NO306684B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av nitrilhydratase og anvendelse av nevnte nitrilhydratase og anvendelse av transformant inneholdende en rekombinant DNA som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet - Google Patents

FremgangsmÕte for fremstilling av nitrilhydratase og anvendelse av nevnte nitrilhydratase og anvendelse av transformant inneholdende en rekombinant DNA som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet Download PDF

Info

Publication number
NO306684B1
NO306684B1 NO910797A NO910797A NO306684B1 NO 306684 B1 NO306684 B1 NO 306684B1 NO 910797 A NO910797 A NO 910797A NO 910797 A NO910797 A NO 910797A NO 306684 B1 NO306684 B1 NO 306684B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
nitrile hydratase
dna
transformant
subunit
added
Prior art date
Application number
NO910797A
Other languages
English (en)
Other versions
NO910797D0 (no
NO910797L (no
Inventor
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Toru Nagasawa
Sueharu Horinouchi
Makoto Nishiyama
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Rayon Co, Teruhiko Beppu, Hideaki Yamada filed Critical Mitsubishi Rayon Co
Publication of NO910797D0 publication Critical patent/NO910797D0/no
Publication of NO910797L publication Critical patent/NO910797L/no
Publication of NO306684B1 publication Critical patent/NO306684B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å produsere nitrilhydratase ved å dyrke en transformant transformert med et rekombinant DNA omfattende et DNA-fragment som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet. Oppfinnelsen omhandler også anvendelser av nitrilhydratase og nevnte transformant.
Nitrilhydratase eller nitrilase er kjent som et enzym som hydratiserer nitriler til amider. Mikroorganismer som produserer nitrilhydratase, inkluderer de som tilhører genus Bacillus, genus Bacteridium, genus Micrococcus og genus Brevibacterium (se JP-B-62-21517/1989, USP nr. 4,001,081), genus Corynebacterium og genus Nocardia (se JP-B-56-17918/1989, USP nr. 4,248,968), genus Pseudomonas (se JP-B-59-37951/1984, USP nr. 4,637,982), genus Rhodococcus, genus Arthrobacter og genus Microbacterium (se JP-A-61-162193/1986, EP-A-0188316) og Rhodococcus rhodochrous (se, JP-A-2-470/1990, EP-A-0307926).
Nitrilhydratase er blitt anvendt til å hydratisere nitriler til amider. I oppfinnelsen blir det konstruert mikroorganismer som inneholder multiple kopier av en rekombinant DNA-kodende nitrilhydratase i henhold til en rekombinant DNA-teknologi. Rekombinanten produserer et merkbart høyt nivå av nitrilhydratase sammenlignet med konvensjonelt anvendte mikroorganismer.
De foreliggende oppfinnere beskrev tidligere et DNA-fragment dannet fra Rhodococcus sp. N-774 (FERM BP-1936) som også koder for et polypeptid som har nitrilhydratseaktivitet (JP-A-2-119778/1988).
Derimot anvender de foreliggende oppfinnere et DNA-fragment dannet fra Rhodococcus rhodochrous J-l til produksjon av nitrilhydratase. Vi isolerte genet som koder for nitrilhydratase, innskjøt genet i en egnet plasmidvektor og trans-formerte en passende vert med det rekombinante plasmid, og oppnådde således på en vellykket måte transformanten som produserer nitrilhydratase, som har høy aktivitet også på aromatiske nitriler.
Sammendrag av oppfinnelsen:
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av nitrilhydratase, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av transformanten transformert med det rekombinante DNA omfattende et DNA^ -fragment som koder for et polypeptid med nitrilhydratase-aktivitet, nevnte polypeptid omfatter a -subenheten som definert i fig. 4(2) og 4(3) og -subenheten som definert i fig. 4(1) og 4(2) i en vektor, ellerDNA(<L>)-fragment som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet hvor nevnte polypeptid omfatter a(<L>)-subenheten som definert i fig. 5(2) og 5(3) og -subenheten som definert i fig. 5(1) og 5(2) i en vektor, og gjenvinning av nitrilhydratase fra kulturen.
Videre omhandler foreliggende oppfinnelse anvendelse av nitrilhydratase for fremstilling av amider ved hydratisering av nitriler.
Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er anvendelse av transformanten ifølge krav 1 til hydratisering av nitriler til amider enten ved å anvende en kultur derav, isolerte bakterieceller, behandlet materiale fra disse eller et fiksert materiale fra disse.
Også omfattet av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av nitrilhydratase som krevet i krav 1, kjennetegnet ved at DNA-fragmentet inneholder nukleotidsekvensen av a(<H>->subenheten som definert i fig. 4(2) og 4(3) og S(<H>)-subenheten som definert i fig. 4(1) og 4(2) og DNA(<L>)-fragmentet inneholder neukleotidsekvensen av a^-subenheten som definert i fig. 5(2) og 5(3) og jS'<l>'-subenheten som definert i fig. 5(1) og 5 (2) .
