CN107937309B - 一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用。丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291，该菌于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14538。本发明的丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291为丙酸杆菌科的新属新种，能够产生叶酸和烟酸，可为叶酸和烟酸的微生物合成提供优良的菌株资源，也可用于饲料添加剂、益生菌剂等的开发。

Description

一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用。
背景技术：
叶酸是一种由嘌呤、对氨基苯甲酸、多聚谷氨酸等三部分组成的水溶性B族维生素。它是细胞代谢不可或缺的重要成分，例如DNA和RNA的生物合成，以及一些维生素、氨基酸等的合成都离不开它。通常所说的叶酸(folate)包括叶酸(folic acid)及其同类物，包括四氢叶酸(tetrahydrofolic acid)、甲基四氢叶酸盐(methyltetrahydrofolate)、次甲基四氢叶酸盐(methenyltetrahydrofolate)、亚叶酸(folinic acid)等。人体缺乏叶酸会带来多种危害，如骨质疏松、提高罹患乳腺癌和结肠直肠癌的风险、造成认知障碍、神经管缺陷等等。叶酸缺乏也会影响到动物健康和生产性能，动物饲料中添加适量叶酸，能改善动物的免疫力、生产及繁殖性能等。
叶酸普遍存在于动植物和发酵食品中。一些细菌可以利用简单的前体如GTP、对氨基苯甲酸、谷氨酸盐合成叶酸。目前报道的合成叶酸的微生物主要有乳酸菌，如Lactococcus lactis，Streptococcus thermophilus，双歧杆菌如Bifidobacteriumbifidum、Bifidobacterium longum，丙酸菌如Propionibacterium sp.等。例如重要的工业菌株L.lactis MG1363的叶酸总产量大约100ng/mL。牛奶是叶酸的一个重要来源，每升牛奶含20-50μg叶酸。工业上常利用Streptococcus thermophilus、Bifidobacterium longum等来生产发酵乳制品，特别是酸奶，可提高其中的叶酸含量至150μg/L。
烟酸，又称为维生素B3或维生素PP，是具有生物化学活性的全部吡啶-3-甲酸及其衍生物的总称。它是生物有机体内氧化还原反应的重要参与者，主要以辅酶I、辅酶II形式作为脱氢酶的辅酶在生物氧化中起递氢体的作用，参与丙酮酸盐代谢、葡萄糖酵解、戊糖的生物合成和脂肪、氨基酸、蛋白质及嘌呤的代谢。当烟酸缺乏时生物体内的锌吸收率、肠道锌、血红蛋白和肝内铁的含量呈明显降低趋势，还会引起赖皮病。在饲料添加剂方面。动物体内的烟酸可以维持机体组织的完整性，并参与体内脂类、碳水化合物和蛋白质等物质的新陈代谢过程。通过抑制脂肪组织的动员作用，提高血糖浓度同时减少游离脂肪酸的释放，达到降低动物体内脂肪的生成，提高产奶量以及肉的品质。此外，烟酸对家禽的骨骼生长、抗应激反应、产蛋量及种蛋孵化率都有积极作用，是饲料中的重要添加剂。肠道微生物、瘤胃微生物被认为可产生烟酸。目前利用微生物生成烟酸，主要是利用微生物细胞的腈水解酶催化3-氰基吡啶生成烟酸和氨，如菌株Nocardia globerula NHB-2和Rhodococcusrhodochrous J1。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种新的丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291菌株，该菌于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14538。
本发明的丙酸杆菌SCSIO 13291从三亚鹿回头岸礁区(109°29′E，18°13′N)采集的珊瑚样本组织中分离获得。
本发明的菌株SCSIO 13291(丙酸杆菌SCSIO 13291)的特性：
形态学特征：
该菌株细胞革兰氏染色阳性，不运动，有氧培养时细胞呈球状或短杆状，细胞多成对或成簇(图1a)；在厌氧条件下细胞呈短杆状，细胞单个或成对(图1b)。
生理生化特征：
菌株SCSIO 13291过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，脲酶阴性，不能降解明胶、淀粉，不能还原硝酸盐，不产生硫化氢。生长pH范围为pH6.0～10.0，最适生长pH值8.0；生长温度范围为15℃～40℃，最适生长温度为30℃；能耐受10％的NaCl浓度。碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、白氨酸芳氨酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶均为阳性。类脂酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶均为阴性。能利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、木苏糖、棉籽糖、D-乳糖、蜜二糖、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-D-甘露糖胺、N-乙酰神经氨酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲酰葡萄糖、D-果糖、L-果糖、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天冬氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、胶质、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡萄糖酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘酸、奎宁酸、糖质酸、D-乳酸甲酯、α-酮戊二酸、D-苹果酸、L-苹果酸、溴-丁二酸、吐温40、γ-氨基-丁酸、β-羟基-D,L丁酸、α-酮-丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、甲酸。不能利用D-纤维二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-丝氨酸、肌醇、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、α-羟基-丁酸。
