CN116286000A - 枯草芽孢杆菌s16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用及缓解设施甜瓜连作障碍的方法 - Google Patents

枯草芽孢杆菌s16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用及缓解设施甜瓜连作障碍的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及缓解连作障碍技术领域，特别是涉及枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用及缓解设施甜瓜连作障碍的方法。该菌株已于2022年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.1.60036；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该枯草芽孢杆菌S16菌株的菌剂能够在一定程度上提高甜瓜的产量和品质，降低土传病害发病率，活化土壤养分，缓解土壤盐渍化，改善土壤微生物群落，因此能够用于缓解设施甜瓜连作障碍，尤其是能够缓解盐渍化土壤设施甜瓜连作障碍。

Description

枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用及 缓解设施甜瓜连作障碍的方法
技术领域
本发明涉及缓解连作障碍技术领域，特别是涉及枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用及缓解设施甜瓜连作障碍的方法。
背景技术
甜瓜富含蛋白质、维生素、Ca、P、Fe等多种营养成分，具有栽培周期短和适应性强等优点，而且市场需求量大、经济效益显著，是一种重要的水果作物，在世界广泛种植。近年来，随着设施农业的快速发展，甜瓜栽培面积亦不断扩大，我国的甜瓜种植面积和年产量均居世界首位。在我国北方地区，以日光温室和塑料大棚为主的春提前栽培和秋延后栽培取得了较好的经济效益，是当前设施甜瓜的主要栽培模式。然而，农户为了获得更高的经济效益，通常采用连作的方式进行规模化栽培，但常年连续单一种植甜瓜导致土壤中有益的微生物不断减少，有害的病原菌积累过多以及土壤次生盐渍化加重等问题，并且随着连作年限的增加，甜瓜植株长势变弱，甜瓜品质与产量急剧下降。日益严重的连作障碍已成为制约其可持续生产的瓶颈之一。
土壤盐渍化是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到土壤表层，从而导致土壤表层的盐分大量积累，我国沿海地区蒸发强烈、地下水矿化度高、水位埋深浅，极易形成盐渍土，相较于传统的农业措施和化学防治，利用微生物菌剂解决连作障碍问题具有节约能源、持久性强、环境友好等特点，集经济、环境和生态效益于一身，但目前利用微生物菌剂解决连作障碍的技术主要针对正常土壤。因此，如何缓解盐渍化土壤条件下的作物连作障碍有待深入研究。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用及缓解设施甜瓜连作障碍的方法。经研究发现，该枯草芽孢杆菌S16菌株的菌剂能够在一定程度上提高甜瓜的产量和品质，降低土传病害发病率，活化土壤养分，缓解土壤盐渍化，改善土壤微生物群落，从而能够用于缓解设施甜瓜连作障碍。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用。该枯草芽孢杆菌S16菌株从甜瓜种植地土壤中分离得到，其分类名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，于2022年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.1.60036；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该枯草芽孢杆菌S16菌株的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示：
TCGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGA AGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT。
经试验研究发现，枯草芽孢杆菌S16菌剂能够降低盐渍化土壤的电导率，对土壤盐渍化现象具有一定的缓解作用；对于在正常土壤和盐渍化土壤中设施化连作的甜瓜均能促进幼苗生长，提高植株株高和茎粗，并能提高甜瓜产量和品质；对于甜瓜枯萎病有明显的防效，特别是对于甜瓜枯萎病发病严重的设施连作甜瓜，该防效更为显著；对于设施化连作甜瓜的正常土壤和盐渍化土壤，均能够增加速效磷和速效钾养分含量，提高土壤细菌群落丰富度指数，增加具有促生和拮抗病原菌功能的有益菌的相对丰度，改善土壤细菌群落组成，还能增加土壤真菌群落中有益拮抗菌属的相对丰度并同时降低有害病原菌属的相对丰度。因此，枯草芽孢杆菌S16能够用于缓解设施甜瓜连作障碍，尤其是能够缓解盐渍化土壤设施甜瓜连作障碍。
结合第一方面，所述应用为通过降低盐渍化土壤电导率、促进甜瓜生长、防治甜瓜枯萎病、提高速效磷和速效钾含量、增加具有促生和拮抗病原菌功能的有益菌的相对丰度、增加土壤真菌群落中有益拮抗菌属的相对丰度以及降低有害病原菌属的相对丰度中的至少一种方式缓解设施甜瓜连作障碍。
第二方面，本发明还提供一种缓解设施甜瓜连作障碍的方法，在种植甜瓜前和定植后，向土壤中接种枯草芽孢杆菌S16菌株的菌剂。
优选地，在种植甜瓜前以沟施的方式接种所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂。
优选地，所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂的制备方法为：
将枯草芽孢杆菌S16菌株接种在LB固体培养基中活化12～16h，然后接种至LB液体培养基中30℃～37℃摇瓶培养12～16h得到种子液，将所述种子液按照5％～7％的接种量接种到发酵培养基中继续发酵培养24～36h，得发酵液；其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖1.5％～1.7％，淀粉0.5％～0.6％，玉米粉3％～4％，硫酸锰0.2％～0.3％，硫酸铵1.5％～1.7％，硫酸镁0.2‰～0.3‰，磷酸二氢钾0.2‰～0.3‰和氯化钙0.1％～0.2％，初始pH为7.0～7.5，发酵温度30℃～35℃；
