CN110218713B - 一种提高桔青霉产核酸酶p1酶活的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体公开一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。本发明通过在使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基,对桔青霉进行半连续发酵,制备获得含有核酸酶P1的发酵液。该本发明方法单批发酵时间由56h缩短至20h,酶活由2500U/mL提高至7100‑7500U/mL。本发明所用的产酶促进剂添加量少,成本低,操作简单,效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。
背景技术
5'-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中,己经由最初的食品助鲜剂,扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂,可以添加在面包、饼干等食品中,尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显,能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力,减少腹泻的发生;在医药领域,5'-核苷酸不但能够作为药物使用,而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料;此外,核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂,有着明显的增产、增重功效。
核苷酸生产主要采取三种方法:化学合成法、微生物发酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四种核苷酸的混合物,且酶反应收率较高,国内外工业化生产核苷酸均采用此法。在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl,它是一种能够水解RNA获得四种5'-核苷酸的磷酸二酯酶,其酶解产物杂质少后续分离工艺简单,国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。
桔青霉属于不对称青霉组,绒状青霉亚组,桔青霉系,是核酸酶P1的重要生产菌种。国内外生产核酸酶P1主要通过桔青霉液体深层发酵,现有方法方法耗时较长酶活较低。如何高效的生产核酸酶P1,降低生产成本,已成为核苷酸生产的首要任务。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足,提供一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基,利用桔青霉进行半连续发酵,制备获得含有核酸酶P1的发酵液。
其中,所述的桔青霉为CGMCC No.2014,该菌株记载在中国专利CN101067116A中。
其中,所述的植酸类化合物为植酸钙镁、植酸钾和植酸锌中的任意一种或多种,优选植酸钙镁和植酸锌中的任意一种或两种组合,发酵培养基中植酸类化合物总浓度为0.001~1g/L,优选0.1~0.8g/L,更优选0.1~0.3g/L。
其中,所述的表面活性剂为吐温80、吐温60和司盘80的任意一种或多种,优选吐温80和司盘80中的任意一种或两种组合,发酵培养基中表面活性剂总浓度为0.001~5g/L,优选0.1~3g/L,更优选0.5~2g/L。
其中,所述的核酸类物质为RNA、DNA和核苷酸的任意一种或多种,优选RNA和核苷酸中的任意一种或两者组合,更优选RNA,发酵培养基中核酸类物质总浓度为0.001~5g/L,优选0.1~3g/L,更优选0.5~2g/L。
其中,所述的发酵培养基组分如下:葡萄糖0.5~50g/L,蛋白胨0.05~5g/L,磷酸二氢钾0.01~5g/L,磷酸氢二钾0.01~5g/L,硫酸镁0.01~5g/L,氯化钙0.01~5g/L,植酸类化合物0.001~1g/L,表面活性剂0.001~5g/L,核酸类物质0.001~5g/L,溶剂为水,pH5~8;
其中,所述的发酵培养基组分优选如下:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,植酸钙镁0.2g/L,植酸锌0.1g/L,Tween-80 0.5g/L,司盘-80 0.5g/L,RNA 0.5g/L,pH6,溶剂为水。
其中,所述的半连续发酵为桔青霉在发酵罐中发酵一段时间,开始周期性地放出部分含有产物的发酵液,然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法,具体方法:a,桔青酶在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7100-7500U/mL左右;b,放出发酵液体积80%,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,向发酵罐补加相同体积无菌发酵培养基继续培养,发酵20个小时左右酶活稳定在7100-7500U/mL左右;c,重复上述步骤b,如此循环补料5次,停止半连续发酵。
其中,所述的含有核酸酶P1的发酵液的酶活为7100~7500U/mL。
本发明中,核酸酶P1酶活定义:将1.9mL的底物溶液(含有浓度为1%左右的RNA;0.2M pH5.2的醋酸缓冲液以0.0005M的ZnSO4)于70℃恒温水浴10min后,加入0.1mL经适当稀释的酶液,70℃保温15min后加入2.0mL核酸沉淀剂(0.25%钼酸铵-2.5过氯酸),冰水浴20min后离心、取上清液用蒸馏水稀释一定倍数,测定其260nm处的吸光值为A260。以先加沉淀剂者作为对照,其它操作同前。在上述条件下,每分钟所生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下技术优势:
本发明通过添加植酸类化合物、表面活性剂类物质和核酸类物质进行发酵,单批发酵时间由56h缩短至20h,酶活由2500U/mL提高至7100-7500U/mL。该方法可以显著的缩短发酵工时提高发酵酶活,所用的产酶促进剂添加量少,成本低,操作简单,效果明显,减少生产成本。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,植酸钙镁0.2g/L,植酸锌0.1g/L,Tween-80 0.5g/L,司盘-80 0.5g/L,RNA 0.5g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵:10L搅拌罐中装入6L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7300U/mL左右,放出发酵液体积4.8L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制4.8L发酵培养基打入发酵罐再次培养,20h后酶活稳定至7300U/mL,再次放出4.8L发酵液,同样方法补入4.8L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7300U/mL左右,停止半连续发酵。
对比例1:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,pH 6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例1。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4100U/mL,放出4.8L发酵液,同样方法补入4.8L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在2650U/mL,停止半连续发酵。
实施例2:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,植酸钙镁0.2g/L,植酸锌0.1g/L,Tween-80 0.5g/L,司盘-80 0.5g/L,RNA0.5g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵:100L搅拌罐中装入60L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7400U/mL左右,放出发酵液体积48L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制48L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7480U/mL,再次放出48L发酵液,同样方法补入48L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7340U/mL左右,停止半连续发酵。
