CN102061327B - 一种枯草菌脂肽钠的制备方法 - Google Patents
一种枯草菌脂肽钠的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种枯草菌脂肽钠的制备方法。本发明以保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8作为出发菌株，接种斜面培养基31～35℃培养48～72h，4℃保藏2～15d，然后取斜面菌落接种于种瓶培养基培养，最后接种发酵培养基发酵制备枯草菌脂肽钠。本发明所述制备方法还包括分离纯化步骤，所述分离纯化包括对枯草菌脂肽钠发酵液预处理所得枯草菌脂肽钠粗提物进行纯化步骤。本发明所述制备方法，发酵24～72h后，枯草菌脂肽钠粗提物的产量达到15～25g/L，经纯化后制得枯草菌脂肽钠成品，纯度达到80％以上，可应用于化妆品、食品、医药、洗涤剂、农药和土壤修复等领域。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体的说是涉及一种枯草菌脂肽钠的制备方法。
背景技术
表面活性剂(Surfactants)是指能显著降低溶剂表面张力和液-液界面张力，并具有一定结构、亲水亲油特性和特殊吸附性能的物质，包括化学表面活性剂和生物表面活性剂。化学表面活性剂大都是以石油为原料化学合成而来，在生产和使用过程中常常会带来严重的环境污染问题。生物表面活性剂(Biosurfactants)是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质，除了具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的特性，如具有结构多样性，较低的毒性，较高的生物可降解性，良好的生物相容性，高的起泡性，对极端的温度、pH值和盐浓度有较高的选择性和专一性，可以由低廉的可再生原料生产得到等特点，因此在环保、石油开采、医药、食品加工等领域具有较大的应用研究价值。
枯草菌脂肽钠是枯草菌脂肽的钠盐，枯草菌脂肽译为Surfactin，是一种由枯草芽孢杆菌合成的环肽，多以钠盐形式应用。自1968年被Arima等人首次发现以来，Surfactin一直是表面活性最强、研究较多的生物表面活性剂之一，被广泛应用在食品工业、环境工业作为良好的生物相容性表面活性剂。除了具有较强的表面活性外，Surfactin还能增加憎水烃类的可生物降解性，在受烃类污染土壤和海洋的生物修复中发挥重要作用，它还能与部分重金属结合而移除受污染土壤和沉积物中的重金属，并具有一定的抗菌活性等。然而，产量低一直制约着Surfactin的广泛应用，Arima等人发现Surfactin时其产量只有0.05～0.10g/L，1997年Kim等人在限氧的条件下采用改进的Cooper培养基培养枯草芽孢杆菌C9，Surfactin产量达7.0g/L，2007年贡国鸿等人提出的Surfactin的制备方法，Surfactin产量达到5～13g/L。然而，到目前为止Surfactin仍然无法实现产业化生产，Surfactin产量仍然不能满足商业化用途。因此，如何降低成本而得到较高的枯草菌脂肽钠产量成为目前研究的焦点。
另一方面，生物表面活性剂生产成本较高，是化学生物表面活性剂的3～10倍，其中产物的提取和下游的处理费用占生产费用的绝大部分。因此，开发简单廉价的产物分离和提纯方法十分必要。在预处理发酵液时由于产品和菌体的特殊性导致发酵液粘度大，菌液分离成本高昂。2000年，Randhir等提出通过泡沫回收分离Surfactin。2007年Huei-Li Chen等利用酸沉淀和PVDF树脂吸附对Surfactin进行提纯操作。2007年贡国鸿等人用高速离心机离心去除菌体，上清液酸化得Surfactin粗提物后进行溶剂抽提。2008年Huei-Li Chen等又利用硫酸铵对Surfactin进行混合盐析，再通过超滤和纳滤收集Surfactin。2008年Mohd Hafez Mohd Isa等利用超滤膜过滤收集Surfactin。但以上工艺均为实验室手段，若进行工业化生产则成本较高。因此开发一种适合于工业化生产的简单廉价的枯草菌脂肽钠分离和提纯方法有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是提供一种产量高的枯草菌脂肽钠的制备方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种枯草菌脂肽钠的制备方法，包括：
