CN112899256A

CN112899256A - 一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶d及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112899256A
Application number: CN202110129291.4A
Authority: CN
Inventors: 王永华; 王方华; 刘思雨; 杨博; 蓝东明
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN112899256B

Abstract

本发明公开了一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；该耐低温磷脂酶D基因序列如SEQ IDNO:2所示。本发明获得一株耐低温磷脂酶D的大肠杆菌重组表达菌株，利用该菌株，可实现重组蛋白大量可溶性表达，易于后期纯化及蛋白获得。本发明的表达产物具备有良好的低温储藏稳定性和良好的酶活力，同时对有机溶剂和表面活性剂有一定的耐受性。本发明获得磷脂酶D可适用于磷脂改性，生产磷脂酸及各类天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物，应用于生物、食品、医药、化妆品、农业、工业等领域。

Description

一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体的说，涉及一种优化的南极细菌来源的耐低温磷脂酶D重组大肠杆菌菌株及酶蛋白制备方法；本发明还涉及所表达的耐低温磷脂酶D的应用。

背景技术

磷脂酶D(Phospholipase D，PLD，EC3.1.4.4)是一类水解磷脂结构中的磷酸二酯键生成磷脂酸(PA)和相应含羟基化合物的酶。PLD可通过其水解产物PA发挥第二信使功能并参与多种生理活动，如细胞增殖、炎症、病毒感染等，也能导致神经退行性疾病、人类癌症和植物应激反应。除此之外，磷脂酶D也可以催化转磷脂酰基反应，合成具有生理功能的磷脂衍生物，如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。因此，作为一类重要的工具酶，PLD在磷脂改性中发挥着重要作用，在食品、医药和化妆品行业中具有极大的应用价值。

目前，限制磷脂酶D得以广泛应用的主要原因有以下几点：一是商品化磷脂酶D来源范围较窄，种类少。国际上商品化磷脂酶D主要被日本天野公司所垄断，且其来源大多为链霉菌属，种类稀少，价格昂贵。国内对磷脂酶D的研究也才刚刚起步，还未开发出商品化PLD。二是现已报道的磷脂酶D的表达量和酶活力都普遍较低。天然磷脂酶D难以提取纯化，且获得的产量较低，生产成本高，难以工业化生产。而基因工程菌异源表达的磷脂酶D主要以包涵体形式存在且酶活力较低，从而限制了磷脂酶D的规模化制备。三是报道的大多数磷脂酶D在低温下酶活力会被抑制，且储藏期较短，这严重影响了该酶的应用和保存。因此，开发一种高表达高活力的低温稳定性磷脂酶D具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种南极细菌来源的耐低温磷脂酶D及其制备方法。

本发明的第一个方面公开了一种来自南极细菌(Moritella sp.JT01)的耐低温磷脂酶D，其含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本发明的另一个方面，提供了一种编码上述磷脂酶D的优化的核酸序列，获得在大肠杆菌高表达的耐低温磷脂酶D，具有如SEQ ID NO：2所示的核酸序列。

本发明的第三个方面，提供了一种重组表达载体，其包含上述多核苷酸。

本发明的第四个方面，提供了一种细胞，其包含上述载体，或其基因组中整合有上述多核苷酸。

本发明的第五个方面，表征了上述磷脂酶D的酶学性质。

本发明的第六个方面，提供了一种生产上述磷脂酶D的方法，包括：培养上述宿主细胞，从培养物中纯化出表达产物。

本发明的第七个方面，提供了上述磷脂酶D的用途，可应用于磷脂改性中。

本发明的技术方案具体如下：

一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D，是在对NCBI数据库中提供的南极细菌(Moritella sp.JT01)磷脂酶D完整蛋白序列(GenBank:KXO13223.1)基础上去除N端28个氨基酸基础上获得(命名为MsPLD)，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。

一种低温磷脂酶D基因，是在对NCBI数据库中提供的南极细菌(Moritellasp.JT01)磷脂酶D(GenBank:LOCN01000006.1)基因序列(SEQ ID NO:1)进行优化的基础上获得，优化后的序列如SEQ ID NO:2所示。

