CN105331649A

CN105331649A - 一种连续生产γ-氨基丁酸的方法

Info

Publication number: CN105331649A
Application number: CN201510724879.9A
Authority: CN
Inventors: 刘建民; 高艳华; 高先岭
Original assignee: National Power Bio Tech Ltd Jinan
Current assignee: National Power Bio Tech Ltd Jinan
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2015-11-02
Publication date: 2016-02-17

Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种应用复合工程手段生产γ-氨基丁酸的方法，该方法包括步骤（1）大肠杆菌菌体的发酵；（2）γ-氨基丁酸的合成；（3）大肠杆菌的连续发酵和γ-氨基丁酸的连续合成，所得最终转化液中GABA的浓度为152-180g/L。

Description

一种连续生产γ-氨基丁酸的方法

技术领域：

本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种应用复合工程手段生产γ-氨基丁酸的方法。

技术背景：

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutanoicacid，简称GABA)是一种在自然界广泛分布的非蛋白质氨基酸，分子量103.1，熔点203℃。GABA介导神经系统内40％以上的抑制性神经传导，可通过突触后膜超极化、减少离子内流和降低细胞代谢及氧消耗等机制，使突触后神经元处于保护性抑制状态，并通过突触前抑制减少谷氨酸释放，提高神经元活力阁。关于GABA生理功能的研究较多，如抗疲劳、降血压、促睡眠等。

GABA因较好的生理功能和应用前景受到广泛关注，并被应用于食品、医药和化妆品中。日本厚生省、欧洲食品安全局(EFSA)和美国食品药品管理局(FDA)承认乳酸菌发酵生产的GABA为天然食品添加剂。2009年，中国卫生部批准此类GABA为新资源食品。天然GABA已被应用到乳制品、软饮料、巧克力、调味品、烘焙食品和酒饮料中。

GABA生产包括化学合成法、植物富集法和微生物合成法。化学合成的GABA有原料残留，因此安全性差，不能添加到食品中；植物中GABA含量低，富集提取成本较高；而微生物合成GABA因安全性高、生产成本低和对环境友好更具开发价值。

随着基因工程技术的发展、工业微生物生物化学信息的增多、特别是工业生物载体系统的成功构建，现在研究者开始用基因工程技术构建产γ-氨基丁酸的菌种，为优良的γ-氨基丁酸生产菌株的筛选提供了可靠的技术保障，但是工程菌发酵的性状稳定性差，在生产γ-氨基丁酸过程中容易退化，且工程菌发酵工艺中原料浓度低，使得在工程菌有效活力批次内，产物的产量和转化率都较低。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种应用了有效整合发酵工程和酶工程的复合工程手段生产γ-氨基丁酸的方法，用以解决γ-氨基丁酸发酵生产产量和产率较低的问题。

本发明提供的γ-氨基丁酸的生产方法包括以下步骤：

一、大肠杆菌菌体的发酵

（1）发酵培养基的配制

甘油20-60g/L,玉米浆10.0-30.0g/L,棉籽蛋白粉10.0-30.0g/L,KH₂PO₄1.0-10.0g/L,MgSO₄0.05-5.0g/L，溶剂为水，充分溶解后，加入培养基质量0.01-1%的乳糖或IPTG。

（2）大肠杆菌的接种与增殖

无菌条件下，在发酵罐中，应用上述培养基接种大肠杆菌2-5%（体积质量比），pH调节至5-7，转速500r/min，然后，于35-39℃下培养5h。

（3）大肠杆菌的富集

大肠杆菌增殖5h后，添加补加培养基并调控发酵参数来对大肠杆菌进行富集，补加培养基组成（质量体积比）为：氨水20%~30%，甘油20-60%，乳糖或IPTG1-5%，溶剂为水；控制参数为：溶氧不低于30%，发酵液中甘油含量维持在5~10g/L。

二、γ-氨基丁酸的合成

（4）大肠杆菌经富集后，当生物量达80~100g/L稳定时，停止搅拌，放出80-85%体积的发酵液，对取出的发酵液用陶瓷膜进行过滤洗涤，得到的菌体进入以下反应体系中，该反应体系依次加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，使其浓度为：磷酸二氢钾浓度5~10g/L，磷酸氢二钾浓度3~8g/L。而后，将该反应体系加入到转化罐中，并分批加入谷氨酸，使谷氨酸浓度维持在22~50g/L，调节pH为4~6，将转化罐升温至30~45℃，通气比为1:1，200rpm搅拌速度下反应15小时后终止反应。

三、大肠杆菌的连续发酵和γ-氨基丁酸的连续合成

（5）向步骤（4）取出发酵液后的发酵罐中，补入连续发酵培养基后，按照步骤（2）的工艺参数继续发酵，并且重复步骤（3）和（4）4-9次后，终止发酵，得到共5-10次合成γ-氨基丁酸的转化液。

上述连续发酵培养基的质量百分比配置如下：甘油50-100g/L,玉米浆10.0-30.0g/L,棉籽蛋白粉10.0-30.0g/L,KH₂PO₄1.0-10.0g/L,MgSO₄0.05-5.0g/L。

本发明方法具有如下优点：

（1）以玉米浆、棉籽蛋白粉为主要原料进行发酵，显著降低了GABA的生产成本。

（2）菌种经过连续发酵，一次接种增殖，菌体重复利用生产，减少了菌种的制备，简化发酵的工艺，降低生产成本及劳动强度。

（3）菌种经过连续的发酵驯化，GABA的生产强度显著提高，最终转化液中GABA含量达到152-180g/L。

（4）本发明实现了GABA的连续生产，过程简单，连续性强，便于工业放大生产。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明提供的γ-氨基丁酸的生产方法进行具体说明。

实施例1

（1）按下述配方配制发酵培养基：甘油40g/L,玉米浆20.0g/L,棉籽蛋白粉20.0g/L,KH₂PO₄5.0g/L,MgSO₄2.0g/L，溶剂为水，充分溶解后，加入发酵培养基质量0.05%的乳糖。

（2）大肠杆菌的接种与增殖

无菌条件下，在发酵罐中，应用上述培养基接种大肠杆菌3%（体积质量比），pH调节至6，转速500r/min，然后，于37℃下培养5h。

（3）大肠杆菌的富集

然后，添加补加培养基并调控发酵参数来对大肠杆菌进行富集，补加培养基组成为：氨水25%，甘油40%，乳糖或IPTG1%，溶剂为水；控制参数为：溶氧不低于30%，发酵液中甘油含量维持在7g/L。

（4）γ-氨基丁酸的合成

大肠杆菌经富集后，当生物量达90g/L稳定时，停止搅拌，放出80%体积的发酵液，对取出的发酵液用陶瓷膜进行过滤洗涤，得到的菌体进入以下反应体系中，该反应体系依次加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，使其浓度为：磷酸二氢钾浓度7g/L，磷酸氢二钾浓度5g/L。而后，将该反应体系加入到转化罐中，并分批加入谷氨酸，使谷氨酸浓度维持在40g/L，调节pH为5，将转化罐升温至40℃，通气比为1:1，200rpm搅拌速度下反应15小时后终止反应。

（5）大肠杆菌的连续发酵和γ-氨基丁酸的连续合成

向步骤（4）取出发酵液后的发酵罐中，补入连续发酵培养基后，按照步骤（2）的工艺参数继续发酵，并且重复步骤（3）和（4）9次后，终止发酵，得到共10次合成γ-氨基丁酸的转化液。

上述连续发酵培养基的质量百分比配置如下：甘油70g/L,玉米浆20.0g/L,棉籽蛋白粉20.0g/L,KH₂PO₄5.0g/L,MgSO₄3.0g/L。

发酵结束后，检测得转化液中GABA的含量能达到180g/L。

实施例2-5

与实施例1的方法相同，区别在于所用三种培养基的组分和工艺参数，具体区别以及所得最终转化液GABA含量见表1

表1实施例2-5培养基组分、工艺参数与实施例1的区别及最终转化液GABA含量

	发酵培养基乳糖含量（%）	大肠杆菌接种量（%）	补加培养基甘油含量（%）	转化体系谷氨酸浓度（g/L）	连续发酵培养基甘油含量（g/L）	GABA浓度（g/L）
							实施例2	0.01	2	20	22	50	152
实施例3	0.03	3	30	30	60	163
							实施例4	0.07	4	50	35	80	180
实施例5	1	5	60	50	100	176

Claims

1.一种连续生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括步骤

（1）大肠杆菌菌体的发酵；

（2）γ-氨基丁酸的合成；

（3）大肠杆菌的连续发酵和γ-氨基丁酸的连续合成。

2.根据权利要求1所述的一种连续生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的步骤（1）大肠杆菌具体的发酵的具体步骤为：

发酵培养基的配制

甘油20-60g/L,玉米浆10.0-30.0g/L,棉籽蛋白粉10.0-30.0g/L,KH₂PO₄1.0-10.0g/L,MgSO₄0.05-5.0g/L，溶剂为水，充分溶解后，加入培养基质量0.01-1%的乳糖或IPTG；

大肠杆菌的接种与增殖

无菌条件下，在发酵罐中，应用上述培养基接种大肠杆菌2-5%（体积质量比），pH调节至5-7，转速500r/min，然后，于35-39℃下培养5h；

大肠杆菌的富集

3.根据权利要求1所述的一种连续生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的步骤（2）γ-氨基丁酸的合成的具体步骤为：

大肠杆菌经富集后，当生物量达80~100g/L稳定时，停止搅拌，放出80-85%体积的发酵液，对取出的发酵液用陶瓷膜进行过滤洗涤，得到的菌体进入以下反应体系中，该反应体系依次加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，使其浓度为：磷酸二氢钾浓度5~10g/L，磷酸氢二钾浓度3~8g/L，而后，将该反应体系加入到转化罐中，并分批加入谷氨酸，使谷氨酸浓度维持在22~50g/L，调节pH为4~6，将转化罐升温至30~45℃，通气比为1:1，200rpm搅拌速度下反应15小时后终止反应。

4.根据权利要求1所述的一种连续生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的步骤（3）大肠杆菌的连续发酵和γ-氨基丁酸的连续合成的具体的步骤为：

向步骤（4）取出发酵液后的发酵罐中，补入连续发酵培养基后，按照步骤（2）的工艺参数继续发酵，并且重复步骤（3）和（4）4-9次后，终止发酵，得到共5-10次合成γ-氨基丁酸的转化液。

5.根据权利要求4所述的一种连续生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的连续培养基的组成为：甘油50-100g/L,玉米浆10.0-30.0g/L,棉籽蛋白粉10.0-30.0g/L,KH₂PO₄1.0-10.0g/L,MgSO₄0.05-5.0g/L。