CN109022326B - 一株产尿素细菌及其应用 - Google Patents

一株产尿素细菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株产尿素细菌及其应用，属于微生物肥料技术领域。所用的产尿素细菌为辣椒芽孢杆菌(Bacillus zanthoxyli)1433菌株，该菌株已于2018年6月14日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号：CCTCC No:M 2018369。本发明的辣椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株在微生物常规培养条件下能产生尿素，其菌体和代谢产物应用于制备微生物肥料中。本发明的有益效果在于：利用1433菌株制备的微生物肥料替代尿素时，对烤烟、番茄的增产率仍在20％以上，具有使用成本低、增产效果好、无残留、对人畜和环境安全的特点。

Description

一株产尿素细菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产尿素细菌及其应用，属微生物肥料技术领域。
背景技术
氮是植物正常生长发育过程中所必需的重要元素，氮肥对粮食增产的贡献率达40％，是农业生产中限制作物产量的主导因素(Jones et al.,2005)。我国绝大部分耕地土壤氮素供应不足，需要不断增施氮肥以保证作物的持续高产(刘春红等，2003)。尿素是目前国际上农业生产中应用最广泛、施用量最大的氮肥品种，约占50％的世界氮肥生产及消费市场。然而，长期过量施用氮肥导致土壤结构恶化、氮肥利用率低，还会出现过量的氮肥以氨挥发、反硝化、淋洗等途径大量流失，既造成巨大的经济损失，又给生态环境和人类健康带来严重的危害(Nosengo，2003)。2015年农业部提出了“一控两减三基本”目标，其中包括到2020年化肥用量要实现零增长；因此，研发和推广新型生物氮肥显得极为重要。
生物源尿素主要来自哺乳动物、两栖动物以及水生浮游生物、鱼类、异养细菌等(Solomon et al,2010)，海洋沉积物中的尿素主要是细菌产生的(Pedersen et al.,1993)。Escherichia coli、Fragilarta crotonensis、Micrococcus denitrificans、Sporosarcina ureae等细菌可产生尿素(Perozich et al.,1998)。辣椒芽孢杆菌(Bacillus zanthoxyli)1433菌株是本发明人等报道的一细菌新物种(Ma et al.,2017)。本发明人在近期的研究中首次发现1433菌株在常规培养基上能产生尿素,对番茄、烤烟等作物具有显著的促进生长的作用，是研发生物肥料的重要菌株，而该细菌的产尿素特性及其在微生物肥料上的应用未见报道。
主要参考文献:
Jones DL,Healey JR,Wilett VB，et.al.Dissolved organic nitrogen uptakeby plants:An important N uptake pathway.Soil Biology and Biochemistry.2005,37:413-423.
Nosengo N.Fertilized to death.Nature,2003，425:894-895.
Pedersen H,Lomstein BA,Blackburn TH.1993.Evidence for bacterial ureaproduction in marine sediments.FEMS Microbiology Ecology,12:51-59.
Perozich J,Hempel J,Morris JS M.1998.Roles of conserved residues inthe arginase family.Biochimica et Biophysica Acta,1382:23-37.
Solomon CM,Collier JL,Berg GM et al.2010.Role of urea in microbialmetabolism in aquatic systems:a biochemical and molecular review.AquaticMicrobial Ecology,59:67-88.
Ma L,Cao YH,Mo MH,et al.2017.Bacillus zanthoxyli sp.nov.,a novelnematicidal bacterium isolated from Chinese red pepper(Zanthoxylum bungeanumMaxim)leaves in China，Antonie van Leeuwenhoek，110:1179-1187.