一种耐低温磷脂酶D重组菌株的制备方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求2所述耐低温磷脂酶D基因克隆到pET-21a表达载体上，构建得到重组质粒；

(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。

一种重组耐低温磷脂酶D的制备方法，以上述获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制得重组耐低温磷脂酶D。具体步骤如下：

(1)将重组大肠杆菌表达菌株接种于含氨苄青霉素的种子培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至对数生长期，制备种子液；

(2)将所述种子液按5～10％的接种量接种到LB液体发酵培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度0.2mM，于16-20℃，摇瓶条件下诱导培养；

(3)将步骤(2)中所得发酵液离心，收集菌体沉淀，用缓冲液重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心，取上清，即为重组耐低温磷脂酶D粗酶液。

优选地，将步骤(3)所得重组耐低温磷脂酶D粗酶液，分别经镍柱亲和层析、G-25脱盐柱纯化获得电泳纯的重组耐低温磷脂酶D酶液。

优选地，步骤(3)重悬的缓冲液为50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0；所述镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液为含有300mM咪唑的50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0；G-25脱盐柱纯化中所用的洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0。

上述耐低温磷脂酶D用于催化合成磷脂酸或磷脂衍生物。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明获得的MsPLD是首个南极细菌来源的具有耐低温且低温储藏期较长的高表达磷脂酶D。MsPLD在35℃，pH8.0表现出最适反应酶活力，该酶在4℃条件下，放置18天，其酶活力仍保持70％以上。根据该酶的酶失活曲线，可知其在4℃的半衰期能长达41天。此外，该酶对50％有机溶剂(N-正己烷、苯、乙醚)和2％(v/v)表面活性剂(吐温-20、吐温-80、曲拉通X-100、司班-80)有较强的耐受性，处理2h后的残余酶活力均在80％以上。

(2)本发明制备所得的MsPLD具有水解PC和LPC等磷脂的活性，可用于水解磷脂酰胆碱制备磷脂酸(PA)，也能应用于磷脂的头部改性制备具有生理功能的磷脂衍生物，例如磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。采用所述方法得到的重组磷脂酶D，具有较高的表达量，且在低温下具有良好的酶活力和储藏稳定性。因此，MsPLD可作为磷脂酶D催化剂，应用于生物、食品、医药、化妆品等领域中。

附图说明

图1为南极细菌JT01来源的磷脂酶D在质粒pET21a上的重组子结构图。

图2为发酵表达优化密码子磷脂酶D纯化后的SDS-PAGE电泳图。泳道一是蛋白分子量marker，泳道二是MsPLD的发酵总菌蛋白，泳道三是菌体破碎后离心上清，泳道四是菌体破碎后离心沉淀，泳道五是MsPLD镍柱亲和层析穿过峰收集样品，泳道六是MsPLD镍柱亲和层析的40mM咪唑洗脱蛋白峰样品，泳道七是纯化后MsPLD目的蛋白。

图3为MsPLD的最适反应温度曲线图。

图4为MsPLD的热稳定性曲线图。

图5为MsPLD的储藏稳定性曲线图。

图6为MsPLD的最适反应pH曲线图。

图7为MsPLDD的pH稳定性曲线图。

图8为有机溶剂对MsPLD的影响结果图。

图9为不同表面活性剂对MsPLD的影响结果图。

图10为MsPLD的底物特异性图。

图11为MsPLD催化合成磷脂酸和磷脂酰丝氨酸的HPLC-ELSD色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

