CZ279498B6 - Genovětechnologický způsob výroby S-/+/-2, 2-dimethylcyklopropankarboxamidu pomocí mikroorganismů - Google Patents

Genovětechnologický způsob výroby S-/+/-2, 2-dimethylcyklopropankarboxamidu pomocí mikroorganismů Download PDF

Info

Publication number
CZ279498B6
CZ279498B6 CS922323A CS232392A CZ279498B6 CZ 279498 B6 CZ279498 B6 CZ 279498B6 CS 922323 A CS922323 A CS 922323A CS 232392 A CS232392 A CS 232392A CZ 279498 B6 CZ279498 B6 CZ 279498B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna
microorganisms
hybrid plasmid
dna fragment
transformed
Prior art date
Application number
CS922323A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Dr. Zimmermann
Karen Robins
Olwen M. Birch
Elisabeth Böhlen
Original Assignee
Lonza A.G.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza A.G. filed Critical Lonza A.G.
Publication of CZ232392A3 publication Critical patent/CZ232392A3/cs
Publication of CZ279498B6 publication Critical patent/CZ279498B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Je popsán nový genovětechnologický způsob výroby S-(+)-2,2-dimethylcyklopropenkarboxamidu. K tomu se izoluje z mikroorganismu nová DNA, která kóduje stereospecifickou hydrolasu. Tato DNA se pak liguje do expresního vektoru. Přitom vznikne hybridní plasmid, který je v mikroorganismech transformován. Tyto mikroorganismy jsou pak schopné v racemickém R,S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformovat R-(-)-izomer na kyselinu R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou, přičemž se získá opticky aktivní S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid.ŕ

Description

Způsob genovětechnologické výroby S-(+)-2,2-dimetyhlcyklopropan-karboxamidu pomocí mikroorganismů, které jsou transformovány, hybridním plasmidem pCAR6, který obsahuje Fragment DNA.
Oblast techniky
Vynález se týká nového způsobu výroby S—(+)—2,2-dimethyl-cyklopropankarboxamidu pomocí nových pro postup vhodných mikroorganismů. Tyto mikroorganismy se transformují novým genem, který tvoří stereospecifickou hydrolasu. Tím jsou schopné v racemickém R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformovat R-(-)-izomer za 'vzniku odpovídající kyseliny, přičemž se získá opticky aktivní S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid.
V následujícím textu se 2,2-dimethylcyklopropankarboxamid zkráceně označuje jako 2,2-DMCPCA a kyselina 2,2-dimethylcyklo-propankarboxylová jako 2,2-DMCPCS.
Dosavadní stav techniky
Opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPCA slouží jako výchozí látka pro výrobu inhibitoru dehydropeptidasy cilastatinu, který se při terapii podává spolu s penemovými popřípadě karbapenemovými antibiotiky, aby se zabránilo desaktivaci antibiotik renální dehydropeptidasou v ledvině (EP 048 301).
Jako příklady mikroorganismů, které tvoří stereospecifickou hydrolasu pro R-(-)-2,2-DMCPCA, jsou mikroorganismy druhu Comamonas acidovorans A:18 (DSM č. 6351). Bakterium sp VIII:II (DSM č. 6316), Pseudomonas sp. NSAK: 42 (DSM č. 6433) a Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552) jakož i jejich descendenty a mutanty. Tyto mikroorganismy jsou již podrobně popsány v Evropské patentové přihlášce 92103780.0.
Podstata vynálezu
Úlohou předloženého vynálezu je poskytnout pomocí rekombinantních DNA-technik nové mikroorganismy jako produkční kmeny, u nichž lze výrazně zvýšit katalytickou schopnost, jakož i expresi tohoto hydrolasového genu vůči známému postupu.
Tato úloha byla vyřešena pomocí nové DNA, která kóduje gen hydrolasy, pomocí nových hybridních plasmidů, které obsahují tuto DNA, pomocí nových mikroorganismů, které jsou tímto hybridním plasmidem transformovány a pomocí nového postupu.
Obr. 1 ukazuje restrikční mapu genu
Obr. 2 ukazuje schéma hybridního plasmidů pCAR6
Obr. 3 ukazuje jak aminokyselinovou sekvenci, tak také DNA sekvenci genu, která kóduje stereospecifickou hydrolasu.
Způsob podle vynálezu se provádí tak, že se v racemickém R,S-(±)-2,2-DMCPCA biotransformuje R-(-)-2,2-DMCPCA pomocí mikroorganismů transformovaných genem, který tvoří stereospecifickou hydrolasu, za vzniku R-(-)-2,2-DMCPCS, přičemž se získá opticky aktivní S-(+)-2,2-DMCPCA a ten se isoluje.
-1CZ 279498 B6
Příprava transformovaných mikroorganismů
Příprava mikroorganismů podle vynálezu, které tvoří stereospecifickou hydrolasu, se může uskutečnit tak, že se
a) isoluje DNA kódující hydrolasu podle vynálezu
b) vnese tato specifická genová sekvence do expresního vektoru, přičemž vznikne hybridní plasmid, popřípadě může být výhodné provést další modifikace v hybridním plasmidu, které umožní efektivnější expresi
c) tento hybridní plasmid se pomocí transformace
d) vnese do vhodného mikroorganismus (hostitelský kmen) (transformace” ě)), přičemž tento transformovaný mikroorganismus potom
f) tvoří produkční kmen pro způsob podle vynálezu (biotransformace g)).
a) Isolace DNA sterospecifické hydrolasy
Jako zdroj DNA hydrolasy, která je dále označována jako hydrolasa-DNA (rad), popřípadě hydrolasa-qen (rad) může sloužit například chrómosomální DNA mikroorganismů Comamonas acidovorans A:18 (DSM č. 6315) nebo Comamonas acidovorans TG 308 (DSM č. 6552), které jsou již popsány v Evropské patentové přihlášce 92103780.0. Jako zdroj slouží výhodně Comamonas acidovorans A:18. DNA hydrolasy je možné izolovat z lineární genové banky z Comamonas acidovorans A:18 v Escherichia coli (E. coli) XLl-BlueR pomocí BLUESCRIPTR (BLUESCRIPT-KS+ nebo BLUESCRIPT-SK+) (lze jej získat od Stratagene Co., dodavatel Genofit SA, Ženeva) jako komerčně dostupný vektor genové banky.
K tomuto účelu se například nejdříve isoluje chromosomální DNA z Comamonas acidovorans A:18 za použití metody R. H. Chesneyho a spol., J. Mol. Biol. 130, 1979, str. 161-173. Tato DNA se potom pomocí obvyklých molekulárněbiologických metod štěpí restrikčním enzymem EcoRI a potom se inseruje do předem stejně rozštěpených částí expresní vektor-DNA pBLUESCRIPT+R. Potom se může tato ligovaná DNA (směs hybridních plasmidů) transformovat například postupem podle S. Fiedlera a R. Wirtha Analyt. Biochem. 170, 1988, str. 38 až 44 do komponent komerčně běžných mikroorganismů E. coli XLl-BlueR.
Vyhledávání (screening) genové banky lze také provádět o sobě známými metodami. K tomu se klony hybridních plasmidů testují na jejich růstovou schopnost, účelně ve vhodném médiu s R,S-(±)-2,2-DMCPCA jako jediným zdrojem dusíku, s obvyklým zdrojem uhlíku, s vhodným induktorem a s vhodným antibiotikem. Tímto vyhledáváním (screening) se potom účelně oddělí klony hybridních plasmidů, které obsahují aktivní hydrolása-gen (rad) ha DNA hybridního plasmidu, a tím jsou schopné použít zejména R-(-)-2,2-DMCPCA jako jediný zdroj dusíku. Tyto klony hybridních plasmidů potom mohou hydrolysovat R-(-)-2,2-DMCPCA na odpovídající kyselinu.
Lokalisace hvdrolasa-qenu (rad) se potom účelně uskuteční v hybridním plasmidu pCARl (zvolený z klonů hybridních plasmidů),
-2CZ 279498 B6 který se skládá z expresního vektoru pBLUESCRIPT-KS+R a EcoRI-insertu o ca 23 kb. Vlastní lokalisace hydrolasa-genu (rad) se potom účelně uskuteční o sobě známou hybridisací Southern-Blot (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, odstavec 2.9). K tomu se nejprve štěpí hybridní plasmid pCARl restrikčními enzymy BamHI, Pstl, PvuII a EcoRI. Fragmenty DNA přitom vzniklé se potom účelně hybridizují proti radioaktivně značeným oligomerům DNA, které odpovídají N-koncové proteinové sekvenci hydrolasy. Takto lze na hybridním plasmidu pCARl označit štěp EcoRI-BamHI-DNA velký 2,3 kb, popřípadě štěp PvuII-BamHI-DNA velký 1,85 kb. Oligomery DNA pro hybridisací se získají v oboru známými metodami. Například se stereospecifická hydrolasa chromatorgaficky obohatí, určí se N-koncóvé aminokyseliny a potom se syntetizuje odpovídající sekvence DNA a radioaktivně se značí. Nyní známý štěp DNA, který kóduje stereospecifickou hydrolasu (rad) a jehož restrikční mapa je charakterizována na obr. 1 je také součástí vynálezu. Lze ho potom izolovat restrikčními enzymy BamHI a EcoRI, popřípadě BamHI a PvuII z hybridního plasmidu pCARl v oboru známými metodami. Tím se mimo jiné určí celková sekvence aminokyselin podle analýzy sekvence nukleotidů přes genetický kód a připraví se mikroorganismy, které jsou vhodné pro postup. Součástí vynálezu je proto jak fragment DNA, který kóduje polypeptid s aktivitou stereospecifické hydrolasy, jehož sekvence aminokyselin je uvedena na obr. 3, tak také fragment DNA, který hybridizuje s fragmentem DNA uvedeným na obr. 3 a tento polypeptid kóduje.
b) Ligace specifické genové sekvence (hydrolasa-gen: rad) do expresních vektorů
Takto získaná genová sekvence se může ligovat obvyklými molekulárněbiologickými metodami s předem stejně štěpenou DNA expresního vektoru za vzniku hybridního plasmidu.
Expresní vektory obvykle obsahují vhodný, většinou regulovatelný promotor (sekvence kontroly exprese). Za tímto promotorem je vhodně ve směru transkripce jedno nebo více zvláštních míst štěpení pro. restrikční enzymy. Do těchto míst štěpení se potom obvyklým způsobem inseruje požadovaný genový štěp, o jehož expresi je zájem.
Pro způsob podle vynálezu se mohou používat buď expresní vektory se širokým hostitelským spektrem (broad host range), nebo se může například použít komerčně dostupný expresní vektor pBLUESCRIPT-KS . Výhodné se jako expresní vektor používá pBLUESCRIPT-KS+R s promotorem PLac (lactosa-promotor). Expresní vektor pBLUESCRIPT-KS+R se účelně štěpí restrikčními enzymy EcoRI a BamHI nebo PvuII a BamHI. Vzniklé restrikční konce s isolovaným štěpem DNA (EcoRI-BamHI nebo PvuII-BamHI), který kóduje stereospečifickou hydrolasu, se ligují například pomocí T4-DNA-ligasou.
c) Hybridní plasmidy
Vynález se dále týká takto vzniklých hybridních plasmidů, které obsahují genovou sekvenci stereospecifícké hydrolasy (rad).·
-3CZ 279498 B6
V podstatě jsou vhodné všechny hybridní plasmidy, které mají schopnost replikovat a exprimovat sekvenci DNA podle vynálezu, která kóduje hydrolasu, ve zvoleném mikroorganismu (produkčním kmenu).
Vhodné hybridní plasmidy obsahují od svého původního expresního vektoru intaktní replikon a značkovací gen, který umožňuje selekci a identifikaci mikroorganismů transformovaných hybridním plasmidem na základě fenotypového znaku. Vhodný značkovací gen propůjčuje mikroorganismu například rezistenci vůči antibiotikům.
Pro dosažení efektivní exprese v hybridním plasmidu je účelné, aby byl hydrolasa-gen (rad) správně uspořádán (ve fázi) s promotorem. Takovými hybridními plasmidy, které jsou vhodné pro expresi hydrolasa-genu ve kmeni E. coli, jsou například hybridní plasmidy pCAR5 a pCAR6, se značkovacím genem bia (propůjčuje rezistenci vůči ampicilinu; ApR) a promotorem PLac. Účelně se hybridní plasmid pCAR5 skládá z fragmentu EcoRI-BamHI-DNA o velikosti 2,3 kb (restrikční mapa obr. 1) a expresního vektoru pBLUESCRIPT-KS+R. Hybridní plasmid pCAR6 se účelně skládá z fragmentu PvuII-BamHI-DNA o velikosti 1,85 kb (restrikční mapa obr. 1) a expresního vektoru pBLUESCRIPT-KS+R. Účelně se používá hybridní plasmid pCAR6 s promotorem PLac, přičemž je exprese hydrolasa-genu (rad) indukována vždy podle hostitelského kmenu isopropylthiogalaktosidem (IPTG). Hybridní plasmid pCAR6 byl uložen jak 06. 06. 1991 pod DMS č. 6551 v E.coli XLl-BlueR, tak také
21. 04. 1992 pod DSM č. 7053 v E.coli DH5 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur GmbH (DSM), Mascherorderweg lb, D-3300 Braunschweig. Obr. 2 ilustruje schéma hybridního plasmidu pCAR6.
d) Hostitelské kmeny
Takto získané hybridní plasmidy se účelně vsadí do hostitelských kmenů. V případě hybridních plasmidů se širokým hostitelským spektrem (broad-host-range) se účelně použijí hostitelské kmeny o vysoké substrátové a eduktové toleranci, jako například mikroorganismy rodu Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium nebo Escherichia. V případě hybridních plasmidů, které mají vlastní hostitelské spektrum, jako například hybridní plasmid pCAR6, se obvykle použijí specifické hostitelské kmeny, ve kterých se replikují.
Jako hostitelské kmeny se pro hybridní plasmid pCAR6 podle toho s výhodou použijí mikroorganismy rodu Escherichia, zvláště druhu E.coli, které jsou uvedené v tabulce 1.
e) Transformace
Transformace hostitelských kmenů hybridními plasmidy podle vynálezu se uskuteční známými způsoby. Isolace transformovaných hostitelských kmenů se potom výhodně uskuteční že selektivního živného média, ke kterému se přidá antibiotikum, vůči kterému propůjčuje značkovací gen obsažený v hybridním plasmidu rezisten
-4CZ 279498 B6 ci. Jestliže se výhodně použije hybridní plasmid pCAR6, který obsahuje bla-qen, přidá se do živného média ampicilin.
f) Produkční kmen
Jako produkční kmeny se mohou použít podle vynálezu všechny hostitelské kmeny, které jsou transformovány hybridním plasmidem obsahujícím gen stereospecifické hydrolasy. Výhodně se jako produkční kmeny používají mikroorganismy druhu E.coli, které jsou uvedeny v tabulce 1 a které jsou transformovány hybridním plasmidem pCAR6, jakož i jejich descendenty a mutanty. Mikroorganismy
E.coli XLl-Blue (DSM č. 6551) a E.coli DH5 (DSM č. 7053) byly uloženy, jak již bylo uvedeno.
Jestliže se například použije z tabulky 1 E.coli MC4100 (popsaný v Mol.Gen.Genet. 192, 1983, str. 293 až 294) jako hostitelský kmen, uskuteční se exprese genu stereospecifické hydrolasy (rad) pod kontrolou promotoru pLac konstituované (permanentně). Je to na základě delece v lac-operonu (laktosa-operon) (delece (arg - lac)U169). Proto se netvoří lac-represorovy gen láci (represorový gen-negativní mikroorganismus). Jestliže se například použijí z tabulky 1 E.coli K12 (možné získat pod DSM č. 498 nebo E.coli HB101 (H. W. Boyer a D. Roulland-Dussoix, J. Mol. Bio. 41, 1969, str. 459 až 472) jako hostitelské kmeny, indukuje se exprese hydrolasa-genu (rad) pomocí IPTG na základě přítomnosti receptorového genu láci (receptorový gen-positivní mikroorganismus).
g) Biotransformace
Podle vynálezu lze použít k biotransformaci všechny mikroorganismy (produkční kmeny), které jsou transformovány genem, který tvoří stereospecifickou hydrolasu, a tím stereospecificky hydrolysují R-(-)-2,2-DMCPCA za vzniku kyseliny. Biotransformace se účelně provádí s mikroorganismy, které jsou transformovány hydrolasa-genem (rad), jehož restrikční mapa je uvedena na obr.l. Vhodné jsou také mikroorganismy, které jsou transformovány fragmentem DNA, který kóduje polypeptid s aktivitou stereospecifické hydrolasy, jehož sekvence aminokyselin je uvedena na obr. 3. Stejně vhodné jsou mikroorganismy, které jsou transformované fragmentem DNA, který hybridizuje s fragmentem DNA uvedeným na obr. 3 a který kóduje polypeptid s aktivitou stereospecifické hydrolasy.
Jak již bylo popsáno jsou zvláště vhodné mikroorganismy druhu E.coli (tabulka 1), transformované hybridním plasmidem pCAR5 nebo pCAR6, obzvláště hybridním plasmidem pCAR6. Vhodné jsou také bezbuněčné enzymy (stereospecifické hydrolasy) z těchto mikroorganismů. Tyto bezbuněčné enzymy lze získat v oboru běžnými metodami rozrušením buněk mikroorganismů. K tomuto účelu lze použít například metody s ultrazvukem. Frenchovým tlakovým zařízením .nebo lysozymem. Tyto bezbuněčné enzymy lze potom pro provedení postupu imobilizovat na vhodném nosičovém materiálu běžnými metodami v oboru.
Postup se výhodně provádí s buňkami mikroorganismů v klidu (nerostoucí buňky), které se nejdříve indukují podle svého expresního systému. To znamená, jestliže se pro postup použijí repre
-5CZ 279498 B6 sorový gen-pozitivní mikroorganismy, jako například E.coli XLl-Blue nebo E.coli DH5, které jsou transformovány hybridním plasmidem pCAR6, uskuteční se indukce pomocí IPTG. Jestliže se pro postup použijí například represorový geň-negativní mikroorganismy (tzn. represorový gen chybí) druhu E.coli, jako například E.coli MC4100, uskutečňuje se exprese hydrolasového genu (rad) permanentně (konstitutivně).
Při zvláště výhodné formě provedení se specificky hydrolasová aktivita mikroorganismů zvyšuje pomocí C-^-C^-alkoholů. Jako Cj-C^alkoholy se mohou například používat methanol, ethanol, propanol/ isopropanol nebo butanol. S výhodou se používá methanol nebo ethanol.
Jako média se mohou použít v oboru běžně používaná média, jakó například nízkomolární fosfátové pufry, minerální médium obsahující soli podle Kulla a spol., Arch. Microbiol. 135, 1983, str. 1 až 7, nebo také HEPES-pufr (kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-2'-ethansUlfonová). Postup se výhodně provádí v nízkomolárním fosfátovém pufru.
Médium pro biotransformaci obsahuje účelně racemický R,S-(±)-2,2-DMCPCA v množství od 0,2 do 5 % hmot., výhodně 0,2 až 2 % hmot.
Biotransformace se účelně provádí v rozmezí pH od 6 do 11, výhodně v rozmezí pH od 6,5 do 10.
Teplota pro biotransformaci leží účelně mezi 15 a 55 °C, výhodně mezi 20 a 40 °C.
Po reakční době obvykle od 1 do 30 hodin, výhodně od 5 do 25 hodin, se R-(-)-2,2-DPCMCA úplně přemění na odpovídající kyselinu, přičemž se získá opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPCA. Takto získaný S-(+)-2,2-DMCPCA lze potom získat například extrakcí, elektrodialysou nebo sušením.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
1.1 Příprava chromosomální DNA ž Comamonas acidovorans A:18
Chromosomální DNA čerstvé kultury Comamonas acidovorans A:18 pěstované přes noc (100 ml kvasinkového živného prostředí, 30 °C) se izoluje podle modifikované metody R. H. Chesneyho a spol., J. Mol. Biol. 130, 1979, 161 až 173: odstředěné buňky (15 min., 6'500 X g, 4 °C) se resuspendují v Tris-HCl pufru (2,25 ml, 0,05 mol/1), pH 8,%, 10 % hmot./obj. sacharosy. Po přidání 375 μΐ roztoku lysozymu (10 mg/ml 0,25 mol/1 Tris-HCl pufr, pH 8,0) a 900 μΐ 0,1 mol/1 EDTA, pH 8,0 se suspenze ochladí na ledu po dobu 10 min. Potom následuje přidání 450 μΐ 5 % hmot./obj. SDS a 50μ1 ribonukleasy (10 mg/ml H2O) a inkubace při 37 °C po 30 min. Inkubace pokračovala po přidání proteinasy K v množství na špičku špaChtličky a 400 μΐ pronasy (20 ml/ml H2O) podobu 2 h. Po míchání s 4,3 g CsCl se směs odstředí (30 min., 40'000 X g, 20 °C), smíchá s 250 μΐ ethidiumbromidu (10 mg/ml) a odstředí v ultracentrifuze (VTi 65.2-trubička) (více než 8 h. 246'000 X g, 20 °C). Pod dlouhovlnným ultrafialovým světlem se z trubičky odsaje skupina DNA. Po přidání čtyřnásobného objemu TE-pufru (10 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,0, 1 mmol/1 EDTA) se ethidiumbromid extrahuje n-butanolem třikrát syceným vodou. DNA se precipituje isopropanolem, zředí v TE-pufru a 15 min. inkubuje při 65 °C. Preparát se může uchovávat při 4 °C.
1.2 Restrikce a ligace chromosomální DNA μg Comamonas acidovorans A:18 (DSM č. 6315)-DNA a 4,5 μg vektor-DNA(pBLUESCRIPT-KS+R) se nyní štěpí 20 jednotkami restrikčního enzymu EcoRI v celkovém objemu restrikčního pufru 100 μΐ (65 hod. při 37 °C). DNA se precipitují ethanolem a suší v rychlovakuovém odpařovacím zařízení (Speed VacR Concentrator). Sraženiny se zředí ligačním pufrem (20 mmol/1 Tris-pufr, 10 mmol/1 DTT (dithiothreitol), 10 mmol/1 MgCl2, 0,6 mmol/1 ATP (adenosintrifosfát, pH 7,2) a spojí (ligační objem 100 μΐ). Po přidání jedné jednotky T4-DNA-ligasy se inkubuje přes noc při 13 C. DNA ligační směsi se precipituje isopropanolem a zředí 30 μΐ vody pro transformaci.
1.3 Transformace E.coli XLl-BlueR a selekce
Kompetentní buňky E.coli XLl-BlueR se transformují pomocí elektroporace s ligační směsí podle popsané metody S. Fiedlera a R. Wirtha (Analyt. Biochem. 170, 1988, 38 až 44). Pro průkaz plasmidu se podrobí selekci na živném agaru s ampicilinem (100 μg/ml) a pro průkaz inserce se podrobí selekci s 0,5 mmol/1 IPTG (isopropyl-3~D-thiogalaktosid) a x-gal (30 μg/ml, 5-brom-4-chlor-3-indolyl-p-D-galaktopyranosid) při inkubaci při 37 °C. Při frekvenci transformace 1,7 X 108 cfu/ml (colony forming units = živoucí buňky) měly téměř všechny klony EcoRI-insert.
Příklad 2
2. Vyhledání genu R-specifické amidasy v genové bance Comamonas acidovorans A:18
135, 1983, 1 až uhlíku, 0,15 % dusíku a 0,5 Dále se použije ampiciplasmidu. Pouze klony, hydrolasa-gen rad na R- (-)-2,2-DPCMPA jako kyselinu a růst na tomKlony s hybridními plasmidy (EcoRI-insert) se testují na jejich růstové schopnosti na agaru s minimálním médiem. Postupuje se shodně s H. Kullou a spol. (Arch. Microbiol.
7) s 0,2 % obj./obj. glycerinu jako zdroje hmot./obj. R,S-(±j-2,2-DPCMPA jako jediným zdrojem mmol/1 IPTG jako induktor lac-promotoru. linu v množství 5 μg/ml ke stabilizaci které obsahuj í v plasmidu intaktní DNA-insertu, jsou schopné zužitkovat zdroj dusíku, ten přeměnit na požadovanou to minimálním médiu. Takto vybrané klony obsahují všechny hybrid ní plasmidy z vektoru pBULESCRIPT-KS+R ,s EcoRI-insertem o ca kb. Plasmid pCARl se izoluje a blíže charakterizuje.
Příklad 3
3.1 Izolace R-specifické hydrolasy z Comamonas acidovorans A:18 a N-koncová peptidová analýza
a) Příprava bezbuněčného extraktu
1 buněčné suspenze z Comamonas acidovorans A:18 (DSM č. 6315) s hydrolasovou aktivitou při 37 C o hodnotě 0,6 g R-(-)-2,2-DMCPCS/l/hod/optická hustota při 650 nm (OD 650) = 1, které se nejdříve indukují pomoci R,S-(±)-DMCPCA, se zahustí na 700 ml (OD650 = 33,5). Potom se buňky několikrát odstředí, resuspendují v HEPES-pufru a potom se suspendují ve 40 ml HEPES-pufru. Objem celkové buněčné suspenze je potom 95 ml (OD650 = 210). Hydrolasová aktivita se stanoví při 30 “C a má hodnotu 0,34 g produkt/l/h/ OD650 = !· Potom se buňky dvakrát rozruší ve Frenchově tlakovém zařízení při tlaku 120 MPa. Tato suspenze se odstředí při 2 000 X g 20 minut, aby se získal bezbuněčný extrakt. Získá se 50 ml extraktu o množství proteinu (měřeno metodou Bradforda) 39,3 mg/ml a o hydrolasové aktivitě 12,5 g R-(-)-2,2-DMCPS/l/hod/mg proteinu při 30 °C.
b) Chromatografie ml tohoto surového buněčného extraktu se nanesena sloupec plněný Q-Sepharosou (Pharmacia), který byl ekvilibrován proti HEPES-pufru (0,1 mol/1, pH 7,5). Tento sloupec se ještě dvakrát promyje stejným pufrem a potom se proteiny eluují gradientem HEPES-pufru (0,1-1 mol/1). Celkem se pomocí HEPES-pufru (1 mol/1) eluuje 140 ml proteinového roztoku s hydrolasovou aktivitou. Roztok se potom zahustí ultrafiltrací (Amicon-membrána YM10). Množství proteinů tohoto enzymového roztoku je 131 mg/ml, přičemž hydrolasová aktivita je 1 pmol/min/ng proteinu. Potom se 2 ml tohoto proteinového roztoku nanesou na sloupec Superosy-12 (Pharmacia), který byl ekvilibrován HEPES-pufrem (0,1 mol/1, pH 7,5). Celkově se tímto pufrem eluuje 36 ml proteinového roztoku. Tento roztok se potom také zahustí ultrafiltrací (Amicon-membrána YM10). Množství proteinu je 20,1 mg/ml, přičemž hydrolasová aktivita je
1.2 μιηοΐ/min/ng proteinu. Takto získaný proteinový roztok se potom nanese na sloupec anexu Li Chirospher 2000 TMAE (trimethylamoniumethylová sůl) (Měrek), který byl ekvilibrován proti HEPES-pufru (0,1 mol/1, pH 7,5). Po promytí sloupce stejným pufrem se eluuje roztok proteinů gradientem NaCl (0-1 mol/1) ve stejném pufřu. Koncentrace proteinů je 15 mg/ml, přičemž hydrolasová aktivita je 1,2 μιποΐ/min/ng proteinu.
c) Identifikace -hydrolasy pomocí jedno a dvoudimensionální elektrof oré.zy
V surovém buněčném extraktu se identifikuje protein hydrolasy pomocí SDS-PAGE. Přitom se srovnává neindukovaný buněčný extrakt s indukovaným extraktem na SDS-PAGE (indukce pomocí R,S-(±)-2,2-DCMPCA). V indukovaném buněčném extraktu se prokáže skupina proteinů o molekulové hmotnosti okolo 46 000. Proteinové frakce s hydrolasovou aktivitou získané chromatografií se také analyzují pomocí SDS-PAGE. Protein o molekulové hmotnosti okolo
-8CZ 279498 B6
000 se tímto chromátografickým čištěním obohatí, přičemž se po třetí chromatografií obohatí ca na 80 %. Tento z 80 % čistý vzorek se potom analyzuje bidimensionální elektroforézou (2-D SDS-PAGE). Touto metodou se prokázala proteinová skvrna o molekulové hmotnosti okolo 46 000, která odpovídá hydrolase.
d) Sekvenování
Proteinová skvrna získaná pomocí 2-D SDS-PAGE se potom absorbuje na PVDF membráně (polyvinylidendifluorid) a z membrány se vyřízne. Potom se tento protein sekvenuje přímo podle metody Hochstrassera a spol. (Applied and Theoretical Electrophoresis 1, str. 73 až 76, 1988, HDL částice-sdružené proteiny v plasmě a cerebrospinální tekutině). Touto metodou se identifikovalo 21 aminokyselin (AS) N-koncové sekvence aminokyselin.
Příklad 4
4. Lokalizace genů hydrolasy (rad) na klonovaném fragmentu EcoRI
4.1 Hrubá restrikční mapa pCARl
Pomocí restrikční analýzy podle obvyklého postupu (Current Protocols Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, odstavec 2) se sestaví hrubá restrikční mapa pCARl vztahující se k EcoRV, PvuII, KspI, Smál, Pstl, Stul, BamHI.
4.2 Formulace směsných DNA-oligomerů na základě N-koncové peptidové sekvence hydrolasy
Na základě genetického kódu se mohou formulovat a pomocí stroje na syntézu DNA syntetizovat dva směsné DNA-oligomery pro N-koncovou peptidovou sekvenci hydrolasy Comamonas acidovorans A:18:
DNA-oiiqomer (směs)
T - T TCT A T T T
5' ATG AAC GAC AGC GAG CTC CAC CA
C C
A A
AS Met Asn Asp Ser Glu Leu His
DNA-nesmyslný oliqomer (směs)
A C T T T T
5' TG GAT TTC CCG CCC CAC CTC 3
G G G
A A
AS Ile Glu Arg Gly Val Glu A
4.3 Hybridizace southern blot restrikčních fragmentů plasmidu pCARl
Fragmenty DNA rozdělené elektroforézou na agarosovém gelu (0,6 %), které se získaly rozdílnými restrikcemi (BamHI, Pstl, EcoRI) pCARl, se přenesou na nitrocelulosu známým postupem, ozna
-9CZ 279498 B6 čovaným jako southern blot (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, odst. 2.9 a další).
Oligomery DNA se stejně koncově označí s [32P]-gama-ATP: 400 ng oligomerů DNA, 22 μϋί 32P-gama-ATP, 11 jednotek bezfosfátové polynukleotidkinasy, v celkových 25 μΐ polynukleotidkinasovém pufru (0,05 mol/1 Tris-HCl, pH 7,5, 0,01 mol/1 MgCl2, 5 mmol/1 DTT) se inkubuje při 37 ’C po dobu 30 min. Potom následuje čištění pomocí gelové filtrace na Sephadexu G-25 (Pharmacia) a hybridizace proti southern blots podle známého postupu (viz výše uvedená citace literatury).
Hybridizací proti nukleotidovým oligomerům odpovídajícím N-koncové proteinové sekvenci se může na hybridním plasmidu pCARl označit fragment EcoRI-BamHI-DNA o velikosti 2,3 kb nebo fragment PvuII-BamHI-DNA o velikosti 1,85.
4.4 Subklonování hydrolasového genu (rad)
Fragment EcoRi-BamHI-DNA o velikosti 2,3 kb nebo fragment PvuII-BamHi-DNA o velikosti 1,85, který kóduje R-specifickou hydrolasu z Comamonas acídovorans A:18 se inseruje do stejně štěpené vektorové DNA pBLUESCRIPT-KS+R nebo pBLUESCRIPT-SK+R. Jen jedna orientace insertu k promotoru PLac v klonech po indukci IPTG hledanou hydrolasovou aktivitu.
Vektor pBLUESCRlPT-KS+R s fragmentem EcoRI-BamHI-DNA o velikosti 2,3 kb se označuje jako hybridní plasmid pCAR6. Vektor pBLUESCRIPT-KS+R s fragmentem PvuII-BamHI-DNA o velikosti 1,85 se označuje jako hybridní plasmid pCAR5.
Příklad 5
5. Stanovení aktivity R-(-)-2,2-DMCPCA-hydrolasy
Ke stanovení aktivity hydrolasy se suspenze mikroorganismů nastaví na hodnotu optické hustoty 0,5 při 650 nm. Jako médium se použije fosfátový pufr (10 mmol/1), pH 7,0, s 0,2 % hmot. R,S—(±)-2,2-DMCPCA. Tato suspenze se inkubuje za třepání 4 h při 30 °C. Měří se NH4 + uvolněný hydrólasou nebo R-(-)-2,2-DMCPCS. Aktivita se vyjadřuje jako g R-(-)-2,2-DMCPCA přeměněné na 1/h optickou hustotu při 650 nm, za předpokladu, že 1 mmol vytvořeného NH4 + = 1 mmol přeměněného R-(-)-2,2-DMCPA.
Příklad 6
Příprava S-(+)-2,2-DMCPCA
E.coli K12 s hybridním plasmidem pCAR6 má v médiu obsahujícím minerální soli, 0,2 % (óbj./obj.) glycerinu a 0,15 % hmot. R,S-(±)-2z2-DMCPCA aktivitu specifické hydrolasy o hodnotě 1,2 g R-(-)-2,2-DMCPCS/l/hod/OD650 po indukci IPTG. Přeměna R-(-)-2,2-10CZ 279498 B6
-DMCPCA na R-(-)-kyselinu se stanoví uvolněním NH4 + a analýzou pomocí plynové chromatografie. Cílový produkt S-(+)-2,2-DMCPCA zůstane nezměněný v racemické směsi.
Stejně jako E.coli K12 se kultivují mikroorganismy uvedené v tabulce 1. Výsledky přeměny jsou uvedeny v tabulce 1.
Tabulka 1
Aktivita stereospecifické hvdrolaSv v různvch kmenech E.coli
kmen spec, aktivita g/l/h/OD faktor stabi- max. celková aktivita g/i/h
lita v % 4 . OD650 ) nm
Comamonas acidovorans
(ne podle vynálezu) A:18 0,5 1 - 6 3,0
E.coli K12/dCAR6 2) 1,2 2,4 90 nt -
E.coli HB101/OCAR6 2) 0,25 0,5 nt nt -
E.coli MC4100/dCAR6 3) 0,53 1 89 nt
E.coli XL1BLUE/DCAR6 5) (DSM č. 6551) 0,5 1 90 30 15,0
E.COli DH5/PCAR6 5) (DSM Č. 7053) 2,1 4,2 100 30 63,0
1) indukce amidem, 2) indukce plasmidu po 24 h bez selekce IPTG, 3) konstitutivní 4) stabilita antibiotiky, nt = netestováno, 5)
bez indukce
Příklad 7
Test aktivity C1-C4-alkoholem
Testy aktivity se nejdříve prováděly s Comamonas acidovorans A:18 při 37 °C s 0,5 % R,S-2,2-DMCPCA v 10 mM pufru fosforečnanu draselného při pH 7,0. Kontrolní pokusy se prováděly bez rozpouštědla, testovací pokusy se prováděly s 5 až 16 % obj. rozpouštědla. Výpočet specifické aktivity se provádí podle příkladu 5.
rozpouštědlo reakční aktivita
(% obj.) g R-2,2-DMCPCA/l/h/OD650 nm 0,64
ethanol (10) isopropanol (10) methanol (5) methanol (10) methanol (16) 1,24 1,85 1,79 1,54 1,66
-11CZ 279498 B6
Při biotransformaci ve 20 1 fermentoru s 2 až 3 % R,S-2,2-DMCPCA (37 °C, 10 mM pufr fosforečnanu draselného, pH 7,0) se přidáním 5 až 7,5 % obj. methanolu nebo ethanolu dosáhne zkrácení reakční doby a vyšších výtěžků S-(+)-2,2-DMCPCA (zvýšení selektivity). Stejný efekt se pozoruje u kmenu E.coli XLl-Blue s hydrolasovým genem. Výsledky jsou shrnuté uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2 (od každého kmenu se použijí stejné aktivity ve vodě)
kmen R,S-2,2- DMCPCA (%) rozpouštědlo 1 (% obj.) doba (h) ee (%) výtěžek (%) +)
A:18 2,0 22 99 41,5
A:18 2,3 methanol (7,5) 15 99,2 47
XLl/pCAR6 2,8 — 24 100 36
XLl/pCAR6 2,8 methanol (7,5) 7 98,2 46
XLl/pCAR6 2,8 ethanol (5) 7 98,6 44
+) s-(+)- 2,2-DMCPCA vztaženo na vnesený R,S-DMCPCA
Příklad 8
Imobilizace stereospecifické hydrolasy z E.coli XLl-Blue/pCAR6
Bezbuněčný extrakt (288 ml) E.coli XLl-Blue/pCAR6 obsahující 28 mg proteinu/ml s hydrolasovou aktivitou při. 37 °C 0,29 μιηοΐ R-(-)-2,2-DMCPCA/min . mg proteinu se nejdříve předčistí sloupcovou chromatorgafií na Q-Sepharose (Pharmacia). Protein hydrolasy se eluuje gradientem NaCl (0-1 mol/1) v Tris-HCl pufru (0,1 molární, pH 7,5). Protein s hydrolasovou aktivitou, který se eluuje mezi 40 % a 80 % gradientu NaCl, se potom zahustí ultrafiltrací (membrána Amicon YM10) a odsolí se gelovou filtrací (PD-10, Sephadex G-25, Pharmacia LKB). Konečný objem potom je 47 ml. Přitom je 67 mg proteinu/ml s hydrolasovou aktivitou při 37 °C 0,69 μιηοΐ R-(-)-2,2-DMCPCA/min . mg proteinu obsaženo v pufru fosforečnanu draselného (0,1 molární, pH 7,0). Potom se tato předčištěná stereospecifická hydrolasa imobilizuje na Eupergitu C (Róhm Pharma GmbH, Weiterstadt, BRD) jako nosičovém materiálu. Oxiranové skupiny nerozpustného nosičového materiálu se kovalentně váží na volné aminoskupiny hydrolasového proteinu. Imobilizace se provádí 90 h při teplotě místnosti v pufru fosforečnanu draselného (1 molární, pH 8,5). Získá se 10,2 mg imobilizovaného proteinu/g vlhkého Eupergitu C, o hydrolasové aktivitě při 37 °C 1,5 μπιοί R-(-) -2,2-DMCPCA/min . g vlhkého Eupergitu C. Stabilita imobilizované hydrolasy při 37 °C v pufru fosforečnanu draselného (10 molární, pH 8,5), který obsahuje 0,5 % hmot. R,S-(±)-2,2-DMCPCA, je uvedena v tabulce 3.
-12CZ 279498 B6
Tabulka 3 doba aktivita zmobilizované hydrolasy (μιηοΐ R-(-)-2,2-DMCPCA/min g vlhkého Eupergitu C) až 90 až 185
1,5
0,68
Průmyslová využitelnost
Opticky čistý S-(+)-2,2-DMCPCA slouží jako výchozí látka pro výrobu inhibitoru dehydropeptidasy cilastatinu, který se při terapii podává spolu s penemovými popřípadě karbapenemovými antibiotiky, aby se zabránilo desaktivaci antibiotik renální dehydropeptidasou v ledvině.

Claims (21)

1. Způsob genovětechnologické výroby S-(+)-2,2-dimethylcykló- propankarboxamidu, vyznačující se t í m, ze se v racemickém R,S-(±)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamidu biotransformuj e R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid pomocí mikroorganismů, které jsou transformovány genem tvořícím stereospecif ickóuhydrolasu a který je charakterizován restrikční mapou uvedenou na obr. 1 na kyselinu R-(-)-2,2-dimethylcyklopropankarboxylovou, přičemž vznikne opticky aktivní S-(+)-2,2-dimethylcyklopropankarboxamid a ten se izoluje.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí s mikroorganismy, které jsou transformovány fragmentem DNA, který kóduje polypeptid s aktivitou stereospecifické hydrolasy, jehož sekvence aminokyselin je uvedena na obr. 3.
3. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 2, v y z n a č uj í c í se tím, že se biotransformace provádí s mikroorganismy, které jsou transformovány fragmentem DNA, který hybridiZuje s fragmentem DNA uvedeným na obr. 3 a který kóduje polypeptid s aktivitou stereospecifické hydrolasy.
4. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 3, vy z n a č ující setím, že se biotransformace provádí s mikroorganismy rodu Escherichia, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobactér, Rhizobium nebo Acrrobacterium.
5. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se biotransformace provádí s mikroorganismy druh Escherichia coli.
6. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 5, vyznač ující se tím, že se biotransformace provádí s mikroorganismy druhu Escherichia coli XLl-Blue DSM č. 6551, které jsou transformovány hybridním plasmidem pCAR6, a/nebo s jejich spontánními mutanty.
7. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 5, vyznačující se t í m, že se biotransformace provádí s mikroorganismy druhu Escherichia coli DH5 DSM č. 7053, které jsou transformovány hybridním plasmidem pCAR6, a/nebo s jejich spontánními mutanty.
8. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 7, vyznačující setím, že se biotransformace provádí s imobilizovanou stereospecifickou hydrolasou.
9. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 8, vyznačující setím, že se biotransformace provádí v médiu, které obsahuje racemický R,S-(+)-2,2-dimethylčyklopropankarboxamid v množství od 0,2 do 5 % hmot.
-14CZ 279498 B6
10. Způsob podle alespoň jednoho z nároků 1 až 9, vyznač ující setím,že se biotransformace provádí při pH od 6 do 11 a při teplotě od 15 do 55 °C.
11. DNA kódující stereospecifickou hydrolasu, charakterizována následující restrikční mapou uvedenou na obr. 1
12. Fragment DNA kódující polypeptid s aktivitou stereospecifické hydrolasy, jehož sekvence aminokyselin je uvedena na obr. 3.
13. Fragment DNA, který hybridizuje s fragmentem DNA uvedeným na obr. 3 a který kóduje polypeptid s aktivitou stereospecifické hydrolasy. '
14. DNA nebo fragment DNA podle nároků 11, 12 nebo 13 v hybridním plasmidu pCAR6, uložené v Escherichia coli XLl-Blue DSM č. 6551.
15. DNA nebo fragment DNA podle nároků 11, 12 nebo 13 v hybridním plasmidu pCAR6, uložené v Escherichia coli DH5 DSM č. 7053.
16. Hybridní plasmid složený z expresního vektoru s DNA nebo s fragmentem DNA podle nároků 11, 12 nebo 13, do něho vloženými.
17. Hybridní plasmid pCAR6 složený z DNA nebo fragmentu DNA podle nároků 11, 12 nebo 13 a expresního vektoru pBLUESCRIPT-KS+, uložený v Escherichia coli XLl-Blue DSM č. 6551.
18. Hybridní plasmid pCAR6 složený z DNA nebo fragmentu DNA podle nároků 11, 12 nebo 13 a expresního vektoru pBLUESCRIPT-KS+, uložený v Escherichia coli DH5 DSM č. 7053.
19. Mikroorganismy, které jsou transformovány hybridním plasmidem podle nároků 16, 17 nebo 18.
20. Mikroorganismy podle nároku 19 druhu Escherichia coli XLl-Blue DSM č. 6551, které jsou transformovány hybridním plasmidem pCAR6.
21. Mikroorganismy podle nároku 19 druhu Escherichia coli DH5 DSM č. 7053, které jsou transformovány hybridním plasmidem pCAR6.
3 Výkresy
CS922323A 1991-07-26 1992-07-24 Genovětechnologický způsob výroby S-/+/-2, 2-dimethylcyklopropankarboxamidu pomocí mikroorganismů CZ279498B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH224791 1991-07-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ232392A3 CZ232392A3 (en) 1993-02-17
CZ279498B6 true CZ279498B6 (cs) 1995-05-17

Family

ID=4229309

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS922323A CZ279498B6 (cs) 1991-07-26 1992-07-24 Genovětechnologický způsob výroby S-/+/-2, 2-dimethylcyklopropankarboxamidu pomocí mikroorganismů

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5427934A (cs)
EP (1) EP0524604B1 (cs)
JP (1) JP3217859B2 (cs)
AT (1) ATE172248T1 (cs)
CA (1) CA2074681C (cs)
CZ (1) CZ279498B6 (cs)
DE (1) DE59209523D1 (cs)
DK (1) DK0524604T3 (cs)
ES (1) ES2124714T3 (cs)
HU (1) HU215231B (cs)
IE (1) IE922406A1 (cs)
IL (1) IL102643A0 (cs)
MX (1) MX9204350A (cs)
PL (1) PL170598B1 (cs)
RO (1) RO114152B1 (cs)
RU (1) RU2126450C1 (cs)
SK (1) SK279048B6 (cs)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG72731A1 (en) * 1996-03-15 2000-05-23 Nabe Seiyaku Co Ltd Process for preparing optically active trans-3-phenylglycidamide compounds
OA12607A (en) * 2001-05-18 2006-06-08 Ranbaxy Lab Ltd Process for the preparation of amorphous cilastatin sodium.
KR100511534B1 (ko) * 2002-07-05 2005-08-31 임광민 아미드 화합물의 새로운 제조방법
KR100650797B1 (ko) * 2005-12-12 2006-11-27 (주)케미코월드 광학활성 사이클로프로판 카복사미드의 제조방법
CN102250934A (zh) * 2010-05-17 2011-11-23 浙江海正药业股份有限公司 一种酰胺水解酶的高效表达及应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2511867A (en) * 1949-12-19 1950-06-20 Method fob separating enantiomers
US3897308A (en) * 1971-05-07 1975-07-29 Exxon Research Engineering Co Immobilized enzymes and method for preparation
JPS5685298A (en) * 1979-12-14 1981-07-11 Asahi Chem Ind Co Ltd Preparation of 7-aminocephem compound
DE48301T1 (de) * 1980-09-24 1983-01-20 Merck & Co., Inc., 07065 Rahway, N.J. 2-(cyclopropancarboxamido)-2-alkensaeuren, deren ester und salze und daraus bestehende bakterienhemmende zusammensetzungen mit einer verbindung des typs thienamycin.
JPS6056936A (ja) * 1983-09-06 1985-04-02 Sumitomo Chem Co Ltd 光学活性２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸及びその誘導体の製法
DE3752086T2 (de) * 1986-04-16 1998-02-26 Sumitomo Chemical Co Verfahren zur Herstellung von optisch-aktiven Cyclopropancarbonsäure
DE3929570A1 (de) * 1989-09-06 1991-03-07 Degussa Mikrobiologisch hergestellte n-acyl-l-prolin-acylase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung
FR2655660B1 (fr) * 1989-12-11 1992-03-20 Rhone Poulenc Sante Nouveaux polypeptides, sequences d'adn permettant leur expression, procede de preparation et leur utilisation.
CA2056840A1 (en) * 1990-12-17 1992-06-18 Thomas Meul Process for the production of dimethylcyclopropanecarboxylic acid
RU2096460C1 (ru) * 1991-03-06 1997-11-20 Лонца Аг Способ получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, штаммы бактерий comamonas acidovorans, pseudomonas sp., bacterium sp., предназначенные для получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида (варианты)

Also Published As

Publication number Publication date
CA2074681A1 (en) 1993-01-27
CA2074681C (en) 2000-11-28
US5427934A (en) 1995-06-27
IE922406A1 (en) 1993-01-27
PL295408A1 (en) 1993-03-22
JP3217859B2 (ja) 2001-10-15
RO114152B1 (ro) 1999-01-29
EP0524604A2 (de) 1993-01-27
HU215231B (hu) 1999-01-28
EP0524604B1 (de) 1998-10-14
CZ232392A3 (en) 1993-02-17
PL170598B1 (pl) 1997-01-31
SK232392A3 (en) 1995-11-08
JPH05236993A (ja) 1993-09-17
HUT67687A (en) 1995-04-28
IL102643A0 (en) 1993-01-14
MX9204350A (es) 1993-02-01
ATE172248T1 (de) 1998-10-15
ES2124714T3 (es) 1999-02-16
SK279048B6 (sk) 1998-06-03
RU2126450C1 (ru) 1999-02-20
HU9202439D0 (en) 1992-10-28
EP0524604A3 (cs) 1994-05-04
DK0524604T3 (da) 1999-06-23
DE59209523D1 (de) 1998-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5281525A (en) Cephalosporin acetylhydrolase gene from Bacillus subtilis
US5759828A (en) Cyclic di-guanylate metabolic enzymes
US5260208A (en) Enantioselective amidases, DNA sequences encoding them, method of preparation and utilization
CA2103616A1 (en) Polypeptides possessing a nitrilase activity, dna sequence coding for said polypeptides, expression cassettes and host microorganisms enabling them to be obtained, and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides
KR20000060322A (ko) 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자
CN112899256A (zh) 一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶d及其制备方法和应用
CZ279498B6 (cs) Genovětechnologický způsob výroby S-/+/-2, 2-dimethylcyklopropankarboxamidu pomocí mikroorganismů
JP2002330785A (ja) ヒダントイナーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞、タンパク質の製造方法および光学活性アミノ酸の製造方法
JP2603777B2 (ja) アジピン酸アンモニウムの酵素的合成方法
KR102722561B1 (ko) 항시발현용 신규 프로모터 변이체 및 이의 용도
EP1197557A1 (en) Gene encoding cyclic lipopeptide acylase and expression of the same
JP2002209582A (ja) 耐熱性グルコキナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法
ES2307746T3 (es) D-hidantoinasa de ochrobactrum anthropi'.
JP3486942B2 (ja) 耐熱性エステラーゼ
JP2001524805A (ja) 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用
WO2000008170A1 (fr) Gene participant a la production d'acide homoglutamique, et utilisation associee
WO1999015632A1 (es) UN PROCEDIMIENTO ENZIMATICO PARA PREPARAR ACIDO 7β-(4-CARBOXIBUTANAMIDO) CEFALOSPORANICO UTILIZANDO LA ENZIMA D-AMINOACIDO OXIDASA DE TRIGONOPSIS VARIABILIS MODIFICADA PRODUCIDA EN ESCHERICHIA COLI.
JPH07222587A (ja) 新規セファロスポリンｃアシラーゼ及びその製造方法
HU223164B1 (hu) S-(+)-2,2-dimetil-ciklopropánkarboxamid előállítására képes transzformált mikroorganizmusok, valamint előállításukhoz alkalmas hibridplazmidok és DNS-fragmensek
JP3012908B2 (ja) ジヒドロ葉酸還元酵素―抗アレルギー性ペンタペプチド多量体の融合タンパク質（▲ｉ▼）
JP2000295992A (ja) シスエポキシコハク酸加水分解酵素をコードするｄｎａ及びその利用
ES2304191B2 (es) Procedimiento para producir acido-6-aminopenicilanico mediante la enzima aculeacina a acilasa de actinoplanes utahensis, purificada a partir de la bacteria recombinante streptomyces lividans cect 3377.
WO2007097429A1 (ja) 新規アシルアミダーゼ遺伝子およびその利用法
WO1999055881A1 (en) Cephalosporin deacetylase, gene coding for it, and preparation method of deacetylated cephalosporin compounds using it
JPH0556779A (ja) 遺伝子組換えによる耐熱性β−チロシナーゼの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20120724