步骤1：取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8接种斜面培养基31～35℃培养48～72h，4℃保藏2～15d，所述斜面培养基配方为：牛肉膏2～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化钠2～8g/L、琼脂粉10～25g/L；
步骤2：取斜面培养基保藏菌落接种于种瓶培养基，31～35℃培养20～28h，所述种瓶培养基配方为：葡萄糖15～25g/L、L-谷氨酸2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.5～3g/L；
步骤3：取种瓶培养液接种发酵培养基，31～37℃、150～350rmp培养24～72h，期间用1～3mol/L氢氧化钠溶液控制发酵液pH值大于6.8，所述发酵培养基配方为：葡萄糖或麦芽糖30～50g/L、可溶性淀粉或糊精30～50g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.5～3g/L。
其中，所述酵母提取物是以新鲜啤酒或面包酵母为主要原料，采用现代生物技术自溶法或加酶水解法工艺，经分离、精制浓缩、喷雾干燥而成的膏状或粉状产品，是一种由氨基酸类、肽类、水溶性维生素及糖类(主要是低聚糖和海藻糖)等组成的混合物，其总氮≥9.0％，α-氨基氮≥3.0％，灰份(以干基计)≤15％，NaCl≤2.0％，pH值(2％溶液)为5.0～7.0。
枯草菌脂肽钠来源于枯草芽孢杆菌发酵产物，结构为一种环状脂肽钠盐化合物，多以钠盐形式应用，其分子式为：C52H90N7NaO13，分子量为：1044。结构通式为：
本发明所述枯草菌脂肽钠的制备方法是以保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8作为出发菌株，接种斜面培养基31～35℃培养48～72h后4℃保藏2～15d，然后取斜面培养基保藏菌落接种种瓶培养基培养，最后接种发酵培养基发酵制备枯草菌脂肽钠。
枯草芽孢杆菌E8采用微生物划线法接种于所述斜面培养基，其中每两条线之间构成一个峰，单峰长为0.5cm、宽为0.2cm，单峰面积为0.5×0.2cm2，即0.1cm2。
其中，作为优选，本发明所述枯草菌脂肽钠的制备方法，按每50mL种瓶培养基接种0.1～0.5cm2斜面保藏菌落的接种量接种种瓶培养基。
更优选地是，取发酵培养基体积1.0～1.9％的种瓶培养液接种发酵培养基发酵制备枯草菌脂肽钠。
本发明在发酵过程中加入1～3mol/L氢氧化钠溶液，来控制发酵液pH值大于6.8，一方面有利于枯草芽孢杆菌E8菌体的生长，同时还可以使大部分枯草菌脂肽转变为枯草菌脂肽钠，而枯草菌脂肽钠是枯草菌脂肽的主要应用形式。
本发明所述枯草菌脂肽钠的制备方法通过控制菌种斜面的保藏时间，即E8菌种接种斜面培养基4℃保藏2～15d，使菌体在进入休眠状态前，抑制其生命活动，并且控制传代转接的菌量，即每50mL种瓶培养基接种0.1～0.5cm2E8菌种的斜面菌落，人为的控制菌体代谢，使菌体内积累大量参与代谢的酶，提高菌体内代谢酶的浓度，提高菌体在产物生成期的代谢能力，达到提高菌株产能的目的。
本发明所述枯草菌脂肽钠的制备方法还包括对步骤3所得发酵液进行分离纯化。
本发明所述枯草菌脂肽钠分离纯化包括：
步骤I：枯草菌脂肽钠发酵液预处理制备枯草菌脂肽钠粗提物；
步骤II：溶解枯草菌脂肽钠粗提物，过滤收集滤液；
步骤III：调节滤液pH值沉淀蛋白，收集上清液；
步骤IV：步骤III所得上清液加入沉淀剂，收集沉淀，所述沉淀剂为氯化钠、磷酸钠盐、脂肪氨盐酸盐、烷磺酸钠、烷基酚醛树脂-聚氧丙烯聚氧乙烯醚、聚甲基苯基硅油-聚氧丙烯聚氧乙烯醚或超高分子聚氧丙烯聚氧乙烯醚；
步骤V：步骤IV所得沉淀用1～3mol/L氢氧化钠溶液溶解，调pH值至6～7，结晶、干燥制得枯草菌脂肽钠成品。
发酵液成分复杂，包括菌体，残存的固体培养基，未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物，而发酵液中发酵产物浓度较低，大多数仅为1％～10％，其余大部分为水，并且发酵液粘度大，性质不稳定，易被空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解。因此大都需要对发酵液进行预处理，以达到分离除去菌体和其他悬浮颗粒的目的，同时除去一部分可溶性杂质，改变发酵液过滤特性，为提取和精制等后续工序创造有利条件。