Den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj som følger.
Den foreliggende oppfinnelse utføres ved trinn (l)-(8): (1) Isolering og rensing av nitrilhydratase og delvis amino-syresekvensering av nitrilhydratase.
To typer nitrilhydratase (betegnet som hhv. H-type og L-type) isoleres og renses fra Rhodococcus rhodochrous J-l (FERM EP-1478), og begge enzymene separeres til a- og ^-underenheter ved å anvende HPLC. En del av aminosyresekvensen for hver av underenhetene bestemmes (fig. 1).
(2) Fremstilling av en DNA-probe for et nitrilhydratasegen
En DNA-probe fremstilles fra JM105/pYUK121 (FERM BP-1937) som beskrevet i JP-A-2-119778/1990 p.g.a. den høye grad av homologi i aminosyresekvensen mellom nitrilhydratase iS-under-enheten i Rhodococcus sp. N-774 beskrevet i nevnte japanske patent - offisielle gasett og de i Rhodococcus rhodochrous J-1. Plasmid pYUK121 som inneholder nitrilhydratasegen dannet fra Rhodococcus sp. N-774 fremstilles fra en JM105/pYUK121-kultur. pYUK121 DNA spaltes med SphI og Sali. SpHI-Sall-fragmentet inneholder nitrilhydratasegenet (fig. 2) i Rhodococcus sp. N-774. DNA-fragmentet radiomerkes.
(3) Påvisning av et DNA-segment som inneholder et nitrilhydratasegen fra kromosomet til Rhodococcus rhodochrous J-l
Kromosomal DNA fremstilles fra en Rhodococcus rhodochrous J-l kultur. Det kromosomale DNA fordøyes med restriksjons-enzymer og hybridiseres til proben beskrevet i (2) ved å anvende en Southern hybridiseringsmetode [Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)].
To DNA-fragmenter med forskjellig lengde kartlegges.
(4) Konstruksjon av et rekombinant plasmid
Et rekombinant plasmid konstrueres ved å innskyte det kromosomale DNA-fragment som fremstilt i (3) i en plasmidvektor.
(5) Transformering og kartlegging av transformanten som inneholder det rekombinante plasmid
Det fremstilles transformanter ved å anvende det rekombinante plasmid som beskrevet i (4). -Transformanten som inneholder det rekombinante plasmid, selekteres ved å anvende proben som beskrevet i (2) i henhold til en kolonihybrid-iseringsmetode [R. Bruce Wallace et al., Nuc. Aci. Res. 9, 879
(1981)]. I tillegg blir tilstedeværelse av nitrilhydratasegenet i det rekombinante plasmid bekreftet ved å anvende en Southern hybridiseringsmetode. De således valgte plasmider er betegnet som pNHJIOH og pNHJ2 0L. (6) Isolering og rensing av plasmid DNA og konstruksjon av restriksjonskartet Plasmid DNAer for pNHJIOH og pNHJ2 0L som fremstilt i (5) isoleres og renses. Restriksjonskartet til disse DNAer konstrueres (fig. 3) for å bestemme området som inneholder nitrilhydratasegenet.
(7) DNA-sekvensering
Det ekstra segment i det innskutte DNA-fragment i pNHJIOH og pNHJ20L skjæres ut ved å anvende et passende restriksjons-enzym. Det innskutte DNA-fragment anvendes så til sekvensering. Nukleotidsekvensen for DNA-fragmentet (fig. 4, 5) åpenbarer at det inneholder sekvensen utledet fra aminosyresekvensen som beskrevet i (1).
(8) Produksjon av nitrilhydratase ved å anvende transformanten og omdannelse av nitriler til amider
Transformanten som beskrevet i (8) dyrkes. Bakteriecellene blandes med nitriler, et substrat av nitrilhydratase og det produseres amider.
Rhodococcus rhodochrous J-l ble deponert i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Techn-ology og ble tildelt adgangsnummeret FERM BP-1478. En transformant TGl/pNHJIOH som inneholdt pNHJIOH som beskrevet i (5) og en transformant TGl/pNHJ20L som inneholdt pNHJ20L som beskrevet i (5) ble deponert i det ovenfor nevnte og tildelt adgangsnummeret hhv. FERM BP-2777 og FERM BP-2778.
En hvilken som helst vektor som inkluderer en plasmidvektor (f.eks. pAT153, pMP9, pHC624, pKC7, etc.) en fagvektor (f.eks. 'gt11 (Toyobo), Charon 4A (Amersham), etc.) kan anvendes. Enzymer som kan anvendes, inkluderer SphI, Sali, EcoRI, BamHI, SacI, o.l., som er kommersielt tilgjengelige (Takara Shuzo). Forskjellige verter kan anvendes til transformering, inkludert, men ikke begrenset til, E_;_ coli JM105 og EL coli TG1.
Dyrkingsmedier for transformanten er de som vanligvis anvendes på fagområdet.
