CN105647881A

CN105647881A - 一种高活力漆酶液的制备方法

Info

Publication number: CN105647881A
Application number: CN201610143931.6A
Authority: CN
Inventors: 李松; 汤斌; 陈阿娜; 刘宇; 杨倩
Original assignee: Anhui Polytechnic University
Current assignee: Anhui Polytechnic University
Priority date: 2016-03-14
Filing date: 2016-03-14
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2036-03-14
Also published as: CN105647881B

Abstract

本发明公开了一种高活力漆酶液的制备方法，包括如下步骤：步骤一，使用固体斜面活化栓菌以制备斜面种子；步骤二，将斜面种子在种子培养基中接种培养以制备种子培养液；步骤三，将种子培养液在发酵培养基中进行发酵产漆酶。所获高活力漆酶液的发酵制备工艺简单、稳定，具有周期短、重复性好等特点，所生产的漆酶液可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。

Description

一种高活力漆酶液的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高活力漆酶液的制备方法。

背景技术

栓菌属微生物，属于担子菌门的白腐真菌(white-rotfungi)。白腐真菌靠降解木质素—纤维素材料的能力穿入木质，侵入木质细胞腔内，释放降解性酶，导致木质腐烂并呈白色，是降解芳香化合物能力最强的微生物。

漆酶(EC1.10.3.2)，属于蓝多铜氧化酶(bluemulticopperoxidases,MCOs)家族的一种，能够在氧气作为电子受体的条件下氧化芳香族化合物，且底物作用特异性低。漆酶不仅可以氧化多酚类芳香族化合物，还可以利用在小分子介体的介导下形成的漆酶/介体体系(LMS)氧化非酚类物质或其它更为复杂的大分子。漆酶可选择性的去除木质纤维素中的木质素，有效地对偶氮染料进行脱色，还可以去除环境中酚类药物或其它类似毒性物质。因此，漆酶在生物质能源、纺织、造纸、废报纸脱墨、食品、生物修复和生物传感器等领域具有重要的研究和应用价值。

漆酶广泛存在于木腐真菌中，并在植物、真菌、细菌和昆虫等物种中也有发现。研究指出高等真菌，尤其是担子菌门的白腐真菌，是目前最主要的漆酶生产菌种。白腐真菌主要利用分泌出的过氧化物酶(LiPs、MnPs和漆酶)对木质素进行催化氧化反应，从而降解木质素分子。与其它两种木质素降解酶LiPs和MnPs相比，漆酶是目前唯一一个实现工业化生产和应用的木质素降解酶。白腐真菌的产酶水平一般在几个至几十个单位每毫升之间不等，极少能够达到100U/mL以上，且发酵时间通常在两周左右，甚至达到一个月之久，使得产酶水平低和产酶周期长成为目前限制漆酶工业化生产和应用的主要瓶颈问题。

由于摇瓶发酵与工业大生产发酵在发酵级别和发酵工艺方面存在巨大差异，因此工业酶制剂在研发到生产的历程中，必须经历一个实验室逐级放大发酵的过程。小型发酵罐内发酵工艺参数的获得可为酶发酵的工业放大提供基本参考数据和时间基础，在酶的工业化生产中具有极其重要的地位。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种高活力漆酶液的制备方法，目的是得到较高活力的漆酶液，所生产的漆酶液可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种高活力漆酶液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，使用固体斜面活化栓菌以制备斜面种子；

步骤二，将斜面种子在种子培养基中接种培养以制备种子培养液；

步骤三，将种子培养液在发酵培养基中进行发酵产漆酶。

所述栓菌保藏编号为：CCTCCNO：M2015191，拉丁文名称为Trametessp.LS-10C，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年04月03日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

斜面种子的具体制备方法为：将该栓菌的超低温(-80℃)甘油冻结管保藏管取出，在10～25℃温度下缓慢回温并溶解，使用无菌接种环挑取含有栓菌菌丝的保藏液体并划线固体斜面培养基(500mL茄子瓶装斜面培养基100mL)，置于30℃恒温培养箱内培养3～5d，使栓菌菌丝长度达到5～10mm，即可作为斜面种子使用。