本发明步骤I所述发酵液预处理为发酵液过滤除菌体，调节pH值至2～5，0～8℃静置12～20h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽钠粗提物。
其中，作为优选，所述发酵液过滤除菌体为发酵液升温至30～95℃，保温0.1～2h，调节发酵液pH值至2～5，再调节发酵液pH值至6～7，过滤收集滤液。
发酵液升温至30～95℃，保温0.1～2h，以降低发酵液的粘度，改善发酵液过滤特性，然后用酸调节发酵液pH值至2～5，使未被微生物完全利用的蛋白质和本发明所述枯草菌脂肽沉淀，枯草菌脂肽钠仍溶解于发酵液中，再用碱调发酵液pH值6～7，本发明所述枯草菌脂肽在pH值6～7的条件下复性溶解，而未被微生物完全利用的蛋白质则无法复性，发酵液过滤时，菌体和未被微生物完全利用的蛋白质被除去。然后利用等电点沉淀法，用酸调节滤液pH值至2～5，0～8℃静置12～20h，收集沉淀，干燥即得到枯草菌脂肽钠粗提物。
其中，作为优选，所述酸为盐酸、磷酸、草酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸和山梨酸中的一种或者几种的混合物；
作为优选，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸氢钠中的一种或几种的混合物。
本发明步骤I所述发酵液预处理利用加热、无机酸或有机酸和碱对发酵液进行处理，抑制菌体的活性，增强菌体颗粒的刚性，降低发酵液粘度；同时，还可以调整产物带电荷状态，从而改变发酵液过滤特性，大大提高产品收率，并减轻了后续工段压力。
本发明所述分离纯化步骤II所述溶解枯草菌脂肽钠粗提物为加入溶解剂溶解，所述溶解剂为醇类、脂类或烷类，所述溶解剂加入量为每1g枯草菌脂肽钠粗提物加入溶解剂5～30mL。作为优选，所述溶解在35～40℃、100～200rpm下，搅拌2～5h。
本发明所述溶解枯草菌脂肽钠粗提物还包括加入增溶剂，以促进枯草菌脂肽钠粗提物溶解，所述增溶剂为聚山梨酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、吐温、司盘类、硫酸化蓖麻油或十二烷基硫酸钠，所述增溶剂与所述溶解剂的体积比为1∶100～10000。
本发明所述分离纯化步骤II所述溶解枯草菌脂肽钠粗提物还包括在溶解枯草菌脂肽钠粗提物过滤所得滤液中加入活性炭脱色，所述活性炭的加入量为所得滤液重量的0.2％～3.0％。
本发明所述分离纯化步骤III所述调节滤液pH值沉淀蛋白为向滤液中加入碱溶液调节滤液pH值至6.5～7.0，离心收集滤液，以去除碱性杂蛋白，然后加入酸溶液调节滤液pH值至3.5～5.5，离心收集滤液，以去除酸性杂蛋白。其中，作为优选，所述碱溶液为碳酸钠、碳酸氢钠、焦磷酸钠、柠檬酸钠、苹果酸钠和硬脂酸钠(C17H35COONa)中的一种或几种的混合物，所述酸溶液为盐酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、草酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、延胡索酸和山梨酸中的一种或几种的混合物。
本发明所述分离纯化步骤IV所述上清液加入沉淀剂，收集沉淀为上清液加入沉淀剂，装入分液装置静止5～15h，弃去底部残渣，离心收集沉淀。其中，作为优选，所述沉淀剂为氯化钠饱和溶液、磷酸钠盐饱和溶液、脂肪氨盐酸盐饱和溶液、烷磺酸钠饱和溶液、烷基酚醛树脂-聚氧丙烯聚氧乙烯醚、聚甲基苯基硅油-聚氧丙烯聚氧乙烯醚或超高分子聚氧丙烯聚氧乙烯醚饱和溶液，所述纯化步骤2所得上清液与沉淀剂的体积比为1∶1～20。
本发明所述分离纯化步骤V所述沉淀用1～3mol/L氢氧化钠溶液溶解，调pH值至6～7，可以使步骤III调节pH值除杂蛋白过程中酸化成枯草菌脂肽的部分和未成盐的枯草菌脂肽全部转变成枯草菌脂肽钠。
本发明所述枯草菌脂肽钠的分离纯化步骤，还包括层析纯化。层析(Chromatography)是“色层分析”的简称，是利用各组分物理性质的不同，将多组分混合物进行分离的方法，分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。本发明所述层析纯化为用吸附树脂或离子交换树脂纯化。
吸附层析是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离的目的。本发明以吸附树脂作为吸附剂，利用吸附树脂对不同组分吸附力的差异进行分离纯化。其中，所述吸附树脂为XAD-7中性吸附树脂、Sephadex LH-20树脂或聚偏氟乙烯树脂。
离子交换树脂纯化是利用离子树脂与溶液中的离子之间所发生的交换反应进行分离的方法，本发明所述离子交换树脂为带电离子交换树脂AGl-X4或强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
实验表明，本发明所述枯草菌脂肽钠的制备方法，发酵24～48h后，枯草菌脂肽钠粗提物的产量达到15～25g/L，HPLC检测枯草菌脂肽钠纯品含量达到5～8g/L。枯草菌脂肽钠粗提物经纯化后制得枯草菌脂肽钠成品，纯度达到80％以上，可应用于洗涤剂、农药和土壤修复领域。进一步利用层析纯化，纯度达到90％以上，可以作为化妆品和食品添加剂以及药物前体使用。
附图说明
图1示本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物的国家生物医学中心鉴定检测图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种枯草菌脂肽钠的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种枯草菌脂肽钠的制备方法进行详细说明。
实施例1：本发明所述培养基配制
斜面培养基：牛肉膏2～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化钠2～8g/L、琼脂粉10～25g/L；
种瓶培养基：葡萄糖15～25g/L、L-谷氨酸2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.5～3g/L；
发酵培养基：葡萄糖或麦芽糖30～50g/L、可溶性淀粉或糊精30～50g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.5～3g/L。
实施例2：本发明所述枯草菌脂肽钠的发酵制备和发酵液预处理
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8接种于斜面培养基，31℃培养48h后，4℃保藏2d，然后取0.1cm2的斜面培养基菌落接种至含50mL种瓶培养基中，31℃培养20h，按1.0％的接种量转接至发酵培养基中，1～3mol/L氢氧化钠溶液控制发酵液pH值大于6.8，31℃、150rmp培养24h，收集发酵液。发酵液过滤除菌体，发酵上清液调节pH值至2.0，0℃静置12h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽钠粗提物。
实施例3：本发明所述枯草菌脂肽钠的发酵制备和发酵液预处理
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8接种于斜面培养基，35℃培养72h后，4℃保藏15d，然后取0.5cm2的斜面培养基菌落接种至含50mL种瓶培养基中，35℃培养28h，按1.9％的接种量转接至发酵培养基中，1～3mol/L氢氧化钠溶液控制发酵液pH值大于6.8，37℃、350rmp培养72h，收集发酵液。发酵液过滤除菌体，发酵上清液调节pH值至5.0，8℃静置20h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽钠粗提物。
实施例4：本发明所述枯草菌脂肽钠的发酵制备和发酵液预处理
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8接种于斜面培养基，35℃培养48h后，4℃保藏15d，然后取0.1cm2的斜面培养基菌落接种至含50mL种瓶培养基中，35℃培养20h，按1.9％的接种量转接至发酵培养基中，1～3mol/L氢氧化钠溶液控制发酵液pH值大于6.8，31℃、350rmp培养24h，收集发酵液。发酵液过滤除菌体，发酵上清液调节pH值至5.0，0℃静置20h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽钠粗提物。
实施例5：本发明所述枯草菌脂肽钠的发酵制备和发酵液预处理
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8接种于斜面培养基，31℃培养72h后，4℃保藏2d，然后取0.5cm2的斜面培养基菌落接种至含50mL种瓶培养基中，31℃培养28h，按1.0％的接种量转接至发酵培养基中，1～3mol/L氢氧化钠溶液控制发酵液pH值大于6.8，37℃、150rmp培养72h，收集发酵液。发酵液过滤除菌体，发酵上清液调节pH值至2.0，8℃静置12h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽钠粗提物。