Omdannelse av nitriler til amider utføres ved å anvende nitrilhydratase, rå nitrilhydratase, dyrking av transformanten, de isolerte bakterieceller eller behandlet materiale fra disse o.l., fremstilt fra kulturen av transformanten.
Egnede nitriler i henhold til oppfinnelsen inkluderer aromatiske nitriler som har 4-10 karbonatomer i den aromatiske del og alifatiske nitriler som har 2-6 karbonatomer, som er beskrevet i den europeiske patentpublikasjon nr. 0,3 07,926. Typiske eksempler på nitrilene er 4-, 3- og 2-cyanopyridiner, benzonitril, 2,6-difluorbenzonitril, 2-tiofenkarbonitril, 2-furonitril, cyanopyrazin, akrylonitril, metakrylonitril, krotonitril, acetonitril og 3-hydroksypropionitril.
De foreliggende oppfinnere har beskrevet aminosyresekvensen og nukleotidsekvensen til oi- og E-underenhetene i to typer nitrilhydratase dannet fra Rhodococcus rhodochrous J-l. DNA-fragmentet som koder for nitrilhydratase, innskytes i en ekspresjonsvektor, og den rekombinante vektor anvendes til transformasjon. Transformanten inneholder multiple kopier av genet og kan produsere mye høyere nivå av nitrilhydratase sammenlignet med konvensjonelt anvendte mikroorganismer.
Beskrivelse av figurene
Fig. 1 viser de N-terminale aminosyresekvenser for a- og fé-underenheter i to typer nitrilhydratase produsert av Rhodococcus rhodochrous J-l. Fig. 2 viser DNA-sekvensen for et nitrilhydratasegen i Rhodococcus sp. N-774 som anvendes som DNA-probe. Fig. 3 viser restriksjonskart på de rekombinante plasmider, pNHJIOH og pNHJ2 0L. Fig. 4 viser DNA-sekvensen for DNA-fragmentet i pNHJIOH, dannet fra Rhodococcus rhodochrous J-l, og den utledede amino-syresekvens. Fig. 5 viser DNA-sekvensen for fragmentet i pNHJ2 0L, dannet fra Rhodococcus rhodochrous J-l, og den utledede amino-syresekvens.
Den foreliggende oppfinnelse vil bli illustrert i detalj i følgende eksempel.
Den følgende forkortelse anvendes i eksemplet.
TE: Tris-HCl (10 mH; pH 7,8), EDTA (1 mM, pH 8,0)
TNE: Tris-HCl (50 mM; pH 8,0), EDTA (1 mM, pH 8,0), NaCl (50 mM)
STE: Tris-HCl (50 mM; pH 8,0), EDTA (5 mM, pH 8,0), sukrose
(35 mM)
2xYT medium: 1,6% Trypton; 1,0% Gjærekstrakt, 0,5% NaCl
Eksempel
(1) Isolering og rensing av nitrilhydratase og delvis amino-syresekvensering av nitrilhydratase
Rhodococcus rhodochrous J-l ble dyrket i et medium (3 g/l gjærekstrakt, 0,5 g/l KH2P04, 0,5 g/l K2HP04, 0,5 g/l MgSO4.4H20, 0,01 g/l CoCl2, og 3 g/l krotonamid, pH 7,2) ved 28°C i 80 timer. Bakteriecellene ble innhøstet. 50 g av bakteriecellene ble oppbrutt og fraksjonert med ammonium-sulfat. Prøven ble dialysert og dialysatet ble sentrifugert. Supernatantan ble satt på DEAE-Cellulofine-kromatografering, fenyl-sefarosekromatografering, Sephadex G-150 kromatografering og oktyl-sefarose-kromatografering. To fraksjoner med enzymaktivitet ble oppnådd og dialysert. Dialysatene ble satt på en høytrykksvæskekromatografering ved å anvende en revers fasekolonne (Senshu Pak VP-304-1251, Senshu Kagaku), og to hhv. underenheter { a og S) ble opnådd. N-terminal aminosyre-sekvens for a± (H> - , Sx (H) - , a1iJj) - og £1 (L) -underenheter ble bestemt ved å anvende en Applied Biosystems model 470A pro-teinsekvenser. Aminosyresekvensene er vist i fig. 1.