细胞化学分类特征：
细胞壁特征性氨基酸组分为D-DAP，全细胞水解糖组分包括核糖，甘露糖，葡萄糖，鼠李糖。主要的呼吸醌为MK-9(H4)，主要的磷酸类脂成分为双磷脂酰甘油(Diphosphatidylglycerol)和磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol)。基因组DNA G+C含量为71.2％。
系统发育特征：
提取菌株SCSIO 13291的基因组DNA，采用通用引物27F/1492R扩增16S rRNA基因片段并测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。对16S rRNA基因序列进行Blast比对分析，发现其与菌株慢生棒状丙酸菌(Propioniciclava tarda)WR061T(序列号NR 112669)的序列相似性最高，为94％。采用邻接法构建系统发育树，清晰的反映了该菌株与丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)的成员之间的亲缘关系(图2)。菌株SCSIO 13291属于丙酸杆菌科的成员，但它与其最近缘的棒状丙酸菌属(Propioniciclava)之间在形态、生理特征、细胞壁特征氨基酸成分等方面显著不同，因此鉴定菌株SCSIO 13291应为丙酸杆菌科的新属新种，命名为Corallicola sp.SCSIO 13291。
本发明的丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291菌株用TSB培养基，培养温度为30℃时，培养87小时后，收集发酵液，采用国标GB 5009.211-2014法检测，其胞外叶酸产量为35.71±6.64μg/L；采用国标GB 5413.15-2010/第一法检测，其胞外烟酸产量为5.27±0.56mg/L。
因此，本发明的第二个目的是提供丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291在生产叶酸和/或烟酸中的应用。
本发明的第三个目的是提供丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291在制备食品、化妆品或饲料添加剂中的应用。
本发明提供了一种新的丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291，该菌能够发酵高效生产大量叶酸和烟酸，可为叶酸和烟酸的微生物合成提供优良的菌株资源，也可用于饲料添加剂、益生菌剂等的开发。
本发明的丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14538。
附图说明：
图1是本发明菌株SCSIO 13291的显微形态透射电镜图；其中a为有氧培养时细胞的显微形态透射电镜图，b为厌氧培养时细胞的显微形态透射电镜图；
图2是基于16S rRNA基因序列构建的本发明菌株SCSIO 13291及其亲缘关系最近的物种之间的系统发育树，图中的SCSIO 13291即为本发明的菌株SCSIO 13291。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：本发明菌株SCSIO 13291的分离
在三亚鹿回头岸礁区(109°29′E，18°13′N)采集珊瑚样本，用无菌海水将采集到的珊瑚表面彻底洗净，取表面积为2cm2的珊瑚块，用无菌海水冲洗下珊瑚组织，震荡混匀作为珊瑚组织样品。取0.2mL的组织样品涂布于谷氨酰胺培养基(谷氨酰胺培养基的配方为：每升含有谷氨酰胺0.5g和琼脂粉15g，余量为海水，pH7.2)上，25℃培养30天后挑取菌落在ISP2(International Streptomyces Project2)培养基上进一步纯化，得到菌株SCSIO13291。
本发明菌株SCSIO 13291的特性：
形态学特征：
该菌株细胞革兰氏染色阳性，不运动，有氧培养时细胞呈球状或短杆状，细胞多成对或成簇(图1a)；在厌氧条件下细胞呈短杆状，细胞单个或成对(图1b)。
生理生化特征：
菌株SCSIO 13291过氧化氢酶阳性，氧化酶阴性，脲酶阴性，不能降解明胶、淀粉，不能还原硝酸盐，不产生硫化氢。生长pH范围为pH6.0～10.0，最适生长pH值8.0；生长温度范围为15℃～40℃，最适生长温度为30℃；能耐受10％的NaCl浓度。碱性磷酸酶、酯酶、类脂酯酶、白氨酸芳氨酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶均为阳性。类脂酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶均为阴性。能利用糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、木苏糖、棉籽糖、D-乳糖、蜜二糖、D-水杨苷、N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-D-甘露糖胺、N-乙酰神经氨酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲酰葡萄糖、D-果糖、L-果糖、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天冬氨酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、胶质、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸内酯、D-葡萄糖酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘酸、奎宁酸、糖质酸、D-乳酸甲酯、α-酮戊二酸、D-苹果酸、L-苹果酸、溴-丁二酸、吐温40、γ-氨基-丁酸、β-羟基-D,L丁酸、α-酮-丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、甲酸。不能利用D-纤维二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-丝氨酸、肌醇、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、α-羟基-丁酸。
细胞化学分类特征：
细胞壁特征性氨基酸组分为D-DAP，全细胞水解糖组分包括核糖，甘露糖，葡萄糖，鼠李糖。主要的呼吸醌为MK-9(H4)，主要的磷酸类脂成分为双磷脂酰甘油(Diphosphatidylglycerol)和磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol)。基因组DNA G+C含量为71.2％。
系统发育特征：
提取菌株SCSIO 13291的基因组DNA，采用通用引物27F/1492R扩增16S rRNA基因片段并测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。对16S rRNA基因序列进行Blast比对分析，发现其与菌株慢生棒状丙酸菌(Propioniciclava tarda)WR061T(序列号NR 112669)的序列相似性最高，为94％。采用邻接法构建系统发育树，清晰的反映了该菌株与丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)的成员之间的亲缘关系(图2)。菌株SCSIO 13291属于丙酸杆菌科的成员，但它与其最近缘的棒状丙酸菌属(Propioniciclava)之间在形态、生理特征、细胞壁特征氨基酸成分等方面显著不同，因此鉴定菌株SCSIO 13291应为丙酸杆菌科的新属新种，命名为Corallicola sp.SCSIO 13291，该菌于2017年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14538。
实施例2：本发明丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291的培养及叶酸、烟酸产量分析
将菌株SCSIO 13291接种至100mL TSB培养基(TSB培养基的配方为：每升含有胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3.0g、葡萄糖2.5g、氯化钠5.0g和K2HPO4 2.5g，余量为水，pH7.3)中，30℃，180转/分钟，培养72小时，用作种子液。将该种子液以2％(v/v)的接种量接种至新鲜的TSB培养基中，30℃，180转/分钟，培养87小时后，于4℃，7000rpm离心15分钟，收集上清液，上清液采用冷冻真空干燥法避光冻干后，采用GB 5009.211-2014法检测其叶酸含量，采用GB 5413.15-2010/第一法检测其烟酸含量。空白TSB培养基冷冻真空干燥法避光冻干后，采用GB 5009.211-2014法检测其叶酸含量，采用GB 5413.15-2010/第一法检测其烟酸含量，分别作为叶酸和烟酸含量的本底值。检测结果为菌株SCSIO 13291胞外叶酸产量为35.71±6.64μg/L，胞外烟酸产量为5.27±0.56mg/L。本发明的丙酸杆菌SCSIO 13291能够发酵高效生产大量叶酸和烟酸，可为叶酸和烟酸的微生物合成提供优良的菌株资源，也可用于饲料添加剂、益生菌剂等的开发。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 丙酸杆菌 SCSIO 13291(Corallicola sp. SCSIO 13291)
<400> 1
agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacgg 60
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gtgatggcct accaaggctt tgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg 300
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aggtggtttg ttgcgtcggg agtgaaaaca cgccgcttaa cggtgtgctt gctttcgata 600
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tgttgccagc gcgtaatggc gggaactcat gggagactgc cggggtcaac tcggaggaag 1140
gtggggatga ggtcaagtca tcatgcccct tatgtccagg gcttcacgca tgccacaatg 1200
gctggtacaa agggttgcga tgccgcgagg ttgagcgaat cccgtaaagc cagtctcagt 1260
tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag 1320
cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag tcatgaaagt 1380
cggtaacacc cgaagccggt ggcccaacct tgtgggggga gccgtcgaag gtgggatcgg 1440
taaatctcta ga 1452

Claims (3)

1.丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291，其保藏编号：CGMCC No.14538。
2.权利要求1所述的丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291在生产叶酸和/或烟酸中的应用。
3.权利要求1所述的丙酸杆菌(Corallicola sp.)SCSIO 13291在制备食品、化妆品或饲料添加剂中的应用。
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