实施例6：本发明所述枯草菌脂肽钠的发酵制备和发酵液预处理
取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌E8接种于斜面培养基，33℃培养60h后，4℃保藏8d，然后取0.3cm2的斜面培养基菌落接种至含50mL种瓶培养基中，33℃培养24h，按1.5％的接种量转接至发酵培养基中，1～3mol/L氢氧化钠溶液控制发酵液pH值大于6.8，35℃、200rmp培养48h，收集发酵液。发酵液过滤除菌体，发酵上清液调节pH值至4.0，4℃静置16h，收集沉淀，干燥即得枯草菌脂肽钠粗提物。
实施例7：本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物的鉴定
取实施例2所制备的枯草菌脂肽钠粗提物，送国家生物医学中心，利用9.4四级杆傅立叶变换离子回旋共振质谱仪分析方法测定主要成分及分子量。检测条件为正离子检测方式，离子源为电喷雾电离子源，检测结果见图1。
图中m/z＝994、1008、1022、1036、1050峰为Surfactin的同系物，m/z＝1016、1030、1044、1058、1072峰为其钠盐。由图1可知，本发明所制备枯草菌脂肽钠粗提物中Surfactin的含量很少，主要成分为枯草菌脂肽钠盐。
实施例8：本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物测定
取实施例2～6发酵制备枯草菌脂肽钠的发酵上清液，每个实施例各取2批，命名1～10，每批量取发酵上清液20mL于烧杯中，用盐酸调节发酵上清液pH值至4.0左右，4℃静置12h，10℃、9000rpm离心25min，收集沉淀60℃烘箱烘干72h即得枯草菌脂肽钠粗提物，称量并计算枯草菌脂肽钠粗提物含量，结果见表1，其中枯草菌脂肽钠粗提物含量计算公式为：
枯草菌脂肽钠粗提物含量(g/L)＝枯草菌脂肽钠质量(g)/发酵上清液体积(L)。
进一步利用HPLC测定枯草菌脂肽钠粗提物中枯草菌脂肽钠纯品含量。以乙腈-3.8mM三氟乙酸溶液(80∶20)为流动相。准确称取枯草菌脂肽钠标准品0.0050g，用流动相配制成含量为2mg/mL的溶液，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取滤液，即得对照品溶液。分别准确称取0.0050g每批枯草菌脂肽钠粗提物至5mL具塞离心管中，加入流动相配制成1mg/mL试样，震荡溶解，用微孔滤膜(0.45μm)过滤，取滤液，即得待测样品溶液。
采用内标法计算枯草菌脂肽钠纯品含量，并计算枯草菌脂肽钠纯品纯度，结果见表1。其中，纯度按下式计算：
纯度＝枯草菌脂肽钠粗提物含量/枯草菌脂肽钠纯品含量×100％。
表1本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物中枯草菌脂肽钠含量
由表1结果可知，本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物含量达到15～25g/L，HPLC测定枯草菌脂肽钠粗提物中枯草菌脂肽钠纯品含量达到5～8g/L，制备的枯草菌脂肽钠纯度为25～35％，而2007年贡国鸿等人提出的制备方法，枯草菌脂肽粗提物含量仅为5～13g/L，表明本发明所述枯草菌脂肽钠的制备方法，枯草菌脂肽钠产量高。
实施例9：本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物的分离纯化
取枯草菌脂肽钠粗提物加入无水乙醇，每1g枯草菌脂肽钠粗提物加5mL无水乙醇，并添加1mL聚山梨酯，35～40℃水浴锅中150～250rpm的转速磁力搅拌5h。过滤，向所得滤液中加入0.2％的活性炭，吸附45min，抽滤去除活性炭。向抽滤所得滤液中滴加4.0～5.5mol/L的碳酸钠溶液并缓慢搅拌，调节滤液的pH值至6.5，10000rpm离心20min。然后取离心后的上清液，缓慢滴入4～5.5mol/L的盐酸溶液并缓慢搅拌，调节上清液的pH值至3.5，10000rpm离心20min。收集离心所得上清液，加入上清液20倍体积的氯化钠饱和溶液，然后装入分液装置中静置5h，弃去底部残渣，上清液8000rpm离心30min，收集沉淀，用1～3mol/L氢氧化钠溶液溶解并调pH值至6，干燥制得枯草菌脂肽钠成品。
实施例10：本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物的分离纯化
取枯草菌脂肽钠粗提物加入脂类，每1g枯草菌脂肽钠粗提物加10mL脂类，并添加1mL聚氧乙烯脂肪酸酯，35～40℃水浴锅中150～250rpm的转速磁力搅拌2h。过滤，向所得滤液中加入3.0％的活性炭，吸附45min，抽滤去除活性炭。向抽滤所得滤液中滴加焦磷酸钠溶液并缓慢搅拌，调节滤液的pH值至7.0，10000rpm离心20min。然后取离心后的上清液，缓慢滴入草酸溶液并缓慢搅拌，调节上清液的pH值至5，10000rpm离心20min。收集离心所得上清液，加入上清液1倍体积的磷酸氢二钠饱和溶液，然后装入分液装置中静置10h，弃去底部残渣，上清液8000rpm离心30min，收集沉淀，用1～3mol/L氢氧化钠溶液溶解并调pH值至7，干燥制得枯草菌肽钠成品。
实施例11：本发明所述枯草菌脂肽钠粗提物的分离纯化
取枯草菌脂肽钠粗提物加入甲烷，每1g枯草菌脂肽钠粗提物加10mL甲烷，35～40℃水浴锅中150～250rpm的转速磁力搅拌3h。过滤，向抽滤所得滤液中滴加硬脂酸钠溶液并缓慢搅拌，调节滤液的pH值至6.5，10000rpm离心20min。然后取离心后的上清液，缓慢滴入乳酸溶液并缓慢搅拌，调节上清液的pH值至4，10000rpm离心20min。收集离心所得上清液，加入上清液10倍体积的烷基酚醛树脂-聚氧丙烯聚氧乙烯醚，然后装入分液装置中静置15h，弃去底部残渣，上清液8000rpm离心30min，收集沉淀，用1～3mol/L氢氧化钠溶液溶解并调pH值至6.5，干燥制得枯草菌肽钠成品。
实施例12：本发明所述枯草菌肽钠成品离子交换树脂纯化
将适量的XAD-7中性吸附树脂装入层析柱中，取枯草菌肽钠成品配制成200～4000mg/L的水溶液，用0.1mol/L的HCl或NaOH调节溶液的pH值在6.5～7.0范围内，从层析柱顶端倒入，用无水乙醇洗脱，在柱子下端收集流出液，浓缩干燥，得到纯度较高的枯草菌脂肽钠。
实施例13：本发明所述枯草菌肽钠成品离子交换树脂纯化
将适量的Sephadex LH-20树脂装入层析柱中，取枯草菌肽钠成品配制成200～4000mg/L的水溶液，用0.1mol/L的HCl或NaOH调节溶液的pH值在6.5～7范围内，从层析柱顶端倒入，用无水乙醇洗脱，在柱子下端收集流出液，浓缩干燥，得到纯度较高的枯草菌脂肽钠。
实施例14：本发明所述枯草菌脂肽钠成品测定
取所制备的10批枯草菌脂肽钠粗提物按照实施例5～9所述的方法进行纯化，然后测定枯草菌脂肽钠成品含量，并利用HPLC进一步测定枯草菌脂肽钠成品中枯草菌脂肽钠纯品含量和纯度，结果见表2。
表2本发明所述枯草菌脂肽钠成品中枯草菌脂肽钠含量
由表2结果可知，本发明所述枯草菌脂肽钠成品含量达到5.5～7g/L，HPLC测定枯草菌脂肽钠成品中枯草菌脂肽钠纯品含量达到5～6g/L，制备的枯草菌脂肽钠纯度达到80％以上，而经离子交换树脂纯化后枯草菌脂肽钠纯度达到90％以上，符合国家化妆品、食品和药品相关规定，可作为化妆品和食品添加剂以及药物前体使用，表明本发明所述枯草菌脂肽钠纯化后枯草菌脂肽钠纯度高。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种枯草菌脂肽钠的制备方法，包括：
步骤1：取保藏编号为CGMCC No.1107的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）E8接种斜面培养基31～35℃培养48～72h，4℃保藏2～15d，所述斜面培养基配方为：牛肉膏2～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化钠2～8g/L、琼脂粉10～25g/L；
步骤2：取斜面保藏菌落接种于种瓶培养基，31～35℃培养20～28h，所述种瓶培养基配方为：葡萄糖15～25g/L、L-谷氨酸2～10g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.5～3g/L；