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种产尿素细菌及其应用。
本发明具体是这样实现的：
本发明人采用细菌传统分离方法，从采自甘肃省陇南市的辣椒叶片上获得了一株细菌1433菌株，鉴定为辣椒芽孢杆菌(Bacillus zanthoxyli)(Ma et al.,2017)。辣椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株已于2018年6月14日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏号：CCTCC No:M 2018369。
辣椒芽孢杆菌1433菌株为革兰氏阳性菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径2-5mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6-0.9μm，长1.2-1.5μm，细胞具游动性。该菌株在4-45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 6.0-10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为7％(W/V)。利用引物5’-GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3’，5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库，其序列号为KX865140，此序列是鉴定该菌株的分子特征依据。1433菌株的主要脂肪酸为异式十五碳饱和脂肪酸，占31.6％，是鉴别该菌的化学特征依据。
本发明的辣椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株在制备微生物肥料中的应用。
本发明的微生物肥料按微生物发酵常规方法及生物肥料制备常规方法制成。
本发明的有益效果在于：
1、利用1433菌株制备的微生物肥料对烟草、番茄等有显著的促进生长效果，作物产量增加达20％以上。
2、利用1433菌株制备的微生物肥料，能高效促进作物生长，具有使用成本低、无残留、对人畜安全的特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详述。实施例中的微生物肥料，按微生物发酵常规方法及微生物肥料制备常规方法制成。
1.1433菌株产尿素测定
尿素含量标准曲线绘制：分别配制质量浓度为20mg/L，50mg/L，100mg/L，200mg/L，300mg/L的尿素水溶液。在棕色比色管中加入5.4ml混合试剂(混合试剂配方：120mg氨基硫脲，125mg Ce(SO4)2·2(NH4)2SO4，55ml浓硫酸，46ml 85％磷酸，380mg 4-安替比林，用去离子水定容至1000ml)，在比色管中分别加入100μL各浓度的尿素水溶液，再加入540μL质量浓度为1.2％的二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，绘制尿素浓度与吸光度间的标准曲线并，求得尿素浓度与吸光度间的换算公式。
1433菌株培养液尿素含量测定：将1433菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、150rpm培养2天，将培养液于8000rpm下离心10min，取上清液用于尿素含量测定。取5.4ml复合试剂于棕色比色管中，加入100μL上清液和540μL1.2％二乙酰一肟水溶液，混匀后100℃水浴8min，之后20℃水浴冷却5min，然后用分光光度计测定溶液在525nm下的吸光度，根据尿素浓度与吸光度间的换算公式求得上清液中的尿素含量；以等体积的牛肉膏蛋白胨液体培养基为对照。
测定结果：根据标准曲线获得尿素浓度(y)与吸光度(x)间的线性关系公式为y＝2672.4x+2.1596(r＝0.9943)。根据此公式，对照牛肉膏蛋白胨培养基中的尿素含量为0，而1433菌株培养液中的尿素含量为327.25mg/L。
2.本发明的1433菌株的培养及微生物肥料制备
1433菌株试管斜面种子培养：将该菌株接种到牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，32℃下培养2天后获得斜面种子。
1433菌株液体种子培养：将斜面种子接种到三角瓶中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，170rpm条件下摇床培养3天获得液体种子。
1433菌株发酵罐大量培养：将液体种子按3％(V/V)的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度150rpm，发酵时间72小时。
1433菌株微生物肥料的制备：经发酵罐培养获得的微生物菌体及其代谢物与适量的硅藻土混合后在65℃以下烘干或晾干至水分含量小于5％，粉碎后制成。需保证1433菌株在菌剂中的活菌数含量在2.5×109个/克以上。
3.本发明的微生物肥料对烤烟的增产效果试验
供试肥料：1433菌株微生物肥料(活菌数含量＝5×109个/克，按本发明上述方法制备)，尿素(N≥46.4％，云南云天化股份有限公司生产)，硫酸钾(K2O≥50％，德国钾盐集团生产)，过磷酸钙(P2O5≥16.0％，云南云天化股份有限公司生产)。
复合微生物肥料：1433菌株微生物肥料:硫酸钾:过磷酸钙＝5:2:1(m:m:m)。
复合化学肥料：硅藻土:尿素:硫酸钾:过磷酸钙＝3:2:2:1(m:m:m:m)。
盆栽试验：烤烟按常规漂浮育苗，待烟苗长至5-6片叶时，用复合微生物肥料或复合化学肥料沾根，2.5克/株，然后移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中。空白对照用硅藻土沾根，2.5克/株。每处理三个重复，每重复5盆，以上各处理的烟苗在温室内随机排列摆放，肥水管理按常规方法进行，60天收获每烟株的所有叶片，65℃烘干至恒重后称重，获得每株烟叶产量并按下列公式计算增产率。
增产率(％)＝(处理的平均株叶重-空白对照的平均株叶重)×100
田间试验：烤烟移栽时，穴施复合微生物肥料或复合化学肥料，5克/株；空白对照穴施硅藻土，5克/株。每处理3个重复，每重复10株，重复间随机排列，肥水管理按常规方法进行。60天收获每株烤烟的所有叶片，65℃烘干至恒重后称重，获得每株烟叶产量并按上述公式计算增产率。
试验结果：从表1看出，施用复合微生物肥料在盆栽试验、田间试验中对烟叶的增产率分别为26.74％和21.35％，而施用复合化学肥料的增产率分别为25.63％和22.33％；施用复合微生物肥料和复合化学肥料对烟叶增产无显著差异，说明1433菌株微生物肥料能够替代尿素在烤烟种植中应用。
表1复合微生物肥料及化学肥料对烤烟烟叶的增产率(％)
Figure BDA0001780031120000041
Figure BDA0001780031120000051
4.本发明的微生物肥料对番茄的增产效果试验
供试肥料：1433菌株微生物肥料(活菌数含量＝5×109个/克，按本发明上述方法制备)，尿素(N≥46.4％，云南云天化股份有限公司生产)，硫酸钾(K2O≥50％，德国钾盐集团生产)，过磷酸钙(P2O5≥16.0％，云南云天化股份有限公司生产)。
复合微生物肥料：1433菌株微生物肥料:硫酸钾:过磷酸钙＝5:2:1(m:m:m)。
复合化学肥料：硅藻土:尿素:硫酸钾:过磷酸钙＝3:2:2:1(m:m:m:m)。
盆栽试验：番茄按常规漂浮育苗，待番茄长至5-6片叶时，用复合微生物肥料或复合化学肥料沾根，2.5克/株，然后移栽于直径15cm、装有500g土壤(沙土:腐殖土＝1:1)的花钵中。空白对照用硅藻土沾根，2.5克/株。每处理三个重复，每重复5盆，以上各处理的番茄在温室内随机排列摆放，肥水管理按常规方法进行，60天收获每株番茄上的所有果实，称重，获得各处理每株番茄果实平均产量并按下列公式计算增产率。
增产率(％)＝(处理的每株果实平均重量-空白的每株果实平均重量)×100
田间试验：番茄移栽时，穴施复合微生物肥料或复合化学肥料，5克/株；空白对照穴施硅藻土，5克/株。每处理3个重复，每重复10株，重复间随机排列，肥水管理按常规方法进行。60天收获每株番茄上的所有果实，称重，获得各处理每株番茄果实产量并按上述公式计算增产率。
试验结果：从表2可以看出，施用复合微生物肥料在盆栽试验、田间试验中对番茄果实的增产率分别为33.25％和29.52％，而施用复合化学肥料的增产率分别为35.61％和31.47％；施用复合微生物肥料对番茄果实的增产率略低于施用复合化学肥料，但1433菌株微生物肥料为生物氮肥，在绿色、有机番茄种植中应用前景巨大。
表2复合微生物肥料及化学肥料对番茄果实的增产率(％)
Figure BDA0001780031120000052

Claims (1)

1.一株保藏号为CCTCC No: M 2018369的辣椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli）1433菌株在制备尿素肥料中的应用。
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