将所述发酵液经离心机离心浓缩，得浓缩液，将所述浓缩液喷洒到载体，在15～30℃造粒并烘干，即得所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂。
优选地，所述载体为质量比为1:1:2～1.5:1:2的玉米秸秆粉、草炭和腐殖酸的混合物。
优选地，在定植后，以灌根的方式接种所述枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂。
优选地，所述枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂的制备方法为：
将枯草芽孢杆菌S16菌株接种在LB固体培养基中活化12～16h，然后接种至LB液体培养基中30℃～37℃摇瓶培养12～16h得到种子液，将种子液按照5％～7％的接种量转接于发酵培养基中继续发酵培养24～36h，即得所述枯草芽孢杆菌S16液体菌剂；其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖1.5％～1.7％，淀粉0.5％～0.6％，玉米粉3％～4％，硫酸锰0.2％～0.3％，硫酸铵1.5％～1.7％，硫酸镁0.2‰～0.3‰，磷酸二氢钾0.2‰～0.3‰和氯化钙0.1％～0.2％，初始pH为7.0～7.5，发酵温度30℃～35℃。
优选地，所述方法具体包括以下操作：
S1、种植前15～20天，在待种植甜瓜的设施大棚内施入有机肥并进行耕翻整地，5～7天后施入复合肥再进行耕翻整地；
S2、种植前4～6天开沟起垄，向沟内撒入枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂；
S3、将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，浇定植水后，施用枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂；
S4、生长期追肥并进行病虫害防治。
该方法能够在一定程度上提高甜瓜的产量和品质，降低土传病害发病率，活化土壤养分，改善土壤微生物群落，具有较好的生态效益和经济效益。
优选地，S1中所述有机肥为腐熟牛粪，用量为4～6方/亩。
优选地，S1中所述复合肥养分含量为氮元素、磷元素(以P2O5计)、钾元素(以K2O计)的含量均为140～160g/kg，用量为50～55kg/亩。
优选地，S1中耕翻的深度不低于20cm。
优选地，S2中所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂中枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数≧1×108CFU/g，用量为8～12kg/亩，在甜瓜种植之前均匀撒施入沟内。
优选地，S3中所述枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂中枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数≧2×108CFU/g，用量为4～5L/亩。
优选地，S4中的追肥以钾含量高的水溶速效复合肥为主。
优选地，S4中所述病虫害防治的方法为以粘虫板粘虫。
本发明的有益效果在于：通过在种植甜瓜前和定植后施用枯草芽孢杆菌S16菌株的菌剂，可以提高盐渍化土壤或正常土壤条件下甜瓜产量和品质，降低甜瓜枯萎病发病率，改善土壤化学性状，增加土壤微生物多样性，改善土壤微生物群落组成，从而达到提质增产，缓解设施甜瓜连作障碍的目的。
附图说明
图1为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤电导率(EC)的影响；
图2为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤中速效磷含量的影响；
图3为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤中速效钾含量的影响；
图4为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤pH的影响；
图5为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对青县地区甜瓜棚室土壤细菌水平群落组成的影响；
图6为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对青县地区甜瓜棚室土壤真菌门水平群落组成的影响；
图7为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对青县地区甜瓜棚室土壤中优势细菌属相对丰度的影响；
图8为实施例1中枯草芽孢杆菌S16菌剂对青县地区甜瓜棚室土壤中优势真菌属相对丰度的影响；
图9为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤pH的影响；
图10为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤电导率(EC)的影响；
图11为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤中速效磷含量的影响；
图12为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤中速效钾含量的影响；
图13为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对廊坊地区甜瓜棚室土壤细菌水平群落组成的影响；
图14为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对廊坊地区甜瓜棚室土壤真菌门水平群落组成的影响；
图15为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对廊坊地区甜瓜棚室土壤中优势细菌属相对丰度的影响；
图16为实施例2中枯草芽孢杆菌S16菌剂对廊坊地区甜瓜棚室土壤中优势真菌属相对丰度的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中所采用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
