JPH0568551A - 新規なｇｌ−７ａｃａアシラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｐseudmonas sp.Ａ１４由来の、（a)グルタ
リル７−ＡＣＡ、アジピル７−ＡＣＡおよびスクシニル
７−ＡＣＡを７−アミノセファロスポラン酸に酵素的に
転換する能力を有し；(b)α−サブユニット[分子量：２
８,０００ダルトン(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)]およびβ−サブ
ユニット[分子量：６１,０００ダルトン(ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ)]よりなり；α−サブユニットのＮ末端アミノ酸配
列が、Ａla−Ａsp−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｓer−Ａla−Ｔ
hr−Ｐro−Ｐro−であることを特徴とする新規ＧＬ−７
ＡＣＡアシラーゼを単離し、クローニングし、これをコ
ードするＤＮＡを含有する発現ベクターで宿主細胞を形
質転換し、形質転換体に該アシラーゼを産生させ、その
特性を決定する。 【効果】 酵素転換法による７−ＡＣＡの製造に有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＧＬ−７ＡＣＡ
アシラーゼ(以下「ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４」と
呼ぶ)に関し、より詳しくは、シュードモナス属菌株Ａ
１４(Ｐseudmonas sp.Ａ１４)由来の新規ＧＬ−７ＡＣ
Ａアシラーゼ、これをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含
有する発現ベクター、該発現ベクターにより形質転換さ
れた微生物、および該形質転換体を培養することによる
ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの生産に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼとは、７−
(４−カルボキシブタンアミド)−３−アセトキシメチル
−３−セフェム−４−カルボン酸(ＧＬ−７ＡＣＡ)を加
水分解して７−アミノセファロスポラン酸(７−ＡＣＡ)
に転換させうることを共通点とする酵素の一般的名称で
ある。従来、７−ＡＣＡは、イミノエーテル法あるいは
塩化ニトロシル法などのセファロスポリンの化学変換法
によって製造されてきた。しかし、β−ラクタム抗生物
質の他の一族であるペニシリン類の出発物質である６−
アミノペニシラン酸(６−ＡＰＡ)の生産に類似の酵素転
換法が成功裏に採用されたので、原価低減のために、酵
素転換を利用する別法が永らく探求されてきた。かかる
努力の過程で、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよびグルタ
リル７ＡＣＡ(ＧＬ−７ＡＣＡ)アシラーゼを用いる２段
階酵素変換法が編み出された。この方法は、酵素酸化を
化学酸化によって置換えたものとして工業化されてい
る。

【０００３】シュードモナス属菌株ＧＫ１６がＧＬ−７
ＡＣＡアシラーゼを産生することが報告され、該アシラ
ーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の一部が明らかにされた
[ジャーナル・オブ・バクテリオロジー１６３巻１２２
２〜１２２８ページ(１９８５年)参照]。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この発明の発明者らは、
新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼを求めて鋭意研究を行っ
た。その結果、本発明者らは、新しく単離された微生物
であるシュードモナス属菌株Ａ１４の培養物中に新規で
特徴的なＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４を見出し、こ
の酵素の工業的生産法を確立した。この発明のＧＬ−７
ＡＣＡアシラーゼＡ１４は、既知のＧＬ−７ＡＣＡアシ
ラーゼとは全く異なる構造(アミノ酸配列)を有する。こ
のＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼのその他の特徴は以下の説
明から明らかになるであろう。

【０００５】ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ産生菌であるシ
ュードモナス属菌株Ａ１４と名付けた菌株は、千葉県で
採取された土壌試料から新しく分離されたものである。

【０００６】シュードモナス属菌株Ａ１４は、以下の形
態学的および生理学的特徴を有する。この分類検討に
は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・
バクテリオロジー(第１巻)に記載の方法が主として用い
られている。

【０００７】１.形態学的特徴 Ａ１４株の形態観察は、トリプチケースソイブロス(米
国ＢＢＬ社)中３７℃で培養した細胞につき、光学顕微
鏡によって行われた。

【０００８】Ａ１４株は、グラム陰性の運動性細菌であ
った。細胞形態は桿状であった。結果を表１に示す。

【０００９】

【表１】

【００１０】２.生理学的特徴 Ａ１４株の生理学的特徴を表２、表３にまとめた。Ａ１
４株は、オキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性、ＯＦテス
ト酸化であった。ゼラチンは液化されなかった。硝酸塩
は還元されなかった。グルコース以外の試験対象炭水化
物(糖質)は醗酵しなかった。リジンおよびオルニチンは
脱炭酸されず、アルギニンは加水分解されなかった。イ
ンドールテストは陰性であった。フォゲス−プロスカウ
エル(Ｖoges−Ｐroskaer)テストは陰性であった。

【００１１】

【表２】

【表３】

【００１２】この発明の新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ
は次の特性をもつ。

【００１３】すなわち、この発明の新規ＧＬ−７ＡＣＡ
アシラーゼは、(a) グルタリル７−ＡＣＡ、アジピル
７−ＡＣＡおよびスクシニル７−ＡＣＡの７−アミノセ
ファロスポラン酸への酵素転換の触媒能を有し、(b)
α−サブユニット[分子量：２８,０００ダルトン(ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ)]およびβ−サブユニット[分子量：６１,
０００ダルトン(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)]よりなり、(c) α
−サブユニットのＮ末端アミノ酸配列が、Ａla−Ａsp−
Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｓer−Ａla−Ｔhr−Ｐro−Ｐro−で
ある。

【００１４】この発明の新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ
は、組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成などによって
調製できる。

【００１５】すなわち、該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼは、該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡを含む発現ベクターによって形質転
換された宿主細胞を培地中に培養し、培養物から該新規
ＧＬ−７ＡＣＡを採取することによって、調製できる。

【００１６】このプロセスの詳細を、以下に、より詳し
く説明する。

【００１７】宿主細胞としては、微生物[細菌(たとえば
大腸菌、枯草菌など)、酵母(たとえばサッカロミセス・
セレビシエなど)、動物細胞および培養植物細胞]が挙げ
られる。微生物の好ましい例は、細菌、とくにエシェリ
キア属に属する菌株(たとえばＥ.coliＪＭ１０９ＡＴＣ
Ｃ５３３２３、Ｅ.coli、ＨＢ１０１ＡＴＣＣ３３６９
４、Ｅ.coliＨＢ１０１−１６ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７
２、Ｅ.coli２９４ＡＴＣＣ３１４４６など)、酵母、と
くにサカロミセス属に属する株(たとえばサッカロミセ
ス・セレビシエＡＨ２２)、動物細胞株(たとえばマウス
Ｌ９２９細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細
胞など)などである。

【００１８】宿主細胞として細菌、とくに大腸菌を使用
するときには、発現ベクターは通常、少なくともプロモ
ーター、開始コドン、該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン、ター
ミネーター領域および複製可能ユニットからなってい
る。酵母または動物細胞を宿主として使用するときに
は、発現ベクターには、少なくともプロモーター、開始
コドン、シグナルペプチドおよび該新規ＧＬ−７ＡＣＡ
アシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡおよび終
止コードよりなっていることが好ましく、エンハンサー
配列、該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの５'−および
３'−非コード領域、スプライシングジャンクション、
ポリアデニル化部位および複製可能ユニットをも該発現
ベクターに挿入することもできる。

【００１９】該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼを細菌に
おいて発現させるためのプロモーターは、プロモーター
とシャイン・ダルガーノ(ＳＤ)配列(たとえばＡＡＧＧ
など)とを含んでなる。細菌での発現のための好ましい
プロモーターとしては、慣用のプロモーター(たとえば
大腸菌用のＰＬプロモーターおよびtrpプロモーター)な
らびにＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４染色体遺伝子の
プロモーターを挙げることができる。酵母での該新規Ｇ
Ｌ−７ＡＣＡアシラーゼの発現のためのプロモーターと
しては、サッカロマイセスセレビシエ用のＴＲＰ１遺伝
子、ＡＤＨ IまたはＡＤＨ II遺伝子および酸性ホスフ
ァターゼ(ＰＨＯ５)遺伝子のプロモーターを、哺乳動物
細胞での該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ発現のための
プロモーターとしては、ＳＶ４０初期または後期プロモ
ーター、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーター、マウスメタロ
チオネイン(ＭＭＴ)プロモーター、ワクシニアプロモー
ターなどを、挙げることができる。

【００２０】好ましい開始コドンとしては、メチオニン
コドン(ＡＴＧ)が挙げられる。

【００２１】シグナルペプチドとしては、慣用されてい
る他の酵素類のシグナルペプチド(天然t−ＰＡのシグナ
ルペプチド、天然プラスミノーゲンのシグナルペプチ
ド)などを挙げることができる。

【００２２】シグナルペプチドまたは該新規ＧＬ−７Ａ
ＣＡアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、
ＤＮＡ合成装置を用いてのＤＮＡの部分合成または全合
成および／または形質転換体(たとえばＥ.コリＭＣ１０
６１(pＣＰＡ１４−６)ＦＥＲＭ ＢＰ３１１２)から得
られる適当なベクター(たとえばpＣＰＡ１４−６)中に
挿入されていて該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼをコー
ドする完全なＤＮＡ配列の適当な酵素(たとえば制限酵
素、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナー
ゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなど)による
処理などの常法によって、調製できる。

【００２３】終止コドンとしては、慣用のもの(たとえ
ばＴＡＧ、ＴＧＡなど)が挙げられる。

【００２４】ターミネーター領域としては、天然または
合成のターミネーター(たとえばＧＬ−７ＡＣＡアシラ
ーゼＡ１４染色体遺伝子のターミネーター、合成fdファ
ージターミネーターなど)がある。

【００２５】複製可能ユニットは、宿主細胞中で自身に
属する全ＤＮＡ配列を複製できるＤＮＡ化合物であり、
その例としては、天然プラスミド、人工修飾プラスミド
(たとえば天然プラスミドから調製されたＤＮＡ断片)お
よび合成プラスミドが挙げられ、該プラスミドの好まし
い例としては、プラスミドpＢＲ３２２またはその人工
修飾物(pＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって得ら
れるＤＮＡ断片)を大腸菌用に、酵母２μプラスミドま
たは酵母染色体ＤＮＡを酵母用に、プラスミドpＲＳＶn
eoＡＴＣＣ３７１９８、プラスミドpＳＶ２dhfrＡＴＣ
Ｃ３７１４５、プラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneoＡＴＣ
Ｃ３７２２４、プラスミドpＳＶ２neoＡＴＣＣ３７１４
９を哺乳動物細胞用に、それぞれ挙げることができる。

【００２６】エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエ
ンハンサー配列(７２bp)を挙げることができる。

【００２７】ポリアデニル化部位としては、ＳＶ４０の
ポリアデニル化部位を挙げることができる。

【００２８】スプライシングジャンクションとしては、
ＳＶ４０のスプライシングジャンクションを挙げること
ができる。

【００２９】それらプロモーター、開始コドン、新規Ｇ
Ｌ−７ＡＣＡアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域は、連続さ
せて、適切な複製可能ユニット(プラスミド)と、所望に
より適切なＤＮＡ断片(たとえばリンカー、他の制限部
位など)を用いて、常法(たとえば制限酵素による消化、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いての連結(ライゲーション))
により環状に相互結合させて、発現ベクターを得ること
ができる。哺乳動物細胞を宿主細胞とするときには、エ
ンハンサー配列、プロモーター、ＧＬ−７ＡＣＡアシラ
ーゼＡ１４染色体遺伝子の５'−非コード領域、開始コ
ドン、シクグナルペプチドおよび新規ＧＬ−７ＡＣＡア
シラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コド
ン、ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４染色体遺伝子の
３'−非コード領域、スプライシングジャンクションお
よびポリアデニル化部位を、連続させて、適切な複製可
能ユニットと、上記方法により環状に相互結合させるこ
とができる。

【００３０】該発現ベクターによって宿主細胞を形質転
換できる。形質転換(またはトランスフェクション)は、
常法(たとえば、大腸菌でのクシュナー(Ｋushner)法、
哺乳動物細胞でのリン酸カルシウム法、マイクロインジ
ェクションなど)により実施して、形質転換体を得るこ
とができる。

【００３１】この発明の方法で新規ＧＬ−７ＡＣＡアシ
ラーゼを生産するため、かくして得られた発現ベクター
含有形質転換体を培地に培養する。

【００３２】該培地は、炭素源(たとえばグルコース、
グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトース
など)および無機また有機窒素源(たとえば硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エ
キス、ポリペプトン、バクトトリプトン、肉エキスな
ど)を含有していてよい。所望により、培地に他の栄養
源[たとえば無機塩類(たとえばリン酸二水素ナトリウム
またはカリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム)、ビタミン
類(たとえばビタミンＢ₁)、抗生物質(たとえばアンピシ
リン、カナマイシン)など]を加えてもよい。哺乳動物細
胞の培養には、ウシ胎児血清および抗生物質を加えたダ
ルベッコの改良イーグル最小必須培地が頻用される。

【００３３】形質転換体の培養は、通常、pＨ５.５〜
８.５(好ましくはpＨ７〜７.５)、１８〜４０℃(好まし
くは２５〜３８℃)で５〜５０時間行えばよい。

【００３４】かくして生産された新規ＧＬ−７ＡＣＡア
シラーゼが培養溶液、培養濾液(上澄み)中に存在してい
るときは、培養物を濾過または遠心分離する。培養濾液
から、該新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼを、天然または
合成の蛋白質の精製、単離に一般的に用いられる常法
(たとえば透析、ゲル濾過、抗ＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼモノクロナール抗体を用いてのアフィニティカラムク
ロマトグラフィー、適当な吸着剤を用いてのカラムクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど)に
よって精製できる。生産された新規ＧＬ−７ＡＣＡアシ
ラーゼが培養形質転換体のペリプラズムおよび細胞質中
に存在するときは、濾過や遠心分離によって細胞を集
め、それらの細胞壁および／または細胞膜を、たとえば
超音波および／またはリゾチーム処理によって、破壊し
て、デブリス(細胞破砕物)を得る。デブリスを適当な水
溶液(たとえば８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグアニジウム塩水
溶液)に溶解させる。この溶液から、上述のごとき常法
によって、新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼを精製するこ
とができる。

【００３５】大腸菌中で生産された該新規ＧＬ−７ＡＣ
Ａアシラーゼを再生(リフォールディング)する必要があ
るときは、これを常法によって行なうことができる。

【００３６】この発明は、さらに、式

【化３】

【００３７】(式中、Ｒ¹はアセトキシ、ヒドロキシまた
は水素を、Ｒ²はカルボキシ(Ｃ₁〜Ｃ₆)アルカノイル、
Ｄ−グルタミルまたはテノイルを表す)で表される化合
物またはその塩を、この発明の新規ＧＬ−７ＡＣＡアシ
ラーゼをコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターに
よって形質転換された宿主細胞の培養物またはそれの処
理物と接触させることを特徴とする、式

【化４】

【００３８】(式中、Ｒ¹は上記と同意義)で表される化
合物またはその塩の製造法を提供する。

【００３９】Ｒ²で表されるカルボキシ(Ｃ₁〜Ｃ₆)アル
カノイルとしては、グルタリル、スクシニル、アジピル
などが挙げられる。

【００４０】化合物(I)および(II)の好適な塩は、アル
カリ金属塩(たとえばナトリウム塩、カリウム塩)であ
る。

【００４１】ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性が形質転換
細胞中に存在する場合には、培養物の処理物として次の
諸製剤を例示することができる。

【００４２】(１)生細胞；濾過、遠心分離などの常法に
よって培養物から分離したもの、(２)乾燥細胞；凍結乾
燥、真空乾燥などの常法によって上記生細胞を乾燥して
得たもの、(３)細胞不含抽出液; 生細胞または乾燥細胞
を常法(たとえば、有機溶媒を用いての細胞の自己消
化、アルミナ、海砂などと共に細胞を破砕すること、あ
るいは細胞の超音波処理)により破壊して得たもの、
(４)酵素溶液；上記細胞不含抽出液を常法(たとえばカ
ラムクロマトグラフィー)によって精製または部分精製
して得たもの、(５)固定化細胞または固定化酵素；上記
の細胞または酵素を常法(たとえば、ポリクリルアミ
ド、ガラスビーズ、イオン交換樹脂など)により固定化
して調製したもの。

【００４３】ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性が形質転換
細胞培養濾液中に存在するときは、該培養濾液(上澄
み)、酵素溶液、固定化細胞または固定化酵素を、培養
物の処理物として例示することができる。

【００４４】化合物(II)と該酵素との接触からなる反応
は、水、緩衝液などの水性媒質中で実施できる。すなわ
ち、該反応は、通常、培養物またはそれの処理物を、化
合物(II)を含有する水、緩衝液などの水性媒質中に、溶
解または懸濁させることによって、行われる。

【００４５】反応混合物の好ましいpＨ、化合物(II)の
濃度、反応時間および反応温度は、使用しようとする培
養物またはそれの処理物の性質によって変動しうるが、
一般には、反応を、pＨ７〜１０、好ましくはpＨ７〜
９、２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃で、２〜５
０時間実施する。

【００４６】反応混合物中の基質としての化合物(II)の
濃度は、１〜１００mg／mlの範囲内で選ぶのが好まし
い。

【００４７】かくして生産された化合物(I)は、常法に
よって反応混合物から精製、単離できる。

【００４８】次下の実施例において、若干のプラスミ
ド、制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどの酵素およびそ
の他の材料は、市販のものである。ＤＮＡクローニン
グ、宿主細胞の形質転換、形質転換体の培養、培養物か
らの新規ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの回収などのために
採用した操作は当該技術分野において周知のものであ
り、文献から適宜採用することができる。

【００４９】［実施例］この発明を説明するために、以
下実施例を挙げるが、この発明がそれらに限定されるも
のではない。

【００５０】実施例１ シュードモナス属菌株Ａ１４のＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼをコードする遺伝子の単離 １.１.シュードモナス属菌株Ａ１４の染色体ＤＮＡの調
製 ハリス−ウォリック(Ｈarris−Ｗarrick)らの方法(Ｐro
c.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,７２：２２０７〜２２１
１,１９７５)に従って、シュードモナス属菌株Ａ１４の
染色体ＤＮＡを調製する。シュードモナス属菌株Ａ１４
を、肉エキスブロス(ポリペプトン０.５％、グルタミン
酸ナトリウム０.５％、肉エキス０.２％、ＭgＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ５０μg／ml)３ｌ中、３０℃で４０時間振盪培養
し、遠心分離によって集菌し、１mＭＥＤＴＡ含有５０m
Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ８)で１回洗う。得られた細胞
ペレット約５ｇ(湿重量)を、２０％スクロースおよび１
mＭＥＤＴＡを含有する５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ
８)１２.５mlに懸濁させ、リゾチーム１２.５mgにより
３７℃で１５分間処理する。さらに、この懸濁液に、１
００mＭＥＤＴＡ(pＨ９.６)−１％ラウロイルザルコシ
ネート３０mlおよび５mg／mlプロナーゼＥ１０mlを加
え、得られた混合物を５０℃で２時間インキュベートす
る。溶解産物を１ml毎に１.２５gのＣsＣlを加えたの
ち、平衡密度勾配遠心分離を行う。遠心分離後、染色体
ＤＮＡ画分をプールし、１mＭＥＤＴＡ含有１０mＭトリ
ス塩酸緩衝液(pＨ８)(ＴＥ緩衝液)に対して透析する。

【００５１】１.２.シュードモナス属菌株Ａ１４のゲノ
ムＤＮＡライブラリーの構築 シュードモナス属菌株Ａ１４の染色体ＤＮＡ３００μg
を、制限酵素Ｓau３ＡＩ３.７５単位で部分切断し、得
られたＤＮＡ断片を、ＳＲＰ２８ローター(日立工機)
中、２６０００rpm、２０時間の１０〜４０％スクロー
ス密度勾配遠心分離に付す。平均サイズ３５〜４５キロ
塩基(kb)のＤＮＡ画分をプールし、ＴＥ緩衝液に対して
透析する。エタノール沈澱によってＤＮＡを集め、ＴＥ
緩衝液に溶解させる。プラスミドベクターpＨＣ７９(ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、米国)(１μg)をＢ
amＨＩ(宝酒造)で切断したのち、フェノール抽出および
エタノール沈澱を行い、ＴＥ緩衝液に溶解させる。Ｓau
３ＡＩ部分切断染色体ＤＮＡ断片(１μg)と線状化pＨＣ
７９(０.３μg)を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(宝酒造)３００
単位を用い、１２℃で１６時間かけて連結する。連結Ｄ
ＮＡを、ラムダインビトロパケッジングキット(アマー
シャム、英国)を用いて、インビトロパケッジし、パケ
ッジしたＤＮＡを用いて、Ｅ.コリＤＨ１(ＡＴＣＣ３３
８４９)への形質導入を行なう。インビトロパケッジン
グおよび形質導入は、それぞれＢ.ホーン(Ｈohn)の方法
(メソッズ・イン・エンザイモロジー６８,２９９〜３０
９(１９７９)参照)およびＴ.マニアティス(Ｍaniatis)
らの方法(モレキュラークローニング、コールドスプリ
ングハーバーラボラトリー、ニューヨーク(１９８２)参
照)に従って実施する。形質導入体を、トリプトン(ディ
フコ)１％、酵母エキス(ディフコ)０.５％、塩化ナトリ
ウム１％および５０μg／mlのアンピシリンを含有する
Ｌ寒天上で選択する。得られる形質導入体の数は２.６
×１０⁵となる。

【００５２】１.３.ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ遺伝子含
有プラスミドを有するクローンの選択 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ遺伝子含有プラスミドを有す
るクローンを、シュードモナス属菌株Ａ１４のゲノムＤ
ＮＡライブラリーの中から、次のＨＰＬＣアッセイ法に
より選択する。

【００５３】形質導入体のコロニーを拾い上げ、１mＭ
イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド(ＩＰＴＧ；
シグマケミカル、米国)添加２％ブイヨン(栄研化学)１m
l中、３０℃で一夜培養する。２０μモルのリン酸緩衝
液(pＨ８)、２mgＧＬ−７ＡＣＡおよび細胞ペレットを
含有する反応混合物(２００μl)を用いる。反応混合物
を３０℃で６時間インキュベートする。４％酢酸２００
μlを加えて反応を停止させる。試料をイナートシル(Ｉ
nertsil)ＯＤＳ−２のカラム(４.６mm×１５０mm)(ガス
クロ工業)にかけ、０.５６７g／lのＮa₂ＨＰＯ₄、０.３
６g／lのＫＨ₂ＰＯ₄および２〜４％メタノールで溶出を
行なう。２５４nmにおける吸収で７−ＡＣＡを検出す
る。試験したおよそ１０００のクローンの中から、陽性
の１クローンを得る。

【００５４】１.４.ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼをコード
する遺伝子のサブクローニング クレウェル(Ｃlewell)とヘリンスキー(Ｈelinski)が記
載している清澄化溶菌液(cleared lysate)法(Ｐroc.Ｎa
tl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,６２,１１５９〜１１６６(１９
６９)参照)に従って、該陽性クローンからプラスミドＤ
ＮＡを抽出する。これをpＣＰＡ１４−１と名付ける。
挿入ＤＮＡ断片のサイズはアガロースゲル電気泳動によ
って、約３２kbと推定される。組換えプラスミドpＣＰ
Ａ１４−１(７０μg)を、Ｓau３ＡＩ９単位で部分切断
し、生じたＤＮＡ断片を、ＳＲＰ２８ローターを用いて
２６０００rpmで２０時間、１０〜４０％スクロース密
度勾配遠心分離に付す。平均サイズ４〜７kbのＤＮＡ画
分をプールし、ＴＥ緩衝液に対して透析する。これらの
ＤＮＡ断片１μgを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２５単位を用
いて、ＢamＨＩ消化により線状化したpＡＣＹＣ１８４
(ＡＴＣＣ３７０３３)ＤＮＡ１μgに連結する。Ｅ.coli
ＭＣ１０６１(米国ＮＩＥＨＳのＫ.フォング(Ｆong)博
士から入手)を、この連結混合物を用いて形質転換す
る。形質転換は、Ｄ.ハナハン(Ｈanahan)の方法(Ｊ.Ｍo
l.Ｂiol.,１６６,５５７〜５８０(１９８３)参照)に従
って行なう。トリプトン(ディフコ)１％、酵母エキス
(ディフコ)０.５％、塩化ナトリウム１０mＭ、硫酸マグ
ネシウム１０mＭ、寒天１.５％およびクロラムフェニコ
ール２５μg／mlを含有するＬＭ寒天プレート上で、形
質転換体を選択し、それらのＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ
活性を試験する。ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性は、実
施例１.３記載通りのＨＰＬＣ法によって測定する。組
換え株の２株から、清澄化溶菌液法によってプラスミド
ＤＮＡを抽出する。これらをpＣＰＡ１４−６およびpＣ
ＰＡ１４−１６９と名付ける。挿入断片のサイズは、そ
れぞれ約７.５および４.０kbと推定される。

【００５５】実施例２ シュードモナス属菌株Ａ１４のＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の決定

【００５６】２.１.ヌクレオチド配列の決定 pＣＰＡ１４−１６９の挿入断片の制限酵素地図作成
を、制限酵素ＡluI、Ｂal I、Ｃla I、ＥcoＲ I、Ｅco
ＲＶ、Ｈind III、Ｎco I、Ｓal I、Ｓca IおよびＳma
I(いずれも宝酒造製)を用いて行なう。適当な制限酵素
で切断したＤＮＡ断片をＭ１３ファージベクターにサブ
クローニングし、ヌクレオチド配列の決定に用いる。ヌ
クレオチド配列は、Ｍ１３配列決定キット(東洋紡)を用
いて、ジデオキシチェインターミネーション法(サンガ
ーら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,７４,５４６３
〜５４６７(１９７７)参照)により決定する。使用する
酵素はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ(シークェナーゼ)であ
り、７−デアザdＧＴＰも基質として使用する。ゲル電
気泳動を、長さ８０cmの７Ｍ尿素含有ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて、２２００Ｖで５または１３時間行な
う。pＣＰＡ１４−１６９の挿入断片のヌクレオチド配
列を図３、図４、図５、図６に示す。２４５７bpのオー
プン・リーディング・フレーム１つが認められる。次の
２つの結果から、このオープン・リーディング・フレー
ムが、シュードモナス属菌株Ａ１４のＧＬ−７ＡＣＡア
シラーゼをコードする遺伝子であることが、確認され
る。１)ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
って推定されるＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの分子量(α
サブユニットの分子量とβサブユニットの分子量との
和)が、該オープン・リーディング・フレームから推定
される蛋白質の配列から計算した分子量とよく一致す
る。２)気相配列決定法(詳細は実施例４に記載)によっ
て求めたＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼのαおよびβサブユ
ニットのアミノ末端配列が、１位〜１０位のコドンおよ
び２５０位〜２５８位のコドンのアミノ酸配列と同一で
ある。

【００５７】２.２.シュードモナス属菌株Ａ１４のＧＬ
−７ＡＣＡアシラーゼのアミノ酸配列とシュードモナス
属菌株ＧＫ１６のそれとの比較 シュードモナス属菌株Ａ１４のＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼのアミノ酸配列を、松田らによって単離されたシュー
ドモナス属菌株ＧＫ１６のそれ(Ｊ.Ｂacteriol.,１６
３,１２２２〜１２２８(１９８５)参照)と比較する。Ｇ
Ｌ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４のアミノ酸配列は、ＧＫ
１６のそれと全く異なる。

【００５８】実施例３ 組換え大腸菌からの、シュードモナス属菌株Ａ１４のＧ
Ｌ−７ＡＣＡアシラーゼの精製 ３％ペプトン(ディフコラボラトリーズ、米国)、１.５
％酵母エキス(ディフコ)および０.５％ＮaＣlからなる
水性培地(３ＬＢ)(２００ml)を、５本の５００mlフラス
コの各々に入れ、オートクレーブにより１２１℃で２０
分間滅菌し、別途濾過滅菌した２５μg／mlクロラムフ
ェニコールを加える。これらの培地に、pＣＰＡ１４−
６を有するＥ.coliＭＣ１０６１の斜面培養１白金耳を
それぞれ接種し、該微生物を、回転振盪機上３００rpm
で振盪しながら、３０℃で２４時間培養する。一方、上
記と同じ諸成分プラス０.０４％アデカノール(旭電化)
を含有してなる水性培地(２０l)を、３０l容のジャーフ
ァーメンターに入れ、１２１℃で１５分間滅菌する。該
培地に、上で得た培養ブロスの全量を接種したのち、該
微生物を３０℃で培養する。プロペラ装置で２５０rpm
でブロスを撹拌するとともに滅菌空気を毎分ブロス１容
当たり１容の割合でブロスに通じることにより、醗酵を
行なう。

【００５９】２４時間培養後、１００００gでの連続流
遠心分離によって細胞を集める。得られた約１００gの
細胞ペレットを、５０mＭグルコース−２５mＭトリス塩
酸緩衝液(pＨ８)１００mlに懸濁させる。この懸濁液
に、ＥＤＴＡおよびリゾチーム(シグマ)をそれぞれ最終
濃度１０mＭおよび２mg／mlになるよう加え、混合物
を、撹拌下に、室温で３０分間インキュベートする。イ
ンキュベーション後、混合物を１００００gで２０分間
遠心分離し、生じた上澄みをまず２０mＭリン酸緩衝液
(pＨ７.５)に対して、つぎに１００mＭリン酸緩衝液(p
Ｈ７.５)に対して透析する。透析液を硫酸アンモニウム
で３５％飽和に調整し、３０分間撹拌し、１００００g
で２０分間遠心分離する。上澄みを、３５％飽和硫酸ア
ンモニウム含有１００mＭリン酸緩衝液(pＨ７.５)で平
衡化させたトヨパールＨＷ５５Ｆ(東ソー)のカラム(層
体積１５０ml)にかける。カラムを同じ緩衝液で洗った
のち、１００mＭリン酸緩衝液(pＨ７.５)中の硫酸アン
モニウム(３５％〜０％飽和)の直線濃度勾配により溶出
する。ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性を含有する画分を
プールし、２０mＭマキルヴェイン(ＭacＩlvain)緩衝液
(pＨ６.０)に対して透析する。透析液を、２０mＭマキ
ルヴェイン緩衝液(pＨ６.０)で平衡化したＣＭトヨパー
ル６５０Ｍ(東ソー)のカラム(層体積３０ml)にかける。
カラムを同じ緩衝液で洗ったのち、２０mＭマキルヴェ
イン緩衝液(pＨ６.０)１００ml中のＮaＣlの直線勾配
(０〜０.２Ｍ)により溶出する。ＧＬ−７ＡＣＡアシラ
ーゼ活性を含有する画分をプールし、２０mＭリン酸緩
衝液(pＨ７.５)に対して透析し、酵素標品として使用す
る。最終酵素標本の総量は１０mgで、その純度は約５０
％と推定される。

【００６０】実施例４ 組換え大腸菌からのシュードモナス属菌株Ａ１４のＧＬ
−７ＡＣＡアシラーゼの特性決定

【００６１】４.１.比酵素活性 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの活性をＨＰＬＣアッセイに
よって求める。２０μモルのグリシン緩衝液(pＨ９)、
０.４８〜１０.４mＭＧＬ−７ＡＣＡおよび１０μgの酵
素を含有する反応混合物(２００μl)を用いる。反応混
合物を３７℃で３分間インキュベートし、４％酢酸２０
０μlを加えて反応を停止させる。ＨＰＬＣの条件は実
施例１.３に記載のものと同じである。本セクションで
のちに用いる全てのアッセイはＨＰＬＣ法である。比酵
素活性は、蛋白質１mg当たりの単位として表現する。蛋
白質濃度は、バイオーラド蛋白質アッセイキット(バイ
オーラド、米国)により、ウシ血清アルブミンを標準物
質として決定する。最大比酵素活性(Ｖmax)およびミカ
エリス定数(Ｋm)を、ラインウィーヴァー・バーク(Ｌin
eweaver−Ｂurk)プロット(Ｍ.ディクソンとＥ.Ｃ.ウェ
ッブ、酵素、ロングマン、ロンドン、１９５８年参照)
によって得た勾配および切片から算出する。ＧＬ−７Ａ
ＣＡアシラーゼＡ１４の最大比酵素活性は７.１単位／m
g、Ｋm値は２.１mＭである。

【００６２】４.２.基質プロフィール ＨＰＬＣアッセイによって酵素活性を求める。２０μモ
ルのグリシン緩衝液(pＨ９)、２mgの基質および１〜１
６μgの酵素を含有する反応混合物(２００μl)を用い
る。この反応混合物を３７℃で２〜６０分間インキュベ
ートし、４％酢酸を加えて反応を停止させる。相対酵素
活性を、ＧＬ−７ＡＣＡに対する活性と比較しての百分
率で表す。結果を表４に示す。

【００６３】

【表４】

【００６４】４.３.温度の影響 a)至適温度(図７参照) ２０μモルのリン酸緩衝液(pＨ７)、０.４mgのＧＬ−７
ＡＣＡおよび５μgの酵素を含有する反応混合物(２００
μl)を用いる。２５〜６２℃の種々の温度で２０分間反
応を行なう。至適温度は５５℃である。

【００６５】b)熱安定性のpＨプロフィール(図８参照） ５００μｇ／mlのＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４を、
種々pＨの０.１Ｍ緩衝液中、５０℃で１時間処理する(p
Ｈ５および６には酢酸緩衝液、pＨ６、７および８には
リン酸緩衝液、pＨ８および９にはグリシン緩衝液を使
用)。２０μモルのグリシン緩衝液(pＨ９)、０.４mgの
ＧＬ−７ＡＣＡおよび１０μgの処理済み酵素を含有す
る反応混合物(２００μl)で、残存酵素活性をアッセイ
する。反応は３７℃で５分間行なう。残存活性を、熱処
理なしの酵素の活性と比較しての百分率で表す。

【００６６】４.４.至適pＨ(図９参照) ０.１Ｍの緩衝液(pＨ４、５および６のクエン酸緩衝
液、pＨ６、７および８のリン酸緩衝液、pＨ７、８およ
び９のトリス塩酸緩衝液、pＨ８、９および１０のグリ
シン緩衝液を使用)、２mgのＧＬ−７ＡＣＡおよび１０
μgの酵素を含有する反応混合物(２００μl)を用いる。
反応は３７℃で７分間行なう。ＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼＡ１４に対する至適pＨは９である。

【００６７】４.５.種々の酵素阻害剤の影響 p−クロロ第二水銀安息香酸塩(pＣＭＢ、シグマケミカ
ル)、フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ、シグ
マ)およびエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ、半井テス
ク)がＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４の活性に及ぼす
影響を、次のように調べる。Ａ１４アシラーゼ１１.６
μgを、２００μlの０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７)中、
０.１、１.０または５.０mＭＰＣＭＢ、１.０または５.
０mＭＰＭＳＦあるいは１.０または５.０mＭＥＤＴＡに
より３７℃で４時間処理する。処理した酵素の残存活性
を、混合物に基質としてＧＬ−７ＡＣＡ(２０mg／ml)２
２μlを加えることにより測定する。反応は３７℃で１
８分間行なう。残存活性を、ブランク溶液で処理した酵
素の活性と比較しての百分率で表す。結果を表５に示
す。

【００６８】

【表５】

【００６９】４.７.分子量測定 a)ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)を、ラエムリ記載の方
法(Ｕ.Ｋ.Ｌaemmli：Ｎature２３７,６８０〜６８５(１
９７０)参照)によって行なう。卵白リゾチーム(分子量
１４,０００)、大豆トリプシン阻害剤(２１,０００)、
ウシカルボニックアンヒドラーゼ(３１,０００)、卵白
オボアルブミン(４３,０００)、ウシ血清アルブミン(６
８,０００)、ウサギ筋ホスホリラーゼb(９７,０００)
は、バイオーラドラボラトリーズから購入し、分子量の
スタンダードとして使用する。実施例３記載の通りに精
製したＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４の最終製剤は、
ＳＤＳ−ゲル電気泳動で明確に区別される２本のバンド
を示し、それらの強度は、相当する分子量に比例する。
ゲル電気泳動での移動度から計算した両蛋白質の分子量
は、２８,０００および６１,０００である。

【００７０】b)ゲル濾過 精製アシラーゼ標品(０.６mg)を、２５mＭトリス塩酸(p
Ｈ７.５)−０.３ＭＮaＣl１mlに溶解させ、トヨパール
ＨＷ５５Ｆのカラム(１.６×５０cm)にかける。溶出
は、２５mＭトリス塩酸(pＨ７.５)−０.３ＭＮaＣlを用
い、流速３０ml／時で１５０分間かけて行なう。２８０
nmでのＵＶ吸収によって蛋白質を検出する。同じ条件下
で、分子量のスタンダードのゲル濾過を行って、検量線
を作成する。使用する分子量のスタンダードは、フェリ
チン(分子量：４５０,０００)、ハーフフェリチン(２２
０,０００)、ウシ血清アルブミン(６８,０００)および
ミオグロビン(１７,８００)である。流出液量から計算
したＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４の分子量は、８
１,０００である。

【００７１】上記の結果から、ＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼＡ１４は、分子量２８,０００のαサブユニットと分
子量６１,０００のβサブユニットからなると、結論さ
れる。

【００７２】４.８.アミノ酸配列の決定 実施例３記載の通りに精製したＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼを、アミノ酸配列決定のため、次のようにＨＰＬＣに
よって更に精製する。酵素標品を２０mＭマキルヴェイ
ン緩衝液(pＨ６.０)に対して透析し、透析液を、同じ緩
衝液で平衡化したＴＳＫゲルＳＰ−トヨパール５ＰＷ
(東ソー)のＨＰＬＣカラム(０.７５×７.５cm)にかけ
る。溶出は、２０mＭマキルヴェイン緩衝液(pＨ６.０)
中のＮaＣlの直線勾配(０〜０.５Ｍ)を用い、流速１ml
／分で３０分間かけて行なう。ＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼ活性含有画分をプールし、この研究に用いる。ＧＬ−
７ＡＣＡＡ１４は、実施例４.７記載の通り、２つの異
種サブユニットαおよびβからなっている。ＧＬ−７Ａ
ＣＡアシラーゼＡ１４を、８Ｍ尿素−１０％２−メルカ
プトエタノール中、室温で３０分間インキュベートして
変性し、逆相ＨＰＬＣによって各サブユニットを単離す
る。使用するカラムは、コスモシル５Ｃ４−３００(４.
６mm×１５cm、半井テスク)である。溶出は、０.０５％
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの直線濃度勾配
(２０％〜６０％)を用い、流速１ml／分で３０分間かけ
て行なう。上記の通り精製された各サブユニットのアミ
ノ酸配列を、気相シークエンサー４７０Ａ(米国アプラ
イドバイオシステムズ)により決定する。αおよびβサ
ブユニットのＮ末端アミノ酸配列は、それぞれ、Ａla−
Ａsp−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｓer−Ａla−Ｔhr−Ｐro−Ｐ
ro−およびＳer−Ａsn−Ａsn−Ｘ−Ｖal−Ｉle−Ｓer−
Ｐro−Ｇln−(Ｘ：決定できず)である。

【００７３】新規に単離されたシュードモナス属菌株Ａ
１４ならびに上記実施例で得られた発現プラスミドpＣ
ＰＡ１４−６をエシェリキア・コリＭＣ１０６１に挿入
した下記形質転換体は、ブダペスト条約による国際寄託
機関の一つである３０５茨城県つくば市東１丁目１−
３、工業技術院微生物工業技術研究所に、１９９０年９
月２５日に寄託されている。

【００７４】 微生物 寄託番号 Ｐseudomonas sp.Ａ１４ ＦＥＲＭ ＢＰ−３１１１ Ｅscherichia coli ＭＣ１０６１(pＣＰＡ１４−６) ＦＥＲＭ ＢＰ−３１１２

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpＣＰＡ１４−１の機能マップを
示す図である。

【図２】 プラスミドpＣＰＡ１４−６およびpＣＰＡ１
４−１６９の制限部位および機能のマップを示す。

【図３】 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４染色体遺伝
子のヌクレオチド配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を示す。

【図４】 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４染色体遺伝
子のヌクレオチド配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を示す。

【図５】 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４染色体遺伝
子のヌクレオチド配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を示す。

【図６】 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４染色体遺伝
子のヌクレオチド配列およびそれから推定されるアミノ
酸配列を示す。

【図７】 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４の至適温度
を示す。

【図８】 ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼＡ１４の至適pＨ
を示す。

【図９】 熱安定性のpＨプロフィールを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 小野 裕樹 大阪府三島郡島本町青葉３−12 (72)発明者 石見 盛太 茨城県つくば市梅園２−８−１ (72)発明者 高乗 仁 茨城県土浦市永国1160−７

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の特性を有するＧＬ−７ＡＣＡアシ
   ラーゼ： (a) グルタリル７−ＡＣＡ、アジピル７−ＡＣＡおよ
   びスクシニル７−ＡＣＡを７−アミノセファロスポラン
   酸に酵素的に転換する能力を有し、 (b) α−サブユニット[分子量：２８,０００ダルトン
   (ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)]およびβ−サブユニット[分子量：
   ６１,０００ダルトン(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)]よりなり、 (c) α−サブユニットのＮ末端アミノ酸配列が、Ａla
   −Ａsp−Ｔhr−Ａla−Ｐro−Ｓer−Ａla−Ｔhr−Ｐro−
   Ｐro−である。
2. 【請求項２】 その前駆体として図３、図４、図５、図
   ６に示されているアミノ酸配列１〜７９０を有すること
   を特徴とする請求項１記載のＧＬ−７ＡＣＡアシラー
   ゼ。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のＧＬ−７ＡＣＡ
   をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 図３、図４、図５、図６に示されている
   ヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３記
   載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項３または４記載のＤＮＡを含有し
   てなる発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の発現ベクターによって形
   質転換された宿主細胞。
7. 【請求項７】 大腸菌であることを特徴とする請求項６
   記載の宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項６または７記載の宿主細胞を培地
   に培養し、培養物からＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼを採取
   することを特徴とするＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼの製造
   法。
9. 【請求項９】 式(II) 【化１】 (式中、Ｒ¹はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素を、Ｒ
   ²はカルボキシ(Ｃ₁−Ｃ₆)アルカノイル、Ｄ−グルタミ
   ルまたはテノイルをそれぞれ表す)で表される化合物ま
   たはその塩を、請求項６または７記載の形質転換体の培
   養液またはその処理物と接触させることを特徴とする、
   式(I) 【化２】 (式中、Ｒ¹は上記と同意義)で表される化合物またはそ
   の塩の製造法。