对比例2:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,pH 6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例2。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4170U/mL,放出48L发酵液,同样方法补入48L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在3730U/mL,第2次补料发酵58h后酶活明显下降,只有2540U/mL,停止半连续发酵。
实施例3:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,植酸钙镁0.2g/L,植酸锌0.1g/L,Tween-80 0.5g/L,司盘-80 0.5g/L,RNA 0.5g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵:1000L搅拌罐中装入600L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7500U/mL左右,放出发酵液体积480L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制480L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7500U/mL,再次放出480L发酵液,同样方法补入480L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7500U/mL左右,停止半连续发酵。
对比例3:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,pH 6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例3。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4220U/mL,放出480L发酵液,同样方法补入480L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在2690U/mL,停止半连续发酵。
实施例4:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,植酸钙镁0.2g/L,植酸锌0.1g/L,Tween-80 0.5g/L,司盘-80 0.5g/L,RNA 0.5g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵:2000L搅拌罐中装入1200L培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7480U/mL左右,放出发酵液体积960L,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制960L发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7380U/mL,再次放出960L发酵液,同样方法补入960L新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7410U/mL左右,停止半连续发酵。
对比例4:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,pH 6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例4。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4190U/mL,放出960L发酵液,同样方法补入960L新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在3830U/mL,第4次补料发酵58h后酶活明显下降,只有2440U/mL,停止半连续发酵。
实施例5:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,植酸钙镁0.2g/L,植酸锌0.1g/L,Tween-80 0.5g/L,司盘-80 0.5g/L,RNA 0.5g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵:20T搅拌罐中装入12T培养基,灭菌后接入经麦芽汁斜面培养基培养的桔青霉菌种进行发酵培养,在发酵罐中温度为30℃的条件下发酵56小时后酶活稳定在7500U/mL左右,放出发酵液体积9.6T,发酵罐中存留的发酵液作为下一批发酵种子,配制9.6T发酵培养基打入发酵罐再次培养。20h后酶活稳定至7500U/mL,再次放出9.6T发酵液,同样方法补入9.6T新鲜培养基。如此循环补料5次,酶活均在7500U/mL左右,停止半连续发酵。
对比例5:
发酵培养基的配制:葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,磷酸氢二钾0.5g/L,硫酸镁0.2g/L,氯化钙0.2g/L,pH 6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例5。用培养条件发酵,但是发酵培养基不加植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质,56h后酶活稳定至4170U/mL,放出9.6T发酵液,同样方法补入9.6T新鲜培养基。发酵55h,酶活稳定在3610U/mL,第3次补料发酵58h后酶活明显下降,只有2640U/mL,停止半连续发酵。
实施例6:
发酵培养基的配制:葡萄糖50g/L,蛋白胨4g/L,磷酸二氢钾4.8g/L,磷酸氢二钾4.5g/L,硫酸镁3.4g/L,氯化钙3.8g/L,植酸钙镁0.02g/L,植酸钾0.07g/L,Tween-800.05g/L,司盘-80 0.005g/L,RNA 0.05g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例3。
实施例7:
发酵培养基的配制:葡萄糖10g/L,蛋白胨0.96g/L,磷酸二氢钾3.1g/L,磷酸氢二钾3.6g/L,硫酸镁0.9g/L,氯化钙5.0g/L,植酸钙镁0.52g/L,植酸钾0.37g/L,Tween-600.75g/L,司盘-80 1.5g/L,核苷酸3.5g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例1。
实施例8:
发酵培养基的配制:葡萄糖15g/L,蛋白胨1.5g/L,磷酸二氢钾4.1g/L,磷酸氢二钾2.5g/L,硫酸镁4g/L,氯化钙2.1g/L,植酸钙镁0.33g/L,植酸锌0.26g/L,Tween-60 0.75g/L,司盘-80 0.5g/L,DNA 0.5g/L,pH6,121℃灭菌15min,降温至30℃左右备用。
半连续发酵同实施例5。
从实施例1~5与对比例1~5的结果可以看出,本发明通过添加植酸类化合物、表面活性剂类物质和核酸类物质进行发酵,单批发酵时间由56h缩短至20h,酶活由2500U/mL提高至7100~7500U/mL。且该方法可以显著的缩短发酵工时提高发酵酶活,所用的产酶促进剂添加量少,成本低,操作简单,效果明显,减少生产成本。
Claims (4)
1.一种提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,使用包含植酸类化合物、表面活性剂和核酸类物质的发酵培养基,利用桔青霉进行半连续发酵,制备获得含有核酸酶P1的发酵液;
其中,所述的桔青霉为CGMCC No.2014;
其中,所述的植酸类化合物为植酸钙镁和植酸锌的两种组合物;
其中,所述的表面活性剂为吐温80和司盘80的两种组合物;
其中,所述的核酸类物质为RNA;
其中,发酵培养基中表面活性剂总浓度为1g/L;植酸类化合物的总浓度为0.3g/L;核酸类物质总浓度为0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的发酵培养基的组分如下:葡萄糖0.5~50g/L,蛋白胨0.05~5g/L,磷酸二氢钾0.01~5g/L,磷酸氢二钾0.01~5g/L,硫酸镁0.01~5g/L,氯化钙0.01~5g/L,植酸类化合物0.3g/L,表面活性剂1g/L,核酸类物质0.5g/L,溶剂为水,pH5~8。
3.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的半连续发酵,其发酵温度为30℃,单批发酵时间为20h。
4.根据权利要求1所述的提高桔青霉产核酸酶P1酶活的方法,其特征在于,所述的含有核酸酶P1的发酵液的酶活为7100~7500U/mL。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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