以下实施例中所采用的原料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1
本发明实施例提供了枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解盐渍化土壤设施甜瓜连作障碍中的应用。
1、土壤情况及分组
本实施例实验于2020年1月在河北省沧州市青县齐营村的根枝叶蔬菜种植专业合作社(116°44′19”E，38°32′6”N)展开，甜瓜温室已连作13年。由于青县地区东临渤海，故土壤有轻度盐渍化现象，土壤质地为中壤土，土壤盐分和基本理化性质见表1和表2，甜瓜品种为羊角脆‘吉星61’。
表1土壤水溶性盐分含量特征
Figure BDA0004085648920000071
表2土壤基本理化性质
Figure BDA0004085648920000072
试验共设2个处理，具体如表3所示，每个处理3个重复，即6个小区，每个小区6行，每个小区随机排列。温室面积为100×14＝1400m2，每个小区面积为14×5.4＝75.6m2。
表3试验处理
Figure BDA0004085648920000081
2、具体的缓解设施甜瓜连作障碍的方法如下：
BS组：
(1)种植前20天，甜瓜温室内每亩施入5方腐熟牛粪进行耕翻整地，翻地深度不低于20cm，5天后施入N-P2O5-K2O＝15-15-15的复合肥(即氮元素、磷元素(以P2O5计)、钾元素(以K2O计)的含量均为150g/kg)再进行耕翻整地，复合肥施用量为50kg/亩。
(2)枯草芽孢杆菌S16固体菌剂在定植前5天开沟后，均匀撒施在沟内，用量为10kg/亩；
枯草芽孢杆菌S16固体菌剂的制备方法为：
①将枯草芽孢杆菌S16菌株接种在LB固体培养基中活化14h，接种至LB液体培养基中30℃摇瓶培养14h得到种子液，将种子液按照5％的接种量接种到装有发酵培养基的发酵种子罐中继续发酵培养30h，得发酵液；发酵培养基成分：葡萄糖1.5％，淀粉0.5％，玉米粉3％，硫酸锰0.2％,硫酸铵1.5％，硫酸镁0.2‰，磷酸二氢钾0.3‰和氯化钙0.1％，装液量100mL/500ML，初始pH为7.0-7.5，发酵温度32℃；
②将发酵液经离心机离心后，得枯草芽孢杆菌S16浓缩液，将该浓缩液喷洒到已充分按比例混合好的复合载体(质量比为1:1:2的玉米秸秆粉、草炭和腐殖酸混合物)上，在低温条件(15℃～30℃)下造粒并烘干。经检测菌剂的各项指标均达到国家标准(GB20287)后，分筛得到枯草芽孢杆菌S16固体菌剂，枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数为1×108CFU/g。
(3)将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，行距0.8m，株距25cm，每行约种50棵。定植当天浇完定植水后，将枯草芽孢杆菌S16液体菌剂兑水稀释60倍后在距离甜瓜主根系5cm位置处，以甜瓜主根系为圆心，围绕甜瓜主根系画圆均匀浇灌一圈，每棵施用100mL。枯草芽孢杆菌S16液体菌剂的制备方法同制备枯草芽孢杆菌S16固体菌剂的步骤①，枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数为2×108CFU/g。
(4)生长期追施N-P2O5-K2O＝13-7-20的水溶肥(即氮元素的含量为130g/kg，磷元素以P2O5计含量为70g/kg，钾元素以K2O计含量为200g/kg)，随水滴灌共施五次，每次用量为10kg/亩。病虫害防控以粘虫板粘虫。
CK组：
(1)种植前20天，甜瓜温室内每亩施入5方腐熟牛粪进行耕翻整地，翻地深度不低于20cm，5天后施入N-P2O5-K2O＝15-15-15的复合肥(即氮元素、磷元素(以P2O5计)、钾元素(以K2O计)的含量均为150g/kg)再进行耕翻整地，复合肥施用量为50kg/亩。
(2)开沟后，将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，行距0.8m，株距25cm，每行约种50棵。
(3)生长期追施N-P2O5-K2O＝13-7-20的水溶肥(即氮元素的含量为130g/kg，磷元素以P2O5计含量为70g/kg，钾元素以K2O计含量为200g/kg)，随水滴灌共施五次，每次用量为10kg/亩。病虫害防控以粘虫板粘虫。
3、实验结果
(1)枯草芽孢杆菌S16菌剂对连作甜瓜土壤电导率的影响
土壤样品于施用枯草芽孢杆菌S16液体菌剂后1、10、20天以及收获后采集。每个小区按“S”型采样法随机选取5个点，在去除表面土壤后，用直径2.5cm的不锈钢土钻采集0～5cm土壤样品带回实验室置于通风阴凉处风干后，用于土壤电导率(EC)的测定。
如图1所示，与CK相比，菌剂施用后20天以及甜瓜收获后(20d，220d)，显著降低了土壤EC值，20天降低了1.97％，220天降低了3.68％(*表示与CK组相比，P＜0.05)，说明枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤盐渍化现象具有一定的缓解作用。
(2)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜生长的影响
甜瓜定植后第10天和第20天，采用直尺和游标卡尺测量甜瓜植株的株高与茎粗，并于甜瓜第一次收获至最后一次收获，详细记录每次采摘的甜瓜产量并最终计算其生育期总产量。
从表4中可以看出，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂均可以一定程度上促进甜瓜幼苗生长。菌剂施用后20天，枯草芽孢杆菌S16菌剂处理分别显著提高了甜瓜植株株高和茎粗9.03％和7.31％，显著提高了甜瓜产量17.3％。
表4施用微生物菌剂对甜瓜生长的影响
Figure BDA0004085648920000101
注：*表示与CK组相比，P＜0.05；**表示与CK组相比，P＜0.01。
(3)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜品质的影响
甜瓜收获时取甜瓜果实样品，测定甜瓜果形指数、维生素C和可溶性糖含量。结果表明(表5)，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂显著改善了甜瓜的品质。在外观品质方面，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂提高了果形指数1.62％，在果实品质方面，枯草芽孢杆菌S16菌剂处理显著提高了果实维生素C含量16.8％，可溶性糖含量4.92％。
表5施用微生物菌剂对甜瓜果实及产量的影响
Figure BDA0004085648920000102
注：*表示与CK组相比，P＜0.05；**表示与CK组相比，P＜0.01。
(4)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜枯萎病的影响
在对甜瓜枯萎病的防治效果方面(表6)，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜枯萎病的防治效果为59.4％。枯草芽孢杆菌S16菌剂处理分别降低了甜瓜枯萎病的发病率和病情指数50％和53.4％，但无显著影响，这可能与该棚室中甜瓜枯萎病的发病率整体偏低有关。
表6施用微生物菌剂对甜瓜枯萎病的防效
Figure BDA0004085648920000111
(5)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜土壤化学性质的影响
土壤样品于枯草芽孢杆菌S16液体菌剂施用后1，10，20天以及收获后采集。每个小区每个小区按“S”型采样法随机选取5个点，在去除表面土壤后，用直径2.5cm的不锈钢土钻采集0～5cm土壤样品带回实验室置于通风阴凉处风干后，用于土壤化学性质的测定。
土壤化学性质的测定参照鲍士旦的《土壤农化分析》。土壤pH采用pH计测定(水土比为1:1)；土壤有效磷(AP)采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；土壤有效钾(AK)采用醋酸铵浸提-火焰光度计法测定。
土壤中速效磷钾含量在一定程度上代表土壤肥力状况，枯草芽孢杆菌S16菌剂施用后显著增加了甜瓜收获后(220d)土壤中速效磷和速效钾养分含量，增幅分别为7.10％和23.56％(如图2、图3所示)。此外，菌剂施用后20天时BS处理还显著提高了土壤速效钾养分含量9.81％(如图3所示)。枯草芽孢杆菌菌剂对连作甜瓜棚室土壤pH无显著影响(如图4所示)。
(6)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜棚室土壤微生物群落多样性的影响
分别于枯草芽孢杆菌S16液体菌剂施用后第1，10，20天后用不锈钢土钻采集0～5cm土壤样品。各小区按照“S”型采样法，随机选取5个采样点取土，并混合成一个土壤样品，立即放入冰盒。样品带回实验室后，将新鲜的土壤样品进一步混匀，去除土壤中的杂物，并保存于-80℃用于提取土壤DNA，后续主要用于分析施用枯草芽孢杆菌对土壤微生物群落多样性、组成以及结构的影响。
土壤微生物DNA提取以及高通量测序：
根据
Figure BDA0004085648920000121
DNA试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA)说明书上的操作步骤，准确称取0.5g土壤样品，提取土壤DNA，并对所有DNA样品的浓度和质量进行检测。将提取的DNA样品保存于-80℃备用。
土壤细菌群落采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)对细菌16S rRNA进行扩增，扩增区为V4～V5区；土壤真菌群落采用引物SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)对真菌18S rRNA进行扩增。PCR扩增条件为：95℃变性30min，27个循环包括55℃退火30s，72℃延伸45s，最终72℃延伸10min。PCR过程反应体系为：4.00μL5×FastPfu Buffer，2.00μL dNTPs(2.50mM)，0.80μL正向和反向引物，0.40μL FastPfuDNA聚合酶，1.00μL DNA模板(10.0ng/μl)，最终用无菌超纯水补充至20.0μL。
在土壤细菌群落分析中，一共获得了662 744条高质量细菌序列，每个样品的序列数为30 669～45 467条，平均长度为419bp。在土壤真菌群落分析中，一共获得了1 273 849条高质量真菌序列，每个样品的序列数为66 010～74 540条，平均长度为243bp。
与CK相比，BS处理在第10天和20天时显著提高了土壤细菌群落丰富度(ACE)指数，增幅分别为9.17％和9.95％，但是对多样性(Shannon)指数无显著影响(表7)。此外，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂对土壤真菌群落多样性无显著影响。说明，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂可以提高土壤细菌群落丰富度指数。
表7枯草芽孢杆菌对土壤细菌、真菌群落多样性的影响
Figure BDA0004085648920000122
Figure BDA0004085648920000131
注：*表示与CK组相比，P＜0.05。
(7)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜棚室土壤微生物群落组成的影响
土壤细菌和真菌群落中优势菌门的相对丰度如图5、图6所示。
在土壤细菌群落中，主要的优势菌门为：变形菌门(Proteobacteria)(22.3％～28.6％)、放线菌门(Actinobacteria)(19.2％～29.1％)、厚壁菌门(Firmicutes)(9.64％～18.0％)、绿弯菌门(Chloroflexi)(8.35％～11.6％)、酸杆菌门(Acidobacteria)(5.21％～10.9％)，主要的细菌门的相对丰度占细菌总群落的75％以上；其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)(4.50％～11.8％)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(2.97％～5.00％)和粘球菌门(Myxococcota)(1.05％～1.97％)(图5)。施用枯草芽孢杆菌S16菌剂后，土壤中优势菌门Actinobacteria和Firmicutes发生了显著变化。与CK相比，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂后第1和20天时，分别显著提高了Actinobacteria的相对丰度47.5％和29.7％；在施用枯草芽孢杆菌S16菌剂后第1和10天时，分别显著提高了Firmicutes的相对丰度46.0％和86.9％。
