BR102016002700A2

BR102016002700A2 - Processo para produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba (acrocomia aculeata) e co-produtos de cervejaria, e uso

Info

Publication number: BR102016002700A2
Application number: BR102016002700-4A
Authority: BR
Inventors: Vera Lúcia Dos Santos; Ana Flávia Batista
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2019-04-24
Also published as: BR102016002700B1

Abstract

processo para produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba (acrocomia aculeata) e co-produtos de cervejaria, e uso. a presente invenção descreve um processo para produção de xilitol utilizando torta de macaúba (acrocomia aculeata) e co-produtos de cervejaria. tal processo permite a redução de custos na produção de xilitol e o reaproveitamento de resíduos e co-produtos gerados pela agroindústria.

Description

“PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE XILITOL A PARTIR DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE TORTA DE MACAÚBA (ACROCOMIA ACULEATA) E CO-PRODUTOS DE CERVEJARIA, E USO” [001] A presente invenção descreve um processo para produção de xilitol utilizando hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba (Acrocomia aculeata) e co-produtos de cervejaria. Tal processo permite a redução de custos na produção de xilitol e o reaproveitamento de resíduos e co-produtos gerados pela agroindústria.

[002] O xilitol é um açúcar natural bem tolerado pelo corpo humano, podendo ser consumido em até 60g por dia, apresentando efeito laxativo se ingerido acima dessa quantidade (EMODI, A. Xylitol, its properties and food application. Food Technol,. v.32, 20-32, 1978). O xilitol possui inúmeras aplicações, uma delas é na prevenção de cáries dentárias, uma vez que é capaz de reduzir a quantidade de Streptococcus mutans, principal agente responsável pela formação da cárie, por meio do uso contínuo de gomas de mascar contendo esse poliol (AUTIO, J.T. Effect of xylitol chewing gum on salivary Streptococcus mutans in preschool children. ASDC Journal of Dentistry for Children, v. 69, n.1, p. 81-86, 2002). Na cavidade bucal, o xilitol assimilado por S. mutans é fosforilado a xilitol-5P, o qual não é metabolizado pela bactéria. O metabólito é liberado para o meio extracelular, e o seu acúmulo na região dentária inibe o consumo de outros açúcares por S. mutans, reduzindo o seu crescimento e adesão na cavidade bucal (GRILLAUD, M. et al. Les polyols em odontologie pediatrique:interet du xylitol. Archives de Pediatrie, v.12, n.7, p.1180-1186, 2005; KANDELMAN, D. Role of xylitol other polyols in dental preventive programs targeted for high caries risk populations. Journal Odonto. Stomatol., v.10. n.2, p.93-102, 2003). Estudos também têm demonstrado que o xilitol parece auxiliar o processo de

Petição 870180133264, de 24/09/2018, pág. 6/6

2/22 remineralização de lesões iniciais no esmalte dentário, uma vez que atua no fluxo e composição da saliva (LOVEREN, C. Sugars alcohols: what in the evidence for caries-preventive effect and caries therapeutic effects? Caries Research, v.38, p. 286-293, 2004).

[003] O xilitol também possui importante aplicação na prevenção da osteoporose. Estudos mostraram que sua administração oral impediu a progressão da osteoporose e proporcionou aumento de massa óssea (SVANBERG, M.J. Dietary xylitol supplementation prevents osteoporotic changes in streptozotocin-diabetic rats. Metabolism Clinicai and Experimental, v.20, p.578-583, 1988). Seu uso também auxilia no tratamento de otites médias e agudas e infecções respiratórias, pois inibe o crescimento e a adesão de Pneumococcus spp. e Haemophilus influenzae em células da nasofaringe (UHARI, M.; KONTIOKARI, T.; NIEMELA, M. 1998, A novel use of xylitol sugar in preventin acute otitis media. Pediatrics, 102(4): 879-884; MUSSATO, S.I.; ROBERTO, I.C. Xilitol: edulcorante com efeitos benéficos para a saúde humana. Brazilian Journal of Pharmaceuticat Sciences, v. 38, n.4, p. 401-4013, 2002).

[004] Outra característica importante do xilitol é que seu metabolismo é independente da insulina, o que, aliado ao seu baixo índice glicêmico, torna seu consumo ideal por pessoas diabéticas (GRILLAUD.M. Les polyols en odontologie pediatrique: interet du xylitol. Archives de Pedriatrie, v.12, n.7, p.1180-1186, 2005), além de ser um terço menos calórico em relação à sacarose (BAR, A. Xylitol. In: O’BREIN NABORS, L., GELARDI, R.C., eds. Altemative Sweeteners. 2. ed., New York: Marcei Dekkor Inc. p.349-379, 1991). Clinicamente, também é indicado na dieta de obesos, uma vez que atua de forma menos acentuada no depósito de gorduras se comparado com outros açúcares (ELLWOOD, K.C.; BHATENA, S.J.; JOHANNNESEN, J.N.; BRYANT, M.A.; 0'DONNEL, M.W. Biomarkers used to acess the effect of dietary xylitol or sorbitol in the rat. Nutrition Research, v.19, n.11, p.1637-1648, 1999). Também pode ser empregado no tratamento de

3/22 desordens metabólicas, como a anemia hemolítica, e para estimular a absorção de vitaminas e cátions metálicos, como o cálcio e o ferro, pelo intestino (MAKINEN, K.K. 2000. Can the pentiol-hexitol theory explain the clinicai observations made with xylitol? Medicai hypotheses, 54(4):603—613).

[005] Desde 1980, 28 países têm utilizado o xilitol em produtos comerciais, sendo a União Européia responsável pela metade da produção mundial (JIN-SEO, C. Xylitol sweetner to be mass-produced via microbe process. Korea: The Korea Times, 2007. Disponível em:

http://www.koreatimes.co.kr/www/news/tech/2010/04/129_9089.html. Acesso em: 19 de outubro de 2007). No Brasil, o interesse pelo uso industrial do xilitol é crescente, sendo destaque na produção de cremes dentais e gomas de mascar (BRANCO, R. F. Produção enzimática de xilitol utilizando sistemas de regeneração de coenzimas como alternativa às vias química e microbiológica de obtenção. USP LORENA, 2010. 132f. Tese (Doutorado em Ciências) - Escola de Engenharia, Universidade de São Paulo, Lorena, 2010).

[006] O xilitol é naturalmente encontrado em frutas, legumes, verduras, liquens, algas e fungos. Porém, a extração realizada diretamente dessas fontes é economicamente inviável, devido à baixa concentração na qual o xilitol se encontra, o que torna baixo o rendimento do processo (0,9g de xilitol por 100g de material utilizado) (PARAJÓ, J.C.; DOMINGUEZ, H.; DOMINGUEZ, J.M.; Biotechnological production of xylitol. Part 1: Interest of xylitol and Fundamentais of its biosynthesis. Bioresource Technology, v.65, p. 191-201, 1998^a).

[007] Em larga escala, a obtenção de xilitol é realizada por processo químico, por meio da hidrólise ácida do material lignocelulósico, seguida da purificação e hidrogenação da xilose em xilitol (MELAJA, A.J., HAMALAINEN, L. Process for making xylitol. U.S. Patent n. 4.008.285, 1975). Um catalisador metálico (Ni/AI₂O₃) é utilizado para a hidrogenação da xilose purificada, sob temperatura de até 140°C

4/22 e pressão média de 50atm (CORTEZ, D.V. Permeabilização de Células de Candida guilliermondii Empregando Processos Químicos e Físicos e Seu Potencial Uso como biocatalisadores na Síntese de Xilitol. 2010, 125f. Tese (Doutorado em Ciências). Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, 2010). Os extensivos procedimentos para purificação da xilose e posterior separação e purificação do xilitol tornam o processo bastante dispendioso, limitando seu uso em escala industrial (LU,J.; TSAI, L.B.; GONG, CS.; TSAO, G.T. Effect of nitrogen sources on xylitol production from D-xylose by Candida sp, L 102. Biotechnology Letters, v.17, n.2, p.167-170, 1995).

[008] Diante dessa limitação e do crescimento do mercado de xilitol, estudos vêm sendo direcionados para o desenvolvimento de tecnologias alternativas que diminuam os custos de produção e os impactos ambientais causados pelos processos químicos (CORTEZ, 2010). Nesse contexto, a via biotecnológica de obtenção de xilitol tem sido considerada uma alternativa viável ao processo químico, uma vez que não requer essas etapas que elevam o custo de produção (BRANCO, R.F.; SANTOS, J. C.; MURAKAMI, L. Y.; MUSSATO, S. I.; DRAGONE, G.; SILVA, S. S. Xylitol Production in a bubble column bioreactor: Influence of the aeration rate and immobilized system concentration. Process Biochemistry, v. 42, p. 258-262, 2007).

[009] A via biotecnológica é baseada na utilização de micro-organismos que convertam a xilose presente em materiais lignocelulósicos em xilitol. Entre os micro-organismos, as leveduras são consideradas os melhores produtores de xilitol, sendo que espécies do gênero Candida têm se destacado na produção e por isso são extensivamente estudadas (KUSMANOVA, S. Microbial Conversion of D-Xylose to Xylitol. Journal of Fermentation and Bioengineering, Osaka, v. 86, n. 1, p. 1-14, 1998). Dentre as espécies já estudadas, Candida tropicalis (Li, H., Cheng,

K., Ge, J. & Ping, W. Statistical optimization of xylitol production from corncob hemicellulose hydrolysate by Candida tropicalis HDY-02. N. Biotechnol. 28, 673-8,

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1/

2011), C. athensensis (ZHANG, J.; GENG, A.; YAO, C.; LU, Y.; LI, Q. Xylitol production from Dxylose and horticultura! waste hemicellulosic hydrolysate by a new isolate of Candida athensensis SB18. Bioresource technology, v.105, p. 13441, 2012), Meyerozyma (Candida) guillermondii (MUSSATO, I.S.; ROBERTO, I.C. Produção biotecnológica de xilitol a partir de palha de arroz. Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, n.28, p.34-39, 2003) e Debaryomyces hansenii (Candida famata) (García-Diéguez C., Salgado J. M., Roca E., Domínguez J. M. Kinetic modelling of the sequential production of lactic acid and xylitol from vine trimming wastes. Bioprocess and Biosystems Engineering, vol. 34, no. 7, pp. 869-878, 2001) estão entre as mais promissoras, sendo o processo de produção de xilitol patenteado no Japão em 1990 (JP19900331686 - Production of xylose and reduced xylose).

[010] Em estudo feito por Barbosa e colaboradores (BARBOSA, M.F.S.; MEDEIROS, M.B.; MANCILHA, I.M.; SCHNEIDER, H.; LEE, H. Screening of yeasts for production of xylitol fromd-xylose and some factors which affect xylitol yield in Candida guilliermondii. J. ind. Microbiol. Biotechnol, 3:241-51, 1988), uma linhagem de M. (Candida) guillermondii, cultivada em condições aeróbicas e alta concentração de xilose (acima de 10Og/l), produziu 77g/l de xilitol. Em 2005, foi verificada a produção de xilitol a partir de hidrolisado de bagaço de cana-deaçúcar por células imobilizadas de M. (Candida) guilliermondii', tendo alcançado a produção máxima de 47,5g/l (CARVALHO, W.; SANTOS, J.C.; CANILHA, L.; SILVA, S.S.; PEREGO, P.; CONVERTÍ, A. Xylitol production from sugarcane bagasse hydrolysate metabolic behaviour of Candida guilliermondii cells entrapped in Ca-alginate. Biochemical Engineering Journal, 25, 25-31, 2005). Em outro estudo, C. tropicalis, cultivada em hidrolisado não detoxificado, atingiu uma produção de xilitol de 31,1g/l (HUANG, C.F.; JIANG, Y.F.; GUO, G.L.; HWANG, W.S. Development of a yeast strain for xylitol production without hydrolysate detoxification as a part of the integration of co-product generation withín the lignocellulosic ethanot process. Bioresource Technology. 102, 3322-3329, 2010).

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Em estudo mais recente, uma linhagem de C. athensensis produziu 100,1g/l de xilitol, a partir de cultivo em hidrolisado de resíduos de horticultura (ZHANG et al., 2012).

[011] Outra forma de se obter xilitol por via biotecnológica é por meio de procedimento enzimático empregando a enzima xilose redutase. Esse processo leva a um rendimento mais alto em relação ao processo que utiliza o microorganismo, uma vez que a enzima que oxida o xilitol, xilitol desidrogenase (XD), não está presente na reação (BARBOSA et al., 1988). Estudos empregando enzimas para a produção de xilitol apresentam uma eficiência de 100% de conversão da xilose a xilitol, tornando esse método uma alternativa interessante para a obtenção de xilitol (NIDETSKY.B.; NEUHAUSER, W.; HALTRICH.D.; KULBE, K.D. Continuous enzymatic production of xylitol with simultaneous coenzyme regeneration in a charged membrane reactor. Biotechnology and Bioengineeríng, v.52, p.387-396, 1996).

[012] Apesar dessas vantagens, o processo enzimático requer a adição de cofatores ao meio reacional, elevando o custo do processo. Uma alternativa para contornar o problema em relação ao custo é a obtenção biotecnológica de xilitol empregando micro-organismos geneticamente modificados, com alta atividade da enzima responsável pela conversão da xilose em xilitol (KIM, M.D.; JUEN, Y.S.; KIM, S.G.; RYU, Y.W.; SEO, J.H. Comparison of xylitol production in recombinat Saccharomyces cerevisiae strains harboring XYL1 gene of Pichia stipitis and GRE3 gene of S. cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p. 862-866, 2002).

[013] Atualmente há um crescimento dos trabalhos voltados para a alteração genética de microrganismos visando a produção de xilitol, como em Saccharomyces cerevisiae (KIM et al., 2002) e Escheríchia coli (SUZUKI, T.; YOKOHAMA, S.I.; KINOSHITA.Y.; YAMADA, H.; HATSU, M.; TAKAMIZAWA, , K.;

Hn

YJ^NAP, Κ. Expression xyrA gene encoding for D-xylose reductase of Candida tropicalis and production of xylitol in Escherichia coli. Journal of Bioscience and Bioengineering, v.87, n.3, p.280-284, 1999). Em estudo realizado com S. cerevisiae contendo o gene que codifica a xilose redutase de Scheffersomyces stipitis, foi possível observar que a produção de xilose a xilitol ocorre com 100% de rendimento e produtividade volumétrica de até 1 ,Og/l.h. Em outro estudo, Wang e colaboradores (WANG, M.Y.; YU, Y.T.; CHNG, T.M.S. New method for preparing more stable microcapsules for the entrapment of genetically engeneering cells. Artificial Cells Blood Substitutes and Biotechnology, v.33, p.257-269, 2005), por meio de inibição do gene da xilitol desidrogenase (XDH1) de Trichoderma reesei, alcançaram um aumento de produtividade volumétrica de 0,008 g/l.h para 0,02 g/l.h em meio contendo 2% de xilose.

[014] Outra estratégia que tem sido utilizada na tentativa de aumentar a produção de xilitol é a imobilização de células. Esse processo, realizado em batelada, é uma alternativa para melhorar o processo fermentativo, pois possibilita o alcance de maiores concentrações celulares, facilita a separação do sistema imobilizado do meio de cultura, além de poder ser reutilizado, diminuindo o custo do processo (SANTOS, J.C.; CONVERTÍ, A.; CARVALHO, W.; MUSSATO, S.I.; SILVA, SS. Influence of aeration rate and Carrier concentration on xylitol production from sugarcane bagasse hydrolysate in immobilized-cell fluidized bed reacfor. Process Biochemistry, v.40, p.113-118, 2005; CUNHA, N.B. Expressão de cinco diferentes proteínas de interesse farmacológico em sementes transgênicas de soja [Glycine max L. (Merril)]. 2008. 123f. Dissertação (Mestrado em Ciências Genômicas e Biotecnologia) - Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2006). Em 2011, Prakash e colaboradores avaliaram a produção de xilitol por D. hansenii, utilizando sistema de imobilização celular, e alcançaram uma produção de 71,2g/l de xilitol (PRAKASH, G.; VARMA, A. J.; PRABHUNE, A.; SHOUCHE, Y.; RAO, M. Microbial production of xylitol from D-xylose and sugarcane bagasse hemicellulose 70 using

8/22 newly isolated thermotolerant yeast Debaryomyces hansenii. Bioresource Technology, v. 102, p. 3304-3308, 2011).

[015] No Brasil, são produzidos anualmente 13,7 bilhões de litros de cerveja dos quais se recupera de 15 a 30kg de levedura por metro cúbico de álcool (SINDCERV, Sindicato Nacional da Industria da Cerveja. Produção Nacional de Cerveja. Disponível em: http://www.sindicerv.com.br/mercado.php Acesso em: 28/07/2015). Esse tipo de biomassa é economicamente importante, pois representa um co-produto do processo industrial obtido a baixo custo e que pode ser utilizado como fonte proteica se processado adequadamente (OLIVEIRA, A. M. Determinação das melhores condições de extração de proteínas de levedura Saccharomyces cerevisiae. Londrina, 2001. 98p. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos). Universidade Estadual de Londrina. Paraná, Brasil). De forma geral, apresentam, em base seca, cerca de 40% de sua composição em proteínas, 5 a 8% de nitrogênio, 45 a 55% de carboidratos e até 10% de minerais como fósforo, potássio, cálcio, magnésio e selênio (YAMADA, E.A.; ALVIM, I.D.; SANTUCCi, M.C.C. et al. Composição centesimal e valor protéico de levedura residual da fermentação etanólica e de seus derivados. Revista de Nutrição, v.16, n.4, p.423-432, 2003; SARWAR, G. et al. Nucleic acid, fiber and nutrient composition of intactive dried food yeast products. Journal of Food Science, v.50, p.353-357, 1985; BUTOLO, J. E. Uso de biomassa de levedura em alimentação animal: propriedades, custo relativo a outras fontes nutrientes. In “Workshop”: Produção de biomassa de levedura: Utilização em alimentação humana e animal, 1996, Campinas. Resumos Campinas: Centro de Química de Alimentos e nutrição aplicada, 1996. p.70; HALÁSZ, A.; LÁSZTITY, R. Use of yeast biomass in food production. Boca Raton: CRC Press, Boca Raton, 1991, 312p). A biomassa de levedura é comumente utilizada como aditivo em ração animal, sendo a espécie mais estudada para esse fim a S. cerevisiae.

9/22 [016] A partir da biomassa de levedura é possível obter o extrato de levedura por meio de autólise, plasmólise ou processos combinados. A autólise ocorre pela ação de enzimas endógenas em pH e temperatura específicos, processo no qual podem ser adicionados plasmolizantes como o cloreto de sódio e solventes orgânicos (BEHALOVÁ, B. et al. Comparison of various ways of extractíon of nucleic acids and of preparation of yeast extract from Saccharomyces cerevísiae and Candida utilis. Acta Biotechnology, n.11, 1991). A composição química do extrato depende da qualidade da biomassa utilizada e do processo de ruptura celular (DZIEZAK, J. D. Yeasts and yeast derivatives: definitions, characteristics and processing. Food Technology, v.41, n.2, p. 104-121, 1987). O extrato vem sendo utilizado no Brasil pelos setores de embutidos e produtos cárneos, biscoitos e massa de tomate (RÉVILLION, J. P. et al. Produção de extrato de leveduras de uso alimentar a partir do soro de queijo: abordagem de elementos técnicos e mercadológicos relevantes. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.20, n.2, maio/ago., 2000). Também tem sido utilizado como suplemento em meios de cultivo de microrganismos. Em 2008, Martins utilizou extrato de levedura residual de cervejaria na produção de bioinseticida por Bacillus sphaericus (MARTINS, A.;

O. Otimização da autólise da Saccharomyces cerevísiae de cervejaria e extração de RNA. Tese de doutorado, São Paulo, 2008).

[017] Cadeias produtivas como as de etanol e de açúcar, a partir da cana-deaçúcar, e de biodiesel, a partir de óleo extraído do fruto da palmeira macaúba, também geram resíduos e co-produtos que podem ser utilizados como matéria prima em novos processos produtivos. Nativa de diferentes regiões do Brasil, a macaúba é encontrada principalmente na região central do país e, em particular, no estado de Minas Gerais. Um dos seus co-produtos, a torta de macaúba é composta por fibras, proteínas, lignina, cinzas e extrativos (Hiane, P.A.; Baldasso,

P. A.; Marangoni, S.; Macedo, M.L.R. Chemical and nutritional evaluation of kernels of bocaiuva, Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. Ciênc. Tecnol. Aliment. v. 26(3), 683-689, 2006). Seus elevados teores de fibras são comparáveis aos da

10/22 biomassa lignocelulósica derivada da cana de açúcar (Soccol, C. R. et al. Bioethanol from lignocelluloses: Status and perspectives in Brazil. Bioresour. Technol. 101, 4820-5, 2010) ou da palha de arroz (OLIVEIRA, R. M.; CARVALHO, E. P.; SCHUWAN, R. F. Produção de enzimas hidrolíticas extracelulares por Fusarium em sistema de batelada simples. Revista Interação, Juiz de Fora, n.2, 2000. Disponível em:<http://interacao.unis.edu.br/ n2/art2.htm>. Acesso em 25 de outubro de 2013), demonstrando seu potencial uso para a produção de compostos com alto valor agregado como o etanol e o xilítol.

[018] A utilização da torta de macaúba em processos fermentativos constitui a possibilidade de integrar os processos de produção de biodiesel, produzido a partir do óleo dos frutos da palmeira, e de etanol ou xilitol, a partir dos resíduos lignocelulósicos das tortas. Essa integração torna-se muito importante à medida que influencia tanto em questões econômicas, quanto nas ambientais associadas a estas cadeias produtivas. Gutiérrez e colaboradores (2009) propuseram uma simulação de integração dos processos de produção dos biocombustíveis, etanol e biodiesel, a partir de frutos do dendezeiro (Elaeis guineenses). Os dados obtidos mostraram uma redução de até 39,8% no custo energético do processo de produção (Gutiérrez, L. F., Sánchez, Ó. J. & Cardona, C. A. Bioresource Technology Process integration possibilities for biodiesel production from palm oil using ethanol obtained from lignocellulosic residues of oil palm industry. Bioresour. Technol. 100, 1227-1237, 2009).

[019] A utilização de co-produtos de cervejaria para a produção do xilitol foi descrita por Pérez-Bibbins e colaboradores, em 2015 (Pérez-Bibbins B, TorradoAgrasar A, Salgado JM, Oliveira RP, Domínguez JM - Potential of lees from wine, beer and cider manufacturing as a source of economic nutrients: An overview. Waste Manag. 2015 Jun;40:72-81). Porém, diferentemente da presente invenção, eles suplementaram os co-produtos de cervejaria com 60g/L de xilose e utilizaram a levedura D. hansenii no processo de fermentação. Além disso, os autores

11/22 demonstraram que o uso da fração sólida dos co-produtos de cervejaria não permitiu o crescimento das leveduras, indicando a necessidade de métodos alternativos para tal.

[020] O documento de patente CN20121551958, intitulado “Method for producing xylitol through fermenting lees hydrolysate by using Pichia guilliermondii”, descreve um método para a produção de xilitol usando co-produtos de vinícola e a levedura Pichia guilliermondii, [021] O documento de patente PI 0903273-8, intitulado “Produção biotecnológica de xilitol a partir do bagaço de cana-de-açúcar orgânico”, descreve o uso de bagaço de cana de açúcar para a produção de xilitol.

[022] O uso de torta de macaúba e Moniliella spathulata foi descrito para a produção de lipases (Souza LT, Oliveira JS, Rodrigues MQ, dos Santos VL, Pessela BC, Resende RR - Microb Cell Fact. 2015 Jun 16;14:87).

[023] A torta de macaúba também foi descrita como substrato para a produção de etanol, utilizando Candida boidinii (Gonçalves DB, Batista AF, Rodrigues MQ, Nogueira KM, Santos VL - Ethanol production from macaúba (Acrocomia aculeata) presscake hemicellulosic hydrolysate by Candida boidinii UFMG14 - Bioresour Technol. 2013 Oct; 146:261-6).

[024] O documento de patente PI 0906455-9, intitulado “PROCESSO DE PRODUÇÃO DE LIPASES A PARTIR DE RESÍDUO AGROINDUSTRIAL” descreve a produção de lipases a partir de torta de pinhão manso, torta de mamona, torta de soja, torta de babaçu, torta de macaúba dentre outras, utilizando fungos filamentosos dos gêneros Aspergillus, Tríchoderma e Rhizopus, por fermentação no estado sólido.

12/22 [025] No estado da técnica não foi encontrada nenhuma tecnologia que trata de um método para produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba (Acrocomia aculeata) e co-produtos de cervejaria.

[026] A presente invenção propõe um método para produção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba (Acrocomia aculeata) e coprodutos de cervejaria. A utilização de meio de cultivo à base de co-produtos agroindustriais em sua totalidade permite a reutilização desta biomassa residual, comumente descartada na natureza pelas agroindústrias, e redução dos custos dos processos de produção de produtos com alto valor agregado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [027] A figura 1 compreende um gráfico de efeito principal, que demonstra a influência dos fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio no crescimento celular (g/l), no tempo máximo de 96h. *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[028] A figura 2 compreende um gráfico de interação, que demonstra a influência da interação dupla entre os fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio no crescimento celular (g/l), no tempo máximo de 96h. *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[029] A figura 3 compreende um gráfico de efeito principal, que demonstra a influência dos fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio na atividade específica máxima da xilose redutase. *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

13/22 [030] A figura 4 compreende um gráfico de interação, que demonstra a influência da interação dupla entre os fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio no crescimento celular (g/l), no tempo máximo de 96h. *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[031] A figura 5 compreende um gráfico de efeito principal, que demonstra a influência dos fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio na produção máxima de xilitol. *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[032] A figura 6 compreende um gráfico de interação, que demonstra a influência da interação dupla entre os fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio na produção máxima de xilitol. *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial), [033] A figura 7 compreende um gráfico de efeito principal, que demonstra a influência dos fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio na eficiência de conversão de açúcares em xilitol(YpZs). *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[034] A figura 8 compreende um gráfico de interação, que demonstra a influência da interação dupla entre os fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio na eficiência de conversão de açúcares em xilitol (Yp/s). *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[035] A figura 9 compreende um gráfico de efeito principal, que demonstra a influência dos fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de

14/22 ζχ9 nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio na produtividade volumétrica máxima em xilitol (Yqp). *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[036] A figura 10 compreende um gráfico de interação, que demonstra a influência da interação dupla entre os fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio na produtividade volumétrica máxima em xilitol (Yqp). *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[037] A figura 11 compreende um gráfico de efeito principal, que demonstra a influência dos fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio no consumo máximo de açúcares (Y%). *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

[038] A figura 12 compreende um gráfico de interação, que demonstra a influência da interação dupla entre os fatores aeração, concentração de xilose no hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio no consumo máximo de açúcares (Y%). *ELCE (Extrato de levedura de cervejaria; ELCO (Extrato de levedura comercial).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [039] A presente tecnologia descreve um processo para produção de xilitol utilizando a torta de macauba (Acrocomia aculeata) e co-produtos de cervejaria. Tal processo permite a redução de custos na produção de xilitol e o reaproveitamento de resíduos e co-produtos gerados pela agroindústria.

[040] O processo da presente invenção compreende as seguintes etapas:

a. Obter o hidrolisado hemicelulósico da torta de macaúba;

15/22 ?/

b. Precipitar a lignina a partir da torta de macaúba, através dos seguintes passos:

i. Corrigir o pH do conteúdo obtido na etapa “a” para 7,0 com CaO;

ii. Corrigir o pH do conteúdo obtido no passo “i” para 4,5 a 5,5 com H3PO4;

iii. Detoxificar o conteúdo obtido em “ii” com carvão ativado de 2,0 a 3,0% (p/v), à temperatura de 28 a 30°C, 180 a 200rpm por 3 a 5 horas;

iv. Remover o carvão ativado por centrifugação a 10.000xg por 15 minutos;

v. Ajustar 0 pH do sobrenadante obtido na etapa “iv” para 7,0 com NaOH;

vi. Esterilizar a 121°C por 15 minutos;

c. Obter 0 extrato de levedura, co-produto de cervejaria;

d. Obter o xilitol, a partir dos seguintes passos:

i. Cultivar uma linhagem de levedura em meio de cultura apropriado, preferencialmente caldo YPD (glicose 20g/l, peptona 10g/I, extrato de levedura 10g/I), com agitação de 180 a 200rpm, a 28 a 30°C por aproximadamente 24 horas;

ii. Centrifugar as culturas a 10.000 a 12.000xg e lavar com água destilada estéril;

iii. Transferir parte das células obtidas para frascos contendo meio à base de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba, como obtido na etapa “b” (20 a 60g/L de xilose) e extrato de levedura, co-produto de cervejaria (5 a 10g/l), de modo a se obter uma DOeoonm inicial igual a 0,2 a 0,3;

16/22 iv. Incubar os frascos a 28 a 30°C, com agitação de 180 a 200rpm, por até 96h;

v. Precipitar o conteúdo e filtrar o sobrenadante.

[041] A obtenção do hidrolisado hemicelulósico da torta de macaúba pode ser realizada através dos seguintes passos:

i. Adicionar à torta de macaúba triturada uma solução de ácido sulfúrico de 0,6 a 1,0% na relação 1:10 (p/v);

ii. Aquecer a 21°C por 60 minutos em autoclave;

iii. Resfriar o produto resultante da etapa “ii;

iv. Filtrar o conteúdo obtido em “iii”;

v. Corrigir o pH para 7,0 com NaOH;

vi. Centrifugar a 10.000xg por 15 minutos;

vii. Liofilizar o conteúdo para aumentar a concentração em aproximadamente 5 vezes.

viii. Esterilizar a 121°C por 15 minutos;

[042] A obtenção do extrato de levedura pode ser realizada através dos seguintes passos:

i. Realizar a desamargura da biomassa de levedura de cervejaria por centrifugação a 10.000xg por 10 min;

ii. Ajustar o pH para 8 a 9 com NaOH;

iii. Neutralizar através de lavagens sucessivas com água destilada;

iv. Centrifugar a suspensão de células;

v. Realizar autólise da biomassa de levedura de cervejaria desamargada ressuspendida em água destilada, colocandose o conteúdo em temperaturas sucessivas de 45 a 60°C;

n ui

vi. Realizar a pasteurização a 80 a 90°C por 25 a 35 minutos;

vii. Resfriar e centrifugar a W.OOOxg por 10 minutos;

viii. Concentrar o sobrenadante obtido na etapa “vii” por pulverização, utilizando temperatura de entrada de ar de 180190°C, para obtenção do extrato de levedura em pó.

[043] O hidrolisado de macaúba e o extrato de biomassa de leveduras podem ser utilizados como substratos para crescimento de diferentes isolados de levedura, na produção de xilitol.

[044] Para a determinação da concentração de açúcares e xilitol pode-se utilizar cromatografia líquida de alto desempenho.

[045] A presente invenção também compreende o uso de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba {Acrocomia aculeata) e co-produtos de cervejaria na produção de xilitol, a partir de fermentação.

[046] O hidrolisado de torta de macaúba (co-produto da produção de óleo de macaúba/biorefinaria de Biodiesel) e o extrato de biomassa de leveduras (coproduto de cervejaria) podem ser utilizados como substratos para o crescimento de diferentes isolados de leveduras. Diferentes isolados podem produzir xilitol em fermentações usando como fonte de nitrogênio e carbono os referidos resíduos.

[047] A produção de xilitol pelo método da presente tecnologia se aproxima da produção usando xilose comercial. A produção de xilitol a partir do hidrolisado de macaúba suplementado com extrato da biomassa de leveduras, como fonte de nitrogênio, se aproxima da produção usando outras fontes de nitrogênio, como ureia e extrato de levedura comercial.

[048] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através do exemplo que se segue, não limitante.

18/22 /

EXEMPLO 1 - Obtenção de xilitol a partir de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba (Acrocomiã aculeata) e co-produtos de cervejaria [049] O exemplo utiliza a levedura Meyerozyma caríbbica da linhagem identificada como UFMG08, porém, diferentes isolados de leveduras podem ser utilizados para produzir xilitol em fermentações usando como fonte de nitrogênio e carbono o hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba (Acrocomiã aculeata) e os co-produtos de cervejaria.

[050] A torta de macaúba foi obtida de acordo com Gonçalves e colaboradores, 2013 (GONÇALVES, D. B.; BATISTA, A.F.; RODRIGUES, M. Q, R. B.; NOGUEIRA, K.M.V.; SANTOS, V.L. Ethanol production from Macaúba (Acrocomiã aculeata) presscake hemícellulosic hydrolysate by Candida boidinii UFMG 14. Bioresource Technology, v.146, p. 261-266, 2013). A torta de macaúba, coproduto da produção de biodiesel, foi submetida à hidrólise ácida para a obtenção de hidrolisado hemicelulósico. Em frascos Erlenmyer de 500ml foi adicionada a relação 1:10 (p/v) de torta de macaúba triturada e solução de ácido sulfúrico a 0,8%. A hidrólise foi conduzida a 121°C por 60 minutos em autoclave e o produto resultante da hidrólise foi resfriado, filtrado em sacos de algodão e corrigido o seu pH para 5,5 com NaOH. Posteriormente, foi centrifugado a 10.000xg por 15 minutos e liofilizado para concentração em 5 vezes. Para precipitação da lignina o pH do hidrolisado concentrado foi corrigido para 7,0 com CaO e depois para 5,5 com H3PO4. A detoxificação foi realizada com carvão ativado a 2,5% (p/v) por meio de incubação a 30°C, 200rpm por 3 horas. Para remoção do carvão ativado o hidrolisado foi centrifugado a 10.000xg por 15 minutos. Para uso como meio de cultura, o pH foi ajustado para 7,0 com NaOH e esterilizado a 121°C por 30 minutos. A análise da composição do hidrolisado foi feita em cromatógrafo líquido de alta eficiência (High performance liquid chromatography, HPLC).

19/22 [051] O extrato de levedura foi obtido de acordo com Vilela, 2000 (VILELA, E.S.D.; SGARBIERI, V.C.; ALVIM, I.D. Valor nutritivo da biomassa de células íntegras, do autolisado e do extrato de levedura originária de cervejaria. Revista de Nutrição, v.13, n.2, p. 127-134, 2000) .A biomassa de levedura utilizada nos experimentos foi fornecida como suspensão aquosa de células frescas por uma cervejaria. Foi realizada a desamargura por centrifugação a H.OOOxg durante 10 min. Foi realizado o ajuste do pH para 9 com NaOH e posteriormente foi realizada a neutralização com lavagens sucessivas com água destilada. A suspensão de células foi centrifugada e procedeu-se a autólise. Para a autólise, 600g de biomassa de levedura de cervejaria desamargada foram ressuspensos em 4 litros de água destilada e colocada a temperaturas sucessivas de 45, 50, 55 e 60°C. Foi realizada pasteurização a 80°C por 30 minutos, seguida de resfriamento e centrifugação a 1.000xg por 10 minutos. O sobrenadante obtido foi concentrado por liofilização, utilizando liofilizador modelo K105,. Kiotop, para obtenção do extrato de levedura em pó.

[051] Neste exemplo, foi realizado um experimento fatorial fracionado para estudar os fatores e níveis que influenciam nas respostas durante o processo fermentativo em hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba e de extrato da biomassa de leveduras de cervejaria por Meyerozyma caríbbica UFMG08. Utilizouse um delineamento fatorial fracionado 3^Λ(4-1) com 27 unidades experimentais (Statistica 7.0). Os fatores avaliados foram: aeração, concentração do hidrolisado, fonte de nitrogênio e concentração da fonte de nitrogênio. Os níveis de cada fator foram: 1) aeração: 1,0; 2,5; 5,0 (relação volume do frasco e volume do meio); 2) Concentração do hidrolisado (em teor de xilose): 20g/l, 40g/! e 60g/l; 3) Fonte de nitrogênio: extrato de levedura comercial (Himedia), extrato de levedura de cervejaria e ureia; 4) Concentração da fonte de nitrogênio: 0,0g/l; 5,0g/l; 10,0g/l. As respostas analisadas foram: crescimento celular (g//l), produção de etanol (g/l), produtividade em etanol YE/S (g/g), eficiência na produção de etanol QE (g/l.h),

20/22 produção de Xilitol (g/l), produtividade de xilitol YX/S (g/g), eficiência da produção de xilitol QX (g/l.h).

[052] O processo fermentativo com as 27 unidades experimentais foi conduzido em frascos Erlenmeyer de 250ml, densidade celular inicial de 0,28g/l, incubados por 96h a 30°C e 200rpm. Uma alíquota de 1ml foi retirada para posterior avaliação da concentração de etanol, xilitol e açúcares por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

[053] Os dados de crescimento, produção de xilitol e os efeitos dos fatores fonte e concentração de nitrogênio, concentração de xilitol e aeração sobre as respostas produção de xilitol (Xmáx: produção máxima de xilitol, Yp/s: fator de conversão de açúcares em xilitol, Qp: produtividade em xilitol, XRmáx: atividade máxima da enzima xilose redutase) estão apresentadas na tabela 1 e Figuras 1 a 12, onde pode ser observada a influência dos fatores isoladamente e da interação entre os fatores sobre as respostas.

[054] As variadas respostas relacionadas à produção de xilitol foram influenciadas significativamente (p<0,1) pelo fator aeração, isoladamente, e pelas interações dos fatores concentração de xilose no hidrolisado e fonte e concentração da fonte de nitrogênio, aeração e fonte e concentração da fonte de nitrogênio.

[055] A aeração se mostrou o fator mais importante, influenciando tanto no crescimento celular (p=0,096), quanto na produção de xilitol (p-0,1). O aumento da aeração de 1,0 para 2,5 resultou em elevação do crescimento celular e da produção de xilitol. O aumento de 2,5 para 5,0 influenciou a produção de xilitol, mas não induziu um crescimento celular maior que o observado com a aeração de

2,5. O fornecimento de oxigênio é parâmetro chave para determinar se ocorrerá maior crescimento celular ou produção de xilitol. Para um processo eficiente, é necessário determinar a aeração que permitirá a utilização balanceada da fonte de

21/22 carbono tanto para o crescimento celular quanto para a produção de xilitol (KUSMANOVA, 1998).

[056] A concentração de xilose no hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba influenciou principalmente na atividade da enzima xilose redutase, porém apenas em associação com a fonte de nitrogênio (p=0,09).

[057] Foi observado que a produção de xilitol aumenta significativamente com o aumento da concentração de xilose do hidrolisado de 20g/l para 40g/l, porém o aumento para 60g/l não eleva a produção de xilitol, pois o consumo máximo de xilose por M. caríbbica UFMG08 é aproximadamente 43g/l em 96h de cultivo, o que também pode ser observado pelos valores de consumo de açúcares totais que variaram de 90 a 100% quando cultivada em meio contendo 40g/l de xilose e 60 a 75% quando cultivada em meio contendo 60g/l de xilose. Determinar uma concentração máxima inicial de xilose é uma forma de evitar quedas nas taxas de bioconversão.

[058] A fonte de nitrogênio não afetou a produção de xilitol, informação importante para a confirmação do potencial de uso do co-produto hidrolisado de biomassa de cervejaria na produção de xilitol em substituição ao extrato de levedura comercial. No estudo foi observado somente efeito positivo da concentração da fonte de nitrogênio na produção de xilitol (Figura 1).

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Tabela 1: Fatores e respostas do planejamento fatorial fracionado para otimização da fermentação de Meyerozyma caribbica UFMG08 em meio a base de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba.

Fatores Respostas

Ensaio	Aeração (Vfrâscc/Vmeio)	Concentração do hidrolisado (xilose g/l)	Fonte de nitrogênio	Concentração da fonte de nitrogênio (g/i)	Bio- massa (g/i)	XmSx (g/i)	Yp/s (g/g)	Qe (g/i-h)	Y (%)	T (h)
1	1,0	20,0	ELCO	0,0	12,32	12,99	3,82	0,13	60,87	96h
2	1,0	20,0	Uréia	10,0	9,8	11,17	0,19	0,11	64,10	96h
3	1,0	20,0	ELCE	5,0	14,0	8,63	0,74	0,08	80,38	96h
4	1,0	40,0	ELCO	10,0	12,32	14,13	5,21	0,14	79,54	96h
5	1,0	40,0	Ureia	5,0	14,56	15,42	1,72	0,16	81,72	96h
6	1,0	40,0	ELCE	0,0	10,92	8,07	0,22	0,08	79,28	96h
7	1,0	60,0	ELCO	5,0	12,88	12,01	2,57	0,12	76,46	96h
8	1,0	60,0	Ureia	0,0	10,36	10,95	1,19	0,11	74,03	96h
9	1,0	60,0	ELCE	10,0	15,4	7,91	2,61	0,08	80,46	96h
10	2,5	20,0	ELCO	10,0	34,44	9,15	1,93	0,35	96,69	72h
11	2,5	20,0	Ureia	5,0	31,64	11,50	2,07	0,15	98,20	72h
12	2,5	20,0	ELCE	0,0	31,64	12,13	1,27	0,16	96,16	72h
13	2,5	40,0	ELCO	5,0	28,6	9,94	1,00	0,13	97,53	72h
14	2,5	40,0	Ureia	0,0	28,8	10,79	0,59	0,14	95,87	72h
15	2,5	40,0	ELCE	10,0	31,64	7,70	0,41	0,16	92,94	48h
16	2,5	60,0	ELCO	0,0	28,84	9,28	0,19	0,12	96,0	72h
17	2,5	60,0	Ureia	10,0	31,64	10,33	0,35	0,14	96,15	72h
18	2,5	60,0	ELCE	5,0	28,84	11,78	0,72	0,16	96,52	72h
19	5,0	20,0	ELCO	5,0	34,44	27,46	0,71	0,57	68,37	48h
20	5,0	20,0	Ureia	0,0	34,44	36,97	0,78	0,77	60,07	48h
21	5,0	20,0	ELCE	10,0	22,68	45,41	1,55	0,47	89,70	96h
22	5,0	40,0	ELCO	0,0	26,04	51,60	0,62	0,53	72,57	96h
23	5,0	40,0	Ureia	10,0	26,04	41,52	0,79	0,86	64,03	48h
24	5,0	40,0	ELCE	5,0	28,84	45,13	0,86	0,94	71,46	48h
25	5,0	60,0	ELCO	10,0	20,72	48,89	0,18	0,50	75,46	96h
26	5,0	60,0	Ureia	5,0	21,0	43,98	0,94	0,91	62,18	48h
27	5,0	60,0	ELCE	0,0	22,68	46,67	0,46	0,64	63,44	72h

ELCE: Extrato de levedura de cervejaria; ELCO: Extrato de levedura comercial; X_Màx·. concentração máxima de xilitol; Y/wáx(%): consumo máximo de açúcares totais; Biomassa (g/l)·. concentração de células produzidas; Yp/s (g/g): fator de conversão de xilose em xilitol; Qp (g/l.h): produtividade em xilitol.

Claims

REINVIDICAÇÕES

1) PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE XILITOL, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a. Obter o hidrolisado hemicelulósico da torta de macaúba;

b. Precipitar a lignina a partir da torta de macaúba, através dos seguintes passos:

i. Corrigir o pH do conteúdo obtido na etapa “a” para 7,0 com CaO;

ii. Corrigir o pH do conteúdo obtido no passo “i” para 4,5 a 5,5 com H₃PO₄;

iii. Detoxificar 0 conteúdo obtido em “ii” com carvão ativado de 2,0 a 3,0% (p/v), à temperatura de 28 a 30°C, 180 a 200rpm por 3 a 5 horas;

iv. Remover o carvão ativado por centrifugação a 10.000xg por 15 minutos;

v. Ajustar o pH do sobrenadante obtido na etapa “iv” para 7,0 com NaOH;

vi. Esterilizar a 121°C por 15 minutos;

c. Obter o extrato de levedura, co-produto de cervejaria;

d. Obter o xilitol, a partir dos seguintes passos:

i. Cultivar a linhagem de levedura escolhida em meio de cultura apropriado, preferencialmente caldo YPD (glicose 20g/l, peptona 10g/I, extrato de levedura 10g/I) a 180 a 200rpm, 28 a 30°C por aproximadamente 24 horas;

ii. Centrifugar as culturas a 10.000 a 12.000xg e lavar com água destilada estéril;

2/2 iii. Transferir parte das células obtidas para frascos contendo meio à base de hidrolisado hemicelulósico de torta de macaúba, como obtido na etapa “b” (20 a 60g/l de xilose) e extrato de levedura, co-produto de cervejaria (5 a 10g/I), de modo a se obter uma DOeoonm inicial igual a 0,2 a 0,3;

iv. Incubar os frascos a 28 a 30°C, com agitação de 180 a 200rpm, por até 96h;

v. Precipitar o conteúdo e filtrar o sobrenadante;
2) USO DE HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE TORTA DE MACAÚBA (ACROCOMIA ACULEATA), caracterizado por ser em associação a coprodutos de cervejaria, na produção de xilitol, a partir de fermentação.