每L斜面培养基含有：土豆浸出汁20mL(取200g土豆去皮加入800mL水，煮沸0.5h，冷却后定容到1000mL)，葡萄糖20g，琼脂粉20g，pH为6.0。

所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，所述斜面种子先接种入一级种子培养基进行液体摇床培养得一级种子培养液，再将一级种子培养液接种入二级种子培养基在发酵罐中进行种子液扩大培养得二级种子培养液。

一级种子液的具体制备方法为：每个培养好的茄子瓶使用40mL无菌水进行洗涤，吸取30mL洗涤后获得的菌丝悬液接入270mL无菌的一级种子培养基中，接种后种子培养基装液量为1L三角瓶装300mL培养基。接种后置于恒温震荡培养摇床中培养，培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，培养48h后，即可作为一级种子液使用。

每L一级种子培养基含有：酵母浸出物5g，葡萄糖10g，麦芽糖10g，氯化铵3g，蛋白胨20g，pH为5.5。

二级种子液的具体制备方法为：将上述培养好的一级种子液全部接种入装有无菌二级种子培养基的全自动搅拌式通气发酵罐，终装料系数为70～80％，罐压设定为0.03～0.06MPa，温度控制为28～30℃，发酵液pH控制为4.0～6.0，搅拌转速控制在300～500r/min之间，通气量控制在0.3～0.6vvm之间，溶解氧浓度控制在30％～50％之间。在上述条件下培养40h后，即获得二级种子液。

所述二级培养基的配方为：每L二级种子培养基含有：葡萄糖10g，10％麸皮浸出汁100g，氯化铵5g，酵母粉2g，五水硫酸铜0.1g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，pH为5.5。

二级种子培养基中所使用的10％麸皮浸出汁按如下方法配置：准确称取100g麸皮，加入1000mL蒸馏水并煮沸30分钟后使用4层纱布过滤，过滤液使用蒸馏水定容至1000mL，即得所述10％麸皮浸出汁。

步骤三中发酵产漆酶具体方法为：将二级种子发酵罐内培养的种子液全部转入三级发酵罐中。罐压设定为0.03～0.08MPa，温度控制为28～30℃，发酵液pH控制为4.0～6.0，搅拌转速控制在300～700r/min之间，通气量控制在0.3～0.8vvm之间，溶解氧浓度控制在20％～60％之间。在上述发酵条件下，分别在发酵时间为48h、96h和144h时向发酵罐内加入500mL营养液，发酵培养8d后获得高活力漆酶液。

所述发酵培养基的配方为：每L含有麦芽糖、葡萄糖之一或其混合物10～40g，10％麸皮浸出汁80～120g，氯化铵、酒石酸铵、豆粕、豆饼粉之一或其混合物5～10g，酵母粉、蛋白胨之一或其混合物2.5g，五水硫酸铜0.1～0.4g，氯化钠1g，磷酸二氢钾2g。

所述发酵培养基配方中10％麸皮浸出汁配置方法同二级种子制备过程中所使用的方法。

为了进一步的增强产漆酶的活力，步骤三发酵过程中通过加酸或者加减控制pH为4。此时得到的漆酶活力相对较高。

所述步骤三中还包括在发酵过程中添加营养液，通过添加营养液，能够使得发酵产漆酶的活力得到很大的提高。

所述营养液的配方为：每L含有麦芽糖、葡萄糖、蔗糖之一或其混合物300～450g，五水硫酸铜0～20g，硝酸铵、硝酸钾或其混合物50～100g，吐温-802～5g。

从所述步骤三中漆酶培养过程中每24h从发酵液中放出50mL液体并对其漆酶活力进行测定，发酵8d后发酵液中的漆酶活力达到970U/mL以上；

漆酶活力的检测方法为：

底物溶液：使用0.1M，pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液配置0.5mMABTS(2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))溶液，即为漆酶活力测定底物溶液；

粗酶液处理：吸取0.5mL发酵液于1.5mL离心管中，在室温条件下使用高速离心机(12000r/min)离心10min，吸取上清0.5mL并使用0.1M，pH4.0的醋酸/醋酸钠缓冲液稀释至1000～5000mL，即得到粗酶液；

酶促反应体系：分别将底物溶液和反应粗酶液置于40℃恒温水浴锅中预热5min后，吸取1.5mL反应粗酶液加入1.5mL底物溶液中，立即充分混匀并分别记录在0至60秒、61至120秒、121秒至180秒内反应液在420nm处吸光值的变化，以上述3次测定的吸光值变化值的平均值记为反应体系平均每min吸光值的变化值；

漆酶活力定义：在上述酶促反应条件下，定义1min内氧化1μmolABTS所需要的酶量为一个漆酶活力单位(U)，并将漆酶发酵活力表示为U/mL。

本发明有益效果是：

1.菌体对溶解氧浓度适应范围广，发酵工艺参数易于控制；

2.发酵pH适应范围广，工艺控制简单；

3.采用逐级放大发酵，主体发酵周期短，节省发酵能耗；

4.利用铜离子诱导和补加营养液，显著提升漆酶发酵活力；

5.重复发酵性能稳定，发酵活力高达900U/mL以上；

6.为栓菌漆酶的工业放大奠定基本工艺参数。

7、所生产的漆酶液可以被应用与生物质能源、纺织、食品、生物修复、造纸等方面。

附图说明

下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1是栓菌在不同pH条件下产漆酶活力值；

图2是本发明的实施例5中栓菌产漆酶发酵曲线。

图中：

1、还原糖消耗曲线；2、菌体生长曲线；3、漆酶发酵活力曲线。

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的工作原理、制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

本发明利用全自动搅拌式通气发酵罐，通过控制溶解氧(或pH、温度、罐压力、搅拌转速)，以酒石酸氨(或豆粕、氯化铵、豆饼粉)为氮源，以麸皮汁(或麦芽糖、葡萄糖)等为碳源，以硫酸铜为产酶诱导因子经液态发酵生产高活力漆酶液。具体实施例如下：

实施例1

将该栓菌的超低温(-80℃)甘油冻结管保藏管取出，在20℃温度下缓慢回温并溶解，使用无菌接种环挑取含有栓菌菌丝的保藏液体并划线固体斜面培养基(500mL茄子瓶装斜面培养基100mL)，置于30℃恒温培养箱内培养4d，使栓菌菌丝平均长度达到6mm左右，使用40mL无菌水进行洗涤，吸取30mL洗涤后获得的菌丝悬液接入270mL无菌的一级种子培养基中，接种后种子培养基装液量为1L三角瓶装300mL培养基。接种后置于恒温震荡培养摇床中培养，培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，培养48h后获得一级摇瓶种子液。将上述培养好的一级种子液全部接种入装有2.1L无菌二级种子培养基的全自动搅拌式通气发酵罐，发酵罐总体积为3L，终装料系数为80％(装液量为2.4L)，罐压设定为0.04MPa，搅拌转速控制在400r/min，通气量控制在0.5vvm，溶解氧浓度控制在40％，温度控制在30℃，发酵液pH控制在5.0。在上述条件下培养40h后，即获得二级种子液。

在总容积为30L的全自动通气式发酵罐内装入21L发酵培养基，并将3L二级种子液全部转接入发酵罐内，使接种后总装料体积为24L，即装液量为80％。发酵过程中，罐压设定为0.05MPa，搅拌转速控制在500r/min之间，通气量调节为0.5vvm，将溶解氧浓度控制在40％左右，温度控制在30℃，使用10％氨水或5％磷酸将发酵液pH控制在4.0。在上述发酵条件下，分别在发酵时间为48h、96h和144h时向发酵罐内加入500mL营养液，发酵培养9d后获得活力为930U/mL的漆酶液，如图1所示。

每L二级种子培养基含有：葡萄糖10g，10％麸皮浸出汁100g，氯化铵5g，酵母粉2g，五水硫酸铜0.1g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g，pH为5.5。

每L发酵培养基含有：葡萄糖20g，麦芽糖10g，10％麸皮浸出汁120g，氯化铵5g，酒石酸铵1g，豆粕5g，酵母粉2g，五水硫酸铜0.2g，氯化钠1g，磷酸二氢钾2g。

每L营养液含有：葡萄糖300g，麦芽糖100g，五水硫酸铜20g，硝酸钾20g，硝酸铵10，吐温-802g。

实施例2

本实施例与实施例1的不同点在于，将实施例1中发酵产漆酶过程中的发酵液pH控制在6.0，其它工艺条件不变。发酵培养9d后获得活力为860U/mL的漆酶液，如图1所示。

实施例3

本实施例与实施例1的不同点在于，在总容积为30L的全自动通气式发酵罐内装入18L发酵培养基，并将3L二级种子液全部转接入发酵罐内，使接种后总装料体积为21L，即装液量为70％。其它工艺条件均不变。

发酵培养9d后获得活力为950U/mL的漆酶液。

实施例4

本实施例与实施例1的不同点在于，发酵产漆酶过程中发酵罐的罐压设定为0.06MPa，通气量控制在0.5vvm，通过调节搅拌转速(300～700r/min)将溶解氧浓度控制在10％，其它工艺条件不变。发酵培养9d后获得活力为910U/mL的漆酶液。

实施例5

本实施例与实施例1的不同点在于发酵培养基组分的不同，其它工艺条件不变。发酵培养9d后获得活力为970U/mL的漆酶液。发酵产漆酶的发酵曲线如图2所示。

每L发酵培养基含有：葡萄糖25g，麦芽糖1,5g，10％麸皮浸出汁100g，氯化铵5g，酒石酸铵1g，豆粕5g，酵母粉2g，五水硫酸铜0.5g，氯化钠1g，磷酸二氢钾2g。

实施例6

本实施例与实施例5的不同点在于，发酵过程中，在发酵培养基中添加的营养液组分不同，其它工艺条件不变。发酵培养9d后获得活力为820U/mL的漆酶液。

每L营养液含有：葡萄糖400g，硝酸钾30g，吐温-802g。

实施例7

本实施例与实施例5的不同点在于，发酵过程中，在发酵培养基中不添加营养液，其它工艺条件不变。发酵培养9d后获得活力为650U/mL的漆酶液。

实施例8

本实施例与实施例5的不同点在于，发酵过程中，在发酵培养基中不通过加酸/碱控制pH，其它工艺条件不变。发酵培养9d后获得活力为950U/mL的漆酶液。

实施例9

本实施例与实施例5的不同点在于，在发酵培养基中不添加硫酸铜，其它工艺条件不变。发酵培养9d后获得活力为260U/mL的漆酶液。

上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种高活力漆酶液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，使用固体斜面活化栓菌以制备斜面种子；

步骤三，将种子培养液在发酵培养基中进行发酵产漆酶。

2.根据权利要求1所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：所述栓菌保藏编号为：CCTCCNO：M2015191。

3.根据权利要求1所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，所述斜面种子先接种入一级种子培养基进行液体摇瓶培养得一级种子培养液，再将一级种子培养液接种入二级种子培养基在发酵罐中进行种子液扩大培养得二级种子培养液。

4.根据权利要求3所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：所述二级培养基的配方为：每L二级种子培养基含有：葡萄糖10g，10％麸皮浸出汁100g，氯化铵5g，酵母粉2g，五水硫酸铜0.1g，氯化钠1g，磷酸二氢钾1g。

5.根据权利要求3所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：制备所述二级种子培养液的发酵罐发酵工艺参数为：终装料系数为70～80％，罐压设定为0.03-0.06MPa，温度控制为28～30℃，搅拌转速控制在300～500r/min之间，通气量控制在0.3～0.6vvm之间，溶解氧浓度控制在30％～50％之间。

6.根据权利要求3所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：步骤二和步骤三的发酵过程中控制pH＝4～6。

7.根据权利要求1所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：步骤三中发酵的工艺参数为：罐压设定为0.03～0.08MPa，温度控制为28～30℃，搅拌转速控制在300～700r/min之间，通气量控制在0.3～0.8vvm之间，溶解氧浓度控制在20％～60％之间。

8.根据权利要求1所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：每L含有麦芽糖、葡萄糖之一或其混合物10～40g，10％麸皮浸出汁80～120g，氯化铵、酒石酸铵、豆粕、豆饼粉之一或其混合物5～10g，酵母粉、蛋白胨之一或其混合物2.5g，五水硫酸铜0.1～0.4g，氯化钠1g，磷酸二氢钾2g。

9.根据权利要求1所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：所述步骤三中还包括在发酵过程中添加营养液。

10.根据权利要求9所述高活力漆酶液的制备方法，其特征在于：所述营养液的配方为：每L含有麦芽糖、葡萄糖、蔗糖之一或其混合物300～450g，五水硫酸铜0～20g，硝酸铵、硝酸钾或其混合物50～100g，吐温-802～5g。