CN104560913B - 一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶p1的方法 - Google Patents
一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶p1的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104560913B CN104560913B CN201410818210.1A CN201410818210A CN104560913B CN 104560913 B CN104560913 B CN 104560913B CN 201410818210 A CN201410818210 A CN 201410818210A CN 104560913 B CN104560913 B CN 104560913B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- enzyme activity
- nuclease
- culture
- penicillium citrinum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 241000228153 Penicillium citrinum Species 0.000 title claims abstract description 21
- 101710149004 Nuclease P1 Proteins 0.000 title abstract 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 41
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 18
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 17
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 16
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 15
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 8
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 6
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 claims 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 abstract 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 5
- WIGIZIANZCJQQY-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-3-methyl-N-[2-[4-[[[(4-methylcyclohexyl)amino]-oxomethyl]sulfamoyl]phenyl]ethyl]-5-oxo-2H-pyrrole-1-carboxamide Chemical compound O=C1C(CC)=C(C)CN1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCC(C)CC2)C=C1 WIGIZIANZCJQQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 4
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 3
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 description 3
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- VJMAITQRABEEKP-UHFFFAOYSA-N [6-(phenylmethoxymethyl)-1,4-dioxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O1C(COC(=O)C)COCC1COCC1=CC=CC=C1 VJMAITQRABEEKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N chloric acid Chemical compound OCl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005991 chloric acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 1
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000012263 liquid product Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940030966 pyrrole Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/26—Endoribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.26)
- C12Y301/26005—Ribonuclease P (3.1.26.5)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1的方法，使用包含了维生素B类物质的发酵培养基，进行桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1。本发明方法单批发酵时间由60h缩短至20h，酶活由3000U/mL提高至6500U/mL，可连续发酵12批以上。该方法可以显著的缩短发酵工时，减少生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种桔青霉半连续发酵生产核酸酶P1的方法。
背景技术
5’-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中，己经由最初的食品助鲜剂，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中，尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，5’-核苷酸不但能够作为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料；此外，核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂，有着明显的增产、增重功效。
核苷酸生产主要采取三种方法：化学合成法、微生物发酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四种核苷酸的混合物，且酶反应收率较高，国内外工业化生产核苷酸均采用此法。在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一种能够水解RNA获得四种5’-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。
桔青霉属于不对称青霉组，绒状青霉亚组，桔青霉系，是核酸酶P1的重要生产菌种。国内外生产核酸酶P1主要通过桔青霉液体深层发酵，属于分批发酵，该方法耗时较长。如何高效的生产核酸酶P1，降低生产成本，已成为核苷酸生产的首要任务。
发明内容
本发明索要解决的技术问题是提供一种桔青霉半连续发酵生产核酸酶P1的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1的方法，使用包含了维生素B类物质的发酵培养基，进行桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1。
