CN111411063A - 一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，它包括贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌体积比为0.5～1.5:0.5～1.5；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.19513；所述解淀粉芽孢杆菌编的保藏登记号为CGMCC No.19514。本发明应用筛选得到的一株贝莱斯芽孢杆菌和一株解淀粉芽孢杆菌进行复配，形成复合菌剂，将其作用在烟草上，对于烟草青枯病、黑胫病等土传病害的防控具有良好的效果。

Description

一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制 备方法
技术领域
本发明涉及生物肥领域，尤其涉及一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法。
背景技术
土传病害是发生在植物根部或茎部以土壤为媒介进行传播的植物病害的统称。目前烤烟土传病害主要包括青枯病、黑胫病、根(黑)腐病、根结线虫病等，病原菌通常从烟株根际侵染，一旦侵入就难以防治，爆发后引起烟株根部茎部腐烂乃至全株的枯死，造成重大经济损失。近年来由于化肥的大量施用，造成土壤肥力严重下降，土壤微生物区系紊乱，烟田土传病害逐年加重已经上升为烤烟的主要病害，严重影响着烤烟的可持续发展。
采用化学药剂防治土传病害在烤烟生产中发挥着重要作用，然而化学药剂的大量使用引起的药物残留、环境污染和抗药性积累等问题已经不符合农业健康可持续发展的要求。生物防治因其低成本、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外防治烤烟土传病害的研究热点，将逐步取代传统的化学防治手段，具有较为广阔的应用前景。生物防治植物病害的常见机制有：改善土壤理化性质及营养状况促进植物生长，提高植物健康水平，增强寄主植物的抗病能力；利用生防细菌、真菌及放线菌等拮抗微生物的寄生、抗生作用，及其与病原菌的营养物质、生态位的竞争效应抑制和消灭病原菌；诱导寄主植物产生对病原菌的系统抗性。目前，生产上一般常在基肥中加入微生物菌肥，这种方式虽然增加了土壤中有益微生物含量，但是缺乏与土壤土著微生物竞争的能力，添加的菌剂存在新的生态环境中不能大量繁殖等问题，致使有益微生物菌剂难以发挥应有效果。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法，芽孢杆菌应用在农业中多具有抗病促生长的作用，本发明应用筛选得到的一株贝莱斯芽孢杆菌和一株解淀粉芽孢杆菌进行复配，形成复合菌剂，将其作用在烟草上，对于烟草青枯病、黑胫病等土传病害的防控具有良好的效果。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现。
一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，它包括贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌体积比为0.5～1.5:0.5～1.5；
所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.19513；
所述解淀粉芽孢杆菌编的保藏登记号为CGMCC No.19514。
制备方法和应用，它包括以下步骤：
复合菌剂的制备方法包括以下步骤，
第一步，菌种活化，将-80℃下保存的贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌在LB固体培养基上分别进行活化，采用划线培养的方式，于34～37℃条件下培养24～48h，挑取单菌落在LB固体培养基上继续进行划线培养，在34～37℃条件下培养24～48h，得活化的菌株；
第二步，种子液制备，用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株分别接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得两株菌株的种子液；
第三步，发酵液制备，按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将第二步中所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下分别培养25～30h，得发酵液；
第四步，复合菌剂制备，将第三步中所得的发酵液按照贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌体积比为0.5～1.5:0.5～1.5进行混配，得到复合菌剂。
进一步的，所述第二步中LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
进一步的，所述第一步中LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
进一步的，所述第三步中车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0～1.6％、蔗糖0.1～0.5％、蛋白胨0.2～0.6％、玉米粉0.2～0.6％、碳酸钙0.3～0.9％、鱼粉0.1～0.3％、硫酸铵0.01～0.08％、硫酸镁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.04％、磷酸氢二钾0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.04％、氢氧化钠0.01～0.04％、氯化钠0.02～0.03％、消泡剂0.5～1.5％，车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8～7.5。