(2) Fremstiling av en DNA-probe for nitrilhydratasegen
E. coli JM105 (FERM BP-1937) som inneholdt pYUK121, ble dyrket i 100 ml 2xYT medium som inneholdt 50/ig/ml ampicillin ved 30°C over natten (12 timer). Bakteriecellene ble inn-høstet, og TNE ble tilsatt til cellene. Cellesuspensjonen ble så sentrifugert. 8 ml STE og 10 mg lysozym ble tilsatt til pelleten. Blandingen ble inkubert ved 0°C i 5 min. fulgt av tilsetning av 4 ml 0,25M EDTA. 2 ml 10% SDS og 5 ml 5M NaCl ble så tilsatt til blandingen ved romtemperatur. Den resulterende blanding ble inkubert ved 0-4°C i 3 timer og så ultrasentrifugert. 1/2 volum 30% PEG 6000 ble tilsatt til supernatanten. Blandingen ble inkubert ved 0-4°C over natten (12 timer) og sentrifugert. TNE ble tilsatt til pelleten for å bringe volumet til 7,5 ml, og CsCl ble så tilsatt til suspensjonen. Blandingen ble sentrifugert for å fjerne proteiner. Så ble 300-500 mg/ml etidiumbromid tilsatt til supernatanten. Blandingen ble overført til et sentrifugerør. Røret ble varmeforseglet og så ultrasentrifugert. cccDNA ble ekstrahert ved å anvende en peristaltisk pumpe. Litt mer enn lik mengde av isopropylalkohol mettet med vann ble tilsatt til ekstraktet for å fjerne etidiumbromid. Prøven ble dialysert mot TE. Omtrent 3 ml renset pYUK121 ble oppnådd.
pYUK121 DNA ble digestert med Sphl og Sali, hvilket resulterte i et 2,07 kb DNA-fragment som inneholdt et nitrilhydratasegen dannet fra Rhodococcus sp. N-774. Fragmentet ble radiomerket med<32>P for å produsere en probe. Nukleotidsekvensen for proben er vist i fig. 2.
(3) Fremstilling av et DNA-fragment som inneholder et nitrilhydratasegen i kromsom
Rhodococcus rhodochrous J-l ble dyrket i 100 ml av et medium (10 g/l glukose, 0,5 g/l KH2P04, 0,5 g/l K2HP04, 0,5 g/l MgS04.7H20, 1 g/l gjærekstrakt, 7,5 g/l pepton, 0,01 g/l CoCl2, 7,5 g/l urea, 1% glycin eller 0,2 fig/ ml ampicillin, 1 1 vann, pH 7,2). Bakteriecellene ble innhøstet, og pelleten ble vasket med TNE. Pelleten ble så suspendert i 10 ml TE. 4 ml 0,2 5M EDTA, 10-20 mg lysozym, 10-2 0 mg akromoprotease og 10 ml IOxSDS ble tilsatt til suspensjonen. Suspensjonen ble inkubert ved 37°C i 3 timer. 15 ml fenol ble tilsatt til suspensjonen. Blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 15 min. og så sentrifugert: Det øvre lag ble fjernet, og 0,7 ml 2,5M natriumacetat og dietyleter ble tilsatt til supernatanten. Blandingen ble sentrifugert, og det øvre lag ble kastet. To volumer etanol ble tilsatt til bunnlaget, og DNA ble fjernet med en glass-stav. DNA ble skylt i 5 min. hver med TE:etanol 2:8, 1:9 og 0:10 (vekt/vol.). DNA ble så resuspendert i 2-4 ml TE (37°C) . 10/il av en blanding av RNase A og T1ble tilsatt til suspensjonen, og blandingen ble inkubert ved 37°C. En lik mengde fenol ble tilsatt til blandingen som så ble sentrifugert. Mer enn lik mengde av eter ble tilsatt til supernatanten. Blandingen ble sentrifugert igjen, og det øvre lag ble kastet, og bunnlaget ble spart. Bunnlaget ble dialysert mot 2 1 TE som inneholdt en liten mengde kloroform, over natten, og videre dialysert mot fersk TE i 3-4 timer. 4 ml rå kromosom DNA ble oppnådd. 10/il TE, 3/il reaksjonsbuf f er (10x) og 2/il SacI ble tilsatt til 15/il rå kromosomal DNA. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 1 time og kjørt på elektroforese på en agarosegel ved 60 V i 3 timer. Southern hybridiseringen av kromosom DNA ble utført ved å anvende proben som beskrevet i (2). Omtrent 6,0 kb og 9,4 kb fragmenter ble funnet å vise sterk hybridi-sering .15/il kromosom DNA ble fordøyd med SacI og kjørt på elektroforese på agarosegel som beskrevet ovenfor. 6,0 kb og 9,4 kb DNA-fragmenter ble skåret ut fra gelen og tatt i tre volumer hver av 8M NaCl04. Etter oppløsning ble hver løsning avsatt flekkvis på GF/C (Whatman) filterpapir (6 mm i dia-meter) .10 dråper (, 100/il) av TE som inneholdt 6M NaCl04og så 10 dråper (,100/il) 95% etanol ble tilsatt til filter-papiret. Papiret ble lufttørket i 3 min. og plassert i 0,5 ml Eppendorf rør. 40/il TE ble tilsatt til røret, og det hele ble inkubert ved 4 7°C i 3 0 min.. Røret ble så sentrifugert. Det ble oppnådd omtrent 4 0/il av supernatanten som inneholdt 6,0 kb og 9,4 kb DNA-fragmenter som inneholdt et nitrilhydratasegen fra kromosom DNA.
