CN103451126B - 一株铵根离子耐受型产丁二酸大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高浓度铵根离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌，其分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BEW308，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2013157。本发明还公开了上述大肠杆菌在丁二酸发酵生产中的应用。本发明采用等离子体诱变大肠杆菌，利用含有高浓度铵根离子浓度的合成培养基平板筛选出能够在厌氧条件下耐受高浓度铵根离子生长的菌体，该菌株可以在厌氧条件下，耐受高浓度的铵根离子，并积累丁二酸。在厌氧摇瓶中，72h菌体密度达到了OD600=5.1，丁二酸产量为20.3g/L，而原始出发菌株在该条件生长极其缓慢，72h菌体OD600仅为0.45，产酸量为3.96g/L。相对于出发菌株，丁二酸产量提高5倍。因此该突变株BEW308具有重大的社会意义和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株铵根离子耐受型产丁二酸大肠杆菌的筛选及应用，属于工业微生物育种及其发酵技术领域。
背景技术
丁二酸，又名琥珀酸，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。丁二酸作为TCA循环的中间产物以及厌氧代谢的终端还原产物之一，在生物代谢过程中占有非常重要的地位。近年来的研究结果表明丁二酸还可以作为C4平台化合物合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等大宗化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解聚酯。近年来，随着化石资源的日益枯竭和环境问题的日益严重，采用生物法制备丁二酸备受瞩目，美国能源部将丁二酸列为未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
相对于化学合成法，生物合成制备丁二酸的方法受到越来越多的关注。生物合成丁二酸，是利用细菌，真菌等各种微生物，以葡萄糖或其他各种水解液为碳源，经微生物发酵生产丁二酸，相对于化学合成的方法，其一大优势是原材料为酸成为近年来研究的热点。
发酵菌株是丁二酸生物合成的关键点之一,多数细菌和真菌都能产生丁二酸，但是只有部分菌株可产生高浓度的丁二酸,丁二酸工业生产菌包括一些丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌。目前,丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)，产丁二酸放线杆菌(Actinobacillu ssuccinogenes)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)等。其中Escherichiacoli由于遗传背景清楚，基因操作简单，生长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。
发酵法生产丁二酸的过程中需要加碱调节pH来维持菌体的最适生长产酸。目前能实现的工艺要求的pH调节剂主要有钠盐、钙盐、镁盐以及浓氨水，前三者有试剂消耗量大、价格昂贵、下游提取工艺复杂等缺点，而采用氨水调节pH发酵生产丁二酸工艺中，不需要消耗大量的试剂，生产的副产物少，结晶的丁二酸是唯一产物，该工艺具有闭合、清洁、廉价和高效等优点。
本申请人的在先专利中国专利申请菌株BER108（中国专利公开号102643770A，保藏编号CCTCC NO：2012068），由于铵离子对该菌株的生长和产酸都有抑制作用，用氨水调pH发酵效果不理想。为了实现氨水调节pH的廉洁工艺，选育可以耐受高浓度铵离子产丁二酸的菌株的工作显得尤为必要。通过改良菌株，使其可以在厌氧条件下耐受高浓度铵根离子并大量积累产酸，在今后的丁二酸生长工业中具有举足轻重的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一株高浓度铵根离子耐受型的大肠杆菌，使其可以积累丁二酸。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株铵根离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308，其保藏编号为：CCTCC NO：M2013157。
以氨水为pH调节剂进行丁二酸生产，当目标丁二酸产量为30g/L时，即丁二酸铵盐浓度为0.25mol/L，计算得NH4 +浓度为0.5mol/L。故菌株至少需耐受0.5mol/L铵根离子浓度。以(NH4)2HPO4提供铵根离子，考察了添加不同浓度铵根离子对BER108生长性能和产酸的影响。由图1可知，当铵根离子浓度为0.125mol/L和0.25mol/L时，菌体生长和产酸性能相差不大。然而，当培养基中铵根离子浓度达到0.5mol/L时，菌体的生长和产酸明显受到影响，菌体OD600仅为0.45，丁二酸产量仅为3.96g/L。该结果说明在高浓度铵根离子浓度下菌体生长以及产酸都受到严重的抑制。因此，选育一株厌氧条件下耐受高浓度铵根离子（0.5mol/L）并大量积累产酸的菌株是很有必要的。
本发明所述的耐受高浓度铵根离子，纯厌氧发酵产丁二酸的大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308的筛选方法，将大肠杆菌的出发菌株BER108经等离体诱变后，利用高浓度铵根离子合成培养基平板筛选得到能够在厌氧条件下生长的菌株，在经过厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产产丁二酸的菌株为目标菌株。
其具体步骤如下：
1）等离子诱变：将大肠杆菌原始菌株BER108在试管中活化，37℃，200r/min，过夜培养。得到的菌液用无菌生理盐水稀释至OD600=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80～120W为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～30s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变；
2）合成培养基平板初筛：将诱变后的载片置于装有1mL的生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌液洗脱，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃厌氧培养24h。挑选生长较大，较为饱满的菌落；
3）合成培养基平板复筛：将步骤2）中筛选到的菌株在合成培养基上反复转点培养，37℃厌氧培养24h，挑选生长较大，较为饱满的菌落；
4）厌氧摇瓶发酵筛选：将步骤3）中筛选出的菌株接种到种子培养基中扩大培养，37℃，200r/min，培养48h，然后在发酵培养基中发酵，接种量为2%（v/v），37℃，200r/min，培养72h；考察步骤3）中筛选出的菌落中筛选出生长速度快，产酸量高的菌株。
在上述筛选方法中，步骤1）中所述的等离子体诱变方法中，选择100W为射频功率，20SLM为气体流量，15s为辐照时间。
在上述筛选方法中，
种子培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
发酵培养基为：柠檬酸3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O10.0mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O0.25mg/L，MnSO4·H2O2.5mg/L，CoCl2·6H2O1.75mg/L，H3BO30.12mg/L，Al2(SO4)31.77mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，柠檬酸铁16.1mg/L，维生素B120mg/L，生物素2mg/L，葡萄糖30～40g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5mol/L，添加量为32g/L。
固体平板培养基为：发酵培养基+2%琼脂，葡萄糖10g/L。
本发明还提供上述的铵根离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌在发酵生产丁二酸的应用。
该应用的具体步骤为：
（1）平板培养：将大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为24h；
（2）种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308接种到种子培养基中，培养温度为37℃，200r/min，培养时间为48h；
（3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量2%（v/v），100mL厌氧摇瓶装液量为30mL，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳2min；培养温度为37℃，200r/min，培养时间为72h。
所述平板培养基配方为：柠檬酸3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O10.0mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O0.25mg/L，MnSO4·H2O2.5mg/L，CoCl2·6H2O1.75mg/L，H3BO30.12mg/L，Al2(SO4)31.77mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，柠檬酸铁16.1mg/L，琼脂20g/L，葡萄糖10g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5mol/L，添加量为32g/L。
所述种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
所述发酵培养基的配方为：柠檬酸3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O10.0mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O0.25mg/L，MnSO4·H2O2.5mg/L，CoCl2·6H2O1.75mg/L，H3BO30.12mg/L，Al2(SO4)31.77mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，柠檬酸铁16.1mg/L，碱式碳酸镁24～42g/L，葡萄糖30～40g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5mol/L，添加量为32g/L。
本发明的有益效果在于：
本发明采用等离子体诱变大肠杆菌，利用含有高浓度铵根离子的合成培养基平板，筛选出在厌氧条件下能够耐受高浓度铵根离子，并高产丁二酸的菌株。该菌株在厌氧条件下快速生长，并大量积累丁二酸；在厌氧摇瓶中，72h菌体密度达到了OD600=5.1，丁二酸产量为20.3g/L，而原始出发菌株BER108在该条件生长极其缓慢，72h菌体OD600仅为0.45，产酸量为3.96g/L。因此该菌株具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1为出发菌株BER108的铵根离子浓度与菌体生长和产酸性能关系图。
图2为大肠杆菌的等离子体诱变存活率曲线。
本发明的微生物分类命名为大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308，保藏日期为2013年4月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：M2013157。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本实施例说明将大肠杆菌原始菌株BER108进行第一步等离子体诱变的方法。
大肠杆菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：
将大肠杆菌BER108原始菌株（本申请人的在先专利中国专利申请菌株，公开号102643770A，保藏编号CCTCC NO：M2012068）在LB试管中活化，37℃，200r/min过夜培养；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；；以氦气为放电气体，以80～120W为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～30s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变，如图2所示；诱变后，将载片上的菌膜用1mL的无菌生理盐水洗脱下来，涂布在合成培养基平板上，在厌氧箱中培养。
实施例2
本实例说明筛选优良大肠杆菌的方法。
其中，所使用的培养基配方如下：
固体合成培养基平板：柠檬酸3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O10.0mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O0.25mg/L，MnSO4·H2O2.5mg/L，CoCl2·6H2O1.75mg/L，H3BO30.12mg/L，Al2(SO4)31.77mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，柠檬酸铁16.1mg/L，琼脂20g/L，葡萄糖10g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5mol/L，添加量为32g/L。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
摇瓶发酵培养基：柠檬酸3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O10.0mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O0.25mg/L，MnSO4·H2O2.5mg/L，CoCl2·6H2O1.75mg/L，H3BO30.12mg/L，Al2(SO4)31.77mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，柠檬酸铁16.1mg/L，碱式碳酸镁24～42g/L，葡萄糖30～40g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5mol/L，添加量为32g/L。
筛选步骤：
1、合成培养基平板初筛
将诱变后的载片置于装有1mL生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌体完全洗脱下来，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃厌氧培养24h，挑选出挑选生长速度快，较为饱满的菌落。
2、合成培养基平板复筛
将筛选到的菌株在平板上反复转点培养，最终得到了菌株BEW59、BEW61、BEW79、BEW103、BEW124、BEW150、BEW201、BEW267和BEW308显示了较强的生长速率和生长稳定性。
3、摇瓶发酵筛选
4、将菌株BEW59、BEW61、BEW79、BEW103、BEW124、BEW150、BEW201、BEW267和BEW308接入种子培养基中扩大培养，充二氧化碳2min，37℃，200r/min，培养48h。然后接种到发酵培养基中，100ml厌氧血清瓶装液量30mL，接种量2%（v/v），充二氧化碳2min，37℃，200r/min，培养72h。检测各个菌株菌体密度和丁二酸产量如表1所示：
表1突变菌株和出发菌株的生长及产算比较
在纯厌氧条件下，出发菌株耐受高浓度铵离子能力较差，生长速度极其缓慢，而且丁二酸的积累了也很低，但是经ARTP诱变后得到可以在纯厌氧条件耐受高浓度铵根离子生长产酸的菌株。经摇瓶发酵筛选，BEW308的菌株生长速率较快，且产酸较高。
实施例3
本实施例说明突变株BEW308的传代稳定性
在合成培养基平板上，将突变株BEW308多次转点培养，并将得到菌株分别进行发酵验证，实验结果如表2所示：
表2突变株BEW308传代稳定性分析
从实验结果可知，经过8次连续传代，突变株BEW308的丁二酸产量和丁二酸转化率都较为稳定，具有很好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌种。
实施例4
本实施例说明大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308发酵生产丁二酸的工艺。
本实施例所述的培养基配方：
平板培养基：柠檬酸3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O10.0mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O0.25mg/L，MnSO4·H2O2.5mg/L，CoCl2·6H2O1.75mg/L，H3BO30.12mg/L，Al2(SO4)31.77mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，柠檬酸铁16.1mg/L，琼脂20g/L，葡萄糖10g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5mol/L，添加量为32g/L。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
发酵培养基：柠檬酸3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO48g/L，MgSO4·7H2O1g/L，CaCl2·2H2O10.0mg/L，ZnSO4·7H2O0.5mg/L，CuCl2·2H2O0.25mg/L，MnSO4·H2O2.5mg/L，CoCl2·6H2O1.75mg/L，H3BO30.12mg/L，Al2(SO4)31.77mg/L，Na2MoO4·2H2O0.5mg/L，柠檬酸铁16.1mg/L，碱式碳酸镁24～42g/L，葡萄糖30～40g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5mol/L，添加量为32g/L。
将大肠埃希氏菌BEW308（Escherichia coli）BEW308接种至平板培养基，在厌氧箱中培养，培养温度37℃，培养时间24h。将平板培养的BEW308接种到种子培养基中，100mL血清瓶装液量30mL，充二氧化碳2min，培养温度37℃，200r/min，培养时间48h；将种子接种到发酵培养基中，接种量2%（v/v），100mL血清瓶装液量30mL，碱式碳酸镁作为pH调节剂调节pH为7.0，充二氧化碳2min，培养温度为37℃，200r/min，培养时间为72h。发酵培养72h后检测OD600为5.10，丁二酸的产量为20.3g/L，丁二酸转化率为75%，其初始菌株BER108发酵培养72h后OD600仅为0.45，丁二酸产量为3.96g/L，BEW308相比于BER108菌体OD600增大10倍，丁二酸产量提高了4倍。同时，BEW308相比于BER108在铵根离子浓度为0.125mol/L和0.25mol/L时丁二酸产量分别提高0.3倍和0.5倍。因此，BEW308能够耐受高浓度铵根离子（0.5mol/L）并高产丁二酸。
Claims (6)
1.一株铵根离子耐受型产丁二酸的大肠杆菌，其特征在于，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BEW308，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2013157。
2.权利要求1所述的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BEW308在发酵生产丁二酸的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，具体步骤为：
（1）平板培养：将大肠埃希氏菌BEW308接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37 °C，培养时间为24 h；
（2） 种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌BEW308 接种到种子培养基中，培养温度为37°C，200 r/min，培养时间为48 h；
（3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量2%，100 mL厌氧摇瓶装液量为30 mL，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳2 min；培养温度为37°C，200 r/min，培养时间为72 h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述平板培养基配方为：柠檬酸3 g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KH2PO4 8 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2·2H2O 10.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.5 mg/L，CuCl2·2H2O 0.25 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.75 mg/L，H3BO3 0.12 mg/L，Al2(SO4)3 1.77 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，柠檬酸铁 16.1 mg/L，琼脂20g/L，葡萄糖10g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5 mol/L，添加量为32 g/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种子培养基的配方为：蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 5g/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：柠檬酸3 g/L，Na2HPO4·12H2O 4g/L，KH2PO4 8 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2·2H2O 10.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.5 mg/L，CuCl2·2H2O 0.25 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.75 mg/L，H3BO3 0.12 mg/L，Al2(SO4)3 1.77 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，柠檬酸铁 16.1 mg/L，碱式碳酸镁 24~42g/L，葡萄糖30 ~40g/L，以(NH4)2HPO4提供铵根离子并使NH4 +浓度为0.5 mol/L，添加量为32 g/L。
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