其中，所述的桔青霉为CGMCC No.2014。该菌株记载在中国专利CN101067116A中。
其中，所述的维生素B类物质为泛酸、烟酸、生物素、叶酸、维生素B1、维生素B2、吡哆醇和氰钴胺中的任意一种或几种，优选泛酸、烟酸、生物素、叶酸、维生素B1和维生素B2中的任意一种或几种，最优选泛酸、烟酸和叶酸三者的组合；发酵培养基中维生素B类物质总浓度为0.001g/L～1g/L，优选0.05-0.8g/L，最优选0.1-0.8g/L
其中，所述的发酵培养基组分如下：葡萄糖0.5～50g/L，蛋白胨0.05～5g/L，磷酸二氢钾0.01～5g/L，磷酸氢二钾0.01～5g/L，硫酸镁0.01～5g/L，氯化钙0.01～5g/L，维生素B类物质0.001～1g/L，溶剂为水，pH5-8。
上述桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1的方法，优选包括如下步骤：
a桔青霉在发酵罐中发酵一段时间，待核酸酶P1酶活增长至稳定后放出一定体积的发酵液，发酵罐中留存的发酵液作为下一批发酵种子；
b通过向发酵罐补加无菌发酵培养基继续发酵培养，待酶活增至稳定后再次放出一定体积的发酵液，发酵罐中留存的发酵液作为下一批发酵种子；
c重复步骤b直至桔青霉产酶能力下降至一定程度后停止发酵。
步骤a中，所述的发酵罐体积为20L～200T，优选1T～50T；所述的发酵一段时间，时间为10～100h，优选20～60h。
步骤a和b中，所述的酶活增长至稳定，是指酶活为3000～6500U/mL，优选4000～6000U/mL。
步骤a和b中，所述的放出一定体积的发酵液，是指放出发酵罐中发酵液体积的20％～95％的发酵液，优选60-90％。
步骤c中，重复步骤b的次数为2～20次，优选10～15次。
步骤c中，所述的桔青霉产酶能力下降至一定程度，是指核酸酶P1酶活小于3000U/mL。
本发明中，核酸酶P1酶活定义：将1.9ml的底物溶液(含有浓度为1％左右的RNA；0.2M pH5.2的醋酸缓冲液以0.0005M的ZnSO4)于70℃恒温水浴10min后，加入0.1ml经适当稀释的酶液，70℃保温15min后加入2.0ml核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵-2.5过氯酸)，冰水浴20min后离心、取上清夜用蒸馏水稀释一定倍数，测定其260nm处的吸光值为A260。以先加沉淀剂者作为对照，其它操作同前。在上述条件下，每分钟所生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。
有益效果：本发明采用半连续发酵的方式，通过添加维生素B类物质进行半连续发酵，单批发酵时间由60h缩短至20h，酶活由3000U/mL提高至6500U/mL，可连续发酵12批以上。该方法可以显著的缩短发酵工时，减少生产成本。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
发酵培养基的配制：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，泛酸0.01g/L，维生素B1 0.05g/L，pH6，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
50L搅拌罐中装入30L培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养。间隔一定时间取样测定核酸酶P1的酶活，培养56h后酶活稳定在3300U/mL左右，放出24L发酵液，罐中留存6L作为下一批发酵的种子液。配制24L发酵培养基打入发酵罐再次培养。22h后酶活稳定至4800U/mL，再次放出24L发酵液，同样方法补入24L新鲜培养基。如此循环补料5次，第2、3次补料后培养酶活均在5000U/mL左右，第4次补料酶活下降至3460U/mL，第5次补料后酶活明显下降，只有2850U/mL，停止半连续发酵。
用同样的培养基和培养条件发酵，但是发酵培养基不加泛酸和维生素B1，58h后酶活稳定至3800U/mL，放出24L发酵液，同样方法补入24L新鲜培养基。发酵44h，酶活稳定在2500U/mL，停止半连续发酵。
实施例2：
发酵培养基的配制：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.2g/L，生物素0.1g/L，烟酸0.06g/L，维生素B2 0.2g/L，pH7，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
2T搅拌罐中装入1.2T培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养。间隔一定时间取样测定核酸酶P1的酶活，培养58h后酶活稳定在3700U/mL左右，放出1T发酵液，罐中留存0.2T作为下一批发酵的种子液。配制1T发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至5200U/mL，再次放出1T发酵液，同样方法补入1T新鲜培养基。如此循环补料10次，第2-8次补料后培养酶活均在5400U/mL左右，第9次补料酶活下降至4200U/mL，第10次补料后酶活明显下降，只有2800U/mL，停止半连续发酵。
用同样的培养基和培养条件发酵，但是发酵培养基不加生物素、烟酸和维生素B2，57h后酶活稳定至4600U/mL，放出1T发酵液，同样方法补入1T新鲜培养基。55h后酶活稳定至4200U/mL，第3次补料发酵55h后酶活明显下降，只有2650U/mL，停止半连续发酵。
实施例3：
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.2g/L，泛酸0.1g/L、烟酸0.2g/L、叶酸0.5g/L，pH7，121℃灭菌15min，降温至30℃左右备用。
20T搅拌罐中装入12T培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养。间隔一定时间取样测定核酸酶P1的酶活，培养56h后酶活稳定在4500U/mL左右，放出8T发酵液，罐中留存4T作为下一批发酵的种子液。配制8T发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至5400U/mL，再次放出8T发酵液，同样方法补入8T新鲜培养基。如此循环补料12次，第2-9次补料后培养酶活均在6500U/mL左右，第10次补料酶活下降至4850U/mL，第11次补料酶活下降至3680U/mL，第12次补料后酶活明显下降，只有2400U/mL，停止半连续发酵。
用同样的培养基和培养条件发酵，但是发酵培养基不加泛酸、烟酸和叶酸，57h后酶活稳定至4500U/mL，放出1T发酵液，同样方法补入1T新鲜培养基。55h后酶活稳定至4000U/mL，第3次补料发酵58h后酶活明显下降，只有2700U/mL，停止半连续发酵。
Claims (1)
1.一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1的方法，其特征在于，
发酵培养基的配制：葡萄糖40g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.2g/L，泛酸0.1g/L、烟酸0.2g/L、叶酸0.5g/L，pH7，121℃灭菌15min，降温至30℃备用；