步骤3：取种瓶培养物接种于发酵培养基，31～37℃、150～350rmp培养24～72h，期间用1～3mol/L氢氧化钠溶液控制发酵液pH值大于6.8，所述发酵培养基配方为：葡萄糖或麦芽糖30～50g/L、可溶性淀粉或糊精30～50g/L、L-谷氨酸钠15～25g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、酵母提取物0.5～3g/L。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2所述接种的接种量为每50mL种瓶培养基接种0.1～0.5cm2斜面保藏菌落。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，步骤3所述种瓶培养物接种量为发酵培养基体积的1.0～1.9%。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，还包括对步骤3所得发酵液进行分离纯化。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述分离纯化包括：
步骤I：枯草菌脂肽钠发酵液预处理制备枯草菌脂肽钠粗提物；
步骤II：溶解枯草菌脂肽钠粗提物，过滤收集滤液；
步骤III：调节滤液pH值沉淀蛋白，收集上清液；
步骤IV：步骤III所得上清液加入沉淀剂，收集沉淀，所述沉淀剂为氯化钠、磷酸钠盐、脂肪氨盐酸盐、烷磺酸钠、烷基酚醛树脂聚氧丙烯聚氧乙烯醚、聚甲基苯基硅油-聚氧丙烯聚氧乙烯醚或超高分子聚氧丙烯聚氧乙烯醚；
步骤V：步骤IV所得沉淀用1～3mol/L氢氧化钠溶液溶解，调pH值至6～7，结晶、干燥得枯草菌肽钠成品。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤I所述发酵液预处理为发酵液过滤除菌体，调节pH值至2～5，0～8℃静置12～20h以上，收集沉淀，干燥得枯草菌脂肽钠粗提物。
7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤II所述溶解枯草菌脂肽钠粗提物为加入溶解剂溶解，所述溶解剂为醇类、脂类或烷类，所述溶解剂加入量为每1g枯草菌脂肽钠粗提物加入溶解剂5～30mL。
8.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤III所述调节滤液pH值沉淀蛋白为滤液先调节pH值至6.5～7.0，然后离心取滤液调节pH值至3.5～5.5，离心。
9.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，还包括层析纯化步骤。
10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述层析纯化为用吸附树脂或离子交换树脂层析纯化。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Sun Wen Inventor after: Yu Zengliang Inventor after: Gong Guohong Inventor after: Fan Jifeng Inventor after: Wang Mei Inventor after: Li Junjun Inventor after: Liu Jie Inventor after: Liu Mei Inventor after: Ding Shiqi Inventor before: Sun Wen Inventor before: Gong Guohong Inventor before: Fan Jifeng Inventor before: Wang Mei Inventor before: Li Junjun Inventor before: Liu Jie Inventor before: Liu Mei Inventor before: Ding Shiqi |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: SUN WEN GONG GUOHONG FAN JIFENG WANG MEI LI JUNJUN LIU JIE LIU MEI DING SHIQI TO: SUN WEN YU ZENGLIANG GONG GUOHONG FAN JIFENG WANG MEI LI JUNJUN LIU JIE LIU MEI DING SHIQI |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
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