の多形成： なし (３) 運動性： なし (４) 胞子の有無： なし (５) グラム染色性： 陰性 (６) 抗酸性： なし Ｂ. 培養的性質 (１) 肉汁寒天平板培養： 良く生育し、平滑な淡青
灰色のコロニーを形成する。
２μm ×３〜６μm (２) 細胞の多形成： なし (３) 運動性： なし (４) 胞子の有無： なし (５) グラム染色性： 陰性 (６) 抗酸性： なし Ｂ. 培養的性質 (１) 肉汁寒天平板培養： 良く生育し、平滑な淡青
灰色のコロニーを形成する。
【００１０】 (２) 肉汁寒天斜面培養： 良く生育する (３) 肉汁液体培養： 良く生育する (４) ゼラチン穿刺培養： 液化せず (５) リトマス・ミルク： 酸性化し凝固する Ｃ. 生理学的性質 (１) 硝酸塩の還元： ＋ (２) 脱窒反応： ＋ (３) ＭＲテスト： − (４) ＶＰテスト： ＋ (５) インドールの生成： ＋ (６) 硫化水素の生成： − (７) デンプンの加水分解： − (８) クエン酸の利用： − (９) 無機窒素源の利用： ＋ (10) 色素の生成 − (11) ウレアーゼ： ＋ (12) オキシダーゼ： − (13) カタラーゼ： ＋ (14) 生育の範囲： 温度５〜40℃ pH４〜9.5 (15) 酸素に対する態度： 通性嫌気性 (16) Ｏ−Ｆテスト： Ｆ (発酵型) (17) 下記の糖類からの酸及びガスの生成 Ｄ. その他の性質 (１) β−ガラクトシダーゼ： ＋ (２) ＤＮase − (３) トリプトファンデアミナーゼ： − (４) エスクリンの分解： ＋ (５) アルギニンの分解： − (６) リジンの脱炭酸反応： ＋ (７) オルニチンの脱炭酸反応： − (８) 砒素耐性： 砒素10000ppm
存在下で生育可。
存在下で生育可。
【００１１】以上の菌学的性質をもとに本菌株の分類学
上の地位をバージェイズ・マニュアル・オブ・システマ
ティック・バクテリオロジー第１巻 415〜416頁、461〜
465頁 (1984) (Bergey's Manual of Systematic Bacter
iology Volume 1, 415-416,461-465 (1984)) の記載と
比較したところ、クレブシエラ・オキシトカに属する新
菌株であると同定し、クレブシエラ・オキシトカ １２
０９２ (Klebsiella oxytoca 12092) と命名した。尚、
本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄
第３６１６号 (FERM BP-3616) として1991年10月22日に
受託され国際寄託されている。
上の地位をバージェイズ・マニュアル・オブ・システマ
ティック・バクテリオロジー第１巻 415〜416頁、461〜
465頁 (1984) (Bergey's Manual of Systematic Bacter
iology Volume 1, 415-416,461-465 (1984)) の記載と
比較したところ、クレブシエラ・オキシトカに属する新
菌株であると同定し、クレブシエラ・オキシトカ １２
０９２ (Klebsiella oxytoca 12092) と命名した。尚、
本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄
第３６１６号 (FERM BP-3616) として1991年10月22日に
受託され国際寄託されている。
【００１２】以下に本菌株の培養方法を記載する。本菌
株の培養は通常の細菌の培養方法であればいずれでも使
用できる。炭素源としては、ぶどう糖、麦芽糖、蔗糖、
糖蜜等通常用いられるものを単独、又は組み合わせて用
いることができる。窒素源としては、有機窒素含有物と
して各種アミノ酸、コーンスティープリカー、マルツエ
キス、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、尿素等をま
た、無機窒素含有物としては塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム等を単独又は組み合わせ
て用いることができる。
株の培養は通常の細菌の培養方法であればいずれでも使
用できる。炭素源としては、ぶどう糖、麦芽糖、蔗糖、
糖蜜等通常用いられるものを単独、又は組み合わせて用
いることができる。窒素源としては、有機窒素含有物と
して各種アミノ酸、コーンスティープリカー、マルツエ
キス、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、尿素等をま