MsPLD的重组表达及纯化

将构建获得的MsPLD重组表达质粒热击转化至大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，涂平板获得重组子，挑取单菌落培养提取质粒后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证，测序正确即获得MsPLD重组表达菌株。将重组菌株接种于LB(含100μg/mLAmp)液体培养基中，37℃培养过夜，按5％的接种量扩大到100mL LB培养基中，当培养液OD_600nm＝0.8时，添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖基吡喃糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，于16-20℃诱导20h后10000rpm，离心5min，收集菌体。获得细胞并用缓冲液A(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0)重悬细胞，并进行超声破碎。破碎后裂解液于4℃、10000rpm，离心50min。收集上清液进行纯化。将离心所得上清液上样用缓冲液A预先平衡好的Ni²⁺-NTA层析柱，用含有40mM咪唑的缓冲液A进行杂蛋白去除。用缓冲液B(50mM Tris HCl，500mM NaCl，300mM咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白。然后将洗脱目的蛋白继续上样脱盐柱G-25，用缓冲液A进行洗脱，收集洗脱样品即可得到高纯度目的蛋白样品。目的蛋白样品纯度用12％SDS-PAGE分析(见图2)。通过该发酵表达纯化方案，每升发酵液最终能获得18.4mg目的蛋白。而同等条件下未经密码子优化的PLD构建菌株发酵表达每升发酵液仅能获得1.6mg目的蛋白。由此可见，优化密码子PLD的表达量约是未优化密码子表达PLD的11倍。

实施例2

磷脂酶D的最适反应温度及温度稳定性

为探索不同温度条件对MsPLD酶反应活力的影响，于不同温度(4℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃)下，采用酶联比色法测定其酶活力。反应体系(100μL)包含0.1MTris-HCl(pH8.0)，5mM soyPC，15mM SDS，15mM Tritonx-100和10μL纯化后的酶溶液，于各温度下反应5min，加热终止反应，待溶液冷却后，加入含10U/mL胆碱氧化酶、1U/mL过氧化物酶、5mM 4-氨基安替林和7mM苯酚的显色液，30℃孵育30min，最后添加1％TrionX-100终止显色反应。于490nm处测定吸光值。实验重复三次，实验结果用相对酶活力表示，测定的最大酶活力定为100％。结果表明MsPLD的最适反应温度为35℃，且在低温4℃下还保留了88.50％的相对酶活力(见图3)。

为评价MsPLD的热稳定性，选择了三个不同的温度35℃、40℃、45℃，采用酶联比色法测定孵育不同时间(0～60min)下的MsPLD的残余酶活，实验重复三次，实验结果用相对酶活力表示，测定的最大酶活力定为100％。结果表明MsPLD的热稳定性较差，根据其失活曲线，能计算出其在35℃下的半衰期才为110min(见图4)。

为测定MsPLD的低温储藏稳定性，将MsPLD于4℃、pH8.0的条件下进行冰箱储藏，每隔2天取样采用酶联比色法检测其残余酶活性，实验重复三次，实验结果用相对酶活力表示，测定的最大酶活力定为100％。结果表明MsPLD具有良好的低温储藏稳定性，根据其失活曲线，能计算出其在4℃的半衰期长达41天(见图5)。

实施例3

最适pH及pH稳定性

为探索pH对MsPLD酶活力的影响，于不同pH(pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)条件下，采用酶联比色法测定MsPLD的酶活力。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例2。使用的各种pH的缓冲液为：50mM柠檬酸盐(pH 4.0-5.0)、50mM磷酸钠(pH 6.0-7.0)、50mMTris-HCl(pH 8.0)和50mM甘氨酸-NaOH(pH 9.0-10.0)。实验重复三次，实验结果用相对酶活力表示，测定的最大酶活力定为100％。结果表明MsPLD的最适pH为8.0(见图6)。

为评价MsPLD的pH稳定性，在不同pH值(pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的条件下处理12h，测定MsPLD的残余酶活，酶活测定反应体系和反应条件参考实施例2。实验重复三次，实验结果用相对酶活力表示，测定的最大酶活力定为100％。结果表明MsPLD在pH6.0-8.0处理12h后，残余酶活力仍在60％以上，在过酸或过碱条件下MsPLD的酶活力迅速下降，表明MsPLD是中性磷脂酶D(见图7)。

实施例4

有机溶剂和表面活性剂的耐受性

将MsPLD酶液与各种不同有机溶剂(乙酸乙酯，正己烷，苯，乙醚，氯仿，丙酮)等体积混合，于4℃，孵育2h，采用酶联比色法测定MsPLD残余酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例2。各种有机溶剂对MsPLD稳定性的影响用相对酶活表示，未经有机溶剂处理过的MsPLD的酶活定为100％。结果表明在所选择的有机试剂中，MsPLD对正己烷、苯和乙醚这三种有机溶剂的耐受性最好，其残余酶活力均在80％以上(见图8)。

将MsPLD酶液与浓度为2％(v/v)的不同表面活性剂(吐温-20，吐温-80，曲拉通X-100，司班-80，十二烷基硫酸钠)等体积混合，于4℃，孵育2h，采用酶联比色法测定MsPLD残余酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例2。各种表面活性剂对MsPLD稳定性的影响用相对酶活表示，未经表面活性剂处理过的MsPLD的酶活定为100％。结果表明在所选择的表面活性剂中，MsPLD对非离子表面活性剂的耐受性较好，其残余酶活力均在80％以上，MsPLD不耐受阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠，其残余酶活力只有20％左右(见图9)。

实施例5

MsPLD对不同酰基链数量的磷脂酰胆碱的底物选择性

以不同酰基链数量的磷脂(L-α-phosphatidylcholine(PC),L-α-lysophosphatidylcholine(LPC)，L-α-glycerophosphorylcholine(GPC))作为底物，采用酶联比色法测定MsPLD的酶活。酶活测定反应体系和反应条件参考实施例2。不同酰基链数量的底物对MsPLD酶活的影响用相对酶活表示，测定的最大酶活定为100％。所有实验重复三次。结果表明MsPLD对PC底物的水解活性最大(见图10)。

实施例6

MsPLD催化合成PA的应用

将40mg粉末大豆卵磷脂(纯度>60％)溶于1mL的苯溶液中，再配置4mL的含酶水溶液，其中MsPLD的酶活为2U/mL，于pH 8.0，30℃，800rpm下反应8h。反应完毕用无水乙醇和丙酮进行除杂，用流动相重新溶解后经HPLC检测磷脂酸，含量约为1.42mg。

实施例7

MsPLD的催化合成PS的应用

将4mg大豆卵磷脂(纯度>95％)溶解在1mL苯溶液中，0.1g L-丝氨酸溶解在0.5mL缓冲液A(50mM Tris-HCl,500mM NaCl,pH 8.0)中，添加50μL MsPLD酶溶液，于黑暗条件下35℃，500rpm反应24h。用氯仿：甲醇(2：1，v/v)萃取磷脂，超声10min后，以8000rpm离心5min，取下层有机相，挥干后重新溶解于流动相中，进行HPLC分析催化合成的磷脂酰丝氨酸，转化率约为25％。

采用蒸发光检测器的HPLC进行磷脂分析：色谱柱为硅胶柱Hyperil GOLD silica(5μm,4.6×250mm)，流动相A为甲醇/纯水/乙酸(85:15:0.5)和0.05％三乙胺，流动相B为正己烷/异丙醇/流动相A(20:48:32)。采用梯度洗脱，0-5min，A:0％，B:100％；14min，A:37％，B:63％；15min，A:90％，B:10％，17min，A:90％，B:10％；18-22min，A:0％，B:100％。柱温为40℃，流速为1.0mL/min，雾化温度保持85℃，空气流速2.0L/min，响应值为4，手动进样5μL。MsPLD催化合成的磷脂酸于4.6min左右出峰，磷脂酰丝氨酸于7.2min左右出峰，磷脂酰胆碱于14.6min左右出峰(见图11)。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1737

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaactatta tttattggta catgtatgct gtttttccac ataggcgtcc acaattgttt 60

ttctaattgt gcggttgcat ctttatcatc cacaataaca ccaaattgct gtagtgatga 120

aggatatata ttatggctac ctacataaaa tactttgtca tcaacaatcc acaatttatt 180

atgactcatg ttattcgttt cacggccatt aattgaaatg aagttgatat gcagattttt 240

atctaagaac gtttttgcat agtttctttc taagtaatac ggtgctttat gtaatacatt 300

taataaatag ttataaacaa actcagaatt ataccctgaa ctataaatac cgccgtctaa 360

agaactcgtc acgatatcaa ccgtaacacc tttgtaaata gcacttgcta acgcttccat 420

tacagtgcca tcgattgttt taagtggatg taatactttg ccaaatgcgc ctttaaaaaa 480

caatgcttgt tgacttattt taatgctttt agtggcattt ttgaatgcat atactctcgc 540

aacttccgat tgatctgcat ctttatctag cacaccattg ttgagtttgc taatagacat 600

tactttcaca gcaaggccat ttttagcatc tgtaggagct acatatgttg acgaaatatg 660

tgcaggacag tcataagtgt actgaccatt tgcgtaggta acgaaggtat tagtaattgt 720

accagtgtta ttacatacat aattccacag tgtatttcca tatttagtcg cagtagatgc 780

aatcggacct aagatattaa tactgagatc attaacagga tttcgctgta aataatcagc 840

accccataag ttatgcccac cagtaataac agactggtta tcaacgttaa ttattttccc 900

atgattccaa gcaacattta acaacacatc tttttgacta ttattgttgc cacaattact 960

tattaattta ttacaagaac gtacgctgcc tacagtaata tcaagattat taacttcagg 1020

aagtacgcta gcaatctcag aaaggtaatt ggtctgagtt agactcaatt gacgtatttc 1080

ttcctcttca gattcagcat cataaccaag catcggcgta aaactacctt gtaatagtcg 1140

aaccgtaata tgatgatcag aatattgcgt attcttcgcc aattgtgaca gtgcattttt 1200

aattgttgcg gtaaatgcac cactcgaaaa actcagattt aagtgactta tatccatcgg 1260

ctgtagtgta acgatatcta cagatcgttt tgctgataca atattgtcat atatagcatc 1320

taatatttta tctgccggaa ccgtacacag ttttttagca tcaccgtctt tgtttttggt 1380

ataagctggc gcagtacagg tagaaacacc tccacattcc gaatcatcat tacaagtaga 1440

catattgaac tcactgtcta catgattaaa actcagcgca tcaaaactct tattatagaa 1500

ttcgctactg gttccaaaag tgaaatgggt atcgaggatc catccaggtt ttaaatagtt 1560

cgtacttggt tttgaaaaag ttacatcgtt aaattgtgaa tacttttcat ttaaatgatc 1620

gtaaatatca ttaacgtcca attcatttgt acttgcactg gcgctggcgc ttacaagtac 1680

aaatgcagaa gctgcacttt tcagaattat catcgcgtgt ttattttgta tcttcac 1737

<210> 2

<211> 1680

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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ctgaacgaaa aatactctca gttcaacgat gttaccttca gcaaaccgtc taccaactac 120

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cgccagctgt ctctgaccca gaccaactac ctgagcgaaa tcgcgtccgt tctgccggaa 660

gttaacaacc tggatattac cgttggtagc gtgcgttctt gcaacaaact gatctctaac 720

tgcggcaaca acaacagcca gaaagatgtt ctgctgaacg ttgcttggaa ccatggtaaa 780

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<210> 3

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met His His His His His His Ser Thr Asn Glu Leu Asp Val Asn Asp

1 5 10 15

Ile Tyr Asp His Leu Asn Glu Lys Tyr Ser Gln Phe Asn Asp Val Thr

20 25 30

Phe Ser Lys Pro Ser Thr Asn Tyr Leu Lys Pro Gly Trp Ile Leu Asp

35 40 45

Thr His Phe Thr Phe Gly Thr Ser Ser Glu Phe Tyr Asn Lys Ser Phe

50 55 60

Asp Ala Leu Ser Phe Asn His Val Asp Ser Glu Phe Asn Met Ser Thr

65 70 75 80

Cys Asn Asp Asp Ser Glu Cys Gly Gly Val Ser Thr Cys Thr Ala Pro

85 90 95

Ala Tyr Thr Lys Asn Lys Asp Gly Asp Ala Lys Lys Leu Cys Thr Val

100 105 110

Pro Ala Asp Lys Ile Leu Asp Ala Ile Tyr Asp Asn Ile Val Ser Ala

115 120 125

Lys Arg Ser Val Asp Ile Val Thr Leu Gln Pro Met Asp Ile Ser His

130 135 140

Leu Asn Leu Ser Phe Ser Ser Gly Ala Phe Thr Ala Thr Ile Lys Asn

145 150 155 160

Ala Leu Ser Gln Leu Ala Lys Asn Thr Gln Tyr Ser Asp His His Ile

165 170 175

Thr Val Arg Leu Leu Gln Gly Ser Phe Thr Pro Met Leu Gly Tyr Asp

180 185 190

Ala Glu Ser Glu Glu Glu Glu Ile Arg Gln Leu Ser Leu Thr Gln Thr

195 200 205

Asn Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Ser Val Leu Pro Glu Val Asn Asn Leu

210 215 220

Asp Ile Thr Val Gly Ser Val Arg Ser Cys Asn Lys Leu Ile Ser Asn

225 230 235 240

Cys Gly Asn Asn Asn Ser Gln Lys Asp Val Leu Leu Asn Val Ala Trp

245 250 255

Asn His Gly Lys Ile Ile Asn Val Asp Asn Gln Ser Val Ile Thr Gly

260 265 270

Gly His Asn Leu Trp Gly Ala Asp Tyr Leu Gln Arg Asn Pro Val Asn

275 280 285

Asp Leu Ser Ile Asn Ile Leu Gly Pro Ile Ala Ser Thr Ala Thr Lys

290 295 300

Tyr Gly Asn Thr Leu Trp Asn Tyr Val Cys Asn Asn Thr Gly Thr Ile

305 310 315 320

Thr Asn Thr Phe Val Thr Tyr Ala Asn Gly Gln Tyr Thr Tyr Asp Cys

325 330 335

Pro Ala His Ile Ser Ser Thr Tyr Val Ala Pro Thr Asp Ala Lys Asn

340 345 350

Gly Leu Ala Val Lys Val Met Ser Ile Ser Lys Leu Asn Asn Gly Val

355 360 365

Leu Asp Lys Asp Ala Asp Gln Ser Glu Val Ala Arg Val Tyr Ala Phe

370 375 380

Lys Asn Ala Thr Lys Ser Ile Lys Ile Ser Gln Gln Ala Leu Phe Phe

385 390 395 400

Lys Gly Ala Phe Gly Lys Val Leu His Pro Leu Lys Thr Ile Asp Gly

405 410 415

Thr Val Met Glu Ala Leu Ala Ser Ala Ile Tyr Lys Gly Val Thr Val

420 425 430

Asp Ile Val Thr Ser Ser Leu Asp Gly Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Tyr

435 440 445

Asn Ser Glu Phe Val Tyr Asn Tyr Leu Leu Asn Val Leu His Lys Ala

450 455 460

Pro Tyr Tyr Leu Glu Arg Asn Tyr Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Asn

465 470 475 480

Leu His Ile Asn Phe Ile Ser Ile Asn Gly Arg Glu Thr Asn Asn Met

485 490 495

Ser His Asn Lys Leu Trp Ile Val Asp Asp Lys Val Phe Tyr Val Gly

500 505 510

Ser His Asn Ile Tyr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Phe Gly Val Ile Val

515 520 525

Asp Asp Lys Asp Ala Thr Ala Gln Leu Glu Lys Gln Leu Trp Thr Pro

530 535 540

Met Trp Lys Asn Ser Ile His Val Pro Ile Asn Asn Ser

545 550 555

Claims

1.一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶D，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种耐低温磷脂酶D基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO:2所示。

3.包含权利要求2所述磷脂酶D基因的表达载体。

4.一种细胞，包含权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的磷脂酶D基因。

5.一种耐低温磷脂酶D重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.一种重组耐低温磷脂酶D的制备方法，其特征在于，以权利要求5获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制得重组耐低温磷脂酶D。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将步骤(3)所得重组耐低温磷脂酶D粗酶液，分别经镍柱亲和层析、G-25脱盐柱纯化获得电泳纯的重组耐低温磷脂酶D酶液。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)重悬的缓冲液为50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0；所述镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液为含有300mM咪唑的50mMTris-HCl，500mM NaCl，pH8.0；G-25脱盐柱纯化中所用的洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH8.0。

10.权利要求1所述耐低温磷脂酶D的应用，其特征在于，该磷脂酶D用于催化合成磷脂酸或磷脂衍生物。