20T搅拌罐中装入12T培养基，灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种CGMCC No.2014进行发酵培养；间隔一定时间取样测定核酸酶P1的酶活，培养56h后酶活稳定在4500U/mL，放出8T发酵液，罐中留存4T作为下一批发酵的种子液；配制8T发酵培养基打入发酵罐再次培养；20h后酶活稳定至5400U/mL，再次放出8T发酵液，同样方法补入8T新鲜培养基；如此循环补料12次，第2-9次补料后培养酶活均在6500U/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410818210.1A CN104560913B (zh) | 2014-12-24 | 2014-12-24 | 一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶p1的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410818210.1A CN104560913B (zh) | 2014-12-24 | 2014-12-24 | 一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶p1的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104560913A CN104560913A (zh) | 2015-04-29 |
| CN104560913B true CN104560913B (zh) | 2017-11-03 |
Family
ID=53077993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410818210.1A Active CN104560913B (zh) | 2014-12-24 | 2014-12-24 | 一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶p1的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104560913B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106318926B (zh) * | 2015-06-19 | 2019-10-25 | 安琪酵母股份有限公司 | 一种桔青霉发酵产核酸酶p1的生产方法 |
| CN107937309B (zh) * | 2017-12-06 | 2019-11-05 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种丙酸杆菌及其在生产叶酸和烟酸中的应用 |
| CN109161570B (zh) * | 2018-09-26 | 2020-12-18 | 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 | 一种提高发酵产n-乙酰神经氨酸的方法及发酵液 |
| CN110218713B (zh) * | 2019-06-24 | 2020-07-03 | 南京工业大学 | 一种提高桔青霉产核酸酶p1酶活的方法 |
| CN113980930B (zh) * | 2021-12-07 | 2023-03-03 | 南京工业大学 | 一种核酸酶p1的制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101037681A (zh) * | 2007-02-14 | 2007-09-19 | 北京燕京中科生物技术有限公司 | 一种发酵法制备核酸酶p1的方法 |
| CN101067116A (zh) * | 2007-05-25 | 2007-11-07 | 南京工业大学 | 一株高产核酸酶p1的桔青霉菌及其选育方法 |
-
2014
- 2014-12-24 CN CN201410818210.1A patent/CN104560913B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101037681A (zh) * | 2007-02-14 | 2007-09-19 | 北京燕京中科生物技术有限公司 | 一种发酵法制备核酸酶p1的方法 |
| CN101067116A (zh) * | 2007-05-25 | 2007-11-07 | 南京工业大学 | 一株高产核酸酶p1的桔青霉菌及其选育方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 半连续发酵及其应用研究进展;孙文敬等;《食品科学》;20130115;345-349 * |
| 响应面法优化桔青霉产核酸酶P1培养基;喻晨等;《食品科学》;20110915;283-286 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104560913A (zh) | 2015-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Behera | Citric acid from Aspergillus niger: a comprehensive overview | |
| CN104560913B (zh) | 一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶p1的方法 | |
| Silbir et al. | Levan production by Zymomonas mobilis in batch and continuous fermentation systems | |
| CN110218713A (zh) | 一种提高桔青霉产核酸酶p1酶活的方法 | |
| Sheu et al. | Production of high-purity neofructooligosaccharides by culture of Xanthophyllomyces dendrorhous | |
| Lai et al. | Optimization of submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides from Lignosus rhinocerus | |
| CN101748177B (zh) | 优化的脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12方法与合成培养基 | |
| CN104250660A (zh) | 一种抗菌肽发酵培养基处方 | |
| Chen et al. | Cost‐effective process for the production of Monascus pigments using potato pomace as carbon source by fed‐batch submerged fermentation | |
| CN104059857B (zh) | 一株曲霉及其在制备果糖基转移酶中的应用 | |
| CN104762360A (zh) | 新特性腈水合酶诱导的高含量烟酰胺合成 | |
| CN106282145B (zh) | 一种腺苷酸脱氨酶的液态发酵方法 | |
| WO2023103543A1 (zh) | 一种核酸酶p1的制备方法 | |
| CN102433289B (zh) | 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法 | |
| CN106754829A (zh) | 一种利用芽孢杆菌hs17发酵生产壳聚糖酶的方法及其应用 | |
| CN106282146B (zh) | 一种腺苷酸脱氨酶的固态发酵方法 | |
| CN102399845A (zh) | 基于尾气中co2浓度的维生素b12发酵生产控制工艺 | |
| CN106520634B (zh) | 一种根瘤菌及其在海藻糖制备中的应用 | |
| CN105400836A (zh) | 提高不饱和脂肪酸含量的生产方法 | |
| CN103642879B (zh) | 一种生产腺苷蛋氨酸的方法 | |
| CN103757086A (zh) | 大肠杆菌与酿酒酵母偶联合成s-腺苷甲硫氨酸的制备方法 | |
| CN106676019B (zh) | 一种利用微生物发酵生产虾青素的方法 | |
| CN105331649A (zh) | 一种连续生产γ-氨基丁酸的方法 | |
| CN106399403A (zh) | 一种微生物生产羟基甲基苯蚁酸的方法 | |
| CN105647881A (zh) | 一种高活力漆酶液的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |