PL166201B1

PL166201B1 - S posób wytwarzania fragmentu DNA(H ) kodujacego polipeptyd o aktywnosci hydratazy nitrylowej i sposób wytwarzania fragmentu DNA( L ) kodujacego polipeptyd o aktywnoscihydratazy nitrylowej PL PL PL PL

Info

Publication number: PL166201B1
Application number: PL91289239A
Authority: PL
Inventors: Teruhiko Beppu; Hideaki Yamada; Toru Dr Nagasawa; Sueharu Horinouchi; Makoto Dr Nishiyama
Original assignee: Teruhiko Beppu; Hideaki Yamada; Nitto Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1991-02-28
Publication date: 1995-04-28
Also published as: DE69119454T2; CS9100531A2; CN1054616A; FI102539B; NO910797D0; ATE138101T1; NO910797L; EP0445646B1; AU7129391A; NO306684B1; EP0445646A3; CZ284048B6; JPH04211379A; CA2037291A1; FI910960A0; RU2081173C1; FI910960A; ES2089044T3; MX193790B; US5731176A

Abstract

1. Sposób wytwarzania fragmentu DNA(H ) kodujacego polipeptyd o aktywnosci hydratazy nitrylowej i o nastepujacych sekwencjach aminokwasów w podjednostkach a(H ) i ß ( H ) podjed- nostka a(H ): znamienny tym, ze wydziela sie chromosomowy DNA z Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERMBP-1478), trawi sie chromosomowy DNA enzymami restrykcyjnymi, selekcjonuje sie wytworzone produkty trawienia za pomoca sondy wytworzonej z genu hydratazy nitrylowej pochodzacego z Rhodococcus sp. N-774. 3. Sposób wytwarzania fragmentu DNA(L ) kodujacego polipeptyd o aktywnosci hydratazy nitrylowej i o nastepujacych sekwencjach aminokwasów w podjednostkach a(L ) i ß (L ), podjednostka a(L ): znamienny tym, ze wydziela sie chromosomowy DNA z Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERMBP-1478), trawi sie chromosomowy DNA enzymami restrykcyjnymi, selekcjonuje sie wytworzone produkty trawienia za pomoca sondy wytworzonej z genu hydratazy nitrylowej pochodzacego z Rhodococcus sp. N-774. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wsnilizkL jest lbosed wytwirzinii fragmentów DNA pochodzących z Rhodococcus rhoZochroLl J-1 kodujących bolibeptsZ o iktywności hydritizy nitrylowej, która hydrolizie nitryle do imidów.

Hydra^zi nitrylowi lud nitrylizi są zninymi enzymimi, które powodują uwodornienie nitryli do imidew. Mikroorginizmy, które wstwirzają hydritizę nitrylową nileżą do rodziju Bicillus, Bicteridium, MicrococcLS i BrevidlctrriLm (pitrz jlboński opis pitentowy B-6221517/1909, opis bltentows Stinów Zjednoczonych Ameryki nr4001001), CorsnedlcteriLm i Nocirdii (pitrz jlboński opis pltentows B-56-179.18/1909, opis pitentowy Stinew Zjednoczonych Ameryki nr 4 240 960), PseLZomonlL (pitrz jibońLki opis bitentowy B-59-17551/1904, opis blteatowy Stinów Zjednoczonych Ameryki nr 4 617 902), R^do^cc^, Arthrodicter i Microdicterium (pitrz jlbońlki opis bltentowy A-61-162193/1906, europejski opis bltentowy A-0100116) i RhodococcLL rhoZnchroLL (pitrz jlbońLki opis bltrntowy A-2-470/1990, europejski opis pitmtowy A-0107926).

Hydri^zy nitrylowej Lżywlnn do brzrbrowlZzenii nitryli w/ imidy. Korzyst^ąc z fragmentu DNA wytworzonego sposobem według wynilizku ni drodze inżynierii genetycznej konstruuje się mikroorgiaizmy, które ziwieriją wiele kopii zrekomdinowinego DNA kodującego hydritizę nitrylową. Rekomdialnts wytwirziją znicznie większe ilości hydr^izy nitrylowej w borówniniu z koawencjonilair ltosowlnymi mikroorginizmimi.

166 201

Znany jest fragment DNA pochodzący z Rhodococcus sp. N-004 (FERMBP-1916), który także koduje polipeptyd o aktywności hydratazy nitrylowej (japoński opis patentowy A-2-119000) (1900).

W przeciwnieństwie do tego, sposobem według wynalazku fragment DNA kodujący polipeptyd o aktywności hydratazy nitrylowej, wytwarza się z Rhodococcus rhodochrous J-1.

Wyizolowany gen kodujący hydratazę nitrylową, wstawia się do odpowiedniego wektora plazmidowego i zrekombinowanym plazmidem transformuje się odpowiedniego gospodarza, otrzymując w ten sposób zadowalające transformanty, które wytwarzają hydratazę nitrylową, która ma dużą aktywność także w stosunku do nitryli aromatycznych.

Fragment DNA wytwarzany sposobem według wynalazku, koduje polipeptyd o aktywności hydratazy nitrylowej, który obejmuje podjednostki α^(ΗΙ i βΗ¹ o następującej sekwencji aminokwasów:

podjednostka αΉ

10 15)

MttSerGLuH.sVaj^AsnLysTyr^ThrGluTyrGluAl^ć^Ar^Thr

25 30

LysAlaIlGGllThrLeuLeulyrGluArgGlyLeuIlelhrPro

40 45)

AlaAlaValAspArgVaaValSerlyrTyrGl·LLAsnGlLlIleGly

55 60

ProMeeGlyGlyAlaLysVaaValAlaLysSerTrpValAspPro

70 75)

GluTyrArgLysTrpLeuGluGlLuλspAlaThrAlaAlaMetAla

85 90

SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHHsGlnIleSerAlaVal

100 105

PheAsrLAspSerGlnThhHHsHisValValValCysThrLeuCyp

110 115 120

SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr

125 130 135

LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgG.ly

140 145 150

ValLeuLysArgAspPhhGlyPhhAlpIleProAspGluValGlu

155 160 110

Va lAr gVv a T irAip S e r 5! e r S e rG 1 u 11 eAi g T tj? IleV v a I le

170 175 180

ProGluArτProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu

185 100 195

Th r L γ s L e uV a IS e rAi gA i pSseM et IleG lyV a IS er AsnA la

200

LeuThrProGlnGluValIleVal podjednostka β'Η

10 15 eetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyeetThpGlyTypGlyPpo

166 201

25 33

ValProTyrGlnLyGAGsGluPrąPhePheHisTyrGluTrsGlu

40 45

GlyArgThrLLuUsrIleLeuThrTrpMMtHdsLeuLLsGlyrle

55 60

SeGTrsTrsAΞpLysSerArτPhePheArτGluSerMetGlyAGn

7(0 70

GluAsnTyrVaLAsnGllIIleArτAsDSerTyrTyrThrHiGTrs

85 90

Le'iGer.A LaAlaGlluYkgTl eLeiA/aa ΑΑ.ΐΑΑρΐ..) sl ell.eThr

100 1015

G1 uG 1 uG 1 uAr gL y s H H sAr gVa 1G l nG l u 11 ej L e uG l uG 1 yAr g

000 m no

TyrThrAspAkgTLsPrrOsrAkgTLsGheAkpProAkaHlnrle

025 no 135

GluLysAlaIleGI^AYrgLeuHiGGluPrąHiGSerLeuAlaLeu

040 105 150

PrąGlyAllGluProSeGPheSerLeuGlyAkpLLsIleLyGVal

055 160 165

LyGSerMetAGDPrąLeuGlyHiGThrArgCysPrąLysTyrVal

000 1715 180

ArgAsnLlss1eG1yG1uIleValAlhTyrHisG1yCysGlηI1e

085 190 195

TyrPrąGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAGsPrąArτPrą

200 205 210

LeuTyrThrValAllPheSerAlaGlnGluLeuTrsGlyAGsAGS

205 220 225

GlyAsDGlyLyGAGsValVl.lCyGVllAGsLeuTGsGluPrąTyG

LeulleSerAlf.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania fragmentu DNA^(L’ kodującego sąlisestsd o aktywności hydratazy nitrylowej obejmujący podjednostki cL^L’ i β^<υ o njstęjującej n^ljwencji aminokwasów:

podjednostka ff¹¹:

10 15

MetThrAlHHiGAGDPrąVllGlnGlyThrLeuPrąArτSerAGD

215 30

HuG 1 u Ile Al ćAl ćAr gVflL ysAlaM e t G1 wAk a Ileś L eu Val

40 45

AssLysGlyLeuIleSerThrAGsAllll<A.GsHiGMetSerSer

515 60

ValTyrGluAsnGluVa1GlyProGlnLLuGlyAkaLLSlleVal

166 201

70 75

Alad.rgdlaTrpValdspProGluPheLysGlrd.rgLeuLeuThr

85 90

AspAllThrSerdlaCysdrgGluMetGlyValGlyGlyMetGla

100 100

GlyGluGluMe eVa lVa 1L euG luAsnT h r G1 yT li rVa 1H isAsn

000 100 100

MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrPrąTrpPrąValLeu

005 130 135

GlyLeuPrąPrąAsaTrpTyrLysTyrPrąAlaTyrArgAlaArg

040 100 100 dlaValdrgdspPrąArgGlyValLeslAlaGluPheGlyTyrThr

050 100 106

ProAspProAdpPalG1uSIeArgI1eTrpdspSerSerA.1aGlu

050 055 . , 180

LeuAr gT y rT rpVa 1L e uP rr oG lnAr gP roAlaG lyThrG luA-sn

085 100 100

PheThrGluGluGlnLeiuAlaAspLeuYalThrArgAspSerLeu

000 205

IleGlyVs l·SerValProThrThrPrąSerLysdla pądjeZlaąstka β^Ζί/:

10 10

Me tAspG 1 yll eH isAspLeuG lyG 1 yArgAlaG lyLeuG lyP ro

20 30

IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu

40 45 drgSerVa1LeuThrMeePheProAlaMeeAlaLe^sAlaGlydla

55 60

PheAsnLejU^!dsGlnnheedgglyAdaMMtG1uG1nylePrąPrą

75 75

HisAspTyrLeuThrSerGlaTyrTyrGluHisTrpMetHisALl

85 90

MetIleHlsHisGlyIelGSA.laGlyIlehedAepSedAspG1u

100 105

LeaAspArgArgThrG1nTyrTyrMMeAspHisPrąAspAspThr

330 115 120

ThrProThrAdrG1πAdpPprąlnaeeValG1uUhr I^SerUn

005 050 005

LeuIleThrHisGlyAlA?sspTyrArgArgProThrAspThrGlu

166 201

150 145 150

AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla

155 160 165

SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg

170 175 180

ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp

185 190 195

ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr

200 205 210

ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro

215 220 225

AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuPro

Ala.

Frigment DNA⁰⁴’ wytwirziny sposodrm według wynilizku, który ziwieri sekwencję nukleotydów kodującą określone powyżej bodjednoLtki α⁰ i β™, odejmuje sekwencje DNA bodjeZnoLtki «‘H

30 45

GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC

745 90

AAGC-CGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC

105 120 110

GCCGCCGTCGACCCACTCGTTTCGTACTACGACAACGAGATCGGC

150 165 110

CCCATCCCCCCTGCCAAGGTCGTGGCCAACTCCTGGGTGGACCCT

105 210 225

GACTACCCCAAGTCCCTCGAACAGGACCCGACGCCCGCGATGGCG

250 255 220

TCATTGCCCTATGCCCCTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC

285 300 315

TTCAACGACTTCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT

000 345 360

TCCTCCTATCCGTGGCCGGTGCTTGCTCTCCCGCCCGCCTGGTAC

075 390 455

AAGAGCATGCAGTACCCGTCCCCAGTGGTAGCGCACCCTCGTGGA

520 435 450

CTGCTCAAGCGCGAT'ΓTCCCTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG

565 480 495

GTCAGCGTTTGGGACAGCACCTCCGAAAΊ'CCGCTACATCGTCATC

510 5^5 540

CCGCAACCGCCCGCCGGCACCCACCCTTGGTCCGAGGAGGAGCTG

555 520 585

ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGCTGTCAGTAATGCG

600

CTCACACCGCACCAACTGATCGTA

166 201 i sekwencję DNA podjednostki β'^Η/:

30 45

ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG

75 90

GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG

105 110 110)

GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA

150 166 110

TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC

105 201 225

GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG

250 255 2550

CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC

205 300 30^5

GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG

000 305 360

TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC

055 30)0 405

GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT

520 435 450

CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG

565 450 495

AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG

510 5^5^5 540

CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC

555 570 55^5

TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG

600 615 630

CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC

655 660 675

GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC

CTGATCTCTGCG.

Fragment DNA^IU wytwarzany syhshbem według wynalazku, który zgwierg sekwencję nuklehtydyw kheującą hnreylone yhwyżej bhejeenhstki α^,ω i β^\ hbejmuje sekwencje DNA bhejeenhstki

30 45

ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC

75 90

GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC

166 201

105 120 105

GACAAGGGCCTGATCTCCACClAClCCATClACCACATlTCCTCl

150 165 HO

1TCTAC1AGAAC1A1GTC1<1TCCTCAACTC11C1CCAAGATC1TC

195 210 225 lCCClC(^<C(GTG(lG^ΓΓ<CGjATCCCl7MTTCAAlCAlClCCTGCTCACC

200 255 220

1ACGCCACCA1C1CCT1CC1T1AAAT111CGTC11C11CAT1CA1

205 300 315

11CG7AS1AASΓGGTCGT1CT11AAAACACC:GGCAC11TCCACAAC

000 345 360

AT11TC1TAT1TACCTT1T1CTC1T1CTATCC1T11CC11TTCTC

075 390 405

11CCT1CCACCCAACT11TACAA1TACCCCGCCTACC1CGCCCGC

020 435 450

1CTGTCC1C1ACCCCC1A11TGT1CT11CCGAATTCG1ATATACC

065 480 495

CCCGACCCT<1AC1TC1A1ATCC1GATAΊ^,111ACTC1A1T1CC1AA

510 5:25 540

CΊTCGCTACTGG1TCCT1CC1CAAC1CCCA1CC11CACCGA1AAC

555 570 585

TTCACCGAAlAACAACTClCClACCTClTCACCClClACTCGCTC

600 615

ATCllClTATCCGTCCCCACCACACCCAlCAAllCC i sekwencję DNA podjednostki

30 40

AT11AT11AATCCAC1ACCTCG1TG1CC1C1CC11CCTG1GTCC1

15 90

ATCAAlCCC:lAATCClATGAACCTGTTTTCCATTCClATTGGlAG

105 120 115

C11TC1GTTTT1AC1AT1TTCCC11C1AT11C1CT11CC1GCGCG

150 165 110

TTCAATCTCGACCA1TTCC111GC1C1AT11A1CA1ATCCCCCC1

195 210 225

CAC1ACTACĆT1ACCTC1CAATACTAC1A1CACT11AT1CAC1C1

200 255 220

ATlATCCACCACGGCATCGAGlCGGGCATCTTClATTCClACGAA

205 000 315

CTC1ACC1CC1CACCCA1TACTACAT11ACCATCC11AC1ACACG

000 005 300

ACCCCCAC1C11CA11ATCC1CAACT11T11A1AC<1ATCTC1CAA

166 201

075 300 440

CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG

420 440 440

GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC

405 448 440

TCACCGAACACCCACACCCGCClCGCCGGAlACGTCCGCGGTClT

510 5525 550

GTCGGCGAAGlClTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC

555 555) 555

ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGTAAlGCCCCGAACACCTGTACACC

000 601 600

GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACClGCCGCCCCG

045 600 6055

AACGTCGTCAATCACATCGACGlGTlCGAACCGTAlCTGCTACCG

GCC.

Według wynalazku sposób wytwarzania fragmentu DNA⁽h i DNA^<LI kodującego polipeptyd o aktywności hydratazy nitrylowej i o sekwencjach aminokwasów w podjednostkach a^<H> i βΗ oraz a^<L> i βΐί) przedstawionych powyżej, polega na wydzieleniu chromosowego DNA z Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERMBP-1400; charakterystyka morfologiczna patrz EP-A2-0,400,926), trawieniu chromosowego DNA enzymami restrykcyjnymi, selekcjonowaniu wytworzonych produktów trawienia za pomocą sondy utworzonej z genu hydratazy nitrylowej pochodzącego z Rhodococcus sp. N-004.

Poniżej opisano procesy, które przedstawiają sposób według wynalazku i późniejsze zastosowanie wytworzonego tym sposobem fragmentu DNA.

1) Wydzielenie i oczyszczenie hydratazy nitrylowej i częściowe sekwencjonowanie aminokwasów hydratazy nitrylowej.

Z Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERMBP-1400) wydziela się i oczyszcza dwa typy hydratazy nitrylowej (oznaczone jako typ H i typ L) i obydwa enzymy rozdziela się na podjednostki a i β stosując wysokosprawną chromatografię cieczową. Określa się część sekwencji aminokwasów każdej podjednostki (fig. 1).

2) Wytwarzanie sondy DNA dla genu hydratazy nitrylowej.

Sondę wytwarza się JM105/pYUK126 (FERM BP-6947) opisanego w japońskim opisie patentowym JP-A-1-119778/6990 wykorzystując wysoki stopień homologii w sekwencji aminokwasów między podjednostką β hydratazy nitrylowej z Rhodococcus sp. N-004, opisanej w japońskiej Patent Official Gazette i podjednostkę z Rhodococcus rhodochrous J-1. Plazmid pYUK121 zawierający gen hydratazy nitrylowej pochodzący z Rhodococcus sp. N-004, otrzymuje się z hodowli JM 105/sYUK121. DNA pYUK121 trawi się za pomocą Sphl i Sall. Fragment Sphl-Sall zawiera gen hydratazy nitrylowej (fig. 2) z Rhodococcus sp. N-004. Fragment DNA znakuje się radioaktywnie.

1) Wykrywanie segmentu DNA zawierającego gen hydratazy nitrylowej z chromosomu Rhodococcus rhodochrous J-1.

Chromosomowy DNA otrzymuje się z kultury Rhodococcus rhodochrous J-1. Chromosomowy DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi i hybrydyzuje się z sondą opisaną w punkcie 2) stosując metodę hybrydyzacji Southerna [E. M. Southern. J. Mol. Biol., 90, 501 (1905)]. Wyselekcjonowano dwa fragmenty DNA o różnej długości.

4) Konstruowanie zrekombinowanego plazmidu.

Zrekombinowany plazmid konstruuje się przez wstawienie fragmentu chromosomowego DNA wytworzonego w punkcie 1) do wektora plazmidowego.

166 201

5) Trinsformicji i selekcji trinsformintów zlwirrijących zrekomdinowiny bllzmid.

TrlnLformlnts uzyskuje się stosując zrekomdinowiny blazmid opismy w punkcie 4). Trans· forminty zawierającr zrekomdinowins plizmid wysrlekcjnaowuje się zi pomocą sondy opinnej w punkcie 2) metodą hybrsdszicji kolonii. [R. Bruce Willici i wsp., Nuc. Aci. Ros., 9,079 (1901)]. Doditkowo, odecność genu hydriU/y nitrylowej w zrekomdinowinym plizmidzie potwierdzi się metodą hydrydyzicji Southerni. Tik wyselekcjonowine bl^azmiZy ozniczi się symdolimi pNHJ10H i pNHJ20L.

6) Wydzielenie i oczylzczanie DNA plizmiZu i konstruowinie mipy restrykcyjnej.

DNA blizmidów pNHJ10H i pNHJ20L, wytworzonych w punkcie 5), wydzieli się i nczyszczi. Konstruuje się mipę restrykcyjną tych DNA (fig. β), idy określić rejon ziwierajocy gen hydritizy nitrylowej.

7) Sekwencjonowinie DNA.

Wycini się ^^ι^ segment z wLtawionrgo fragmentu DNA w pNHJ10H i pNHJ20L zi pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego. Następnie do sekwencjonowinii używi się wstiwionego frigmentu DNA. Sekwencji nuklrotydów fragmentu DNA (fig. 4, 5) wykizuje, że fragment ten ziwiera sekwencję wydedukowaną z sekwencji aminokwaLÓw opisinej w punkcie (1).

0) Wytwirzinie hydritizy nitrylowej z użyciem trinsformintów i konwersji nitryli do imidów.

Prowidzi się hodowlę trinsformintów z punktu (5). Komórki dakteryjnr mieszi się z nitrylimi, podłożem dli hydratizy nitrylowej i wytwirzi się imidy.

Rhodocnccus rhodochrous J-1 zdebonowino w Fermentition Reseirch Institute, Agency of Industriil Science ind Trchanlogs, pod numerem FERM BP-1470. Traasformaat TGI/pNHJ10H ziwierijący pNHJ10H, opisiny w punkcie 5) i traasformint TGl/bNHJ2()L ziwierajocy pNHJ20L, opinny w punkcie 5) zdeponowiao jik wyżej pod numerimi FERMBP-2777 i FERMBP-2770, odpowiednio.

Możni stosowić dowolne wektory włączijąc w to wektory plizmidowe (np. pAT151, pMP9, pHC624, pKC7 itd.), wektory figowe (np. λ gtll (Toyodo), Chiron 4A (Amershim) itd.). Enzymy, które możni stosowić odejmują SphI, Sili, EcoRI, BimHI, Sicl itp., które są dostępne w hindlu (Tikira Shuzo). Transformowić możni komórki różnych gospodi^y, w tym E. coli JM 105 i E. coli TGI, nie ograniczijąc się do tikich.

Stosuje się podłoże do hodowli transform^tów zwykle stosowine w technice.

Konwersję nitryli do imidów przeprnwidzi się stosując hydritizę nitrylową, surową hydritizę nitrylową, hodowlę transform^tów, wyizolowlar komórki daktrrsjae rwratuilaie poddine ohródce, itp., uzyskine z hodowli tranLformintew.

Odpowiednie nitryle, które możm w powyższy sbosód poddiwić konwersji do imidów odejmują nitryle iromityczne ziwirrające 4-10 itomów węgli w grupie iromitycznej i nitryle ilifityczne ziwierijące 2-6 itomów węgli, które są opinne w europejskim opisie pi^ntowym nr 0107 926. Typowymi przskłidimi nitryli so 4-, 1- i 2-cyjlnobigydsas, drnzonitrsl, 2,6difluorodeazonitgsl, 2-tiofrnoklrdonitryl, 2-furnnitrsl, cyjaaobirazsal, ikrylonitryl, metikrylonitryl, krotnaitgyl, icetonitryl i 3-hyZrokLyprobinnitryl.

Osiągnięciem wynilizku jest określenie sekwencji iminnkwiLÓw podjednostek α i β dwóch typów hydritizy nitrylowej i określenie sekwencji kodujących je aukleotsdów pochodzących z Rhodococcus rhodochrous J-1. Frigment DNA kodujący hydritizę nitrylową wstiwii się do wektori ekspresji i zrekombinowinego wektori używi się do trlasformowlnii. Tranlformint ziwieri wiele kopii genu i może produkowić dużo więcej hydritizy nitrylowej w porówmaiu z konwrncjonilnie ltnsowinsmi mikroorginizmimi.

Figuri 1 przeZltiwii sekwencję iminokwisów od N-końci podjrdaostek α i β dwóch typów hydritizy nitrylowej wstwirziaej przez Rhodococcul rhndnchrous J-1, fig. 2 - sekwencję DNA genu hydritizy nitrylowej pochodzącego z Rhndncoccul sp. N-774, który jest stosowmy jiko sondi DNA, ni fig. 1 brzrZstlwione so mipy restrykcyjne zrrkomdiaowiasch plizmiZów, pNHJ10H i bNHJ20y, ni fig. 4 brzeZstiwioao sekwencję DNA frigmentu dNa w pNHJ10H pochodzącego z Rhodococcul rhodochroul J-1 i wsdeZukowlną sekwencję iminokwisów, ni fig. 5 - sekwencję DNA fragmentu w pNHJ20L pochodzącego z RhoZococcus rhodochrnul J-1 i wsdedLkowiaą sekwencję imiankwisów.

166 201

Wynalazek ilustruje szczegółowo następujący przykład, nie ograniczający zakresu wynalazku,

W przykładzie stosuje się następujące skróty:

TE: Tris-HCl (10 mM; pH 7,8), EDTA (1 wM, pH 8,0)

TNE: Tris-HCl (50 mM; pH 8,0), EDTA (1 mM, pH 8,0), NaCl (50 wM)

STE: Tris-HCl (50 mM; pH 8,0), EDTA (5 wM, pH 8,0), sacharoza (35 mM)

2^XYT podłoże: 1,6% Trypton, 1,0% ekstrakt drożdżowy, 0,5% NaCl,

Przykład,

1) Wydzielanie i oczyszczanie hydratazy nitrylowej i częściowe sekweacjoaowanie aminokwasów hyd^azy nitrylowej,

Prowadzono hodowlę Rhodącąccus rhodąchrąus J-1 na podłożu składającym się z 3 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,5 g/l KH2PO4,0,5 g/l K2HPO4,0,5 g/l MgSO4 · 4H^, 0,01 g/l COCk i 3 g/l krozonαwidu o pH 7,2, w temperaturze 28°C w ciągu 80 godzin, Zebrano komórki bakteryjne, 50 g komórek rozerwano i frakcjonowano siarczanem amonu, Próbkę poddano dializie i dializat odwirowano, SupewaZaat wprowadzono do kolumny chromatograficznej DEAE-Ce11u1ofiae, Feay1o-Sepharose, Sephadex G-150 i Oktylo-Sepharose, Otrzymano dwie frakcje o aktywności enzymu, które poddano dializie. Dializaty poddano wysokosprawnej chromatografii cieczowej stosując kolumnę z odwróconymi fazami (Senshu Pak VP-304-1251, Senshu Kagaku) i otrzymano dwie odpowiednie pądjednostki (a i β). N-końcową sekwencję aminokwasów podjednostek c/h, β/Η, α/D i βι^<υ określono stosując sekwenser białka Applied Biąsystews model 470A, Sekwencje aminokwasów są przedstawione na fig, 1,

2) Wytwarzanie sondy DNA dla genu hydratazy nitrylowej,

Prowadzono hodowlę E, coli JM105 (FERM BP-1937) zawierającej pYUK121, w 100 ml podłoża 2xYT zawierającego 50 pg/ml ampicyliny, w 30°C przez noc (12 godzin), Zebrano komórki bakteryjne i dodano do nich TNE, Zawiesinę komórek odwirowano, Do osadu dodano 8 ml STE i 10 mg 1izązywu, Mieszaninę iakubowaaą w 0°C w ciągu 5 minut, po czym dodano 4 ml 0,25 EDTA, Następnie do mieszaniny w temperaturze pokojowej dodano 2 ml 10% SDS i 5 ml 5 M NaCl, Wytworzoną mieszaninę iakubąwaao w temperaturze 0 - 4°C w ciągu 3 godzin, po czym odwirowano w ultrawirówce, Do supernatantu dodano 0,5 objętości 30% PEG 6000, Mieszaninę inkubowano w 0-4°C w ciągu nocy (12 godzin) i odwirowano, Do osadu dodano TNE doprowadzając objętość do 7,5 ml i do zawiesiny dodano CsCl, Mieszaninę odwirowano w celu usunięcia białek, Następnie do superaαZaaZu dodano 300- 500//g/ml bromku etydeay, Mieszaninę przeniesiono do probówki wirówki, Probówkę uszczelniono na gorąco i odwirowano w u1zrawirewce, Wyekstrahowano cccDNA (kowalencyjnie zamknięty kolisty DNA) stosując pompę peresta1zeczną, Do ekstraktu dodano trochę ponad równą ilość alkoholu izopropylowego nasyconego wodą w celu usunięcia bromku etydeny, Próbkę poddano dializie do TE, Otrzymano około 3 ml oczyszczonego pYUK121,

DNA pYUK121 trawiono enzymami SphI i Sali i otrzymano w rezultacie fragment o długości 2,07 kilozasad, zawierający gen hyd^azy nitrylowej pochodzący z RIoZo^^^ sp, N-774, Fragment oznakowano radioaktywnie za pomocą “P i otrzymano sondę, Sekwencja nuk1eoZeZouα sondy jest przedstawiona na fig, 2,

3) Wytwarzanie fragmentu DNA zawierającego chromosomowy gen hyZrataze nitrylowej,

Prowadzono hodowlę RhoZocąccus rhoZochrous J-1w 100 ml podłoża (10 g/l glukozy, 0,5 g/l

KH2PO4, 0,5 g/l K2HPO4, 0,5 g/l MgSO4 · 7 H2O, 1 g/l ekstraktu CrożCżowego, 7,5 g/l peptonu, 0,01 g/l CoCl2,7,5 g/l mocznika, ^glicyny lub 0,2pg/ml ampicyliny, 11 wody, pH 7,2), Zebrano komórki bakteryjne i przemyto je wodą z TNE, Następnie zawieszono je w 10 ml TE, Do zawiesiny dodano 4 ml 0,25 M EDTA, 10-20 mg lizozymu, 10-20 mg achrąwoprąZeazy i 10 ml 10% SDS, Zawiesinę iakubowαaą w 37°C w ciągu 3 godzin, Do zawiesiny dodano 15 ml fenolu, Mieszaninę iakubowαao w temperaturze pokojowej w ciągu 15 minut, następnie odwirowano, Górną warstwę usunięto, a Co superaαtαaZu dodano 0,7 ml 2,5 M octanu sodu i eteru Ziete1owego, Mieszaninę odwirowano, górną warstwę odrzucono, Do dolnej warstwy dodano 2 objętości etanolu i usunięto DNA za pomocą szklanego pręcika, DNA płukano mieszaniną TE i etanolu w stosunkach 2:8,1:9 i 0:10 (obj./ąbj,) w ciągu 5 minut każdą, Następnie DNA ponownie zawieszono w 2 - 4 ml TE (37°C),

166 201

Dh zawiesiny eheanh 10 pl mieszaniny RNazyA i T1 i inkubhwgnh mieszaninę w 30°C. Dh mieszaniny dheanh równą ilhyć fenhlu, następnie hewirowanh. Dh supernatantu dheanh więcej niż równą ilhyć eteru. Mieszaninę znów oewirowanh, górną warstwę herzuconh bozhstawiając dhlną. Dhlną warstwę przez nhc bheeawarh dializie dh 21 TE zgwiergjąceoh małą ilhyć chlhrhfhrmu, dalej eializhwano dh ywieżegh TE w ciągu 3-3 ohdzin. Otrzymanh 3 ml surhweth chromoshmhwegh DNA.

Dh surhwegh chromhshmhweoo DNA eoefrh 10 pi TE, 3 r/l bufhru reakcji (10x) i 2 pl óacl. Mieszaninę inkubhwgnh w 30°C w ciągu 1 ohdziny i pheeawanh elektroforezie na żelu agarowym przy 60 V. Przeprowadz^h hybrydyzację óoutaerrf caromhshmoweoh DNA sthsując shndę hpisarą w (2). ótwierdzonh, że fragmenty h długhyci 6,0 kilhzgsfe i 9,3 kilhzasad wykazują silną hybrydyzację.

pl chromoshmhwegh DNA trawihnh enzymem óacl i boedgnh elektroforezie na żelu agarowym, jak hpisanh phwyżej. Z żelu wycięth fragmenty 6,0 kilhzasad i 9,3 kilhzasad i każdy z nich werowadzhnh dh 3 hbjęthyci 8 MNaClO4. Ph rozpuszczeniu każdy roztwór nanhszhnh na bibułę GF/C (Whatman) (h średnicy 6 mm). Na bibułę naniestom 10 kropli (—100 pl) TE zawierającegh óMNaC^, następnie 10 kropli (—100 pl) 90% etanhlu. Bibułę wysusz^h w phwietrzu w ciągu 3 minut i umieszczhnh w probówce Eppendhrfg o bojemnhyci 0,0 ml. Dh probówki dodfrh 30 pl TE i całhyć inkubhwanh w 30°C w ciągu 30 minut. Następnie zawartość probówki hewirowanh. Otrzymanh hkhłh 30 pl supernatantu, który zawierał fragmenty o długhyci 6,0 kilozgsge i 9,3 kilozfsad, zawierające gen hydratazy nitrylhwej z chromosomhwegh DNA.

Phniżej hpisgny jest sphsób wytwarzania fragmentu DNA h długhyci 6,0 kz dh wektora. Taką samą methdę sthsuje się dh wstawienia fragmentu DNA h dłuohyci 9,3 kz.

3) Wstawienie fragmentu chromhshmhwego DNA dh wektora.

Dh 10 pl pUC 19 dhdgnh 10 pi TE, 3 pl bufhru reakcji (10x) i 2 pl óacl. Mieszaninę inkubhwanh w 30°C w ciągu 1 ghdziny. W celu zahamhwgnig reakcji dh mieszaniny dhdanh 2 pl 0,20M EDTA. Następnie dhdgnh 0pl IM Tris-HCl (pH9) i 3plBAP (bakteryjna fosfataza alkaliczna). Mieszaninę inkubhwanh w 60°C w ciągu 1 ghdzmy. Dh mieszaniny dhdgnh TE w ilhyci uzupełniającej hbjęthyć dh 100 pl. Mieszaninę ekstrahhwfnh trzy razy równymi ilhyciami fenhlu. Dh ekstraktu dodanh równą ilhyć eteru. Górną warstwę usunięth, a dh dhlnej dhdfrh 10 pl 3M hctanu shdu i 200 pl etanhlu. Mieszaninę inkubhwanh w temperaturze -00°C w ciągu 30 minut, hdwirhwanh, wysusz^h i phnhwnie zawieszhnh w TE.

Zmieszanh 0 pl tak htrzymanegh DNA pUC19 i 30 pl fragmentu DNA h dłuohyci 6,0 kz, hbisgnego w (3). Dh mieszaniny dhdfno 6pl bufhru dh ligacji, 6pl ATP (6 mg/ml) i 3pl ligazy DNAT3. Mieszaninę inkubhwanh w 3°C przez nhc (12 ghdzm) i uzyskanh zrekhmbinhwgny plazmid zawierający fragment DNA h długhyci 6,0 kz khdujący żądany enzym w miejscu pUC19 przeciętnym óacl.

0) Transformacja i selekcja transformantów.

E. chli TG1 (Amersham) inhkulhwfrh na 10 ml bhdłhża 2xYT i inkubhwanh w 30°C w ciągu 12 ohdzin. Ph inkubacji uzyskaną hhdhwlę dhearh dh ywieżegh bhełhża 2xYT dh stężenia 1% i inkubhwanh mieszaninę w 30°C w ciągu 2 godzin. Hhdhwlę hdwirowfrh i hsad zawieszhnh w 0 ml zimnegh 00 mM CaCh. Zawiesinę umieszczhnh na lhdzie na 30 minut, ph czym hdwirowgnh. Dh hsadu dhdanh 0,20 ml zimnegh 00 mM CaCk i 60pl zrekombinhwareoh DNA hpisanegh w (3). Mieszaninę ^ku^wam w 0°C w ciągu 30 minut, bhddfrh wstrząshwi cieplnemu w 32°C w ciągu 2 minut, umieszczhnh na lhdzie na 0 minut i dhdarh dh 10 ml bhdłhża 2xYT. Mieszaninę inkubhwanh w 30°C w ciągu 90 minut wytrząsając, po czym hdwirowarh. Osad zawiesz^h w 1ml phdłhża 2xYT i dwie próbki ph 10 pl zawiesiny umieszczrah na płytce agarowej na bhełhżu 2xYT zawierającym 00 pg/ml ampicyliny. Płytkę inkubowano w 30°C. Wyhhdhwarą na płytce khlhnię bhddarh selekcji methdą hybrydyzacji khlhnii. Khlhnię przeniestom na filtr nitrhcelulhzhwy i phddfnh trawieniu. DNA unieruchhmihro na filtrze i hybrydyzhwanh z shndą hpisaną w (2). Filtr bhdegnh guthrgeihgrgfii i wyselekcjhnhwanh zrekhmbinhwaną khtomę. Dhdatkhwh, hbecnhyć genu hydratazy nitrylhwej w transformancie phtwierdzorh methdą hybrydyzacji óhutherna.

6) Wydzielenie i hczyszczenie zrekhmbirhwaregh plazmidu i khnstrukcjf mapy restrykcyjnej wstawihnych fragmentów DNA.

166 201

Prowldzonn hodowlę wysrlrkcjoaowlaego trinsformintu opisinego w (5) w 100 ml podłożi 2xYT zlwirrającego 50 pg/ml impicyliny w 17°C w ciągu nocy (12 godzin). Zedrino komórki diktegyjar i dodino do komórek TNE. Komórki znów zedrino przez odwirowiaie i dodino do komórek δ ml STE i 10 mg lizozymu. Miesziniaę iakudowlno w 0°C w ciągu 5 minut. Do mirlziaias dodiao 4 ml 0,25M EDTA, 2 ml 10% SDS (w temperaturze pokojowej) i 5 ml 5M NiCl. Mirszaaiaę iakudowino w 0-4°C w ciągu 1 godzin i ndwirowiao w ultriwirówce. Do supernitintu doCino 0,5 odjętości 10% PEG 6000. Mielziainę inkubowiao w 0-4°C w ciągu nocy (12 godzin) i znów odwirnwiao. Do ouCu dodino TNE dobrowadzając odjętość do 7,5 ml. Do ziwirsins Zodiao CsCl w celu uwolnienii diiłek. NlLt^paie do supernatintu dodino 100500 mg/ml Bromku ety-dyny i przraiesioao mieszininę do prodówki wirówki. Prodówkę zltobioao i odwirnwlno w ultriwirówce. Usunięto cccDNA stosując pompę perystiltyczną. Do cccDNA dndlno nieco więcej niż równą ilość ilkoholu izopropylowego aisscoargo wodą w celu usunięcii dromku ^dyny. Pródkę DNA diilizowiao do TE i uzyskino około 1 ml oczyszczonego zrekomdinowaargn DNA. Tik wytworzony zrekomdinowiny blizmid ziwierijący frigment DNA o długości 6,7 kz ozniczono jiko pHNJ10H (zrekombinowaas plizmid ziwierijący frigment o długości 9,4 kz dył ozniczons symdolrm pNHJ20L).

DNA tych plizmidów trawiono razymimi EcoRI, BimHI, PstI, SicI i SilI. Skonstruow^o mipę restrykcyjną, którą przedstlwioao ni fig. .1.

7) Serwonajpnnwanie DNA.

Lokilizicję genu hydritizy nitrylowej we fragmencie DNA pNHJ10H określono ni podstiwie mipy restrykcyjnej i metodą hybrydyzacji Southerni. DoZitkows segment w pNHJ10H odszczebinao zi pomocą PstI i SilI, w wyniku czego ntrzsmlno frigment DNA o długości 6,0 kz. Pndodnir odszczebioao doditknws segment w pNHJ20L zi pomocą EcoRI i SicI i ntrzymlao frigment DNA o długości 9,4 kz.

Te fragmenty DNA sekwencjonnwlno metodą Singeri [F. Singer, Science 214:1205-1210 (1901)] stosując wektor figowy MU. Sekwencje nLkleotsdów frigmentu DNA o długości 1,97 kz (pNHJ10H) i 1,71 kz (pNHJ20L) przedstawione są odpowiednio ni fig. 4 i 5. Sekwencji iminokwisów 0'yZedLkowiai z sekwencji nukleotsdów nkizlłl się identyczni z sekwencją iminokwisów określoną w (1). Anilizi sekwencyjni potwierdzić tikże, że frigment DNA rawim sekwencję kodującą bodjrdnostki α i β.

β. Wytwirzinie hydritizy nitrylowej z użyciem trlasformlntu i konwersji nitryli do imidów z użyciem hydritizy nitrylowej.

ml podłożi 2xYT ziwierającrgo 50 pg/ml lmpicyliay ziszczepinno TG-1/pNHJ10H i TG-1/pNHJ20L i iakudowian w 10°C przez noc (12 goZzia). 1 ml LzyLklarj hodowli dodiao do 100 ml podłożi 2 X XT (50 pg/ml imbicylins, 0,1 g Co Cl2 · 6H2C(1). Miesziaiaę inkudowino w 10°C przez 4 godziny. Do mieszininy Codnio IPTG do końcowego stężenii 1 mM. MirLZiainę inkudowlao w 10°C przez 10 goZzia. Po zedraaiu komórek zlwirLzonn je w 5 ml 0,1 M duforu fosforanowego (pH 7,5). Zlwieszonr komórki rozrrwiao ni drodze sonifikicji w ciągu 5 minut i odwirnwlno przy 12000odr./mia. w ciągu 10 minut. Uzyskine suprrnitinty wykorzystano do ^ódy enzymowej. Pródę tę przebrowldzono w mieszininie reikcyjnej (12 ml) ziwierijącej 50 mM huforu - fosforanu potasowego (pH 7,5), 6 mM drnzoaitgylu i odpowiednią ilość enzymu. Reikcję prowidznao w 20°C przez 10 minut i zitrzymino Coditkiem 0,2 ml 1M HCl. Ilość wytworzonego denzlmiZL w miesziniaie reikcyjnej określono ni drodze wysokospriwaej chromitogrifii cieczowej. Przeprowadzono również p^dę kontrolną z mieLZiaiaą wytworzoną opinnym powyżej spnsodem ile z użyciem E. coli TG-1. Gdy prowidzono hodowlę w podłożu 2xYT w odecności CoCl2 i IPTG poziomy iktywności hydr^izy nitrylowej w ekstraktach z E. coli wolnych od komórek, ziwirrijących pNHJ 10H i pNHJ20L, wynosiły odpowiednio 1,75 X 10^-3 jednostek/mg. W mieszlainie rrlkcyjnrj TG-1/pNHJ10H i pNHJ20L zaileziono benzlmid, bodczls gdy w mielzlniaie relkcyjarj z TG-1 drnzlmiCu nie stwierdzono.

166 201

656106

FIG. 2(1)

SphI . . .

GCATGCTTTCCACATCTGGAACGTGATCGCCACGGACGGTGGTG

CCTACCAGATGTTGGACGGCAACGGATACGGCATGAACGCCGAAG . .10 0 . . . GTTTGTACGATCCGGAACTGATGGCACACTTTGCTTCTCGACGCA . ’ ,15 0 , .

TTCAGCACGCCGACGCTCTGTCCGAAACCGTCAAACTGGTGGCCC . . 2 0 0 . . TGACCGGCCACCACGGCATCACCACCCTCGGCGGCGCGAGCTACG

GCAAAGCCCGGAACCTCGTACCGCTTGCCCGCGCCGCCTACGACA . . . 3 0 0 .

CTGCCTTGAGACAATTCGACGTCCTGGTGATGCCAACGCTGCCCT

ACGTCGCATCCGAATTGCCGGCGAAGGACGTAGATCGTGCAACCT

TCATCACCAAGGCTCTCGGGATGATCGCCAACACGGCACCATTCG

A C G T G A C C G G AC AT C C G T C C C TG T C C G TT C C G G C C G G C C T G G T G A

ACGGGGTTCCGGTCGGAATGATGATCACCGG CAGACACTT CGACG .5oo . . 11 i n d HI

ATGCGACAGTCCTTCGTGTCGGACGCGCATTCGAAAAGCTTCGCG

GCCGGTTTCCGACGCCGGCCGAACGCGCCTCCAACTCTGCACCAC . . 6 0 0 . .

AACTCAGCCOCGCCTAGTCCTGACGCACTGTCAGACAACAAATTC

CACCGATTCACACATGATCAGCCCACATAAGAAAAGGTGAACCAG

ATGTCAGTAACGATCGACCACACAACGGAGAACGCCGCACCGGCC MetSerVaIThrIleAspHisThrThrGluAsnAlaAlaProAla podjednostkaa . .750 .

CAGGCGGCGGTCTCCGACCGGGCGTGGGCACTGTTCCGCGCACTC GlnAlaAlaValSerAspArgAlaTrpAlaLeuPheArgAlaLeu

166 201

FI

I G.

. K p Π I . .000

GACGGTAAGGGATTGGTACCCGACGGTTACGTCGAGGGATGGAAG AspGlyLysGlyLeuValProAspGlyTyrValGluGlyTrpLys aagacctccgaggaggacttcagtccaaggcgcggagcggaATTg

LysThrSerGluGluAspPheSerProArgArgGlyAlaGluLeu . - . . PvuH

GTAGCGCGCGCATGGACCGACCCCGAGTTCCGGCAGCTGCTTCTC ValAlaArgAlaTrpThrAspProGluPheArgGlnLeuLeuLeu . 0 0 0 K k n I . . .

ACCGACGGTACCGCCGCAGTTGCCCAGTACGGATACCTGGGCCCC ThrAspGlyThrAlaAlaValAlaGlnTyrGlyTyrLeuGlyPro .9 5 0 . . .

CAGGCGGCCTACATCGTGGCAGTCGAAGACACCCCGACACTCAAG G lnAlaAlaTyrIleValAlaValGluAspThrProThrleuLys

AACGOGATCGTGTGCTCGCOGTGTTCATGCACCGCGTGGCCCATC AsnVal 1 leValCysSerLeuCysSerCysThrAlaTrpProlle ctcggtctgccacccaccTGgtacaagagcttcgaataccgtgcg

LeuGlyLeuProProThrTrpTyrLysSerPheGluTyrArgAla

CGCGOGGTCCGCGAACCACGGAAGGTTCTCTCCGAGATGGGAACC

ArgValValArgGluProArgLysV^lLeuSerGluM^tGlyThr

GAGATCGCGTCGGACATCGAGAOTCGCGTCOACGACACCACCGCC GlulleAlaSerAsplleGluIleArgValTyrAspThrThrAla . . . .1 2 0 0 . GAAACTCGCTACATGGTCCTCCCGCAGCGTCCCGCCGGCACCGAA GluThrArgTyrMetValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGlu . . PS t I . .12 5 0

GGCTGGAGCCAGGAACAACTGCAGGAAATCGTCACCAAGGACOGC GlyTrpSerGlnGluGlnLeuGlnGlulleValThrLysAspCys

CTGATCGGGGTTGCAATCCCGCAGGTTCCCACCGOCTGATCACCC Leu l l eG lyVa l Al a I 1 ePooG 1 nVa 1 PooTluN^a 1TRM

CGACAAGAAGGAAGCACACC-AOGGATGGAGTACACGATCTTGCC

MetAspGlyValHhsAspLeuAla podjednostka β

F I 6 .23

GGAGTACAAGGCTTCGGCAAAGTCCCGCATACCGTCAACGCCGAC

GlyValGlnGlyPheGlyLysValProHisThrValAsnAlaAsp

ATCGGCCCCACCTTTCACGCCGAATGGGAACACCTGCCCTACAGC

IleGlyProThrPhellisAlaGluTrpPluHisLeuProTyrSer . .1450 . . Sali

CTGATGTTCGCCGGTGTCGCCGAACTCGGGGCCTTCAGCGTCGAC LeuMetPheAlaGlyValAlaGluLeuGlyAlaPheSerValAsp . .1 5 0 0 . .

GAAGTGCGATACGTCGTCGAGCGGATGGAGCCGGGCCACTACATG

GluValArgTyrValValPluArgMetPluProGlyHisTyrMet atgaccccgtactacgagaggTacGTcatcggtgtcgcgacattg

MetTltrProTyrTyrGluArgTyrValIleGlyValAlaThrLeu

ATGGTCGAAAAGGGAATCCTGACGCAGGACGAACTCGAAAGCCTT

MetValGluLysPlylleLeuThrGlnAspGluLeuPluSerLeu gcggggggaccgttcccactgtcacggcccagCgAAtccgaaggg

AlaGlyGlyProPheProLeuSerArgProSerGluSerPluPly cggccpPcacccgtcgagacgaccaccttcgaagtcpGGcAgcga

ArgProAlaProValGluThrThrThrPheGluValGlyGlnArg

GTACGCGTACPCPACGAPTACGTTCCGGGGCATATTCGAATGCCT⁰

ValArgValArgAspGluTyrValProPlyHisIleArgMetPro

PCATACTGCCGTPPACGAGTGPPAACCATCTCTCATCPAACTACC

AlaTyrCysArgPlyArgValPlyTłirIleSerHisArgThrThr .1 8 0 0 . . . .

GAGAAGTGPCCGTTTCCCGACPCAATCPGCCaCPPGCPCaaCPaC

GluLysTrpProPheProAspAlallePlyHisGlyAtgAsnAsp . 1 8 5 0 . ,

GCCGGCGAAPAACCGACPTACCACGTPAAPTTCPCCPCCGAPGAA

AIpGlyGlpGluProThrTyrllisValLysPheAlaAlpGluGlu . .1000 . Sali

TTPTTCGGTAPCGacaCCGaCPPTPPAAGCPTCPTTPTCPaCCTC

LeuPhePlySeraspThrAspGlyPlySerValValVaiaspLeu

066050

F I (5 .2(4)

TTCGAGGGTTACCTCGAGCCTGCGGCCTGATCTTCCAGCATTCCA

PheGluGlyTyrLeuGluProAlaAlaTRM

GGCGGCGGTCACGCGATCACaGCGGTtCGTGCGACCGCCGCĆtGA tcaccacgattcactcattcggaaggaCACTggaaatcatggtcg Sal I AC

16^6201

BamHI

Pstl

Sali

SacI

EcoRI

Pstl

SacI

F IG. 4(1)

CTGCAGCTCGAACATCGAAGGGTGCGAGCCGAGAGATCGGAGACGCAGACACCCGGAGGG

AACTTAGCCTCCCGGACCGATGCGTGTCCTGGCAACGCCTCAAAATTCAGTGCAAGCGAT tcaatcttGttacttccAGAaccgaatcacgtccccgtagtgtgcggGGAgagcgcccga acgcagggatggtatccatgcgccccttCtcttttcgaacgagaaccggccggtacaGcc

AGACACTGTGACGCCGTTCAACGATTGTTgTGCtGTGAAGGaTtCACCCAAgC

CAACTGATATCGCCATTCCGTTGCCGgAaCATTTGAcAcCTTCTCCCtAcGAGTAGAAGC cagctggacccctctttGAgcccagctccgatgaaagGAAtgaggaaATggatggtaTcc

MetAspGIyI leH podjednostka β ^<ł°

ACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCGGTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCT isAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyProValProTyrGlnLysAspGluProPheP

TCCACTACGAGTGGGAGGGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCA heHisTyrGluTrpGluGlyArgThrLeuSerl leLeuThrTrpMetllisLeuLysGly I

TATCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAACGAAAACTACGTCA leSerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsnGluAsnTyrValA

ACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGGCTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCG snGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrpLeuSerAlaAlaGluArglleLeuValA

CCGACAAGATCATCACCGAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTC laAspLysIleileThrGluGluGluArgLysHisArgValGlnGlulleLeuGluGlyA

O66201

F 1 G. 4(2) ggtacacGGAcaggaagccgtcgcggaagttcgatccGGcccagatcgagaaggcgatcG rgTyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnlleGluLysAlalleG

AACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTTCCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCG luArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeuProGlyAlaGluProSerPheSerLeuG

GTGACAAGATCAAAGTGAAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATG lyAspLysI1eLysValLysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrV

TGCGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATCTATCCCGAGAGCA alArgAsnLyslleGlyGlulleVa!AlaTyrHisGlyCysGlnIleTytProGluSerS

GCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCGCTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGG erSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgProLeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnG

1030 1040 1050 1060 1070 1080

AACTGTGGGGCGACGACGGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGT luLeuTrpGlyAspAspGlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGłuProT

ACCTGATCTCTGCGTGAAAGGAATACGATAGTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAG yrLeuI1eSerAla MetSerGluHisValAsnLysTytThrGlu podjednostka ^<H>

TACGAGGCACGTACCAAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC AyrGluTlaArgThrCysAlal1eGłuThsLeuLeuTyrCluArgCIyLeulleThrPro

GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGCCCGATGGGCGGTGCC AlaAlaValAspArgValValScrTyrTyrGluAsnGlulleGlyProMelGlyGlyAla

AAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCTGAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCG LysValV.alAlaLysSerTrpValAspProGluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAla

ACGGCCGCGATGGCGTCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC

ThrAłaAlaMetAlaSei LeuGlyTyrAlaG 1 yGluGInA 1 allisG 1 ηI leSei A1 aVa 1

TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGTTCGTGCTATCCGTGG PheAsnAspSerGInThiHisHi sValValVaICysThrLeuCysSerCysTyrProTrp

166 201

F I G. 4(3)

1450 1460 1470 1480 1480 1500

CCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTACAAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTA

ProYalLeuGlyLeuProProAlaTrpTyrLysSeiMetGluTyrArgSerArgyaiyal

GCGGACCCTCGTGGAGTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG AlaAspProArgGlyValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGłuValGłu

GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATCCCGGAACGGCCGGCC ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrlleValIleProGluArgProAla

1630 1640 1650 1660 1670 1680

GGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTGACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATC GlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeuThrLysLeuValSerArgAspSerMetI1 e

GGTGTCAGTAATGCGCTCACACCGCAGGAAGTGATCGTATGAGTGAAGACACACTCACTG

GlyValSerAsnAłaLeuThrProGlnGluValΪleVal

ATCGGCTCCCGGCGACTGGGACCGCCGCACCGCCCCGCGACAATGGCGAGCTTGTATTCA

1810 1820 1830 1840 1850 1860

CCGAG(^^TTGGGy^(^G(^/^AC^GG^AT^(^(^(^(^(^T^(^(^(^(^^^CGCGCTTTCGGATCAGAAGTCGT

1870 1880 1880 1800 1010 1820

CCGCCTGGGAGTTCTTCCGACAGCGTCTCATTCCCTCCCTCGCTGAGGCCAACGGTTGCG

1830 1840 1850 1860 1070

CGGCATACTACGCGAGCTGGACAAAGGCGCTCGCGGCCAGCGTGGTCGCC

166 201

20 30 40 50 60

GAGCOCCCTGGAGCCACTCGCGCCGACGCATCCACGCTCGGACAGCCCACGGTGCGGATC acccctgoocgocggtaacAgaacagtaAcatgtcatcAggtcatgacgtgttgacgcAT

OAGACGaGgGcACATAGGGTOGGOGAcOcACGGCACAaGGaGAGCATTTCAOGGAOGGAA MetAspGlyl Subunit β ^<L1

TCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCGATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTG lellisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyProlleLysProGluSerAspGluProV

TTTTCCATTCCGATTGGGAGCGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATG,GCGCTGGCCG alPheHisSerAspTrpGluArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaG

GCGCGTTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCGCACGACTACC lyAiaPheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnl leProProHisAspTyrL

TGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCGATGATCCACCACGGCATCGAGGCGG euTh r Se rG 1 nTy rTy rG 1 uli i sTrpMe tH i s A1 aMe 11 lellisllisGlyl leGluAlaG

GCATCTTCGATTCCGACGAACTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACG ly1lePheAspSerAspGluLeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspll isPr oAspA

ACACGACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAACTGATCACCC spThrTlirProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGInLeulleThrH

ACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAGGCCGCATTCGĆCGTAGGĆGACAAAG isGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGluAlaAlaPheAlaValGlyAspLysV

TCATCGTGCGGTCGGACGCCTCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCG al1leValArgSerAspAlaSerProAsnThrllisThrArgArgAlaGlyTyrValArgG

GTCGTGTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGACACCAACGCAC lyArgValGlyG 1 uVa 1 Va 1A1 aThrll i sG 1 y A1 aTy rVa 1 PheP r o AspTh r Asn A1 ab

F I G. 5(2)

TCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAi^t^/^i^l^^^^ACACCGTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGT euGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThrValArgPheSerAlaThtGluLeuT

GGGGTGAACCTGCCGCCCCGAACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGC rpGlyGluProAlaAlaProAsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuL

TACCGGCCTGACCAGGTCATCCGGTCCACCCAGCGAGACGTCCCTTCACCACAGACAGAA cuProAla

ACGAGCCCACCCCGATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAACG

MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsnG podjednostkaα ^<L)

91» 980 990 1000 1010 1020

AGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTCGACAAGGGCCTGATCT luGlul IeAlaAIaArgValLysAIaMetGluAlaI1eteuValAspLysGlyLeu1leS

1030 1040 1030 1000 1070 1080

CCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCGGTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCG erThrAspAlalleAspHisMetSerSerValTyrGluAsnGluVaIGlyProGlnLeuG gcgccaagatcgtcgcccgcgcctgggtĆgatcccgagttcaagcagĆgcctgctcaccg lyAlaLyslleValAlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThrA

ACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAGGGCGAAGAAATGGTCG spAlaThrSerAlaCysArGAluMetGlCValGlyGlyMetGlnGlyGluGluMetValV

T(^C'^GG;^^^ź^(^ACC^GGĆ^^(^(^GTCVAC^VaC^ATGHrSGT^/^T{}'^AC(^T^'r(^T(^(^TOG^ryGLT^ULC alLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsnMetValValCysThrLeuCysSerCysTyiP

1270 1280 1200 1300 1310 1320

CGTGGCCGGTTCTCGGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGCG roTrpProValLeuGlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAłaTyrArgAlaArgA

1330 1340 1350 1300 1370 1380

CTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACCCCCGACCCTGACGTCG IaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThrProAspProAspValG

AGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAACTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAG łu IleArglleTrpAspSerSerAlaGluLeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProA

CCPPCACCpaGAACTTCACCGAAGAACMnTGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCpĆTCa laPlyThrPluAsnPheThrPluGluGlnLeuAlaaspLeuValThrArgAspSerLeuI

TCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCCTGACATGCCCCGACTCAACGAACAA leG lyValSerValProThrThrProSerLysAla

1570 1580 1580 1600 1810 1620

CCCCACCCGGGTCTCGAAGCCAACCTCGGCGACCTGGTACAGAATCTGCCGTTCAACGAA

0 3 0 t 0 4 0 t05(l 0 0 0 0 1 8 0 0 0680

CGAATCCCCCPCCGCTCCGGCGAGGTCGCCTTCPaTCaPGCCTGGG^(^^T^CGCGCCTTC aGCATTGccAccGCATTpcaTGGCCAGGGccGATTcGaATPGGacpaATTc

Dppartpment Wydawnictw UP RP. Nak(ad 00 egz.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. SposSp wótwarzaaia fraamentu DNA^(H) kodującego pglipeptydoaktywkościhydrhtazy nitrylowej i o następujących sekwencjach aminokwasów w podjednostkach 0“ i β^<ΗΙ; podjednostka cl’^H):

5 10 15

MetSerGludisVflAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr

20 23 30

LysAlalleGluThrLeuLeuTyrGliHkrgGlyLeuIleThrPrO

35 40 45

AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGlluAnGluIleGly

50 55 60

PrąMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro

05 70 70

GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAkaThrAlaAlaMetAlf

80 85 90

SerLeuG1yTyrTA aGlyGluGl uDAaHdsGlnnleSerAlaVal

05 100 105

PheAsJDkspSerGlnThrHlsHlGValValVHlCysThrLeuCyG

000 105 120

SerCyGTyrPrąTrpPrąValLeuGlyLeuPrąPrąAlaTrpTyr

025 130 135

LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlHAGpPrąArgGly

040 105 150

ValLeuLysArσkspPheGlyPheAkGllePrąAGpGluValGlu

055 160 165

VałArgVvaTrpAkpSSrSSrSSrGluIleAkgTTrIleVvaIle

000 175 180

PrąGluArτPrąAlHGlyThrAssGlyTrpSeGGluGluGluLeu

085 190 105

ThrLysLeuVafSerArgAkpSsrMetIleGlyValS_erA_Gn.Al_H

200

LeuThrProGlnGluVafIleVal pod jednostka p^/H/:

5 00 15

Me tAspG 1 yl 1 ed ikAspThrl 1 yl 1 yMetThrl lyT y_rH yP_{r o}

166 201

20 25 30

ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu

05 40 45

GlyArgThrLLuSerlleLeuThrTrpMetHHsLLuLyySlylle ' 50 55 60

SrrTrpTrpAspLysSrrArgPhrPheArgGluSereetGlyAsn

65 70 77

Gl uAsnTyrVal AsnGG uIleArgAsnSrrTyrTyrThrHisTrp

80 85 90

LeuSerAl aAl aGliLAgll eLeuVvlAlaAsppysIl elleThr

05 100 1005

Gl ul 1 uG 1 uAr gL y s H H sAr gVa l G l nG l u 11 e L ru u G a u G a yAr g

110 115 100

TyrThrAlpAlggLsLpgOsrAlggLsSPhΆlppPoAlaGlnϊlr

125 100 135

GluLysAllareGLιAVrgLeuHisGluPgoHisSerLeuAaaLru

150 155 150

ProGlyAllGlLProSerPheSeryeuGlyAlpLLsLlrLssVal

155 160 165

LysSrreetAsnPgoLeLGlsHisThrArgCysProLysTyrVal

170 175 180

ArgAsnLysSlrGlyGluIaeVaaAlaTygHisGlsCysGlnIlr

185 100 195

TyrProGlLSegSrgSerAlaGlyLeLlGlyAspAspPgoAggPro

200 205 210

LeLTyrThrValAlaPhrSrrAlaGlnGluLruTrp'GayAspAsp

215 220 225

GlyAsnGlyLysAspValVlaCysVllAspLrLTgpGlLPgoTyr

LeuiaeSrrAli, ζηΐΜίΜΠ^ tym, żr wydzieli się chromosomowy DNA z Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP1478), trawi się chromosomowy DNA enzymami restrykcyjnymi, selekcjonuje się wytworzone produkty triwienii zi pomocą sondy wytworzonej z genu hydritizy nitrylowej pochodzącego z Rhodococcus sp. N-774.
2. SposSb według zautrz. 1 ,zn amieimy eym, żs wytwoyzonr fragmenty DNA koAującepodjednostki a(H i β'™, miją niLtębLjące sekwencje nLideotsZowe:

sekwencji DNA bodjedaostki «‘H

15 30 405

GTGAGCGAGCACGTCCllTAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC

60 7 75 90

AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC

105 120 105

GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC

166 2Φ1

150 165 110

CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT

195 210 225

GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG

240 255 220

TCATTGGGCTATGCCGGTG^GCAGGCACACCAAA.TTTCGGCGGTC

205 300 315

TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT

110 345 360

TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC

105 390 405

AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA

420 435 450

GTGCTC^GCGt^C^T^TTTCGGTTTCGACA^l^C^CCC^GT^^GTKGGTGGAG

465 4600 495

GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC

510 525 540

CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGlTGGTCCGAGGAGGAGCTG

555 500 585

ACGAAGCTGGTG^l^C^l^t^i^CG^CTCG.ATGATCGGTGTCAGTAATGCG

600

ClCACACCGCAGGAAGTGATCGTA i sekwencja DNA podjednostki βΉ

15 31 45

ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGAlACGGACCG

60 77 90

GlCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG

105 112 135

GGTCGGACCCTGTCAAUCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA

150 H5 180

TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC

195 210 225

GAAAACTACGTCACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG

240 255 200

CTGAGTGCGGCA<GAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGTCAlCACC

205 300 115

GAAGAGAGCGTAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG

110 345 160

TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC

105 190 405

GACGA.GGCGATCGAA.CGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT

166 201

420 435 450

CCAGGAGCGGAGCCCGGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG

360 430 435

AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG

010 502» 500

CGGTiAC^G7VTCGG(^(^7AAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC

000 500 585

TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG

600 615 630

CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC

630 660 675

GGAAACGGGTAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC

CTGATCTCTGCG.
3. Sposób wytwarzania fragmentu DNA^,L) kodującegopolipeptyd oaktywności hydratazy nitrylowej i h następujących senwencjgca gminhjwgsyw w yhejeerhstngca a^<L) i β^ίυ, yhejeenhstng α .

0 10 10 MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProAroóerAsn

20 25 30

GluG 1 u HeAl fAl fAroValL ysAlfMe t G1 lUA. a Ileś L euVal

30 43 45

AsyLysGlyLeuIleóerThrAsbAlglleAspHisMetóeróer

00 50 60

ValTyrGluAsnGluVafGlyPrc>GlnLLeUlyAkaLLySleVal

60 70 Ί5

AlaAroAlaTryWglAspProGluPheLysGlrArgLeuLeuThr

00 8 0> 90

AsyAlgThrÓerAlaCysAroGluMetGlyValGlyGlyMetGln

90 100 , 100

GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn

110 115 120

MetValValCysThrLeuCysóerCysTyrProTrbProValLeu

120 130 130

GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlgTyrAroAlaAro

130 145 100

AlgVglA.roAsbPrOAroGlyValLeuAlgGluPheGlyTyrThr

100 1^0 160

ProAspProAkpbafGluIleArgIleTrbAsbÓeróerAlaGlu

100 175 100

LeuArgTyrTrpVal Let^i^:roG].in^i^<^]^i^<^.^lgGlt^ThrGluAsn

166 201

185 190 195

PheThrGluGiuGlnLeuAlaAspLeuYalThrArgAspSerLeu

200 205

IleGlyValSerVaPProThrThrProSerLysAla podjednostka β^/ν:

5 10 15

MetAspGlylleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro

20 22 30

IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu

05 40 45

ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla

50 55 60

Ph e A s n L e eUS s p G G η I⁵ hhAs gd yA S aM et (tUiUGiIJ-eP roPro

65 70 75

HisAspTyrLeuThrSegGlnTyrTyrGluHisTgpeetHisAla

80 85 99 eeeIleHisHisllyIllGlSallGlyIlehhsAspSesAspGlu

95 H0 H5

LeuAspArgArgThrGlnTyrTyreetA-spHisProAspAspThr

0l5 m no

Thr?roϊhrAsgGlnAspSpgGlnLe'eValGlUu nr IlePerUn

125 110 110

LeuIleThrHisGlAAlAAspTysArgArgProThrAspThgGlu

100 115 HO

AlaAlaPheAiaVaHlyAspLysVaa IleyalArgPerAspAla

155 116 115 perProAsnThrHlsThrArgArgAlaGlyTyrVa^.A.ggl lyArg

170 115 110

ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp

105 110 195

ThrAsϊnA.aLeuGlyAlallylluPerhroGluHisLeuTyrThg

200 205 210

ValArghhePerAlaThglluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPgo

215 220 225

AsnValValAsnHisIesAspVahPheGluProTyrLeuLeuPgo

Ala, znamienny tym, że wydziela się chromosomowy DNA z Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP1470), trawi się chromosomowy DNA enzymami restrykcyjnymi, selekcjonuje się wytworzone produkty trawienia za pomocą sondy wytworzonej z genu hydratazy nitrylowej pochodzącego z Rhodococcus sp. N-770.

166 201

4, SposSp webługzastrz. 3,zrn arnieamytym, że wytworzoor zragmentyDNA kodujące pądj ednostki a(L i β^(υ, mają następujące sekwencje nukleąZydąwe:

sekwencja DNA podjednostki a^,u:

15 30 44

ATGACCGCCCACddTCCCGTCCdGGGCdCGTTGCCACGdTCGdAC

60 75 90

GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC

105 120 135

GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG

150 115 HO

GTCTdCGdGdACGAGGTCGGTCCTCAdCTCGGCGCC.ddGdTCGTC

195 210 225

GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAdGCdGCGcCTGCTCdCC

240 22353 270

GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGdddTGGGCGTCGGCGGCATGCdG

285 300 315

GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAddCdCCGGCACGGTCCdCddC

330 345 360

ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC

375 390 405

GGCCTGCCACCCAdCTGGTdC.ddGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC

420 435 450

GCTGTCCGCGACCCCCGdGGTGTGCTGGCCG3ddTTCGGdTdTdCC

465 480 4S95

CCCGACCCTGACGTCGdGATCCGGATdTGGGdCTCGdGTGCCGAd

510 525 540

CTTCGCTdCTGGGTCCTGCCGCdACGCCCdGCCGGCdCCGdGddC

555 570 585

TTCdCCGAdGAdCAdCTCGCCGdCCTCGTCdCCCGCGdCTCGCTC

600 615 dTCGGCGTdTCCGTCCCCACCdCdCCCdGCdAGGCC i sekwencja podjednostki β^/:

15 30 45 dTGGdTGGAdTCCdCGdCCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG

60 75 90 dTCddGCCCGAAΓCCGATGAACCTGTTTTCCdTTCCGATTGGGdG

105 120 135

CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG

166 201

150 165 110

TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG

195 210 225

CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG

240 255 227

ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA

205 300 315

CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG

110 3145 310

ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA

175 390 405

CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG

420 44345 450

GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC

465 480 495

TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT

510 525 540

GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC

555 570 585

ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC

600 615 630

GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG

645 660 675

AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG

GCC.