た、無機窒素含有物としては塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム等を単独又は組み合わせ
て用いることができる。
【００１３】その他、ビタミン、ミネラル等の成分を適
宜添加使用することができる。培養温度は好ましくは20
℃〜40℃、更に好ましくは28℃〜37℃である。培養pHは
好ましくは4.５〜9.０、更に好ましくは5.５〜8.０であ
る。培養方法は液体培養及び固体培養のいずれでも可能
であるが、生育力の強い対数増殖期の菌体が望ましく、
培養時間は、好気的に液体培養を行う場合には好ましく
は10時間〜72時間、更に好ましくは12時間〜48時間であ
る。固体培養を行う場合には好ましくは12時間〜96時
間、更に好ましくは24時間〜72時間である。
宜添加使用することができる。培養温度は好ましくは20
℃〜40℃、更に好ましくは28℃〜37℃である。培養pHは
好ましくは4.５〜9.０、更に好ましくは5.５〜8.０であ
る。培養方法は液体培養及び固体培養のいずれでも可能
であるが、生育力の強い対数増殖期の菌体が望ましく、
培養時間は、好気的に液体培養を行う場合には好ましく
は10時間〜72時間、更に好ましくは12時間〜48時間であ
る。固体培養を行う場合には好ましくは12時間〜96時
間、更に好ましくは24時間〜72時間である。
【００１４】培養終了後、公知の一般的方法にて菌体を
得ることができるが、例えば遠心分離法により菌体を集
めることができる。得られた菌体は蒸留水等で洗浄した
後、固定化を行うが、固定化法には通常用いられる方法
が使用でき、例えばメンブランフィルター (ポアサイズ
0.45ミクロン以下) などの膜の間に固定化して用いると
菌体の漏洩がなく安定した固定化微生物膜が得られる。
得ることができるが、例えば遠心分離法により菌体を集
めることができる。得られた菌体は蒸留水等で洗浄した
後、固定化を行うが、固定化法には通常用いられる方法
が使用でき、例えばメンブランフィルター (ポアサイズ
0.45ミクロン以下) などの膜の間に固定化して用いると
菌体の漏洩がなく安定した固定化微生物膜が得られる。
【００１５】微生物の固定化に使用する膜は、菌体は通
過しないが試料溶液中の酸素、有機物などの溶解成分が
通過できる親水性の材質のものであればよく、１例を挙
げればポアサイズが0.45ミクロン以下のアセチルセルロ
ース膜、ニトロセルロース膜などが適している。また、
微生物を２枚の膜の間に固定化する際には、できるだけ
膜間の間隙を少なくし、密着した膜と膜の間に微生物が
封入される状態を保つことで安定した応答が得られ、か
つ酸素電極への密着性も高まるため酸素濃度変化に対す
る応答性も向上し望ましい。
過しないが試料溶液中の酸素、有機物などの溶解成分が
通過できる親水性の材質のものであればよく、１例を挙
げればポアサイズが0.45ミクロン以下のアセチルセルロ
ース膜、ニトロセルロース膜などが適している。また、
微生物を２枚の膜の間に固定化する際には、できるだけ
膜間の間隙を少なくし、密着した膜と膜の間に微生物が
封入される状態を保つことで安定した応答が得られ、か
つ酸素電極への密着性も高まるため酸素濃度変化に対す
る応答性も向上し望ましい。
【００１６】本発明の微生物電極は上記固定化微生物膜
と酸素電極とからなり、微生物膜は着脱可能なキャップ
などにより酸素電極に密着固定されており、膜の交換が
容易にできる。また、この微生物電極は通常使用される
フローセルであればいずれにも装着して利用できるが、
本発明の微生物は試料溶液中の成分に対する応答が早
く、かつ、検出感度が高いため少量の試料でのＢＯＤ測
定が可能であり、従って測定時間の短縮化のためにフロ
ーセルの容量を１ml以下、更に好適には、0.３ml〜0.６
mlと微小にすることができ、また、試料中の酸素濃度に
ついては、必ずしも完全に酸素飽和とする必要はなく、
酸素濃度が一定した状態であればよい。
と酸素電極とからなり、微生物膜は着脱可能なキャップ
などにより酸素電極に密着固定されており、膜の交換が
容易にできる。また、この微生物電極は通常使用される
フローセルであればいずれにも装着して利用できるが、
本発明の微生物は試料溶液中の成分に対する応答が早
く、かつ、検出感度が高いため少量の試料でのＢＯＤ測
定が可能であり、従って測定時間の短縮化のためにフロ
ーセルの容量を１ml以下、更に好適には、0.３ml〜0.６
mlと微小にすることができ、また、試料中の酸素濃度に
ついては、必ずしも完全に酸素飽和とする必要はなく、
酸素濃度が一定した状態であればよい。
【００１７】更に、フローセルを縦位置に配し、フロー
セル中を攪拌子で攪拌しながら下方より試料溶液を通
じ、上方より排出する方法をとることにより、気泡など
の微生物膜への付着や残留がなく安定した測定ができ
る。例えば、試料溶液を４ml／分で通過させた場合、30
℃では、約５分で１試料の測定ができる。図１に本発明
の微生物電極を示す。
セル中を攪拌子で攪拌しながら下方より試料溶液を通
じ、上方より排出する方法をとることにより、気泡など
の微生物膜への付着や残留がなく安定した測定ができ
る。例えば、試料溶液を４ml／分で通過させた場合、30
℃では、約５分で１試料の測定ができる。図１に本発明
の微生物電極を示す。
【００１８】酸素電極３に固定化微生物膜２を密着さ
せ、キャップ１を外嵌して微生物電極８が構成されてい
る。本発明のＢＯＤ測定方法によれば、試料中のＢＯＤ
値を５分以内という極めて短時間に、かつ正確に測定で
きる。以下本発明の実験例を示す。
せ、キャップ１を外嵌して微生物電極８が構成されてい
る。本発明のＢＯＤ測定方法によれば、試料中のＢＯＤ
値を５分以内という極めて短時間に、かつ正確に測定で
きる。以下本発明の実験例を示す。
【００１９】〔実験例１〕 培養 クレブシエラ・オキシトカ １２０９２ (FERM BP-361
6）株を下記の組成を含む滅菌した培地 100mlの入った
500ml容三角フラスコに無菌的に接種し、30℃にて24時
間好気的条件下で液体振とう培養を行った。培養終了
後、培養液を6000rpm で20分間遠心分離し菌体を集め
た。その菌体に少量の滅菌蒸留水を加えて懸濁し、再度
6000rpm で20分間遠心分離して洗浄を行った。その洗浄
操作を３回繰り返し洗浄菌体150mg (乾重) を得た。培
地組成 ポリペプトン １％ 酵母エキス 0.１％ 塩化ナトリウム 0.５％ pH6.５ 〔実験例２〕 活性測定 実験例１で得られたクレブシエラ・オキシトカ １２０
９２株の菌体及び同様の条件で培養した各種菌体のＢＯ
Ｄ標準液 (グルコース、グルタミン酸ナトリウム水溶液
ＪＩＳ Ｋ０１０２記載。以下「ＢＯＤ標準液」とい
う) に対する酸素消費速度を測定した。
6）株を下記の組成を含む滅菌した培地 100mlの入った
500ml容三角フラスコに無菌的に接種し、30℃にて24時
間好気的条件下で液体振とう培養を行った。培養終了
後、培養液を6000rpm で20分間遠心分離し菌体を集め
た。その菌体に少量の滅菌蒸留水を加えて懸濁し、再度
6000rpm で20分間遠心分離して洗浄を行った。その洗浄
操作を３回繰り返し洗浄菌体150mg (乾重) を得た。培
地組成 ポリペプトン １％ 酵母エキス 0.１％ 塩化ナトリウム 0.５％ pH6.５ 〔実験例２〕 活性測定 実験例１で得られたクレブシエラ・オキシトカ １２０
９２株の菌体及び同様の条件で培養した各種菌体のＢＯ
Ｄ標準液 (グルコース、グルタミン酸ナトリウム水溶液
ＪＩＳ Ｋ０１０２記載。以下「ＢＯＤ標準液」とい
う) に対する酸素消費速度を測定した。
【００２０】
【表１】
【００２１】表１に示すように、クレブシエラ属に属す
る微生物はいずれもＢＯＤ標準液に対して活性を示し、
中でもクレブシエラ・オキシトカ １２０９２株は最も
高い酸素消費速度の応答を示した。 〔実験例３〕 装置・測定例 (標準曲線) 実験例１で得られたクレブシエラ・オキシトカ １２０
９２の菌体 0.4mg (乾重) をポアサイズ0.45μm のニト
ロセルロース膜 (ミリポア社製メンブランフィルター H
AWPO2500) ２枚の間に入れて周囲を接着し微生物を包括
固定する以外の間隙が生じないように膜同士を接着させ
菌体を包括固定し、固定化微生物膜を作製した。この固
定化微生物膜を100mM リン酸バッファー (pH7.０) 中に
浸漬し、エアポンプで 100ml／分のばっ気を３時間行っ
て活性化した。活性化した固定化微生物膜を図２に示す
装置に装着しＢＯＤ標準液の測定を行った。
る微生物はいずれもＢＯＤ標準液に対して活性を示し、
中でもクレブシエラ・オキシトカ １２０９２株は最も
高い酸素消費速度の応答を示した。 〔実験例３〕 装置・測定例 (標準曲線) 実験例１で得られたクレブシエラ・オキシトカ １２０
９２の菌体 0.4mg (乾重) をポアサイズ0.45μm のニト
ロセルロース膜 (ミリポア社製メンブランフィルター H
AWPO2500) ２枚の間に入れて周囲を接着し微生物を包括
固定する以外の間隙が生じないように膜同士を接着させ
菌体を包括固定し、固定化微生物膜を作製した。この固
定化微生物膜を100mM リン酸バッファー (pH7.０) 中に
浸漬し、エアポンプで 100ml／分のばっ気を３時間行っ
て活性化した。活性化した固定化微生物膜を図２に示す
装置に装着しＢＯＤ標準液の測定を行った。
【００２２】装置の概略は次の通りである。試料ビン４
から採取されたＢＯＤ溶液は、電磁弁５を通り、ポンプ
６を経て、フローセル７に導かれる。フローセル７中は
モーター10により攪拌子２で攪拌される。酸素電極３の
電極面にキャップ１で外嵌された固定化微生物膜２から
構成される微生物電極８で検知された値はアンプ部13で
増幅され、記録計14で記録される。測定を終了した試料
は、排液槽11に入る。測定終了後、電磁弁５を切り替え
洗浄液槽12より洗浄液を通じて、洗浄を行う。
から採取されたＢＯＤ溶液は、電磁弁５を通り、ポンプ
６を経て、フローセル７に導かれる。フローセル７中は
モーター10により攪拌子２で攪拌される。酸素電極３の
電極面にキャップ１で外嵌された固定化微生物膜２から
構成される微生物電極８で検知された値はアンプ部13で
増幅され、記録計14で記録される。測定を終了した試料
は、排液槽11に入る。測定終了後、電磁弁５を切り替え
洗浄液槽12より洗浄液を通じて、洗浄を行う。
【００２３】本装置を使用して、各種濃度のＢＯＤ標準
液の測定を行った結果、図３に示すように、ＢＯＤの濃
度とそれに応答する酸素電極の電圧変化量の間にはきわ
めて良い直線関係が得られた。次に、本装置において、
反応槽の容量を種々変えて実験を行った。表２に結果を
示すが、表中の標準液に対する測定値は図３で得られた
標準曲線を基に電圧変化量をＢＯＤ濃度として換算した
値で示した。表２の結果より容量１ml以下で充分測定が
可能であった。容量が１mlより大きい場合は洗浄も含め
た測定時間が長くかかり、0.３mlより小さい場合は、検
出感度が低くなり正確な測定が困難であった。
液の測定を行った結果、図３に示すように、ＢＯＤの濃
度とそれに応答する酸素電極の電圧変化量の間にはきわ
めて良い直線関係が得られた。次に、本装置において、
反応槽の容量を種々変えて実験を行った。表２に結果を
示すが、表中の標準液に対する測定値は図３で得られた
標準曲線を基に電圧変化量をＢＯＤ濃度として換算した
値で示した。表２の結果より容量１ml以下で充分測定が
可能であった。容量が１mlより大きい場合は洗浄も含め
た測定時間が長くかかり、0.３mlより小さい場合は、検
出感度が低くなり正確な測定が困難であった。
【００２４】
【表２】
【００２５】〔実験例４〕 活性化時間の比較 実験例１の方法で培養して得られた各種微生物を実験例
３と同様に固定化し、固定化微生物膜とした。これらの
固定化微生物膜を100mM リン酸バッファー (pH7.０) 中
に浸漬しエアポンプ 100ml／分のばっ気を行い経時的に
図２に示す装置でＢＯＤ標準液の測定を行った。表３に
示すようにトリコスポロン・クタネウムＩＦＯ １０４
６６株では活性化に１〜２日必要であるのに対して、ク
レブシエラ属に属する微生物、特にクレブシエラ・オキ
シトカ １２０９２株では３時間で活性化ができるとい
う特長があった。
３と同様に固定化し、固定化微生物膜とした。これらの
固定化微生物膜を100mM リン酸バッファー (pH7.０) 中
に浸漬しエアポンプ 100ml／分のばっ気を行い経時的に
図２に示す装置でＢＯＤ標準液の測定を行った。表３に
示すようにトリコスポロン・クタネウムＩＦＯ １０４
６６株では活性化に１〜２日必要であるのに対して、ク
レブシエラ属に属する微生物、特にクレブシエラ・オキ
シトカ １２０９２株では３時間で活性化ができるとい
う特長があった。
【００２６】
【表３】
【００２７】〔実験例５〕 既知標準物質の測定例 (ト
リコスポロンとの比較) 実験例４のクレブシエラ・オキシトカ １２０９２株の
固定化微生物膜とトリコスポロン・クタネウム株の固定
化微生物膜を充分活性化し、各種標準物質に対する応答
を測定し、５日間ＢＯＤ法による測定値と比較した。微
生物固定化膜の測定には、実験例３で使用した装置を用
いＢＯＤ標準液で検量線を作製して行った。５日間ＢＯ
Ｄ法はＪＩＳ Ｋ０１０２記載の方法に従って行った。
リコスポロンとの比較) 実験例４のクレブシエラ・オキシトカ １２０９２株の
固定化微生物膜とトリコスポロン・クタネウム株の固定
化微生物膜を充分活性化し、各種標準物質に対する応答
を測定し、５日間ＢＯＤ法による測定値と比較した。微
生物固定化膜の測定には、実験例３で使用した装置を用
いＢＯＤ標準液で検量線を作製して行った。５日間ＢＯ
Ｄ法はＪＩＳ Ｋ０１０２記載の方法に従って行った。
【００２８】表４に示すようにクレブシエラ・オキシト
カ １２０９２株の測定値は公定法である５日間ＢＯＤ
法の測定値と良く一致しており、両者の相関計数はｒ2
＝0.993 であった。また、トリコスポロン・クタネウム
ＩＦＯ １０４６６株では応答のみられなかった二糖
類に対しても本発明のクレブシエラ・オキシトカ １２
０９２株は応答を示し、逆にエチルアルコールに対して
トリコスポロン・クタネウム ＩＦＯ １０４６６株が
５日間ＢＯＤ法より高い測定値を与えるのに対して、ク
レブシエラ・オキシトカ １２０９２株は５日間ＢＯＤ
法とほぼ等しい値を示した。
カ １２０９２株の測定値は公定法である５日間ＢＯＤ
法の測定値と良く一致しており、両者の相関計数はｒ2
＝0.993 であった。また、トリコスポロン・クタネウム
ＩＦＯ １０４６６株では応答のみられなかった二糖
類に対しても本発明のクレブシエラ・オキシトカ １２
０９２株は応答を示し、逆にエチルアルコールに対して
トリコスポロン・クタネウム ＩＦＯ １０４６６株が
５日間ＢＯＤ法より高い測定値を与えるのに対して、ク
レブシエラ・オキシトカ １２０９２株は５日間ＢＯＤ
法とほぼ等しい値を示した。
【００２９】
【表４】
【００３０】〔実験例６〕 砒素存在下での測定 実験例３と同様にして各種濃度のＢＯＤ溶液を砒素存在
下で測定した。図４に結果を示すが、砒素濃度5000ppm
存在下でもＢＯＤ濃度と酸素電極での電圧変化量の間に
は良好な直線関係が得られた。以上のように、本発明に
よれば、各種化合物のＢＯＤ測定が迅速にかつ正確にで
きることが明らかとなった。
下で測定した。図４に結果を示すが、砒素濃度5000ppm
存在下でもＢＯＤ濃度と酸素電極での電圧変化量の間に
は良好な直線関係が得られた。以上のように、本発明に
よれば、各種化合物のＢＯＤ測定が迅速にかつ正確にで
きることが明らかとなった。
【００３１】次に、実施例をあげて説明するが、本発明
はこの実施例に限定されるものではない。
はこの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】 実廃液の測定例 (５日間法との比較) 図２に示す装置に実験例３で製造したクレブシエラ・オ
キシトカ １２０９２株の活性化した固定化微生物膜を
装着し、実際の各種廃液についてＢＯＤの測定を行っ
た。比較として同じ試料について５日間ＢＯＤ法で測定
した。表５に示すように本発明によるＢＯＤ測定結果と
公定法の５日間ＢＯＤ法の測定結果は高い相関性があっ
た。
キシトカ １２０９２株の活性化した固定化微生物膜を
装着し、実際の各種廃液についてＢＯＤの測定を行っ
た。比較として同じ試料について５日間ＢＯＤ法で測定
した。表５に示すように本発明によるＢＯＤ測定結果と
公定法の５日間ＢＯＤ法の測定結果は高い相関性があっ
た。
【００３３】
【表５】
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば試料中のＢＯＤを迅速に
かつ正確に測定できる。
かつ正確に測定できる。
【図１】 本発明の微生物電極を示す図である。
【図２】 実験例３で用いた装置を示す図である。
【図３】 図２に示す装置を用いて各種濃度のＢＯＤ標
準液を測定した結果を示す図である。
準液を測定した結果を示す図である。
【図４】 図２に示す装置を用いて各種濃度のＢＯＤ標
準液を砒素存在下で測定した結果を示す図である。
準液を砒素存在下で測定した結果を示す図である。
１・・・キャップ ２・・・固定化微生物膜 ３・・・酸素電極 ４・・・試料ビン ５・・・電磁弁 ６・・・ポンプ ７・・・フローセル ８・・・微生物電極 ９・・・攪拌子 １０・・モーター １１・・排液槽 １２・・洗浄液槽 １３・・アンプ部 １４・・記録計
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:22） (72)発明者 赤野 裕文 愛知県半田市有脇町２−46−28 (72)発明者 川村 吉也 愛知県江南市古知野町古渡132 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/06 G01N 33/18 105 G01N 27/30 - 27/46 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (7)
- 【請求項１】 クレブシエラ属に属する微生物を固定化
した微生物膜を使用することを特徴とするＢＯＤの測定
方法。 - 【請求項２】 酸素電極とクレブシエラ属に属する微生
物を固定化した微生物膜とからなる微生物電極を装着し
たフローセルに被試験液を流入させることを特徴とする
ＢＯＤの測定方法。 - 【請求項３】 クレブシエラ属に属する微生物がクレブ
シエラ・オキシトカである請求項１又は２記載の測定方
法。 - 【請求項４】 酸素電極とクレブシエラ属に属する微生
物を固定化した微生物膜とからなる微生物電極。 - 【請求項５】 クレブシエラ属に属する微生物がクレブ
シエラ・オキシトカである請求項４記載の微生物電極。 - 【請求項６】 請求項４又は５記載の微生物電極を装着
したフローセルを具備したＢＯＤ測定装置。 - 【請求項７】 クレブシエラ・オキシトカに属する微生
物で資化性が広く、砒素耐性を有する新菌株クレブシエ
ラ・オキシトカ １２０９２株。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3307694A JP3051881B2 (ja) | 1991-11-22 | 1991-11-22 | Ｂｏｄの測定方法、測定装置及びそれらに用いる微生物 |
| US07/978,843 US5356792A (en) | 1991-11-22 | 1992-11-19 | Biochemical oxygen demand analyzer and methods of analysis using Klebsiella microorganisms |
| EP92119824A EP0543407B1 (en) | 1991-11-22 | 1992-11-20 | Biochemical oxygen demand analyzer, methods of analysis, microorganisms used for analysis |
| DE69201937T DE69201937T2 (de) | 1991-11-22 | 1992-11-20 | Biochemischer Sauerstoffbedarfanalysator, Verfahren zur Analyse, Mikroorganismen zur Verwendung in Analyse. |
| CA002083410A CA2083410A1 (en) | 1991-11-22 | 1992-11-20 | Biochemical oxygen demand analyzer, methods of analysis, microorganisms used for analysis |
| US08/179,593 US5426042A (en) | 1991-11-22 | 1994-01-07 | Klebsella oxytoca ferm BP-I/3616 and immobilization thereof with a gelating agent in pores of a membrane |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3307694A JP3051881B2 (ja) | 1991-11-22 | 1991-11-22 | Ｂｏｄの測定方法、測定装置及びそれらに用いる微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05137597A JPH05137597A (ja) | 1993-06-01 |
| JP3051881B2 true JP3051881B2 (ja) | 2000-06-12 |
Family
ID=17972102
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3307694A Expired - Fee Related JP3051881B2 (ja) | 1991-11-22 | 1991-11-22 | Ｂｏｄの測定方法、測定装置及びそれらに用いる微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3051881B2 (ja) |
-
1991
- 1991-11-22 JP JP3307694A patent/JP3051881B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05137597A (ja) | 1993-06-01 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |