CN1054616A - 编码具有腈水化酶活性的多肽的dna片段、含该基因的转化株和用该转化株生产酰胺的方法 - Google Patents

编码具有腈水化酶活性的多肽的dna片段、含该基因的转化株和用该转化株生产酰胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了由玫瑰色红球菌J-1产生的两种 腈水化酶的α-和β-亚单位的氨基酸顺序和核苷酸 顺序。将编码腈水化酶的DNA片段插入表达载体 并将该重组载体用于转化。转化株与常规用的微生 物相比含有基因的更多拷贝和能生产更大量的腈水 化酶。

Description

本发明涉及由玫瑰色红球菌J-1（Rhodococcus    rhodochrous    J-1）产生的并编码具有将腈水化为酰胺的腈水化酶活性的多肽的DNA片段。本发明还涉及含该DNA片段的重组DNA和用该重组DNA转化的转化株。本发明进一步涉及用该转化株生产腈水化酶和用该腈水化酶生产酰胺的方法。
公众已知腈水化酶是一种将腈水化为酰胺的酶。产生腈水化酶的微生物包括属于芽孢杆菌属（Bacillus）、杆菌属（Bacteridium）、微球菌属（Micrococcus）和短杆菌属（Brevibacterium）（参阅JP-B-62-21517.1989，USP    No.4001081）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和诺卡氏菌属（Nocardia）（参阅JP-B-56-17918/1989，USP    No.4248968）、假单胞菌属（Pseudomonas）（参阅JP-B-59-37951/1984，USP    No.4637982）、红球菌属（Rhodococcus）、节细菌属（Arthrobacter）和微杆菌属（Microbacterium）、（参阅JP-A-61-162193/1986，EP-A-0188316）和玫瑰色红球菌（Rhodococcus    rhodochrous）（参阅JP-A-2-470/1990，EP-A-0307926）。
腈水化酶已经用于将腈水化为酰胺。在本发明中，根据重组DNA技术，采用遗传工程方法使微生物含有编码腈水化酶的更多拷贝重组DNA。与常规所用的微生物相比，重组体产生显著高水平的腈水化酶。
本发明人先前公开了由Rhodococcus    sp.N-774（FERM-BP-1936）产生的DNA片段，该片段编码具有腈水化酶活性的多肽（JP-A-2-119778/1988）。
可是本发明人由玫瑰色红球菌J-1产生的DNA片段用于产生腈水化酶。我们分离到编码腈水化酶的基因，并将该基因插入到适当的质粒载体中，再用该重组质粒转化适当的寄主，从而成功地获得产生对芳腈具有高活性的腈水化酶的转化株。
本发明涉及如下几个方面。
（1）编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA（H）片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α（H）-和β（H）-亚单位：
α（H）-亚单位：
5    10    15
MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr
20    25    30
LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro
35    40    45
AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly
50    55    60
ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro
65    70    75
GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla
80    85    90
SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal
95    100    105
PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys
110    115    120
SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr
125    130    135
LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly
140    145    150
ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu
155    160    165
ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrIleValIle
170    175    180
ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu
185    190    195
ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla
200
LeuThrProGlnGluValIleVal
β（H）-亚单位：
5    10    15
MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro
20    25    30
ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu
35    40    45
GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle
50    55    60
SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn
65    70    75
GluAsnTyrValAsnGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp
80    85    90
LeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValAlaAspLysIleIleThr
95    100    105
GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleLeuGluGlyArg
110    115    120
TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnIle
125    130    135
GluLysAlaIleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu
140    145    150
ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLysIleLysVal
155    160    165
LysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal
170    175    180
ArgAsnLysIleGlyGluIleValAlaTyrHisGlyCysGlnIle
185    190    195
TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro
200    205    210
LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp
215    220    225
GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyr
LeuIleSerAla;
（2）编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA（L）片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α（L）-和β（L）-亚单位：
α（L）-亚单位：
5    10    15
MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn
20    25    30
GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal
35    40    45
AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer
50    55    60
ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal
65    70    75
AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr
80    85    90
AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln
95    100    105
GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn
110    115    120
MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu
125    130    135
GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg
140    145    150
AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr
155    160    165
ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu
170    175    180
LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn
185    190    195
PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu
200    205
IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAla
β（L）-亚单位：
5    10    15
MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro
20    25    30
IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu
35    40    45
ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla
50    55    60
PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro
65    70    75
HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla
80    85    90
MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu
95    100    105
LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr
110    115    120
ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln
125    130    135
LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu
140    145    150
AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla
155    160    165
SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg
170    175    180
ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp
185    190    195
ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr
200    205    210
ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
215    220    225
AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuPro
Ala
（3）含有编码所述α（H）-和β（H）-亚单位的核苷酸顺序的（1）的DNA（H）片段，包括：
α（H）-亚单位的DNA顺序：
15    30    45
GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC
60    75    90
AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC
105    120    135
GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC
150    165    180
CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT
195    210    225
GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG
240    255    270
TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC
285    300    315
TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT
330    345    360
TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC
375    390    405
AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA
420    435    450
GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG
465    480    495
GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC
510    525    540
CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG
555    570    585
ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG
600
CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA
β（H）-亚单位的DNA顺序：
15    30    45
ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG
60    75    90
GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG
105    120    135
GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA
150    165    180
TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC
195    210    225
GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG
240    255    270
CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC
285    300    315
GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG
330    345    360
TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC
375    390    405
GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT
420    435    450
CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTGGGTGACAAGATCAAAGTG
465    480    495
AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG
510    525    540
CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC
555    570    585
TATCCCGAGAGCAGCTCCGGGCGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG
600    615    630
CTCTACACGGTCGCGTTTTCGGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC
645    660    675
GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC
CTGATCTCTGCG
(4)含有编码α(L)-和β(L)-亚单位的核苷酸顺序的(2)的DNA(L)片段,包括:
α(L)-亚单位的DNA顺序:
15    30    45
ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC
60    75    90
GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC
105    120    135
GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG
150    165    180
GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC
195    210    225
GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC
240    255    270
GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG
285    300    315
GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC
330    345    360
ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC
375    390    405
GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC
420    435    450
GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC
465    480    495
CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA
510    525    540
CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC
555    570    585
TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC
600    615
ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC
β（L）-亚单位的DNA顺序：
15    30    45
ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG
60    75    90
ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG
105    120    135
CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG
150    165    180
TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG
195    210    225
CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG
240    255    270
ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA
285    300    315
CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG
330    345    360
ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA
375    390    405
CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG
420    435    450
GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC
465    480    495
TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT
510    525    540
GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC
555    570    585
ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC
600    615    630
GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG
645    660    675
AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG
GCC
（5）重组DNA，包括载体中（1）-（4）的DNA（H）或DNA（L）;
（6）用（5）的重组DNA转化的转化株;
（7）生产腈水化酶的方法，该方法包括培养（6）所述转化株，并由其培养物回收腈水化酶;
（8）生产酰胺的方法，该方法包括用（7）所述腈水化酶将腈水化成酰胺;
（9）生产酰胺的方法，该方法包括培养（6）所述转化株并用生成的培养物将腈水化成酰胺，所述培养物系经过分离的细菌细胞、其经过处理的或其固定的材料。
本发明详述如下。
本发明按以下（1）-（8）步骤进行：
（1）    腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排
由玫瑰色红球菌J-1（FERM    BP-1478）（CCTCC    No.M88091）（CGMCC：0143）分离并纯化H型和L型两种腈水化酶，用HPLC将其分离为α和β亚单位。测定该两种亚单位的部分氨基酸顺序（图1）。
（2）    制备用于腈水化酶基因的DNA探针
由于日本专利公报中所述的Rhodococcus    sp.N-774的腈水化酶β亚单位与玫瑰色红球菌J-1之间的腈水化酶β亚单位在氨基酸顺序上具有高度的同源性，因此由JP-A-2-119778/1990中所述的JM105/pYUK121（FERM    BP-1937）制备DNA探针。含有由Rhodococcus    sp.N-774产生的腈水化酶基因的质粒pYUK121是由JM105/pYUK121培养制备的。用SphI和SalⅠ消化pYUK    121    DNA。SphⅠ-SalⅠ片段含有Rhodococcus    sp.N-774的腈水化酶基因（图2）。用放射性同位素标记DNA片段。
（3）    检测含由玫瑰色红球菌J-1的染色体产生的腈水化酶基因的DNA片段
由玫瑰色红球菌J-1的培养物制备染色体DNA后，用限制酶对其进行消化，并按Southern杂交方法（Southern，E.M.，J.Mol.Biol，98，503，1975）将其与（2）所述探针杂交。筛选出不同长度的两个DNA片段。
（4）    重组质粒的构建
重组质粒的构建是将（3）所制备的染色体DNA片段插入质粒载体。
（5）    含有重组质粒的转化株的转化和筛选。
用（4）所述的重组质粒制备转化株。按菌落杂交方法（R.Bruce    Wallace    et.al.，Nuc.Aci.Res.9，879，1981），用（2）所述探针选择含重组质粒的转化株，并再用Southern杂交方法确认重组质粒中是否存在腈水化酶基因。由此选出的质粒命名为pNHJ10H和pNHJ20L。
（6）质粒DNA的分离和纯化以及限制性图的构建
分离和纯化（5）所制备的pNHJ10H和pNHJ20L的质粒DNA，构建DNA的限制性图（图3），以测定含腈水化酶基因的区域。
（7）DNA顺序的编排
用适当的限制酶切除插入在pNHJ10H和pNHJ20L中的DNA片段的多余片段，然后将插入的DNA片段用于顺序编排。DNA片段的核苷酸顺序（图4和5）显示其含有由（1）所述氨基酸顺序推导得到的顺序。
（8）用转化株生产腈水化酶并将腈转化为酰胺
培养（8）所述的转化株，将细菌细胞与作为腈水化酶底物的腈混合，生产酰胺。
玫瑰色红球菌J-1保藏在日本工业科学技术厅发酵研究所（FERM），保藏号为FERM    BP-1478。含（5）所述pNHJ10H的转化株TG1/pNHJ10H和含（5）所述pNHJ20L的转化株TG1/pNHJ20L也都保藏在该所，保藏号分别为FERM    BP-2777和FERM    BP-2778。
任何载体都可用于本发明，包括质粒载体（例如pAT153，pMP9，pHC624，pKC7等）和噬菌体载体（例如λgtll（Toyobo），Charon    4A（Amersham）等）。可用的酶包括SphI，SalI，SacI，BamHI和EcoRI等，它们均可通过商业途径得到（Takara    Shuao）。各种宿主都可用于转化，包括但不限于大肠杆菌JM105和大肠杆菌TG1。用于转化株的培养基系本领域常用的培养基。
将腈转化酰胺是用腈水化酶，粗制腈水化酶和转化株、分离的细菌细胞或其经处理过的材料等的培养物，它们均由转化株的培养物制备。
本发明适用的腈如欧洲专利公报No.0307926中所述，包括在芳族部分具有4-10个碳原子的芳族腈和具有2-6个碳原子的脂族腈。所述腈的典型例子是4-，3-和2-氰基吡啶，苄腈，2，6-二氟苄腈，2-噻吩腈，2-糠腈，氰基吡嗪，丙烯腈，甲基丙烯腈，巴豆腈，乙腈和3-羟丙腈。
本发明已经公开了由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α和β亚单位的氨基酸顺序和核苷酸顺序，插入表达载体编码腈水化酶的DNA片段，重组载体用于转化。与常规用的微生物相比，转化株含有更多的基因拷贝数和产生更大量的腈水化酶。
附图说明如下：
图1    表示由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α和β亚单位的N端氨基酸顺序;
图2    表示用作DNA探针的Rhodococcus    sp.N-774的腈水化酶基因的DNA顺序;
图3    表示重组质粒pNHJ10H和pNHJ20L的限制性图;
图4    表示在由玫瑰色红球菌J-1产生的pNHJ10H中的DNA片段的DNA顺序推导得到的氨基酸顺序。
图5    表示在由玫瑰色红球菌J-1产生的pNHJ20L中的DNA片段的DNA顺序和推导得到的氨基酸顺序。
本发明将通过以下实施例予以详细说明，但决不是以此来限制本发明。
在实施例中使用了以下省略符号：
TE：Tris-HCl（10    mM，pH7.8），EDTA（1mM，pH8.0）
TNE：Tris-HCl（50    mM，pH8.0），EDTA（1    mM，pH8.0），NaCl（50    mM）
STE：Tris-HCl（50    mM，pH8.0），EDTA（5    mM，pH8.0），蔗糖（35    mM）
2×YT培养基：1.6%胰蛋白胨，1.0%酵母膏，0.5%NaCl。
实施例
（1）腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排
在28℃下，将玫瑰色红球菌J-1在培养基中培养80小时。培养基含有酵母膏3g/l，KH2PO40.5g/l，K2HPO40.5g/l，MgSO4·4H2O 0.5g/l，CoCl20.01g/l和巴豆酰胺3g/l（pH7.0）。收集细菌细胞，取其50g用硫酸铵破碎和分级分离。将样品进行透析，并离心透析物。取其上清液装载在DEAE-Cellulofine色谱、Octyl-Senharose
Figure 911013237_IMG1
色谱、Phenyl-Sapharose CL-4B色谱和Sephadex G-150色谱上。收集和透析具有酶活性的两部分，将透析物用反向柱装载在HPLC（Senshu Pak VP-304-1251，Senshu Kagaku），得到两个亚单位（α和β）。用Applied Biosystems model 470A蛋白顺序仪测定α（H）-，β（H）-，α（L）-和β（L）-亚单位的N端氨基酸顺序。氨基酸顺序示于图1。
（2）用于腈水化酶基因的DNA探针的制备
在30℃下将含pYUK121的大肠杆菌JM105（FERM    BP-1937）培养在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜（12小时）。收集细胞细胞，加入TNE，离心该细胞悬浮液。将8ml    STE和10mg溶菌酶加到细胞碎片沉淀物中，该混合物在0℃下温育5分钟后加入4ml    0.25M    EDTA，然后再在室温下加入2ml的10%    SDS和5ml的5M    NaCl。生成的混合物在0-4℃下温育3小时后进行超速离心。以1/2体积的30%    PEG    6000加到上清液中，混合物在0-4℃下温育过夜（12小时）后离心。然后将TNE加入细胞碎片沉淀物中，使体积达到7.5ml，再将CsCl加到悬浮液中。混合物经离心去除蛋白质。将300-500mg/ml溴乙锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热封闭后进行超速离心，并用蠕动泵抽提cccDNA。将略多于等量的水饱和异丙醇加到提取液中，去除溴乙锭。样品经TE透析，得到约3ml纯化的pYUK121。
pYUK121 DNA用SphI和SalI消化，形成含由Rhodococcus sp.N-774产生的腈水化酶基因的2.07kb DNA片段。该片段用32P进行放射性同位素标记，产生探针。探针的核苷酸顺序示于图2。
（3）含染色体腈水化酶基因的DNA片段的制备
将玫瑰色红球菌J-1培养在100ml培养基中，培养基含有葡萄糖10g/l，KH2PO40.5g/l，K2HPO40.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨7.5g/l，CoCl20.01g/l，尿素7.5g/l，甘氨酸1%或氨苄青霉素0.2μg/ml，水11（pH7.2）。收集细菌细胞，细胞碎片经TNE洗涤后悬浮于10ml TE中，加4ml 0.25M EDTA，10-20mg溶菌酶，10-20mg非染色体蛋白酶（achro-moprotease）和10ml 10×SDS。悬浮液在37℃下温育3小时，再加15ml苯酚。该混合物在室温下温育15分钟后离心。取上层将0.7ml的2.5M乙酸钠和乙醚加到上清液中，然后再离心。滗去上层，向底层加二倍体积的乙醇，用玻璃棒取出DNA。该DNA依次用2∶8、1∶9和0∶10（V/V）的TE：乙醇各冲洗5分钟，然后再将DNA悬浮在2-4ml的TE（37℃）中。将10μl RNA酶A和T1的混合物加到悬浮液中，在37℃下温育，加入等量苯酚，离心。将多于等量的乙醚加到上清液中，离心。离心后，滗去上层，底层用21含少量氯仿的TE透析过夜后，再用新鲜的TE透析3-4小时。得到4ml粘制染色体DNA。然后按如下所述对染色体DNA进行酶消化：
将10μl    TE，3μl反应缓冲液（10X）和2μl    SacI加到15μl粗制染色体DNA中，该混合物在37℃下温育1小时后，在60V的琼脂糖上电泳3小时，用（2）所述探针进行染色体DNA的Southern杂交，得到约6.0kb和9.4kb片段，显示杂交情况极其良好。
15ml的染色体DNA按如上所述用SacⅠ消化，在琼脂糖上进行电泳。从凝胶上切下6.0kb和9.4kb DNA片段后置于3倍体积的8M NaClO4中。经加溶作用后，将各溶液点在GF/C（Whatman）滤纸（直径6mm）上，再在滤纸上先后滴加10滴（≌100ml）含6M NaClO4的TE和10滴（≌10ml）95%乙醇。滤纸经空气干燥3分钟后置于0.5ml Eppendorf管中，加40μl TE，在37℃下温育30分钟，离心。得到约40μl上清液，其中6.0kb和9.4kb DNA片段含有染色体DNA的腈水化酶基因。
按如下所述方法将6.0kb    DNA片段插入载体中，以同样方法将9.4Kb    DNA片段插入载体中。
（4）将染色体DNA片段插入载体
将2μl    SacⅠ、3μl反应缓冲液（10X）和10μl    TE加到10μl的pUC19    DNA中，在30℃下温育1小时，加2μl的0.25M    EDTA，终止反应。然后再加7μl    1M    Tris-HCl（pH9）和3μl    BAP（细菌碱性磷酸酶），在65℃温育1小时，将TE加到该混合物中，使总体积达到100μl，再用等量苯酚提取3次，在提取液中加等量的醚。取出底层，将10μl    3M乙酸钠和250μl乙醇加到该底层液中，在-80℃下温育30分钟，离心，干燥。再悬浮在TE中。
将由此得到的5μl    pUC19    DNA与（3）所述40μl的6.0kb    DNA片段混合后，加入6μl连接缓冲液、6μl    ATP（6mg/ml）和3μlT4DNA连接酶。该混合物在4℃温育过夜（12小时），产生的重组质粒含有编码pUC19的SacⅠ位点上所需酶的6.0kb    DNA片段。
（5）转化株的转化和筛选
将大肠杆菌TG1（Amersham）接种到10ml的2×YT培养基后，在37℃下温育12小时。温育后，将生成的培养物加到浓度为1%的新鲜的2×YT培养基中，该混合物在37℃下温育2小时后离心，将碎片沉淀物悬浮在5ml冷却的50mM CaCl2中。悬浮液在冰上下放置40分钟后离心，再将0.25ml冷却的50mM CaCl2和60μl的按（4）所述的重组DNA加到碎片沉淀物中。该混合物在0℃下温育40分钟，在42℃下热休克2分钟，置于冰上5分钟，然后将其加到10ml的2×YT培养基中，在37℃摇动培育90分钟，离心。将碎片沉淀物悬浮在1ml 2×YT培养基中，取10μl悬浮液两份分别置于含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂板上，在37℃下温育。用菌落杂交方法挑选生长在琼脂板上的菌落，将菌落转移到硝基纤维滤膜上进行消化。将DNA固定在滤膜上并与（2）所述探针杂交，滤膜经放射自显影后，选出重组菌落，再按Southern杂交方法确认转化株中是否存在腈水化酶基因。
（6）重组质粒的分离和纯化以及插入DNA片段限制性图的构建
在37℃下将按（5）选择的转化株在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜（12小时），收集细菌细胞，并将TNE加到细胞中。再离心收集细胞，并将8ml    STE和10mg溶菌酶加到细胞中。该混合物在0℃下温育5分钟后，加入4ml的0.25M    EDTA、2ml的10%SDS（室温）和5ml的5M    NaCl，在0-4℃下温育3小时后进行超速离心。将1/2体积的30%PEG    6000加到上清液中，在0-4℃下温育过夜（12小时），再进行离心。将TNE加到碎片沉淀物中，使体积达高至7.5ml。将CsCl加到悬浮液中，除去蛋白质。然后将300-500mg/ml溴化锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热密封后进行超速离心。用蠕动泵移取cccDNA，加入略多于等量的水饱和异丙醇，以除去溴化锭。DNA样品经TE透析，生成约3ml纯化的重组DNA。由此得到的重组质粒，含有6.7kb    DNA片段，命名为pNHJ10H（重组质粒含有9.4kb    DNA片段，命名为pNHJ20L）。
上述质粒DNA用EcoRI、BamHI，PstⅠ，SacⅠ和SalⅠ消化。构建的限制性图示于图3。
（7）DNA顺序的编排：
根据构建的限制性图和Southern杂交方法，测定腈水化酶基因在pNHJ10H的片段中的位置。用PstI和SalI切下pNHJ10H中的多余部分即在1.97Kb中形成的6.0Kb    DNA片段。并且EcoRI和SacI切下pNHJ20L中的多余部分即在1.73Kb中形成的9.4Kb    DNA片段。
采用Sanger方法（Sanger，F.，Science    214：1205-1210，1981）和M13噬菌体载体，将上述DNA片段编排顺序。1.97Kb    DNA片段（pNHJ10H）和1.73    Kb    DNA片段（pNHJ20L）的核苷酸顺序分别示于图4和5。
由核苷酸顺序推导得到的氨基酸顺序与（1）所测定的氨基酸顺序完全一致。顺序分析还证明，该DNA片段含有编码α和β亚单位的顺序。
（8）用转化株生产腈水化酶并用该酶将腈转化为酰胺
将TG 1/pNHJ10H和TG l/pNHJ20L接种到10ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于30℃下温育过夜（12小时）。将1μl生成的培养物加到100ml的2×YT培养基中（50μg/ml氨苄青霉素，0.1g CoCl2·6H2O/l）。该混合物在30℃下温育4小时，将IPTG加到该合物中，使其最终浓度为1mM，再在30℃下温育10小时。将细胞收集后，悬浮在5ml的0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.5）中。悬浮液经超声波破碎5分钟，在12000×g下离心30分钟。生成的上清液用于酶测定。酶测定是在含50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）、6mM苄腈和适量酶的反应混合物（12ml）中进行的。该反应在20℃下进行30分钟，加0.2ml的1 M HCl使反应终止。通过HPLC测定反应混合物中形成的苯甲酰胺的量。按上述同样方法但用由大肠杆菌TG1得到的混合物用作对照。当培养在有CoCl2和IPTG存在下的2×YT培养基中时，在含pNHJ10H和pNHJ20L的大肠杆菌无细胞提取液中腈水化酶活性分别为1.75×10-3和6.99×10-3单位/毫克。在TG l/pNHJ10H和pNHJ20L的反应混合物中获得了苯甲酰胺，而在TG1反应混合物中则无苯甲酰胺。

Claims (9)

1、编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(H)片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α(H)-和β(H)-亚单位：
α(H)-亚单位：
              5             10             15
MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr
             20             25             30
LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro
             35             40             45
AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly
             50             55             60
ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro
             65             70             75
GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla
             80             85             90
SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal
             95            100            105
PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys
            110            115            120
SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr
             125           130            135
LysSerMettGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly
            140            145            150
ValLeuLysArgAspPheGlyPheAsplleProAspGluValGlu
            155            160            165
ValArgValTrpAspSerSerSerGlulleArgTyrIleVallle
            170            175            180
ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu
            185            190            195
ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla
         200
LeuThrProGlnGlnValIleVal
β(H)-亚单位：
              5             10             15
MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro
             20             25             30
ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu
             35             40             45
GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle
             50            55             60
SerTrpTrpAspLySerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn
             65             70             75
GluAsnTyrValAsnGluLleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp
             80             85             90
LerSerAlaAlaGluArglleLcuValAlaAspLysLielleThr
             95            100            105
GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluLieLeuGluGlyArg
            110            115            120
TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnlle
            125            130            135
GluLysAlalleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu
            140            145            150
ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLyslleLysVal
            155            160            165
LysSerMetAsnProleuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal
            170            175            180
ArgAsnLyslleGlyGlulleValAlaTyrHisGlyCysGlnlle
            185            190            195
TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro
            200            205            210
LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp
            215            220            225
GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyr
LeuLlSerSla
2、编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA（L）片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α（L）-和β（L）亚单位：
α（L）-亚单位：
5  10  15
MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn
20  25  30
GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal
35  40  45
AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer
50  55  60
ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal
65  70  75
AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr
80  85  90
AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln
95  100  105
GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn
110  115  120
MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu
125  130  135
GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg
140  145  150
AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr
155  160  165
ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu
170  175  180
LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn
185  190  195
PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu
200  205
IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAla
β(L)-亚单位:
5  10  15
MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro
20  25  30
IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu
35  40  45
ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla
50  55  60
PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro
65  70  75
HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla
80  85  90
MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu
95  100  105
LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr
110  115  120
ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln
125  130  135
LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu
140  145  150
AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla
155  160  165
SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg
170  175  180
ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp
185  190  195
ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr
200  205  210
ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
215  220  225
AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuPro
Ala
3、按权利要求1的DNA（H）片段，其含有α（H）-和β（H）-亚单位的核苷酸顺序，包括：
α（H）-亚单位的DNA顺序：
15  30  45
GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC
60  75  90
AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC
105  120  135
GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC
150  165  180
CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT
195  210  225
GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG
240  255  270
TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC
285  300  315
TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT
330  345  360
TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC
375  390  405
AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA
420  435  450
GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG
465  480  495
GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC
510  525  540
CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG
555  570  585
ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG
600
CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA
和β（H）-亚单位的DNA顺序：
15  30  45
ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG
60  75  90
GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG
105  120  135
GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA
150  165  180
TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC
195  210  225
GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG
240  255  270
CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC
285  300  315
GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGACATCCTTGAGGGTCGG
330  345  360
TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC
375  390  405
GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT
420  435  450
CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG
465  480  495
AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG
510  525  540
CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC
555  570  585
TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG
600  615  630
CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC
645  660  675
GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC
CTGATCTCTGCG
4、按权利要求2的DNA（L）片段，其含有α（L）-和β（L）-亚单位的核苷酸顺序：包括：
α（L）-亚单位的DNA顺序：
15  30  45
ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC
60  75  90
GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC
105  120  135
GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG
150  165  180
GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC
195  210  225
GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC
240  255  270
GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG
285  300  315
GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC
330  345  360
ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC
375  390  405
GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC
420  435  450
GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC
465  480  495
CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA
510  525  540
CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC
555  570  585
TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC
600  615
ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC
和β（L）-亚单位的DNA顺序：
15  30  45
ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG
60  75  90
ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG
105  120  135
CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG
150  165  180
TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG
195  210  225
CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG
240  255  270
ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA
285  300  315
CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG
330  345  360
ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA
375  390  405
CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG
420  435  450
GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC
465  480  495
TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT
510  525  540
GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC
555  570  585
ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC
600  615  630
GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG
645  660  675
AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG
GCC
5、重组DNA，包括在载体中的权利要求1-4的DNA（H）或DNA（L）。
6、用权利要求5的重组DNA转化的转化株。
7、生产腈水化酶的方法，该方法包括培养权利要求6所述的转化株和由该培养物回收腈水化酶。
8、生产酰胺的方法，该方法包括用由权利要求6的转化株培养物得到的腈水化酶将腈水化。
9、生产酰胺的方法，该方法包括培养权利要求6所述的转化株和用其生成的培养物、分离的细菌细胞、以及其经过处理的材料，或其固定的材料，将腈水化为酰胺。
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