进一步的，所述第四步中复合菌剂的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/mL。
上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),保藏编号CGMCC NO.19513,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年3月26日。编号：YWF2019-1。
上述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏编号CGMCCNO.19514,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2020年3月26日。编号：YWF2019-2。
本发明与现有技术比较具有以下优点：
1、防效优良
本专利中的复合菌剂对于青枯病、黑胫病等烟草土传病害具有优良的防控效果，采用复合菌剂在烟草种植前期进行病害预防，通过微生物的竞争占位作用和拮抗作用，对青枯病和黑胫病等病害形成防控。
2、使用方便
本专利中的复合菌剂可以兑水稀释后直接施用，也可与有机类肥料混合后施用，使用方便，只需一次使用，即可形成有效防护，节约大量人工和时间。
3、安全环保
本专利技术中的功能菌种YWF2019-1和YWF2019-2是由自然界中筛选分离得到，未进行基因改造，田间使用不具有风险，对作物、动物和人体均不产生危害，可实现田间、作物、水源无污染、无残留，与常规农药相比安全性大大提高，有利于有机农业的发展。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不局限于说明书上的内容。
一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，由一株贝莱斯芽孢杆菌和一株解淀粉芽孢杆菌组成，其中贝莱斯芽孢杆菌编号为YWF2019-1，其保藏登记号为CGMCCNo.19513，解淀粉芽孢杆菌编号为YWF2019-2，其保藏登记号为CGMCC No.19514，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司进行保藏。
制备方法和应用，它包括以下步骤：
第一步，菌种活化：将-80℃下保存的芽孢杆菌菌株YWF2019-1和YWF2019-2在LB固体培养基上分别进行活化，采用划线培养的方式，于34～37℃条件下培养24～48h，挑取单菌落在LB固体培养基上继续进行划线培养，在34～37℃条件下培养24～48h，得活化的菌株；
第二步，种子液制备：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株分别接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得两株菌株的种子液；
第三步，发酵液制备：按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将步骤(2)所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下分别培养25～30h，得发酵液，两株菌株均为芽孢杆菌，活性相似，所得发酵液的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/mL；
第四步，复合菌剂制备：将第三步中所得的菌液中按照YWF2019-1：YWF2019-2＝0.5～1.5:0.5～1.5的体积比进行混配，得到复合菌剂。
LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0～1.6％、蔗糖0.1～0.5％、蛋白胨0.2～0.6％、玉米粉0.2～0.6％、碳酸钙0.3～0.9％、鱼粉0.1～0.3％、硫酸铵0.01～0.08％、硫酸镁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.04％、磷酸氢二钾0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.04％、氢氧化钠0.01～0.04％、氯化钠0.02～0.03％、消泡剂0.5～1.5％。两株菌株采用相同的培养基进行培养。
车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8～7.5。
本发明的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法和应用，复合菌剂可作为微生物菌剂直接稀释使用，也并可添加到肥料中制成具有防治土传病害功能的肥料产品进行使用，使用方法如下：
1.将复合菌剂稀释500～1000倍，采用浇施、蘸根、灌根的方式进行施用；
2.将复合菌剂按照1～5：1000的重量比添加到有机类肥料中，制成生物有机类肥料，采用塘施、穴施、条施、环施等方式进行施用。
下面以具体实施例来说明。
实施例1：
一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，由一株贝莱斯芽孢杆菌和一株解淀粉芽孢杆菌组成，其中贝莱斯芽孢杆菌编号为YWF2019-1，其保藏登记号为CGMCCNo.19513，解淀粉芽孢杆菌编号为YWF2019-2，其保藏登记号为CGMCC No.19514，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司进行保藏。