Fremgangsmåten for å innskyte 6,0 kb DNA-fragmentet i en vektor er beskrevet nedenfor. Den samme fremgangsmåte er anvendt til innskuddet av 9,4 kb fragmentet i en vektor.
(4) Innskudd av kromosom DNA-fragmentet i en vektor
10/il TE, 3/il reaksjonsbuf f er (10x) og 2/il SacI ble tilsatt til 10/il pUC19. Blandingen ble inkubert ved 30°C i 1 time. 2/il 0,25M EDTA ble tilsatt til blandingen for å stoppe reaksjonen. Så ble 7/il IM Tris-HCl (pH 9) og 3/il BAP (bakteriealkalisk fosfatase) tilsatt til blandingen. Blandingen ble inkubert ved 65°C i 1 time. TE ble så tilsatt til blandingen for å lage et totalt volum på 100/il. Blandingen ble ekstrahert 3x med et likt volum fenol. En lik mengde eter ble tilsatt til ekstraktet. Bunnlaget ble fjernet, og 10/il 3M natriumacetat og 250/il etanol ble tilsatt til bunnlaget. Blandingen ble inkubert ved -80°C i 30 min., sentrifugert, tørket og resuspendert i TE. 5/il pUC19 DNA oppnådd på denne måte og 40/il av 6,0 kb DNA-fragmentet som beskrevet i (3), ble blandet. 6/il liger-ingsbuffer, 6/il ATP (6 mg/ml) og 3/il T4 DNA ligase ble tilsatt til blandingen. Blandingen ble inkubert ved 4°C over natten (12 timer) for å produsere det rekombinante plasmid som inneholdt 6,0 kb DNA-fragmentet som koder for det ønskede enzym i Sacl-setet i pUC19.
(5) Transformering og kartlegging av transformanter
E. coli TG1 (Amersham) ble inokulert i 10 ml 2xYT medium og inkubert ved 37°C i 12 timer. Etter inkubering ble den resulterende kultur tilsatt til fersk 2xYT medium til en konsentrasjon på 1%, og blandingen ble inkubert ved 3 7°C i 2 timer. Kulturen ble sentrifugert, og pelleten ble suspendert i 5 ml kald 50 mM CaCl2. Suspensjonen ble plassert på is i 40 min. og så sentrifugert. 0,25 ml kald 50 mM CaCl2og 60/il av det rekombinante DNA som beskrevet i (4) ble tilsatt til pelleten. Blandingen ble inkubert på 0°C i 40 min., varme- sjokkbehandlet ved 42°C i 2 min., plassert på is i 5 min. og tilsatt til 10 ml 2xYT medium. Blandingen ble inkubert ved37°C i 90 min. med risting, så sentrifugert. Pelleten ble suspendert i 1 ml 2xYT medium, og to10/ti alikvote mengder av suspensjonen ble platet ut på en 2xYT agarplate som inneholdt 50 fig/ ml ampicillin separat. Platen ble inkubert ved 37°C. Kolonien dyrket på platen ble selektert ved kolonihybridiser-ingsmetoden: Kolonien ble overføtt til et nitrocellulose-filter og digestert. DNA ble fiksert på filteret og hybrid-isert til proben som beskrevet i (2). Filteret ble autoradio-grafert og det ble selektert en rekombinant koloni. I tillegg ble tilstedeværelse av et nitrilhydratasegen i transformanten bekreftet i henhold til Southern hybridiseringsmetoden.
(6) Isolering og rensing av rekombinant plasmid og konstruksjon av restriksjonskartet for de innskutte DNA-fragmenter
Transformanten selektert som beskrevet i (5) ble dyrket i100 ml 2xYT medium som inneholdt 50/xg/ml ampicillin ved 37°C over natten (12 timer). Bakteriecellene ble innhøstet, og TNE ble tilsatt til cellene. Cellene ble oppsamlet igjen ved sentrifugering, og 8 ml STE og 10 mg lysozym ble tilsatt til cellene. Blandingen ble inkubert ved 0°C i 5 min.. 4 ml 0,25M EDTA, 2 ml 10% SDS (ved romtemperatur) og 5 ml 5M NaCl ble tilsatt til blandingen. Blandingen ble inkubert ved 0-4°C i 3 timer og ultrasentrifugert. 1/2 volum 30% PEG 6000 ble tilsatt til supernatanten. Blandingen ble inkubert ved 0-4°C over natten (12 timer) og sentrifugert igjen. TNE ble tilsatt til pelleten for å bringe volumet opp til 7,5 ml. CsCl ble tilsatt til suspensjnen for å fjerne proteiner. Så ble 300-500 mg/ml etidiumbromid tilsatt til supernatanten, og blandingen ble overført til et sentrifugerør. Røret ble varmeforseglet og ultrasentrifugert. cccDNA ble fjernet ved å anvende en peristaltisk pumpe. Litt mer enn lik mengde isopropylalkohol mettet med vann ble tilsatt til cccDNA for å fjerne etidiumbromid. DNA-prøven ble dialysert mot TE, hvilket resulterer i omtrent 3 ml renset rekombinant DNA. Det rekombinante plasmid oppnådd på denne måte som inneholdt et 6,7 kb DNA-fragment, ble betegnet som pNHJIOH (det rekombinante plasmid som inneholdt et 9,4 kb DAN-fragment, ble betegnet som pNHJ2 0L).