在土壤细菌群落属水平组成上，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂改变了细菌群落中一些有益菌属的相对丰度(图7)。菌剂施用后20天内(1d，10d，20d)，BS处理显著提高了厚壁菌门中的芽孢杆菌属(Bacillus)(5.43％～11.8％)的相对丰度，增幅为19.3％～160％，其中在第10天时增幅最大，为160％(P<0.05)。相似的，菌剂施用后20天内(1d，10d，20d)，BS处理显著提高了具有促生和拮抗功能的放线菌门中链霉菌属(Streptomyces)(0.84％～3.14％)和厚壁菌门中类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(0.46％～1.49％)的相对丰度，增幅分别为99.2％～201％和99.1％～113％。另外，菌剂施用后10天内(1d，10d)还显著提高了变形菌门中假单胞菌属(Pseudomonas)(0.39％～2.92％)、溶杆菌属(Lysobacter)(0.56％～2.41％)以及放线菌门中谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter)(0.77％～2.26％)的相对丰度，增幅分别149％～194％、95.3％～116％和120％～247％，而这些菌属都具有抗病功能。说明在青县甜瓜棚室土壤中，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂可以促进土壤中具有促生和拮抗病原菌功能的有益微生物生长，从而改善土壤群落组成。
在真菌群落中，主要的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)(83.8％～96.0％)，其相对丰度占整个真菌群落的83.0％以上，其次为被孢霉菌门(Mortierellomycota)(3.29％～14.9％)，担子菌门(Basidiomycota)(0.01％～0.18％)和罗兹菌门(Rozellomycota)(0.00％～0.20％)(图6)。施用枯草芽孢杆菌S16菌剂虽然未显著影响土壤真菌群落中主要优势菌门的相对丰度，然而却改变了主要优势菌属的相对丰度，这些菌属均属于子囊菌门(图8)。与CK相比，菌剂施用后20天内(1d，10d，20d)，BS处理显著增加了具有拮抗功能的毛壳菌属(Chaetomium)(38.6％～65.3％)和枝顶孢菌属(Acremonium)(5.07％～30.0％)的相对丰度，增幅分别为25.0％～41.3％和57.4％～164％，同时降低了枯萎病病原菌尖孢镰刀菌属(Fusarium)(0.10％～0.78％)的相对丰度，降幅为62.7％～92.3％。此外，在菌剂施用后10天内(1d，10d)，菌剂处理还显著降低了病原菌属腐质霉属(Humicola)(0.28％～5.74％)和新赤壳属(Neocosmospora)(0.05％～3.19％)的相对丰度，降幅分别为80.9％～85.0％和80.8％～98.4％。说明在青县地区甜瓜棚室土壤中，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂可以增加土壤真菌群落中有益拮抗菌属的相对丰度，同时还可以降低有害病原菌属的相对丰度。
实施例2
本发明实施例提供了枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解盐渍化土壤设施甜瓜连作障碍中的应用。
1、土壤情况及分组
本实施例实验于2020年4月在河北廊坊市孟村甜瓜大棚(116°35′25”E，38°32′52”N)展开，甜瓜温室已连作23年，该大棚与实施例1相比，所种甜瓜品种为网纹厚皮甜瓜‘西州蜜17号’，且该大棚甜瓜枯萎病发病严重，土壤基本理化性质见表8。
表8土壤基本理化性质
Figure BDA0004085648920000151
试验处理与实施例1的试验处理一样，见表9。每个处理3个重复，即6个小区，每个小区6行，每个小区随机排列。每个小区面积为50×4.2＝210m2。
表9试验处理
Figure BDA0004085648920000152
2、具体的缓解设施甜瓜连作障碍的方法如下：
BS组：
(1)种植前20天，甜瓜温室内每亩施入5方腐熟牛粪进行耕翻整地，翻地深度不低于20cm，5天后施入N-P2O5-K2O＝15-15-15的复合肥(即氮元素、磷元素(以P2O5计)、钾元素(以K2O计)的含量均为150g/kg)再进行耕翻整地，复合肥施用量为50kg/亩。
(2)枯草芽孢杆菌S16固体菌剂在定植前5天开沟后，均匀撒施在沟内，用量为10kg/亩；枯草芽孢杆菌S16固体菌剂的制备方法同实施例1。
(3)将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，行距0.7m，株距50cm，每行约种100棵。定植当天浇完定植水后，将枯草芽孢杆菌S16液体菌剂兑水稀释40倍后在距离甜瓜主根系5cm位置处，以甜瓜主根系为圆心，围绕甜瓜主根系画圆均匀浇灌一圈，每棵施用100mL。枯草芽孢杆菌S16液体菌剂的制备方法同实施例1，枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数为2×108CFU/g。
(4)生长期追施N-P2O5-K2O＝15-5-25的水溶肥(即氮元素的含量为150g/kg，磷元素以P2O5计含量为50g/kg，钾元素以K2O计含量为250g/kg)，随水滴灌共施2次，每次用量为20kg/亩。,病虫害防控以粘虫板粘虫。
CK组：
(1)种植前20天，甜瓜温室内每亩施入5方腐熟牛粪进行耕翻整地，翻地深度不低于20cm，5天后施入N-P2O5-K2O＝15-15-15的复合肥(即氮元素、磷元素(以P2O5计)、钾元素(以K2O计)的含量均为150g/kg)再进行耕翻整地，复合肥施用量为50kg/亩。
(2)开沟后，将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，行距0.7m，株距50cm，每行约种100棵。
(3)生长期追施N-P2O5-K2O＝15-5-25的水溶肥(即氮元素的含量为150g/kg，磷元素以P2O5计含量为50g/kg，钾元素以K2O计含量为250g/kg)，随水滴灌共施2次，每次用量为20kg/亩。病虫害防控以粘虫板粘虫。
3、实验结果
(1)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜生长的影响
甜瓜定植后第10天和第20天，采用直尺和游标卡尺测量甜瓜植株的株高与茎粗，并于甜瓜第一次收获至最后一次收获，详细记录每次采摘的甜瓜产量并最终计算其生育期总产量。
从表10中可以看出，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂均可以一定程度上促进甜瓜幼苗生长。菌剂施用后20天，BS处理分别显著提高了甜瓜植株株高和茎粗10.5％和7.46％，显著提高了甜瓜产量22.6％。
表10施用微生物菌剂对甜瓜生长的影响
Figure BDA0004085648920000161
注：*表示与CK组相比，P＜0.05
(2)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜品质的影响
甜瓜收获时取甜瓜果实样品，测定甜瓜果形指数、维生素C和可溶性糖含量。结果表明(表11)，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂均显著改善了甜瓜的品质。在外观品质方面，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂提高了果形指数18.6％，在果实品质方面，枯草芽孢杆菌S16菌剂处理显著提高了果实维生素C含量13.3％，提高了果实可溶性糖含量3.37％。
表11施用微生物菌剂对甜瓜果实及产量的影响
Figure BDA0004085648920000171
注：**表示与CK组相比，P＜0.01。
(3)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜枯萎病的影响
在对甜瓜枯萎病的防治效果方面(表12)，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂显著降低了廊坊地区甜瓜枯萎病发病率以及枯萎病病情指数，降低幅度分别为55.6％和54.6％，菌剂对甜瓜枯萎病的防治效果为54.6％。
表12施用微生物菌剂对甜瓜枯萎病的防效
Figure BDA0004085648920000172
注：*表示与CK组相比，P＜0.05。
(4)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜土壤化学性质的影响
土壤样品于枯草芽孢杆菌S16液体菌剂施用后1，10，20天以及收获后采集。每个小区每个小区按“S”型采样法随机选取5个点，在去除表面土壤后，用直径2.5cm的不锈钢土钻采集0～5cm土壤样品带回实验室置于通风阴凉处风干后，用于土壤化学性质的测定。
土壤化学性质的测定参照鲍士旦的《土壤农化分析》。土壤pH采用pH计测定(水土比为1:1)；电导率(EC)采用电导率仪测定(水土比为1:5)；土壤有效磷(AP)采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定；土壤有效钾(AK)采用醋酸铵浸提-火焰光度计法测定。
结果表明，枯草芽孢杆菌S16菌剂施用后同样显著增加了土壤速效磷钾养分含量(图9～图12)。其中，在菌剂施用后第10天和甜瓜收获后显著提高了土壤速效磷养分含量12.99％和13.35％，在第20天时显著提高了土壤速效钾养分含量4.82％。此外，施用菌剂对甜瓜土壤pH及EC均无显著影响。
(5)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜棚室土壤微生物群落多样性的影响
分别于枯草芽孢杆菌S16液体菌剂施用后第1，10，20天后用不锈钢土钻采集0～5cm土壤样品。各小区按照“S”型采样法，随机选取5个采样点取土，并混合成一个土壤样品，立即放入冰盒。样品带回实验室后，将新鲜的土壤样品进一步混匀，去除土壤中的杂物，并保存于-80℃用于提取土壤DNA，后续主要用于分析施用枯草芽孢杆菌对土壤微生物群落多样性、组成以及结构的影响。
土壤微生物DNA提取以及高通量测序方法同实施例1。
在土壤细菌群落分析中，一共获得了703 757条高质量细菌序列，每个样品的序列数为32 348～46 775条，平均长度为417bp。在土壤真菌群落分析中，一共获得了1 008 477条高质量真菌序列，每个样品的序列数为38 989～71 421条，平均长度为244bp。
与CK相比，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂处理在第1天和10天时显著提高了土壤细菌群落丰富度(ACE)指数，增幅分别为10.2％和7.14％，但是对多样性(Shannon)指数无显著影响(表13)。在真菌群落中，菌剂施用后第1天显著提高了土壤Shannon指数34.4％，对ACE指数无显著影响。说明，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂可以提高土壤细菌群落多样性指数。
表13枯草芽孢杆菌对土壤细菌、真菌群落多样性的影响
Figure BDA0004085648920000181
Figure BDA0004085648920000191
注：*表示与CK组相比，P＜0.05；**表示与CK组相比，P＜0.01。
(6)枯草芽孢杆菌S16菌剂对甜瓜棚室土壤微生物群落组成的影响
土壤细菌和真菌群落中优势菌门的相对丰度如图13、14所示。
在土壤细菌群落中，主要的优势菌门为：放线菌门(Actinobacteria)(25.1％～34.5％)、变形菌门(Proteobacteria)(20.5％～26.2％)、厚壁菌门(Firmicutes)(7.58％～15.6％)、绿弯菌门(Chloroflexi)(9.46％～10.6％)、酸杆菌门(Acidobacteria)(5.93％～13.2％)，主要的细菌门的相对丰度占细菌总群落的82％以上；其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)(3.48％～4.70％)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(2.29％～3.00％)和粘球菌门(Myxococcota)(1.31％～2.17％)(图13)。枯草芽孢杆菌施用后10和20天时，分别显著提高了优势菌门Firmicutes的相对丰度52.6％和54.6％。
在细菌群落属水平组成上，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂显著增加了土壤细菌群落中一些有益菌属的相对丰度(图15)。与CK相比，在菌剂施用后20天内(1d，10d，20d)，BS处理显著提高了厚壁菌门中的芽孢杆菌属(Bacillus)(1.92％～3.89％)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(0.43％～1.01％)的相对丰度，增幅分别为68.2％～131％和54.9％～134％，同时还增加了变形菌门中溶杆菌属(Lysobacter)(1.18％～3.89％)的相对丰度36.9％～99.6％。此外，施用菌剂处理还显著增加了第1天和10天时放线菌门中节杆菌属(Arthrobacter)(3.16％～7.45％)以及第1和20天时变形菌门中假单胞菌属(Pseudomonas)(0.20％～1.58％)的相对丰度，增幅分别为87.1％～124％和55.3％～145％。说明在廊坊地区甜瓜棚室土壤中，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂可以促进土壤中具有促生和拮抗病原菌功能的有益细菌生长。
在真菌群落中，主要的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)(61.0％～79.9％)，其相对丰度占整个真菌群落的61.0％以上，其次为被孢霉菌门(Mortierellomycota)(11.5％～26.6％)，担子菌门(Basidiomycota)(5.80％～11.0％)和壶菌门(Chytridiomycota)(0.01％～1.00％)(图14)。施用枯草芽孢杆菌显著改变了土壤中优势菌门Ascomycota和Mortierellomycota的相对丰度。与CK相比，在菌剂施用1d时，Ascomycota的相对丰度显著降低了23.7％，而菌剂施用后1和10天时Mortierellomycota的相对丰度分别增加了92.0％和99.7％。
施用菌剂也改变了主要优势真菌属的相对丰度(图16)。与CK相比，菌剂施用后20天内(1d，10d，20d)，BS处理显著提高了具有拮抗功能的子囊菌门中毛壳菌属(Chaetomium)(18.5％～43.1％)和被孢霉菌门中被孢霉菌属(Mortierella)(6.67％～23.3％)的相对丰度，增幅分别为20.9％～57.4％和78.1％～106％。此外，在施菌后10天内(1d，10d)，施用菌剂处理还显著降低了病原菌属瓶毛壳属(Lophotrichus)(8.19％～46.1％)和赤霉菌属(Gibberella)(0.00％～0.64％)的相对丰度，降幅分别为37.7％～82.2％和55.6％～96.2％。说明在廊坊地区甜瓜棚室土壤中，施用枯草芽孢杆菌S16菌剂在增加土壤真菌群落中有益拮抗菌属的同时，还可以降低有害病原菌属的相对丰度。
实施例3
本发明实施例提供了一种缓解设施甜瓜连作障碍的方法：
(1)种植前17天，甜瓜温室内每亩施入4方腐熟牛粪进行耕翻整地，翻地深度不低于20cm，7天后施入N-P2O5-K2O＝15-15-15的复合肥(即氮元素、磷元素(以P2O5计)、钾元素(以K2O计)的含量均为160g/kg)再进行耕翻整地，复合肥施用量为50kg/亩。
(2)枯草芽孢杆菌S16固体菌剂在定植前6天开沟后，均匀撒施在沟内，用量为8kg/亩；
枯草芽孢杆菌S16固体菌剂的制备方法为：
①将枯草芽孢杆菌S16菌株接种在LB固体培养基中活化12h，接种至LB液体培养基中32℃摇瓶培养16h得到种子液，将种子液按照7％的接种量接种到装有发酵培养基的发酵种子罐中继续发酵培养24h，得发酵液；发酵培养基成分：葡萄糖1.7％，淀粉0.6％，玉米粉4％，硫酸锰0.3％,硫酸铵1.7％，硫酸镁0.3‰，磷酸二氢钾0.2‰和氯化钙0.2％，装液量100mL/500ML，初始pH为7.0-7.5，发酵温度30℃；
②将发酵液经离心机离心后，得枯草芽孢杆菌S16浓缩液，将该浓缩液喷洒到已充分按比例混合好的复合载体(质量比为1.5:1:2的玉米秸秆粉、草炭和腐殖酸混合物)上，在低温条件(15℃～30℃)下造粒并烘干。经检测菌剂的各项指标均达到国家标准(GB20287)后，分筛得到枯草芽孢杆菌S16固体菌剂，枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数为1.5×108CFU/g。
(3)将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，行距0.8m，株距25cm。定植当天浇完定植水后，将枯草芽孢杆菌S16液体菌剂兑水稀释后(稀释倍数根据枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数进行折算，使枯草芽孢杆菌S16液体菌剂的施用量相当于5L/亩)在距离甜瓜主根系5cm位置处，以甜瓜主根系为圆心，围绕甜瓜主根系画圆均匀浇灌一圈，每棵施用100mL。枯草芽孢杆菌S16液体菌剂的制备方法同制备枯草芽孢杆菌S16固体菌剂的步骤①，枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数为2×108CFU/g。
(4)生长期追施N-P2O5-K2O＝13-5-23的水溶肥(即氮元素的含量为130g/kg，磷元素以P2O5计含量为50g/kg，钾元素以K2O计含量为230g/kg)，随水滴灌共施3次，每次用量为10kg/亩。病虫害防控以粘虫板粘虫。
实施例4
本发明实施例提供了一种缓解设施甜瓜连作障碍的方法：
(1)种植前15天，甜瓜温室内每亩施入6方腐熟牛粪进行耕翻整地，翻地深度不低于20cm，5天后施入N-P2O5-K2O＝15-15-15的复合肥(即氮元素、磷元素(以P2O5计)、钾元素(以K2O计)的含量均为140g/kg)再进行耕翻整地，复合肥施用量为55kg/亩。
(2)枯草芽孢杆菌S16固体菌剂在定植前4天开沟后，均匀撒施在沟内，用量为12kg/亩；
枯草芽孢杆菌S16固体菌剂的制备方法为：
①将枯草芽孢杆菌S16菌株接种在LB固体培养基中活化16h，接种至LB液体培养基中37℃摇瓶培养12h得到种子液，将种子液按照5％的接种量接种到装有发酵培养基的发酵种子罐中继续发酵培养36h，得发酵液；发酵培养基成分：葡萄糖1.5％，淀粉0.5％，玉米粉3％，硫酸锰0.2％,硫酸铵1.5％，硫酸镁0.2‰，磷酸二氢钾0.3‰和氯化钙0.1％，装液量100mL/500ML，初始pH为7.0-7.5，发酵温度35℃；
②将发酵液经离心机离心后，得枯草芽孢杆菌S16浓缩液，将该浓缩液喷洒到已充分按比例混合好的复合载体(质量比为1.2:1:2的玉米秸秆粉、草炭和腐殖酸混合物)上，在低温条件(15℃～30℃)下造粒并烘干。经检测菌剂的各项指标均达到国家标准(GB20287)后，分筛得到枯草芽孢杆菌S16固体菌剂，枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数为1.2×108CFU/g。
(3)将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，行距0.8m，株距25cm。定植当天浇完定植水后，将枯草芽孢杆菌S16液体菌剂兑水稀释后(稀释倍数根据枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数进行折算，使枯草芽孢杆菌S16液体菌剂的施用量相当于4L/亩)在距离甜瓜主根系5cm位置处，以甜瓜主根系为圆心，围绕甜瓜主根系画圆均匀浇灌一圈，每棵施用100mL。枯草芽孢杆菌S16液体菌剂的制备方法同制备枯草芽孢杆菌S16固体菌剂的步骤①，枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数为2.5×108CFU/g。
(4)生长期追施N-P2O5-K2O＝14-6-22的水溶肥(即氮元素的含量为140g/kg，磷元素以P2O5计含量为60g/kg，钾元素以K2O计含量为220g/kg)，随水滴灌共施4次，每次用量为10kg/亩。病虫害防控以粘虫板粘虫。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌S16菌株在缓解设施甜瓜连作障碍中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌S16菌株的保藏编号为CGMCC No.1.60036。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为通过降低盐渍化土壤电导率、促进甜瓜生长、防治甜瓜枯萎病、提高速效磷和速效钾含量、增加具有促生和拮抗病原菌功能的有益菌的相对丰度、增加土壤真菌群落中有益拮抗菌属的相对丰度以及降低有害病原菌属的相对丰度中的至少一种方式缓解设施甜瓜连作障碍。
3.一种缓解设施甜瓜连作障碍的方法，其特征在于，在种植甜瓜前和定植后，向土壤中接种枯草芽孢杆菌S16菌株的菌剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在种植甜瓜前以沟施的方式接种所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂的制备方法为：将枯草芽孢杆菌S16菌株接种在LB固体培养基中活化12～16h，然后接种至LB液体培养基中30℃～37℃摇瓶培养12～16h得到种子液，将所述种子液按照5％～7％的接种量接种到发酵培养基中继续发酵培养24～36h，得发酵液；其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖1.5％～1.7％，淀粉0.5％～0.6％，玉米粉3％～4％，硫酸锰0.2％～0.3％，硫酸铵1.5％～1.7％，硫酸镁0.2‰～0.3‰，磷酸二氢钾0.2‰～0.3‰和氯化钙0.1％～0.2％，初始pH为7.0～7.5，发酵温度30℃～35℃；
将所述发酵液经离心机离心浓缩，得浓缩液，将所述浓缩液喷洒到载体，在15～30℃造粒并烘干，即得所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述载体为质量比为1:1:2～1.5:1:2的玉米秸秆粉、草炭和腐殖酸的混合物。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在定植后，以灌根的方式接种所述枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂的制备方法为：
将枯草芽孢杆菌S16菌株接种在LB固体培养基中活化12～16h，然后接种至LB液体培养基中30℃～37℃摇瓶培养12～16h得到种子液，将种子液按照5％～7％的接种量转接于发酵培养基中继续发酵培养24～36h，即得所述枯草芽孢杆菌S16液体菌剂；其中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖1.5％～1.7％，淀粉0.5％～0.6％，玉米粉3％～4％，硫酸锰0.2％～0.3％，硫酸铵1.5％～1.7％，硫酸镁0.2‰～0.3‰，磷酸二氢钾0.2‰～0.3‰和氯化钙0.1％～0.2％，初始pH为7.0～7.5，发酵温度30℃～35℃。
9.根据权利要求3～8任一项所述的方法，其特征在于，具体包括以下操作：
S1、种植前15～20天，在待种植甜瓜的设施大棚内施入有机肥并进行耕翻整地，5～7天后施入复合肥再进行耕翻整地；
S2、种植前4～6天开沟起垄，向沟内撒入枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂；
S3、将30-45天苗龄的甜瓜幼苗移栽定植于土壤中，浇定植水后，施用枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂；
S4、生长期追肥并进行病虫害防治。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，S1中所述有机肥为腐熟牛粪，用量为4～6方/亩；和/或
S1中所述复合肥中氮元素、磷元素、钾元素的含量均为140～160g/kg，其中磷元素含量以P2O5计，钾元素含量以K2O计，用量为50～55kg/亩；和/或
S1中耕翻的深度不低于20cm；和/或
S2中所述枯草芽孢杆菌S16菌株的固体菌剂中枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数≧1×108CFU/g，用量为8～12kg/亩；和/或
S3中所述枯草芽孢杆菌S16菌株的液体菌剂中枯草芽孢杆菌S16的有效活菌数≧2×108CFU/g，用量为4～5L/亩。
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