制备方法，它包括以下步骤：
第一步，菌种活化：将-80℃下保存的芽孢杆菌菌株YWF2019-1和YWF2019-2在LB固体培养基上分别进行活化，采用划线培养的方式，于34℃条件下培养48h，挑取单菌落在LB固体培养基上继续进行划线培养，在34℃条件下培养48h，得活化的菌株；
第二步，种子液制备：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株分别接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得两株菌株的种子液；
第三步，发酵液制备：按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将第二步所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃，转速为120rpm/min条件下分别培养30h，得发酵液，两株菌株均为芽孢杆菌，活性相似，所得发酵液的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/mL；
第四步，复合菌剂制备：将第三步中所得的菌液中按照YWF2019-1：YWF2019-2＝0.5:1.5的体积比进行混配，得到复合菌剂。
LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0％、蔗糖0.5％、蛋白胨0.2％、玉米粉0.6％、碳酸钙0.3、鱼粉0.3％、硫酸铵0.01％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.01％、磷酸氢二钾0.05％、硫酸锰0.01％、氢氧化钠0.04％、氯化钠0.02％、消泡剂1.5％。两株菌株采用相同的培养基进行培养。
车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8。
本发明的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法和应用，复合菌剂可作为微生物菌剂直接稀释使用，将复合菌剂稀释500～1000倍，采用浇施、蘸根、灌根的方式进行施用。
实施例2：
一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，由一株贝莱斯芽孢杆菌和一株解淀粉芽孢杆菌组成，其中贝莱斯芽孢杆菌编号为YWF2019-1，其保藏登记号为CGMCCNo.19513，解淀粉芽孢杆菌编号为YWF2019-2，其保藏登记号为CGMCC No.19514，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司进行保藏。
制备方法，它包括以下步骤：
第一步，菌种活化：将-80℃下保存的芽孢杆菌菌株YWF2019-1和YWF2019-2在LB固体培养基上分别进行活化，采用划线培养的方式，于37℃条件下培养24h，挑取单菌落在LB固体培养基上继续进行划线培养，在37℃条件下培养24h，得活化的菌株；
第二步，种子液制备：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株分别接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得两株菌株的种子液；
第三步，发酵液制备：按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将第二步所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为37.5℃，转速为120rpm/min条件下分别培养25h，得发酵液，两株菌株均为芽孢杆菌，活性相似，所得发酵液的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/mL；
第四步，复合菌剂制备：将第三步中所得的菌液中按照YWF2019-1：YWF2019-2＝1.5:0.5的体积比进行混配，得到复合菌剂。
进一步的，所述LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
进一步的，所述LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
进一步的，所述车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.6％、蔗糖0.1％、蛋白胨0.6％、玉米粉0.2％、碳酸钙0.9％、鱼粉0.1％、硫酸铵0.08％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.04％、磷酸氢二钾0.02％、硫酸锰0.04％、氢氧化钠0.01％、氯化钠0.03％、消泡剂0.5％。两株菌株采用相同的培养基进行培养。
进一步的，所述车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至7.5。
本发明的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法和应用，复合菌剂可添加到肥料中制成具有防治土传病害功能的肥料产品进行使用，将复合菌剂按照1～3：1000的重量比添加到有机肥料中，制成生物有机肥，采用塘施、穴施、条施、环施等方式进行施用。
实施例3：
一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，由一株贝莱斯芽孢杆菌和一株解淀粉芽孢杆菌组成，其中贝莱斯芽孢杆菌编号为YWF2019-1，其保藏登记号为CGMCCNo.19513，解淀粉芽孢杆菌编号为YWF2019-2，其保藏登记号为CGMCC No.19514，由云南省微生物发酵工程研究中心有限公司进行保藏。
制备方法，它包括以下步骤：
第一步，菌种活化：将-80℃下保存的芽孢杆菌菌株YWF2019-1和YWF2019-2在LB固体培养基上分别进行活化，采用划线培养的方式，于35℃条件下培养36h，挑取单菌落在LB固体培养基上继续进行划线培养，在35℃条件下培养36h，得活化的菌株；
第二步，种子液制备：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株分别接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得两株菌株的种子液；
第三步，发酵液制备：按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将第二步所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为37℃，转速为120rpm/min条件下分别培养28h，得发酵液，两株菌株均为芽孢杆菌，活性相似，所得发酵液的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/mL；
第四步，复合菌剂制备：将第三步中所得的菌液中按照YWF2019-1：YWF2019-2＝1:1的体积比进行混配，得到复合菌剂。
LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.3％、蔗糖0.3％、蛋白胨0.3％、玉米粉0.4％、碳酸钙0.5％、鱼粉0.2％、硫酸铵0.05％、硫酸镁0.03％、磷酸二氢钾0.02％、磷酸氢二钾0.04％、硫酸锰0.02％、氢氧化钠0.03％、氯化钠0.02％、消泡剂1.2％。两株菌株采用相同的培养基进行培养。
车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至7.2。
本发明的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂及其制备方法和应用，复合菌剂可添加到肥料中制成具有防治土传病害功能的肥料产品进行使用，将复合菌剂按照3～5：1000的重量比添加到有机-无机复混肥料中，制成生物-有机-无机复混肥料，采用塘施、穴施、条施、环施等方式进行施用。
效果验证：
效果验证1：保山昌宁烟草病害生物防治试验
1、试验目的
为了能更快的实现农用微生物菌剂代替农药的使用，进一步推广本专利产品，从生物防治和提高烟株营养抗性出发，设计使用微生物菌剂等产品，对烤烟移栽后的两黑病、青枯病进行综合防治，通过数据调查，对比防治效果，
2、材料与方法
2.1试验地点
保山市昌宁县珠街镇羊街村。
2.2试验材料
(1)供试品种
红花大金元
(2)供试肥料
本专利的芽孢杆菌复合菌剂。
2.3试验设计
试验设3个处理，不设重复：
处理一：移栽时使用芽孢杆菌复合菌剂500倍稀释液进行烟苗蘸根，移栽后使用芽孢杆菌复合菌剂1000倍稀释液进行烟苗灌根，不进行青枯病和黑胫病的化学药剂防控，其他一切农事操作与常规相同；
处理二：生育期内不采用任何药剂进行青枯病和黑胫病的防控，其他一切农事操作与常规相同。
对照：常规种植，采用化学农药进行青枯病和黑胫病的防控。
处理一和处理二试验地的布局如下所示：
处理二 处理一
处理一 处理二
处理二 处理一
以试验地周围按当地常规方式进行病虫害防治的地块为对照。各处理其余的田间管理措施均按当地管理方案实施。
3、调查的项目及方法
3.1土壤微生物区系及土传病害病原菌含量调查
在移栽前取一个基础土样，在移栽后的团棵期、旺长期、封顶后和采烤后每个处理分别取一个土样，对土壤微生物区系以及青枯病、黑胫病的病原菌数量应用平板涂布法进行检测。
3.2病虫害发生情况调查
在整个大田生育期对各处理各种病虫害发病时间及其危害程度(发病率和病情指数、虫株率和虫口密度)进行调查统计。
3.3经济性状调查
每个处理单独挂牌烘烤，对烤后烟叶的亩产量、亩产值、均价、上等烟比例和中上等烟比例进行统计。
3.4常规防治措施化学农药使用情况调查
对常规防治措施中所使用化学农药的药品名、厂家、使用时间、使用方法、防治成本等进行调查统计。
4、过程记录
4.1移栽
移栽时间为5月5日。株行距为120cm，株间距为50cm，种植密度为1200株/亩。
4.2肥料施用情况
表1施肥情况表
Figure BDA0002493236990000131
Figure BDA0002493236990000141
4.3中耕管理
6月14日前后，第一次除草，采用人工拔除杂草，揭膜培土，使用锄头人工培土，培土后墒面不低于45cm，墒面饱满。
4.4防治措施
主要防治措施如下表：
表2防治措施记录表
Figure BDA0002493236990000142
4.5封顶打叉
7月15日，开始封顶。
5、结果分析
5.1大田生育期
由表3生育期进展可以看出，整体大田生育期无差异，而采用生物防治的烟株较不采用任何防治的烟株要早进入团棵期，较常规种植也略有提前，说明使用微生物菌剂对烟株有促进生长发育的作用。
表3生育期进展
Figure BDA0002493236990000151
5.2田间长势长相
由表4烟株田间长势长相可以看出，处理与对照田间长势长相无差异，6月中旬至7月中旬试验地块未下雨、日照较强，部分烟株出现日灼现象，导致试验田间整体生长势不强，降雨成为主要生长制约因素。
表5烟株田间长势长相
Figure BDA0002493236990000152
Figure BDA0002493236990000161
5.3农艺性状调查
由表5农艺性状调查可以看出从处理一不同时期的株高、茎围、节距、叶片数大于处理二和对照的，上中下三个部位的叶片的长度及宽度均大于处理二和对照的，说明复合菌剂有促进烟株生长发育的作用。
表5农艺性状调查
Figure BDA0002493236990000162
5.4病虫害发生情况调查
田间烟株除受强光影响出现日灼现象，在烟株生长后期主要爆发黑胫病及青枯病，由表6田间病害情况可以看出，处理一的青枯病及黑胫病的发病率比处理二明显降低，同时对照区农户未提前做好防治措施，在发现烟株被病害侵染后才开始使用化学药剂，导致发病率较高，说明生物防治措施对青枯病及黑胫病有预防作用。
表6田间病害发生情况
Figure BDA0002493236990000171
5.5经济性状调查
由表7经济性状调查表可以看出，处理一的产值产量、均价都高于对照，且处理一和对照都远远优于处理二，说明采用生物防治能提高烟叶产值，进行病害防控可有效减少烟叶产值量损失；处理一的上等烟及中上等烟比例均高于对照，说明使用复合菌剂改善烟叶品质提升中上等烟的比例。
表7经济性状调查表
处理 亩产值 亩产量 均价 上等烟比例 中上等烟比例
处理一 4300.59 140.42 31.04 68.83 83.2
处理二 3828.49 138.54 28.08 60.89 71.28
对照 4203.03 139.75 29.61 63.61 77.12
6、试验总结
采用复合菌剂进行烟草青枯病和两黑病的防控，较常规化学防控可以取得更佳的效果，同时复合菌剂对于烟株的长势和产量具有促进的作用。
效果验证2：昭通鲁甸烟草青枯病等土传病害生物防治试验
1材料与方法
1.1试验地点
试验安排在昭通鲁甸。
1.2试验材料
供试品种：当地主栽品种，为了验证生防措施对病害防控的有效性，尽可能选择该病害的易感品种。
供试生物菌剂(制剂)：本发明的复合菌剂及生物有机肥。
1.3试验设计
采用随机区组试验设计，设6个处理，3次重复，各处理如下所示：
处理1：施用生物有机肥80kg/亩+移栽时复合菌剂500倍液蘸根+移栽后7-10和团棵至旺长前期复合菌剂800倍液灌根(用量为2L/亩)；
处理2：施用精制有机肥80kg/亩+移栽时复合菌剂500倍液蘸根+移栽后7-10和团棵至旺长前期复合菌剂800倍液灌根(用量为2L/亩)；
处理3：清水对照，整个大田生育期不使用任何农药；
处理4：大田生育期间的病虫害防治按当地常规方式进行。
小区示意
Figure BDA0002493236990000181
1.4数据调查和记录
1.4.1大田生育期进展调查
观察记载各处理50％烟株达到团棵、旺长、现蕾、采烤等生育期进展，记录打顶时间、第一次采烤时间和最后一次采烤时间，探讨生物防控各项措施对烤烟生育期进展的影响。
1.4.2农艺性状调查
在旺长期和打顶后，每个小区随机选5株烟株，对烟株的株高、茎围、叶片数、最大叶长和最大叶宽等农艺性状进行调查。
1.4.3病害发生情况调查
从移栽后10天开始，每隔10天对每个处理的的主要病害发生情况进行调查，统计发病率，研究生物防控措施对烟草主要病害发生和发展的影响。
1.4.4经济性状调查
每个处理单独挂牌烘烤，对其亩产量、亩产值、均价、上等烟比例和中上等烟比例进行统计。研究不同的生物防控措施对烟草经济性。
1.4.5内在品质调查
各处理选取C3F 1kg统一送检，进行烟叶内在化学成分分析和评吸分析，并重点关注不同处理的农药残留情况。
2结果与分析
2.1青枯病等土传病害的生物防控对烤烟大田生育期进展的影响
试验烟田烤烟生育进展调查统计见表8，从表中可以看出处理1和处理2较其他处理生育前期略有提前，其他各处理无明显差异；说明有机肥及生物菌剂能促进烤烟前期的生长发育。
表8烤烟大田生育期进展统计表
Figure BDA0002493236990000201
2.2青枯病等土传病害的生物防控对烤烟农艺性状的影响
2.2.1对旺长期烤烟农艺性状的影响
试验田烤烟旺长期农艺性状调查见表9，从表中可以看出，株高指标处理1和处理2相当高，处理4次之，处理3较低；茎围指标处理3最低，处理1最高；各处理节距指标相差不大；单株叶数处理1较多，其他处理相差不大；叶片长和宽处理1相对较大。说明使用有机肥和复合菌剂能有效改善旺长期烤烟农艺性状。
表9旺长期烤烟农艺性状调查表
Figure BDA0002493236990000211
2.2.2对封顶后烤烟农艺性状的影响
试验烟株封顶后农艺性状测量结果见表10，通过表中可以看出株高和单株叶数指标前两个处理较高；茎围指标处理1较其他处理略高；叶片开片前两个处理相当较好，处理4略差。说明使用有机肥和复合菌剂能改善后期烟株农艺性状。
表10封顶后烤烟农艺性状测量表
Figure BDA0002493236990000212
Figure BDA0002493236990000221
2.3病害发生情况
试验烟株发病率调查情况见表11，通过表可以看出试验烟株主要发生病害有两黑病、普通花叶病、番茄斑萎病和青枯病；根黑腐病发病率处理3>处理4>处理1>处理2；黑胫病发病率处理3>处理4>处理2>处理1；普通花叶病除处理3外其他各处理发病率相差不大；番茄斑萎病发病率处理3>处理2>处理1>处理4；青枯病发病率处理3>处理4>处理1>处理2。采用复合菌剂的防治略优于化学防治，说明生物防控对两黑病和青枯病的发生得到很好的防治。
表11试验烟株病害发生情况调查表
Figure BDA0002493236990000222
2.4经济性状调查
从表12可以看出，均价指标、亩产量指标及亩产值指标处理1、2较其他处理好，处理4次之，处理3最差；上等烟比例、上中等烟比例指标处理1最高，处理2和处理4次之，处理3最差。说明有机肥配合复合菌剂使用可以提升烤烟经济性状，处理3由于不采用任何防护措施，导致烤烟病害比较严重，对产质量造成了很大影响。
表12试验地块小区经济性状统计表
Figure BDA0002493236990000231
2.5内在品质调查
从表13中可以看出，总糖含量指标处理4偏高，处理1-3较适宜；还原糖含量指标处理4偏高，其他处理相差不明显；总氮含量指标总体呈中等偏高水平；烟碱含量指标均在适宜范围内；氧化钾含量指标处理4偏低；氯离子含量指标相差不大；从糖碱比和氮碱比看，处理4化学协调性较差。
表13中部烤后烟叶化学成分分析结果表
Figure BDA0002493236990000232
3结论与讨论
通过2019年在昭通市鲁甸县大水塘开展的云南烟草青枯病等土传病害的生物防控技术得出；有机肥与复合菌剂复配使用能促进烤烟前期的生长发育，整体生物防控技术对烤烟生育期的影响不明显；生物有机肥较常规有机肥能有效改善旺长期烤烟农艺性状，并提高经济效益。
复合菌剂对两黑病和青枯病的发生取得了很好的效果，整体通过生物防治手段各类病害的发生得到很好的控制。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (6)

1.一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，其特征在于：它包括贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌体积比为0.5～1.5:0.5～1.5；
所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏登记号为CGMCC No.19513；
所述解淀粉芽孢杆菌编的保藏登记号为CGMCC No.19514。
2.根据权利要求1所述的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，其特征在于：其制备方法包括以下步骤，
第一步，菌种活化，将-80℃下保存的贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌在LB固体培养基上分别进行活化，采用划线培养的方式，于34～37℃条件下培养24～48h，挑取单菌落在LB固体培养基上继续进行划线培养，在34～37℃条件下培养24～48h，得活化的菌株；
第二步，种子液制备，用无菌接种环刮取一环第一步中活化的菌株分别接种到50ml LB液体培养基中，在温度为35℃、转速为160rpm条件下培养24h，得两株菌株的种子液；
第三步，发酵液制备，按照菌种种子液、培养液体积比为1：120的比例将第二步中所得的种子液接入到车间发酵料培养基中，在温度为36.5℃～37.5℃，转速为120rpm/min条件下分别培养25～30h，得发酵液；
第四步，复合菌剂制备，将第三步中所得的发酵液按照贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌体积比为0.5～1.5:0.5～1.5进行混配，得到复合菌剂。
3.根据权利要求2所述的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，其特征在于，所述第二步中LB液体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，即得液体培养基。
4.根据权利要求2所述的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，其特征在于，所述第一步中LB固体培养基的组成成分及其配比为：细菌学蛋白胨10g，酵母提取粉5g，氯化钠10g，水1L，琼脂粉7.5g。
5.根据权利要求2所述的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，其特征在于，所述第三步中车间发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：黄豆粉1.0～1.6％、蔗糖0.1～0.5％、蛋白胨0.2～0.6％、玉米粉0.2～0.6％、碳酸钙0.3～0.9％、鱼粉0.1～0.3％、硫酸铵0.01～0.08％、硫酸镁0.02～0.05％、磷酸二氢钾0.01～0.04％、磷酸氢二钾0.02～0.05％、硫酸锰0.01～0.04％、氢氧化钠0.01～0.04％、氯化钠0.02～0.03％、消泡剂0.5～1.5％，车间发酵培养基用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8～7.5。
6.根据权利要求2所述的一种具有防治烟草土传病害功能的芽孢杆菌复合菌剂，其特征在于，所述第四步中复合菌剂的有效活菌数均大于2.0×1010cfu/mL。
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False: MICROBIAL FERMENTATION ENGINEERING RESEARCH CENTER Co.,Ltd. OF YUNNAN PROVINCE|650000 No. 49, Changhong Road, Kunming Economic Development Zone, Kunming City, Yunnan Province|Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences (Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corporation) Baoshan Branch of Yunnan Tobacco Company

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