Disse plasmid DNAer ble digestert med EcoRI, BamHI, Pstl, SacI og Sali. Restriksjonskartene ble konstruert og er vist i fig. 3.
(7) DNA-sekvensering
Lokaliseringen av et nitrilhydratasegen i DNA-fragmentet fra pNHJIOH ble bestemt i henhold til det konstruerte restriksjonskart og Southern hybridiseringsmetoden. Et ekstra segment i pNHJIOH ble spaltet av med Pstl og Sali: 6,0 kb DNA-fragmentet resulterte i 1,97 kb. På samme måte ble et ekstra segment i pNHJ20L spaltet av med EcoRI og SacI: 9,4 kb DNA-fragmentet resulterte i 1,73 kb.
Disse DNA fragmenter ble sekvensert ved Sanger-metoden [Sanger, F., Science 214: 1205-1210 (1981)] ved å anvende M13 fagvektor. Nukleotidsekvensen for 1,97 kb DNA fragmentet (pNHJIOH) og 1,73 kb DNA fragmentet (pNHJ20L) er vist i fig. hhv. 4 og 5.
Aminosyresekvensen utledet fra nukleotidsekvensen ble funnet fullt ut identisk med aminosyresekvensen som bestemt i (1). Sekvensanalysen åpenbarte også at DNA-fragmentet inneholdt sekvensen som koder for a- og S-underenhetene.
(8) Produksjon av nitrilhydratase ved å anvende transformanten og omdannelse av nitriler til amider ved å anvende nitrilhydratase
TG-1/pNHJIOH og TG-l/pNHJ2 0L ble inokulert i 10 ml 2 x YT medium som inneholdt 50//g/ml ampicillin og inkubert ved 3 0°C over natten (12 timer). 1 ml av den resulterende kultur ble tilsatt til 100 ml 2 x YT medium (50/xg/ml ampicillin, 0,1 g CoCl2x 6H20/1). Blandingen ble inkubert ved 30°C i 4 timer. IPTG ble tilsatt til blandingen til en sluttkonsentrasjon på 1 mM. Blandingen ble inkubert ved 3 0 °C i 10 timer. Etter innhøsting av cellene ble cellene suspendert i 5 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,5). Suspensjonene ble avbrutt ved lydbe-handling i 5 min. og sentrifugert ved 12.000 x g i 30 min. De resulterende supernatanter ble anvendt til enzymmålingen. Enzymmålingen ble utført i en reaksjonsblanding (12 ml) som inneholdt 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,5), 6 mM benzonitril og en passende mengde av enzymet. Reaksjonen ble utført ved 20°C i 30 min. og stoppet ved tilsetning av 0,2 ml IM HCl. Mengden av benzamid dannet i reaksjonsblandingen ble bestemt vedHPLC. Som kontroll ble blandingen oppnådd ved samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor, men fra EL. coli TG-1, anvendt. Nivåene av nitrilhydrataseaktivitet i cellefrie eks-trakter fra EL. coli som inneholdt pNHJIOH og pNHJ2 0L, var hhv. 1,75 x IO"<3>og 6,99 x IO"<3>enheter/mg, når dyrket i 2 x YT medium i nærvær av CoCl2og IPTG. Benzamid ble funnet i reaksjonsblandingen med TG-1/pNHJIOH og pNHJ2 0L, mens ikke noe . benzamid ble funnet i reaksjonsblandingen med TG-1.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av nitrilhydratase,karakterisert vedat den omfatter dyrking av transformanten transformert med det rekombinante DNA omfattende etDNA(<H>->fragment som koder for et polypeptid med nitrilhydratase-aktivitet, nevnte polypeptid omfatter a(<H>)-subenheten som definert i fig. 4(2) og 4(3) og (3<<H>)-subenheten som definert i fig. 4(1) og 4(2) i en vektor, eller DNA(<L>)-fragment som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet hvor nevnte polypeptid omfatter a(<L>)-subenheten som definert i fig. 5(2) og 5(3) og p(<L>)-subenheten som definert i fig. 5(1) og 5(2) i en vektor, og gjenvinning av nitrilhydratase fra kulturen.
2. Anvendelse av nitrilhydratase fremstilt ifølge krav 1, for fremstilling av amider ved hydratisering av nitriler.
3. Anvendelse av transformanten ifølge krav 1,karakterisert vedat den omfatter dyrking av transformanten og hydratisering av nitriler til amider ved å anvende den resulterende kultur, isolerte bakterieceller, behandlet materiale fra disse eller et fiksert materiale fra disse.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av nitrilhydratase som krevet i krav 1,karakterisert vedat DNA(<H>)-fragmentet inneholder nukleotidsekvensen av a<<H>)-subenheten som definert i fig. 4(2) og 4(3) og P<<H>)-subenheten som definert i fig. 4(1) og 4(2) og DNA(L1 -fragmentet inneholder neukleotidsekvensen av a(<L>)-subenheten som definert i fig. 5(2) og 5(3) og P'<L>)-subenheten som definert i fig. 5(1) og 5(2).
NO910797A 1990-02-28 1991-02-27 FremgangsmÕte for fremstilling av nitrilhydratase og anvendelse av nevnte nitrilhydratase og anvendelse av transformant inneholdende en rekombinant DNA som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet NO306684B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4807890 1990-02-28
US08/028,463 US5731176A (en) 1990-02-28 1993-03-09 DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO910797D0 NO910797D0 (no) 1991-02-27
NO910797L NO910797L (no) 1991-08-29
NO306684B1 true NO306684B1 (no) 1999-12-06

Family

ID=26388301

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO910797A NO306684B1 (no) 1990-02-28 1991-02-27 FremgangsmÕte for fremstilling av nitrilhydratase og anvendelse av nevnte nitrilhydratase og anvendelse av transformant inneholdende en rekombinant DNA som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5731176A (no)
EP (1) EP0445646B1 (no)
JP (1) JP3162091B2 (no)
KR (1) KR950002004B1 (no)
CN (1) CN1054639C (no)
AT (1) ATE138101T1 (no)
AU (1) AU627648B2 (no)
CA (1) CA2037291C (no)
CZ (2) CZ284048B6 (no)
DE (1) DE69119454T2 (no)
DK (1) DK0445646T3 (no)
ES (1) ES2089044T3 (no)
FI (1) FI102539B1 (no)
MX (1) MX193790B (no)
NO (1) NO306684B1 (no)
PL (1) PL166201B1 (no)
RU (1) RU2081173C1 (no)
SK (1) SK280199B6 (no)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2907479B2 (ja) * 1990-02-28 1999-06-21 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体及びアミド類の製造法
EP0502476B1 (en) * 1991-03-04 2001-07-18 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Hybrid plasmid vectors containing genes encoding nitrile degrading enzymes and methods of producing amides and acids
AU3692593A (en) * 1992-04-28 1993-11-04 Mitsubishi Kasei Corporation Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
JP3828590B2 (ja) * 1994-10-03 2006-10-04 昌 清水 ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子
JP3154633B2 (ja) * 1994-12-28 2001-04-09 三菱レイヨン株式会社 ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子
AU7514896A (en) * 1995-10-06 1997-04-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragments encoding stereospecific nitrile hydratase and amidase enzymes and recombinant microorganisms expressing those enzymes useful for the production of chiral amides and acides
CN1101470C (zh) * 1996-02-14 2003-02-12 三井东压化学株式会社 新型腈水合酶
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.
FR2770214B1 (fr) * 1997-10-24 1999-12-31 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation d'un benzamide halogene
JP2000050866A (ja) * 1998-08-06 2000-02-22 Rikagaku Kenkyusho ニトリルヒドラターゼの生産方法
JP4185607B2 (ja) 1998-12-15 2008-11-26 ダイセル化学工業株式会社 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法
CN1340101A (zh) * 1999-10-26 2002-03-13 昭和电工株式会社 新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法
RU2288270C2 (ru) 2000-12-20 2006-11-27 Диа-Нитрикс Ко., Лтд. Способ производства амидного соединения с применением микробного катализатора
PT1352050E (pt) * 2001-01-09 2009-03-24 Lonza Ag Processo microbiológico para a produção de amidas
JP2002325587A (ja) * 2001-03-02 2002-11-12 Daicel Chem Ind Ltd ニトリルヒドラターゼ、およびアミドの製造方法
JP2004194588A (ja) 2002-12-19 2004-07-15 Mitsui Chemicals Inc 新規なニトリルヒドラターゼ
WO2004067738A2 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Degussa Ag Nitrile hydratases from rhodococcus erythropolis and their application
SG148992A1 (en) 2003-12-02 2009-01-29 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Strain of rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
CN103146670B (zh) * 2004-05-26 2014-11-26 Dia-Nitrix株式会社 改良型腈水合酶
JP2006187257A (ja) 2005-01-07 2006-07-20 Daiyanitorikkusu Kk アミド化合物の製造方法およびアクリルアミド系ポリマー
EP1842907A1 (en) 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
WO2008004473A1 (fr) * 2006-07-06 2008-01-10 University Of Tsukuba Nouveau complexe de protéines, procédé de maturation de nitrile hydratase à faible poids moléculaire de type au cobalt utilisant le complexe de protéines, nitrile hydratase correspondante et procédé l'utilisant
WO2008056827A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Process for production of betaine
AU2012264058B2 (en) 2011-05-31 2015-10-22 Mitsubishi Chemical Corporation Improved nitrile hydratase
US9193966B2 (en) 2011-06-07 2015-11-24 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Nitrile hydratase
FR3002542B1 (fr) * 2013-02-28 2016-01-22 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
KR101995103B1 (ko) * 2014-06-06 2019-07-03 미쯔비시 케미컬 주식회사 개량형 니트릴 히드라타제
EP3535386A4 (en) * 2016-11-04 2020-04-15 Georgia State University Research Foundation, Inc. ENDOTOXIN-FREE ASPARAGINASE
CN116888269A (zh) 2021-02-10 2023-10-13 三菱化学株式会社 用醛提高腈水合酶的反应性
CN114934006A (zh) * 2022-06-02 2022-08-23 无锡新晨宇生物工程有限公司 一种腈水合酶催化乙腈生成乙酰胺的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD274631A5 (de) * 1987-09-18 1989-12-27 Kk Verfahren zur biologischen herstellung von amiden
JP2840253B2 (ja) * 1988-07-06 1998-12-24 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
CZ284017B6 (cs) 1998-07-15
CN1054639C (zh) 2000-07-19
JPH04211379A (ja) 1992-08-03
ATE138101T1 (de) 1996-06-15
DK0445646T3 (da) 1996-09-30
MX193790B (en) 1999-10-19
CS9100531A2 (en) 1991-10-15
KR910021473A (ko) 1991-12-20
RU2081173C1 (ru) 1997-06-10
NO910797D0 (no) 1991-02-27
SK280199B6 (sk) 1999-09-10
CZ284048B6 (cs) 1998-07-15
CZ317094A3 (cs) 1998-05-13
EP0445646A2 (en) 1991-09-11
KR950002004B1 (ko) 1995-03-08
CA2037291C (en) 2001-07-24
PL289239A1 (en) 1992-03-23
FI910960A (fi) 1991-08-29
AU7129391A (en) 1991-09-12
AU627648B2 (en) 1992-08-27
FI102539B (fi) 1998-12-31
CA2037291A1 (en) 1991-08-29
DE69119454T2 (de) 1996-09-26
CN1054616A (zh) 1991-09-18
ES2089044T3 (es) 1996-10-01
PL166201B1 (pl) 1995-04-28
JP3162091B2 (ja) 2001-04-25
NO910797L (no) 1991-08-29
EP0445646B1 (en) 1996-05-15
EP0445646A3 (en) 1992-01-08
DE69119454D1 (de) 1996-06-20
US5731176A (en) 1998-03-24
FI910960A0 (fi) 1991-02-27
FI102539B1 (fi) 1998-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO306684B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av nitrilhydratase og anvendelse av nevnte nitrilhydratase og anvendelse av transformant inneholdende en rekombinant DNA som koder for et polypeptid med nitrilhydrataseaktivitet
US5753481A (en) L-sorbose dehydrogenase and novel L-sorbosone dehydrogenase obtained from gluconobacter oxydans T-100
US6251650B1 (en) Pseudomonas putida amidase polypeptide useful for the production of chiral amides and acids
JP2840253B2 (ja) ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法
EP0444639B1 (en) A gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
CA2090571A1 (en) Cephalosporin c acylase
JP3380133B2 (ja) 新規なニトリルヒドラターゼ
US7074606B2 (en) Process for the preparation of (S) - or (R) -3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropionic acid
US5648256A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
US5753472A (en) DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
JP3828590B2 (ja) ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子
US5804429A (en) Cephalosporin C acylase
US5789211A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
WO2000063354A1 (fr) Nouveau gene amidase
US5314819A (en) Protein having nitrile hydratase activity obtained from rhizobium, gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
JP4287144B2 (ja) 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法
JP3709422B2 (ja) ニトリラーゼ遺伝子発現に関わる調節因子およびその遺伝子
RU2173708C2 (ru) Фрагмент днк, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, рекомбинантная плазмидная днк рnhj20l, кодирующая полипептид, штамм escherichia coli tg1/рnhj20l, способ получения полипептида со свойствами нитрилгидратазы
JP2001292772A (ja) ロドコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子
KR20170099510A (ko) 박테로이데스 속 미생물 유래의 ｇａｂａ 생성 고활성 글루탐산탈탄산효소 및 이의 용도
JP3798460B2 (ja) コバルト輸送活性を有するポリペプチドおよびその遺伝子
US5043279A (en) DNA encoding a bacillus creatinase
CA2024145A1 (en) Expression plasmids and use thereof
EP0833926A1 (en) Chondroitinase production in recombinant proteus vulgaris strains
JPH0568551A (ja) 新規なｇｌ−７ａｃａアシラーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired