RO114152B1 - PROCEDEU DE OBTINERE A S (+) 2,2 DIMETILCICLOPROPANCARBOXAMIDEI, FRAGMENT DNA CARE CODIFICA PENTRU O HIDROLAZA STEREOSPECIFICA, PLASMIDA HIBRIDA pCAR6, SI MUTANTI DE ESCHERICHIA COLI PENTRU REALIZAREAACESTUI PROCEDEU - Google Patents
PROCEDEU DE OBTINERE A S (+) 2,2 DIMETILCICLOPROPANCARBOXAMIDEI, FRAGMENT DNA CARE CODIFICA PENTRU O HIDROLAZA STEREOSPECIFICA, PLASMIDA HIBRIDA pCAR6, SI MUTANTI DE ESCHERICHIA COLI PENTRU REALIZAREAACESTUI PROCEDEU Download PDFInfo
- Publication number
- RO114152B1 RO114152B1 RO92-01033A RO9201033A RO114152B1 RO 114152 B1 RO114152 B1 RO 114152B1 RO 9201033 A RO9201033 A RO 9201033A RO 114152 B1 RO114152 B1 RO 114152B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- escherichia coli
- pcar6
- hydrolase
- dsm
- microorganisms
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 44
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 26
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 60
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 44
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 241000589519 Comamonas Species 0.000 claims description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 claims description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- RSYOSUMAMNFKSM-UHFFFAOYSA-N 2-[(7-chloroquinolin-4-yl)amino]ethanol Chemical compound ClC1=CC=C2C(NCCO)=CC=NC2=C1 RSYOSUMAMNFKSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- BFNMOMYTTGHNGJ-BYPYZUCNSA-N (1r)-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylic acid Chemical compound CC1(C)C[C@H]1C(O)=O BFNMOMYTTGHNGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 63
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 10
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 8
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- BFNMOMYTTGHNGJ-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylic acid Chemical compound CC1(C)CC1C(O)=O BFNMOMYTTGHNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZOXSGKVRDAOPV-UHFFFAOYSA-N 2-(2,2-dimethylcyclopropyl)acetamide Chemical compound CC1(C(C1)CC(=O)N)C BZOXSGKVRDAOPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USWINTIHFQKJTR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C=C(S(O)(=O)=O)C(O)=CC2=C1 USWINTIHFQKJTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- JDAWAWXGAUZPNJ-ZPFDUUQYSA-N Ile-Glu-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N JDAWAWXGAUZPNJ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- IVCPHARVJUYDPA-FXQIFTODSA-N Met-Asn-Asp Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N IVCPHARVJUYDPA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N bromoethane Chemical compound CCBr RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N carbapenem Chemical compound C1C=CN2C(=O)C[C@H]21 YZBQHRLRFGPBSL-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- DHSUYTOATWAVLW-WFVMDLQDSA-N cilastatin Chemical compound CC1(C)C[C@@H]1C(=O)N\C(=C/CCCCSC[C@H](N)C(O)=O)C(O)=O DHSUYTOATWAVLW-WFVMDLQDSA-N 0.000 description 1
- 229960004912 cilastatin Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 102000013151 hydrolase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007831 hydrolase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 125000000466 oxiranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001624918 unidentified bacterium Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
Invenția de față se referă la un procedeu de obținere a S-(+)-2,2-dimetilciclopropancarboxiamidei, un fragment DNA care codifică pentru o hidroliză stereospecifică, o plasmidă hibridă pCAR6 și mutanți de Escherichia coli pentru realizarea acestui procedeu. Invenția poate fi aplicată în domeniul biosintezei cu ajutorul microorganismelor a unor compuși chimici.
In cele ce urmează, 2,2-dimetilciclopropancarboxiamida se prescurtează 2,2-DMCPCA și acidul 2,2-dimetilciclopropan-carboxilic cu 2,2-DMCPCS.
S-(+)-2,2-DMCPCA optic pur folosește ca material inițial pentru obținerea inhibitorului dehidropeptidază cilastatină, care se administrează în terapie împreună cu antibioticele penem- respectiv carbapenem, pentru a împiedica dezactivarea antibioticelor prin dehidropeptidază în rinichi (EP 048301).
Exemple de microorganisme, care formează o hidrolază stereospecifică pentru R-(-)-2,2-DMCPCA, sunt microorganismele speciei Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-Nr. 6351), Bacterium sp. NSAK:42 (DSM-Nr. 6316), Pseudomonas sp. NSAK:42 [DSM-Nr. 6433) și Comamonas acidovorans TG 308 (DSM-Nr. 6552) precum și descendenții și mutanții acestora. Aceste microorganisme sunt descrise detaliat în cererea de brevet european 92103780,0.
Problema, pe care o rezolvă invenția de față, este punerea la dispoziție prin tehnici DNA recombinant, noi microorganisme ca tulpini de producție, în care capacitatea catalitică, precum și expresia acestei gene de hidrolază să poată fi mărită în mod considerabil față de procedeele cunoscute.
Procedeul conform invenției constă în aceea că din amestecul racemic R,S-(±)-2,2-dimetilciclopropancarboxiamidă se realizează biotransformarea R-(-)-2,2-dimetilciclopropan-carboxiamidei în acid R-(-]-2,2-dimetilciclcpropancarboxilic, cu microorganisme transformate genetic încât să producă o hidrolază stereospecifică, într-un mediu conținând de la 0,2 până la 5% în greutate amestec racemic, la un pH cuprins între 6,0 și 11,0 și la o temperatură de 15 până la 55°C, în urma biotransformării separându-se S-(+)-2,2-dimetilciclopropan-carboxiamida care se izolează.
Fragmentul DNA care codifică pentru o hidrolază stereospecifică, coform invenției, are harta de restricție prezentată în fig.1 și o secvență de nucleotide prezentată în fig.2.
Plasmida hibridă pCAR6, conform invenției, conține fragmentul DNA definit mai sus în vectorul de expresie pBLUESCRIPT-KS+ și prezintă harta de restricție din fig. 2.
Mutantul de Escherichia coli, pentru realizarea procedeului, conform invenției, este transformat cu plasmida pCAR6 definită mai sus și este depusă în colecția DSM sub denumirea Escherichia coli XL1-Blue(DSM-nr.6551).
Mutantul de Escherichia coli, pentru realizarea procedeului, conform invenției, este transformat cu plasmida pCAR6 definită mai sus și este depusă în colecția DSM sub denumirea Escherichia coli DH5(DMS nr. 7053).
Prin aplicarea invenției, se obține avantajul unei sinteze biochimice fine.
Conform invenției, procedeul se realizează în așa fel încât din R,S-(±)-2,2DMCPCA racemic se biotransformă R,S(-)-2,2-DMCPCA cu ajutorul microorganismelor, care sunt transformate cu o genă, care formează o hidrolază stereospecifică, în R-(-)-2,2-DMCPCS, formându-se S-(+]-2,2-DMCPCA optic activ, care se izolează.
Obținerea microorganismelor conform invenției, care formează o hidrolază stereospecifică, poate avea loc în așa fel încât
a) se izolează un DNA care codifică pentru hidrolaza conforTn invenției;
b) se introduce această secvență specifică de genă într-un vector de expresie, formându-se o plasmidă hibridă, putând fi eventual avantajos să se facă în plasmida hibridă alte modificări, care dau posibilitatea unei expresii efective;
c) această plasmidă hibridă se
RO 114152 Bl introduce prin transformare într-un
d) microorganism (tulpină gazdă] adecvat pentru procedeu (transformare
e) acest microorganism transformat formând apoi
f) tulpina de producție pentru procedeul conform invenției (biotransformarea g).
Ca sursă a hidrolazei-DNA, care în cele ce urmează se notează hidrolază DNA [rad] respectiv hidrolază-genă (rad), se poate folosi de exemplu DNA cromosomal al microorganismelor Comamonas acidovorans A: 18 (DSM-Nr. 6351) sau Comamonas acidovorans TG 3D8 (DSMNr. 6552) care au fost deja descrise în cererea de brevet european 92103780,0
De preferință, se folosește ca sursă Comamonas acidovorans A: 18.
Hidrolaza-DNA poate fi izolată dintr-o bancă de gene de Comamonas acidovorans A: 18 în Escherichia coli [E coli] XL1-BlueR cu BLUESCRIPT (BLUESCRIPT-KS+ sau BLUESCRIPT-SK+) (care se poate obține de la Stratagene Co., furnizor Genofit SA, Geneva) ca vector de bancă de gene.
Pentru aceasta, se izolează de exemplu mai întâi DNA cromosomal din Comamonas acidovorans A: 18, pe baza metodei lui R.H.Chesney et al., (J. Mol. Biol. 130 (1979), pag.161...173]. Acești DNA pot fi apoi tăiați cu ajutorul metodelor molecularbiologice obișnuite cu enzimă de restricție EcoRI și apoi să fie inserați în vectorii de expresie DNA pBLUESCRIPT-KS+R tăiați înainte la fel. Apoi acești DNA ligați (amestec de plasmide hibride) pot fi transformați de exemplu după metoda lui S.Fiedler și R.Wirth [Analyt.Biochem. 170 (1988), pag.38...44) în microorganismele E.coli XL1-BlueR competente obișnuite din comerț.
“Screening”-ul băncii de gene poate avea loc și după metode cunoscute în sine. Pentru aceasta, clonele de plasmide hibride se verifică în mod adecvat într-un mediu cu R,S-(±)-2,2DMCPCA ca singură sursă de N, cu o sursă de C, cu un inductor adecvat și cu un antibiotic potrivit capacității lor de creștere. Cu acest “screening” se selectează apoi în mod adecvat clonele de plasmide hibride, care conțin gena hidrolazei (rad) pe DNA de plasmide hibride și sunt capabile să folosească de preferință R-(-)-2,2-DMCPCA ca singură sursă de N. Aceste clone de plasmidă hibridă sunt apoi în situația să hidrolizeze R-(-)-2,2-DMCPCA în acidul corespunzător.
Localizarea genei hidrolazei (rad) are loc apoi în mod adecvat în plasmida hibridă pCAR1 (aleasă din clonele de plasmidă hibridă) care constă din vectorul de expresie BLUESCRIPT-KS+0 si a unui “insert” EcoRI de circa 23 kb.
Localizarea propriu-zisă a genei hidrolazei (rad) are loc apoi în mod adecvat cu hibridizarea “Southern-Blot” cunoscută în sine [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New-York, 1987, paragraful 2.9). Pentru aceasta, se digeră mai întâi în mod adecvat plasmida hibridă pCAR1 cu enzimele de restricție BamHI, Pstl, Pvull și EcoRI. Fragmentele DNA formate în acest caz se hibridizează apoi în mod adecvat în sens invers oligomerilor DNA radioactiv marcați, care corespund secvențelor de proteină cu terminal în N, ale hidrolazei. In acest mod, se poate marca un segment EcoRI-BamHI-DNA cu dimensiunea de 2,3 kb, respectiv un segment de Pvull-BamHI-DNA cu dimensiunea de 1,85 kb pe plasmida hibridă pCAR1.
Oligomerii DNA pentru hibridizare se pot obține după metode obișnuite în domeniu. De exemplu, prin aceea că hidrolaza stereospecifică se îmbogățește cromatografie, se stabilesc aminoacizii N-terminali și apoi se sintetizează și se marchează radioactiv secvența DNA corespunzătoare.
Segmentul acum cunoscut de
DNA care codifică hidrolaza stereospecifică (rad) și a cărui hartă de restricție este arătată în fig. 1, este de asemenea parte componentă a invenției și poate apoi fi izolată cu enzimele de restricție
BamHI și EcoRI, respectiv BamHI și Pvull
RO 114152 Bl din plasmida hibridă pCAR1 după metode obișnuite, de specialitate, pentru a determina, între altele, după analiza secvenței de nucleotide din codul genetic, întreaga secvență de aminoacizi și pentru a obține microorganismele transformate adecvate pentru procedeu.
O parte a invenției este de aceea atât un fragment DNA, care codifică pentru o polipeptidă cu activitate stereospecifică de hidrolază, a cărui secvență de aminoacizi este reprezentată în fig. 3, cât și un fragment DNA, care hibridizează cu fragmentul DNA reprezentat în fig. 3 și codifică pentru această polipeptidă.
Secvența de genă astfel obținută poate fi ligată cu ajutorul unor tehnici obișnuite molecular-biologice cu un vector de expresie tăiat mai înainte în același fel, la o plasmidă hibridă.
Vectorii de expresie conțin în mod obișnuit un promotor adecvat, de cele mai multe ori reglabil (secvență de control a expresiei). In spatele acestui promotor, se află în mod avantajos în direcția de transcripție, unul sau mai multe locuri de tăiere singulare pentru enzime de restricție. In aceste locuri de tăiere, se inserează secțiunea de genă dorită, pentru expresia căreia există interes.
Pentru procedeul conform invenției, se pot aplica fie vectori de expresie cu spectru larg de gazdă (“broad host range”), sau se poate folosi de exemplu vectorul de expresie obișnuit pBLUESCRIPT-KS+R. De preferință, se folosește ca vector de expresie pBLUESCRIPT-KS+R împreună cu promotorul P,ac (promotor de lactoză).
In mod adecvat, vectorul de expresie pBLUESCRIPT-KS+R se taie cu enzimele de restricție EcoRI și BamHI sau cu Pvull și BamHI și capetele de restricție formate se leagă cu segmentul izolat DNA (EcoRI-BamHI sau PvullBamHI), care codifică pentru hidrolaza stereospecifică, prin intermediul de exemplu a T4-DNA-ligazei.
Invenția se mai referă la plasmidele hibride astfel formate, care conțin secvența genei hidrolazei stereo6 specifice (rad).
In principiu, sunt adecvate toate palsmidele hibride, care se pot replica și exprima secvența DNA care codifică hidrolaza conform invenției în microorganismul ales (tulpina de producție).
Hibridplasmidele adecvate conțin de la vectorul lor de expresie inițial un replicon intact și o genă de marcare, care dă posibilitatea selecției și identificării microorganismelor transformate cu plasmida hibridă pe baza unei caracteristici fenotipice. □ genă de marcare adecvată conferă microorganismului de exemplu o rezistență față de antibiotice.
Pentru a ajunge la o expresie eficientă într-o plasmidă hibridă, este potrivit ca gena hidrolazei (rad) să fie dispusă corect (în “fază”) cu promotorul.
Exemplele pentru astfel de plasmide hibride, care se pretează pentru expresia genei hidrolazei într-o tulpină de E.coli, sunt plasmida hibridă pCAR5 și pCAR6, cu gena de marcare bla (conferă rezistență față de ampicilina; ApR) și promotorul Plac. In mod adecvat, plasmida hibridă pCAR5 constă din fragmentul EcoRI-BamHI-DNA cu dimensiunea de 2,3 kb (hartă de restricție în fig. 1) și din vectorul de expresie pBLUESCRIPT-KS+. Plasmida hibridă pCAR6 constă în mod adecvat din fragmentul Pvull-BamHI-DNA cu dimensiunea de 1,85 kb (hartă de restricție în fig. 1) și din vectorul de expresie pBLUESCRIPTKS+.
In mod adecvat, plasmida hibridă pCAR6 se folosește cu promotorul P,ac> expresia genei hidrolazei (rad) fiind indusă în funcție de tulpina gazdă cu izopropiltiogalactozidă (IPTG).
Plasmida hibridă pCAR6 a fost depusă atât la 6.D6.1991 sub Nr.DSM 6551 în E.coli XL-BlueR cât și la 21.04.1992 sub Nr.DSM 7053 în E.coli DH5, în colecția germană pentru microorganisme și culturi de celule GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300
Braunschweig.
Fig. 2 arată o schemă a plasmidei hibride pCAR6.
RO 114152 Bl
Plasmide hibride astfel obținute se introduc în mod adecvat în tulpini gazdă.
In cazul plasmidelor hibride “broad-host-range” (plasmide hibride cu spectru larg de gazdă) se folosesc în mod adecvat tulpini gazdă cu toleranță ridicată la substrat și educt, ca de exemplu, microorganisme din specia Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium sau Escherichia.
In cazul plasmidelor hibride care prezintă un spectru de gazdă îngust, ca de exemplu plasmida hibridă pCAR6, se folosesc în mod adecvat tulpini gazdă în care ele replică.
De preferință, se folosesc așadar ca tulpini pentru plasmida hibridă pCAR6 microorganisme din specia Escherichia, mai ales speciile E.coli care sunt prezentate în tabelul 1.
Transformarea tulpinilor gazdă cu plasmidele hibride are loc după procedee cunoscute. Izolarea tulpinilor gazdă transformate are loc apoi, de preferință, dintr-un mediu de cultură selectiv, căruia i se adaugă antibioticul, împotriva căruia genul de marcare conținut în plasmida hibridă îi conferă o rezistență. Dacă se folosește de preferință plasmida hibridă pCAR6, care conține gena bla, atunci se adaugă mediului de cultură ampicilină.
Toate tulpinile gazdă, care sunt transformate cu o plasmidă hibridă, care conține gena hidrolazei stereospecifică se pot folosi conform invenției ca tulpini de producție. De preferință, ca tulpini de producție se folosesc microorganisme din specia E.coli care sunt prezentate în tabelul 1 și sunt transformate cu plasmida hibridă pCAR6 precum și descendenții și mutanții acestora.
Microorganismele E. coli XL1 -Blue (DSM-Nr.6551) și E.coli DH5 (DMSNr.7053) au fost depuse, așa cum s-a prezentat deja.
Dacă, de exemplu, se folosește
E.coli MC4100 din tabelul 1 (descris în
Mol. Gen. Genet. 192, 1983, pag. 293
...294) ca tulpină gazdă, are loc expresia genei hidrolazei stereospecifice (rad) sub controlul promotorului P,ac constitutiv (permanent) pe baza unei deleții în operon-lac (operon-lactoză) (deleția (arqF-lac) U169). Prin urmare lacrepressorgen Iaci nu se formează (microorganism repressogen-negativ). Dacă se folosesc de exemplu din tabelul 1 E.coli K12 (care se poate obține din DSM-Nr.498) sau E.coli HB101 (H.W.Boyer și D.Roulland-Dussoix, J. Mol. Bio41 (1969), pag. 459...172) ca tulpini gazdă, expresia genei hidrolazei (rad) se introduce cu IPTG, pe baza prezenței repressorgenului Iaci (microorganism repressogen-pozitiv).
Conform invenției, se pot folosi pentru biotransformare toate microorganismele (tulpini de producție), care sunt transformate cu o genă, care formează o hidrolază stereospecifică și cu aceasta, hidrolizează stereospecific R-(-)-
2,2-DMCPCAîn acid.
In mod adecvat, biotransformarea se realizează cu microorganisme, care sunt transformate cu o genă de hidrolază (rad) a cărei hartă de restricție este prezentată în fig. 1. Se pretează și microorganisme, care sunt transformate cu un fragment DNA care codifică pentru o polipeptidă cu activitate stereospecifică de hidrolază, a cărei secvență de aminoacizi este reprezentată în fig. 3. La fel se pretează microorganisme, care sunt transformate cu un fragment DNA care este hibridizat cu fragmentul DNA reprezentat în fig. 3 și care codifică pentru o polipeptidă cu activitate stereospecifică de hidrolază.
Pentru procedeu sunt deosebit de potrivite, așa cum s-a arătat mai înainte, microorganismele din specia E.coli (tabelul 1), transformate cu plasmida hibridă pCAR5 sau pCAR6, mai ales cele care sunt transformate cu plasmida hibridă pCAR6.
La fel de potrivite sunt enzimele lipsite de celule (hidrolazele stereospecifice) din aceste microorganisme. Aceste enzime lipsite de celule se pot obține prin descompunerea obișnuită în specialitate a celulelor de microorganisme. Pentru aceasta, se poate utiliza metoda cu ultrasunete, French-Press
RO 114152 Bl precum și metoda cu lizozimă.
Aceste enzime lipsite de celule pot fi apoi imobilizate pentru realizarea procedeului pe un material purtător adecvat, conform metodelor obișnuite în specialitate.
De preferință, procedeul se realizează cu celule de microorganisme în repaus (celule care nu cresc), care au fost induse în prealabil corespunzător sistemului lor de expresie. Aceasta înseamnă că dacă s-au folosit microorganisme represoogen-pozitive pentru procedeu, cum ar fi E.coli XL1-Blue sau E.coli DH5, care sunt transformate cu plasmida hibridă pCAR6, inducția are loc cu IPTG. Dacă se folosesc pentru procedeu, de exemplu, microorganisme represoogen-negative (adică cu lipsă de repressorgen) din specia E.coli, ca de exemplu E.coli MC4100, expresia genei hidrolazei (rad) are loc permanent (constitutiv] .
Intr-o formă de realizare preferată, activitatea specifică de hidrolază a microorganismelor se mărește cu alcooli (/-(Ξ/
Ca alcooli C^C^, se pot utiliza de exemplu metanol, etanol, propanol, izopropanol sau butanol. De preferință, se folosește metanol sau etanol.
Ca mediu pentru procedeu se pot folosi cele obișnuite în domeniu, ca de exemplu, tampoane de fosfat cu molaritate mică, un mediu de săruri minerale conform Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, (1983), pag. 1...7 sau tamponul HEPES (acidul N-2-hidroxietil-piperazin-2'etansulfonic). De preferință, procedeul se realizează într-un tampon de fosfat cu molaritate mică.
In mod adecvat, mediul pentru biotransformare conține R,S-(±)-2,2DMCPA într-o cantitate de 0,2 până la 5% în greutate, de preferință 0,2 până la 2% în greutate.
In mod adecvat, biotransformarea se realizează într-un interval de pH de 6 până la 11, de preferință într-un interval de pH de 6,5 până la 10.
Temperatura pentru biotransformare se află în mod adecvat între 15 și
55°C, de preferință între 20 și 40°C.
După o durată de reacție obișnuită de 1 până la 30 h, de preferință de 5 până la 25 h, R-(-)-2,2-DMCPA se transformă complet în acidul corespunzător, obținându-se S-(+)-2,2-DMCPA optic pur. S-(+)-2,2-DI\/ICPA astfel obținut se poate apoi obține prin extracție, electrodializă sau prin uscare.
Se dau, în continuare, opt exemple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1...3, care reprezintă:
- fig. 1, harta de restricție a genei;
-fig. 2, schema plasmidei hibride pCAR6;
- fig. 3, atât secvența de aminoacizi, cât și a DNA-ului genei care codifică hidrolaza stereospecifică.
Exemplul 1. Prepararea DNA cromosomal din Comamonas acidovorans A: 18. DNA cromosomal al unei culturi proaspete peste noapte de Comamonas acidovorans A: 18 (100 ml Nutrient Yeasr Broth, 30°C) este izolat după metoda modificată a lui R.H. Chesney etal.,(J. Mol. Biol. 730 (1979], pag. 161...173).
Celulele centrifugate (15 min, 6500xg, 4°C) sunt resuspendate în tampon Tris-HCI (2,25 ml, 0,05 mol/l) pH=8,0, 10% masă/volum zaharoză.
După adaosul a 375 pl soluție de lizozimă (10 mg/ml 0,25 mol/l tampon Tris-HCI, pH=8,0) și 900 pl 0,1 mol/l EDTA, pH=8,0, suspensia se răcește timp de 10 min pe gheață.
După aceea urmează adaosul a 450 pl 5% (m/v) SDS și a 50pl ribonuclează (10 mg/ml H20) și o incubație de 30 min la 37°C. Incubația este continuată după adaosul unui vârf de spatulă de proteinază K și 400 pl pronază (20 ml/ml apă] timp de 2 h.
După amestecul cu 4,3 g CsCI se centrifughează (30 min, 40000 xg, 20°C), se tratează cu 250 pl bromură de etidiu (10 mg/ml) și se centrifughează în ultracentrifugă (Vti 65.2 capilare, peste 8 h, 246000 xg, 20°C). Banda de DNA se absoarbe sub lumină UV cu undă lungă, din capilar, După
RO 114152 Bl adaosul cu un volum de 4 ori mai mare de tampon TE (10 mmol/l Tris-HCI, pH=8,01 mmol/l EDTA) se extrage bromură de etidiu de trei ori cu n-butanol saturat cu apă. DNA este precipitat cu izopropanol, preluat în tamponul TE și incubat la 65°C. Preparatul poate fi păstrat la 4°C.
1.2 Restricția și ligarea DNA cromosomal. 5 pg Comamonas acidovorans A: 18 (DSM. Nr.6315)-DNA și
4,5 pg vector DNA (pBLUESCRIPT-KS+R) se taie fiecare cu 20 unități de enzimă de restricție EcoRI într-un volum total de tampon de restricție de 100 pl (6,5 h, la 37°C). DNA-urile sunt precipitate cu etanol și sunt uscate în concentratorul Speed VacR. Precipitatele se iau și se unifică în tamponul de ligație (20 mmol/l MgCIp, 0,6 mol/l] ATP (trifosfat de adenosină, pH=7,2, volum de ligație 100 pl]. După un adaos de o unitate de T4DNA liqază, se incubează peste noapte la 13°C.
DNA-ul amestecului de ligație s-a precipitat cu izopropanol și s-a preluat în 30 pl apă pentru transformare.
1.3 Transformarea E.coli XL1BlueR și selecția. Celule competente de E.coli XL1-BlueR sunt transformate cu ajutorul electroporației cu amestecul de ligație după metoda descrisă de S.Fiedler și R.Wirth [Analyt. Biochem. 170 (1988), pag. 38...44).
Pentru obținerea plasmidei, se selecționează pe mediul nutritiv agar cu ampicilină (100 pg/ml) și pentru obținerea “insertului” se lucrează cu 0,5 mmol/l IPTG (izopropil-beta-D-tiogalactosidă) și x-Gal (30 pg/ml, 5-brom-4clor-3-indolil-beta-D-galactopiranosidă) cu incubație la 37°C.
La o frecvență de transformare de 1,7 x 108 cfu/ml (“colony forming units” = celule vii) aproape toate clonele au posedat in insert” EcoRI.
Exemplul 2. Screening-ul băncii de gene Comamonas acidovorans A: 18 după gena de amldază R-specifică. Clone cu palsmide hibride (“insert” EcoRI) sunt verificate pe mediu minimal agar după
H.KulIa et al. [Arch. Microbiol. 135 (1983), 1 ...7) cu 0,2% (v/v) glicerină ca sursă de C, 0,15% (m/v) R,S-(±)-2,2DMCPCA ca singură sursă de N și 0,5 mmol/l IPTG ca inductor al lac-promotorului, precum și ampicilină (5 pg/ml) pentru stabilizarea plasmidei, asupra posibilității lor de creștere. Numai clonele care conțin gena hidrolazei rad intactă pe DNA-”insert” în plasmidă, sunt capabile să valorifice R-(-)-2,2DMCPCA ca sursă de N, să transforme aceasta în acidul R- cerut și să crească pe acest mediu minimal. Astfel de clone selecționate au conținut cu toate o plasmidă hibridă din vectorul pBLUESCRIPT-KS+R cu un “insert” EcoRI de circa 23 kb.
Plasmida pCAR1 a fost izolată și caracterizată mai detaliat.
Exemplul 3. Izolarea hidrolazei Rspecifice din Comamonas acidovorans A: 18 și analiza de peptidă N-terminală.
a) Prepararea extractului lipsit de celule. 16 I dintr-o suspensie de celule de Comamonas acidovorans A: 18 (DSMNr. 6315) cu o activitate de hidrolază la 37°C de 0,6 g R-(-)-2,2-DMCPCS/l/h densitate optică la 650 nm (0D650=1 ), care au fost induși mai înainte cu R,S-(±J-
2,2-DMCPCA, sunt concentrați la 700 ml (0D65O=33,5). Apoi celulele sunt centrifugate de mai multe ori, resuspendate în tampon HEPES și apoi preluate în tampon HEPES (40 ml), volumul întregii suspensii de celule fiind apoi de 95 ml (0D650=210]. Activitatea hidrolazei este stabilită la 30°C și este de 0,34g produs/l/h/OD650=1. Apoi celulele sunt descompuse într-o French-press la o presiune de 1200 bari. Pentru a obține un extract lipsit de celule, această suspensie s-a centrifugat la 20000xg timp de 20 min. S-au obținut 50 ml extract cu o cantitate de proteină (măsurată după metoda Bradford) de 39,3mg/ml și cu o activitate de hidrolază la 30°C de 12,5 g R-(-)-2,2-DMCPCS/l/h proteină.
b) Cromatoqrafia. Acest extract de celule brute (50 ml] este introdus într-o coloană umplută cu Q-sepharoză (Pharmacia) care este echilibrată față de un tampon HEPES (0,1 mol/l, pH=7,5).
RO 114152 Bl
Această coloană este spălată încă de două ori cu același tampon și apoi proteinele sunt eluate cu gradient de tampon HEPES (0,1...1 mol/l). In total, se eluează cu tamponul HEPES (0,1 mol/l) 140 ml soluție de proteină cu activitate de hidrolază, care sunt apoi concentrați prin ultrafiltrare (Amicon-Membran YM10). Cantitatea de proteină a acestei soluții de enzimă este de 131 mg/ml, activitatea de hidrolază fiind de 1 pmol/ min/ng proteină.
Apoi 2 ml din această soluție de proteină s-au încărcat într-o coloană umplută cu Superose-12 (Pharmacia), care este echilibrată față de tamponul HEPES (0,1 mol/l, pH=7,5). In total, cu acest tampon, se eluează 36 ml soluție de proteină. Aceasta se concentrează la fel prin ultrafiltrare (Amicon-Membran YM10). Cantitatea de proteină de 20,1 mg/ml, activitatea de hidrolază fiind de
1,2 pmol/min/ng proteină. Soluția de proteină astfel obținută este apoi încărcată într-o coloană umplută cu schimbătorul de anioni Li Chirospher 2000 TMAE (sare de trimetilamoniuetil, Merk), care este echilibrată față de tamponul HEPES (0,1 mol/l, pH=7,5). După spălarea coloanei cu același tampon, soluția de proteină este eluată cu un gradient de NaCI (0...1 mol/l) în același tampon. Concentrația de proteină este de 15 mg/ml, activitatea de hidrolază fiind de
1,2 pmol/min/ng proteină.
c) Identificarea hidrolazei cu ajuoturl electroforezei 1 si 2-dimensionale. In extractul brut de celule, se identifică proteina hidrolază cu ajutorul SDS-PAGE. Pentru aceasta, se compară extractul neindus cu extractul de celulă indus pe SDS-PAGE (inducție cu R,S-[±J-
2,2-DMCPCA).
In extractul de celule indus, s-a evidențiat o bandă de proteină cu o greutate moleculară de 46000. Fracțiunile de proteină obținute prin cromatografie cu activitate de hidrolază, se analizează de asemenea cu ajutorul SDS-PAGE. Proteina cu o greutate moleculară de circa 46000 este îmbogățită prin această purificare cromatică, după a treia cromatografie, ajungându-se la circa 80% îmbogățire. Această probă pură de circa 80% este apoi analizată cu ajutorul electroforezei bidimensionale (2-D SDSPAGE). Prin această metodă, se poate evidenția un “spot” de proteină cu o greutate moleculară de circa 46000, care corespunde hidrolazei.
d) Secventarea. “Spot”-ul de proteină obținut cu ajutorul 2-D SDS-PAGE este apoi pus pe o membrană PVDF (difluorură de poliviniliden) și tăiată din membrană. Apoi această proteină este secvențată direct după metoda lui Hochstrasser et al. [Applied and Theoretical Electrophoresis 7, pag. 73...76, 1988; HDL particle-associated protems in plasma and cerebrospinal fluid}.
După această metodă, se evidențiază 21 aminoacizi (AA) ai secvenței de aminoacizi N-terminali.
Exemplul 4. Localizarea genei de hidrolază [rad] pe fragmentul EcoRI donat.
4.1 Harta grobă de restricție a pCAR1. Prin analiza de restricție după procedeul de până acum [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, paragraful 2), se întocmește o hartă de restricție grobă a pCAR1, respectiv EcoRV, Pvull, Kspl, Smal, Pstl, Stul, BamHI.
4.2 Formularea oligomerilor DNA amestecați pe baza secvenței de peptidă N-terminală a hidrolazei. Pe baza codului genetic, pot fi formulați doi oligomeri de DNA amestecați pentru secvența de peptidă N-terminală a hidrolazei de la Comamonas acidovorans A: 18 și sintetizate cu o mașină de sinteză DNA.
RO 114152 Bl
Oliqomer DNA (amestec)
| T | T | TCT | A | T | T | ||||
| 5' | ATG | AAC | GAC | AGC | GAG | CTC | CAC | CA | 3' |
| C | c | ||||||||
| A | A | ||||||||
| AA | Met | Asn | Asp | Ser | Glu | Leu | His | AA | |
| Oliqomer DNA “antisense” | (amesteci | ||||||||
| A | C | T | T | T | T | ||||
| 5' | TG | GAT | TTC | CCG | CCC | CAC | CTC | 3' | |
| G | G | G | |||||||
| A | A | ||||||||
| AA | Ile | Glu | Arg | Gly | Val | Glu | AA |
4.3 Hibridizarea Southern Blot 15 a fragmentelor de restricție ale plasmei pCAFH. Fragmente DNA separate pe gel de agaroză prin electroforeză (0,6%) care sunt obținute prin restricții diferite (BamHI, Pstl, EcoRI) din pCAR1, sunt 20 trecute pe nitroceluloză prin procedeul cunoscut “Southern Blot” (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, paragraful 2.9ff). 25 □ligomerii DNA sunt marcați final la fel cu [32P]-Gamma-ATP:
400 ng oligomeri DNA, 22 pCi 32 P-Gamma-ATP, 11 unități polinucleotidkinază liberă de fosfat, în total 25 μΙ 3 o tampon de polinucleotidkinază (0,05 mol/l Tris-HCI, pH=7,5, 0,01 mol/l MgCI2, 5 mmoli/1 DTT) sunt incubați timp de 30 min la 37°C. După aceea, se purifică prin filtrare pe gel Sephadex G- 35 25 (Pharmacia) și se hibridizează față de “Southern Blot” prin procedee cunoscute (din literatura citată mai sus).
Prin hibridizare față de secvența de proteină N-terminală a oligomerilor de 4 o nucleotide corespunzătoare, poate fi marcat un fragment EcoRI-BamHI-ADN cu dimensiunea de 2,3 kb sau un fragment Pvull-BamHI-ADN pe plasmida hibridă pCAR1. 45
4.4 Subclonări ale genei de hidrolază (rad). Fragmentul de DNA EcoRIBamHI cu dimensiunea de 2,3 kb, sau un fragmentul de DNA Pvull-BamHI cu dimensiunea de 1,85 kb, care codifică 50 pentru hidrolaza R-specifică din Comamonas acidovorans A: 18, este inserat în vectorul DNA pBLUESCRIPT-
KS+R la fel digerat sau în pBLUESCRIPTSK+R .
Numai o orientare a “insertului” către promotorul Plac arată în clone după inducția IPTG activitatea de hidrolaza cautată.
Vectorul pBLUESCRIPT-KS+R cu fragmentul DNA EcoRI-BamHI cu dimensiunea de 2,3 kb este denumit plasmidă hibridă pCAR6.
Vectorul pBLUESCRIPT-KS+R cu fragmentul DNA Pvull-BamHI cu dimensiunea de 1,85 kb este denumit plasmidă hibridă pCAR5.
Exemplul 5. Determinarea activității R-(-)-2,2-DMCPCA-hidrolazei. Pentru determinarea activității hidrolazei, suspensia de microorganisme este reglată la o densitate optică de 0,5 la 650 nm. Ca mediu, se folosește un tampon de fosfat (10 mmol/l], pH=7,0, cu 0,2% în greutate R,S-(±)-2,2-DMCPCA. Această suspensie este incubată 4 h la 30°C sub scuturare. NH/ pus în libertate sau R-(-)-
2.2- DMCPCA sunt măsurați și activitatea este transformată ca g de R-(-)-2,2DMCPCA exprimată pe l/h/densitate optică la 650 nm, cu condiția, ca 1 mmol de NH4 + format = 1 mmol de R(-)-2,2-DMCPCA, reacționat.
Exemplul 6. Obținerea de S-(+J-
2.2- DMCPCA. E.coli K12 cu plasmida hibridă pCAR6 prezintă în mediu de săruri minerale, conținând 0,2% (v/v) glicerină și 0,15% în greutate R,S-(±J-
2.2- DMCPCA, o activitate specifică de hidrolază de 1,2 g R-(-)-2,2-DMCPCS/ l/h/0D650 după inducția IPTG. Transformarea R-(-)-2,2-DMCPCA în acid R-(-)
RO 114152 Bl este confirmată prin eliberarea de NH4 + și analiza GC. Produsul dorit S-(+)-2,2DMCPCA rămâne neschimbat în amestecul racemic.
Corespunzător cu E. co//'K12 s-au cultivat microorganismele arătate în tabelul 1 și rezultatele au fost reprezentate în același tabel.
Tabelul 1
Activitatea stereospecifică a hidrolazei În diferite tulpini de E. coli
| Tulpina | Activitate specifică g/l/h/OD | Factor în % 41 | Stabilitate | Max. 0D650nm | Activitat e totală g/i/h |
| Comaminas acidovorans (neconform cu invenția) A: 18 11 | 0,5 | 1 | 6 | 3,0 | |
| E.coli K12/pCAR6 1 2) | 1,2 | 2,4 | 90 | nt | - |
| E. coli HB101/pCAR6 21 * | 0,25 | 0,5 | nt | nt | - |
| E.coli MC41OO/pCAR6 31 | 0,53 | 1 | 89 | nt | - |
| E.coli XL1 BLUE/pCAR65) (DSM- Nr.6551) | 0,5 | 1 | 90 | 30 | 15,0 |
| E.coli DH5/pCAR65’ (DSM-Nr.7053) | 2,1 | 4,2 | 100 | 30 | 63,0 |
1) inducție cu amidă; 2) inducție 25 cu IPTG; 3) constitutiv; 4) stabilitatea plasmidei după 24 h, fără selecția antibioticelor, nt=netestat; 5) fără inducție
Exemplul 7. Testul de activitate cu alcooli Cj-C/ Testele de activitate 3 0 sunt efectuate mai întâi cu Comamonas acidovorans A: 18 la 37°C, cu 0,5% R,S-
2,2-DMCPCA în 10 mM tampon de fosfat de potasiu, la pH=7,O, control fără solvent, încercări de testare cu 5 până la 16% în volum solvent. Calculul activității specifice are loc așa cum s-a descris în exemplul 5.
| Solvent (% voi.) | Activitatea pentru transformarea g R,S-2,2DMCPCA/l/h/0D65Onm |
| — | 0,64 |
| Etanol (10) | 1,24 |
| Izopropanol (10) | 1,85 |
| Metanol (5) | 1,79 |
| Metanol (10) | 1,54 |
| Metanol (16) | 1,66 |
2,2-OMCPCA (37°C, 10 mM, tampon de fosfat de potasiu, pH=7,0) se poate
La biotransformările în fermentatorul de 20 I, cu 2 până la 3% R,SRO 114152 Bl obține, cu adaosul de 5...7,5% voi metanol sau etanol o scurtare a duratei de transformare și un randament mai ridicat în R,S-2,2-DMCPCA [mărirea se- lectivității). Același efect se observă la tulpina Eco/AXL1-Blue cu gena de hidrolază. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2.
Tabelul 2 (s-au introdus (în apă) din aceeași tulpină activități egale)
| Tulpina | R,S-2,2DMCPCA (%) | Solvent [% în voi.) | Durata (h) | ee (%) | Randament (%) x) |
| A: 18 | 2,0 | — | 22 | 99 | 41,5 |
| A:18 | 2,3 | metanol (7,5) | 15 | 99,2 | 47 |
| XL1/pCAR6 | 2,8 | — | 24 | 100 | 36 |
| XL1/pCAR6 | 2,8 | metanol (7,5) | 7 | 98,2 | 46 |
| XL1/pCAR6 | 2,8 | etanol (5) | 7 | 98,6 | 44 |
x) de S-(+]-2,2-DMCPCA față de R.S-DMCPCA introdus.
Exemplul 8. Imobilizarea hidrola- 15 zei stereospecifice de E.coli XL1-Blue/ pCAR6. Extractul liber de celule (288 ml) de E.coli XL1-Blue/pCAR6 conținând 28 mg proteină/ml cu o activitate de hidrolază la 37°C de 0,29 pmol R-(-)-2,2- 20 DMCPCA/min mg proteină este mai întâi prepurificat prin cromatografie în coloană de Q-sefaroză (Pharmacia). Apoi proteina de hidrolază este eluată cu un gradient de NaCI (O...1 mol/l) într-un 25 tampon de Tris-HCI (0,1 molar, pH=7,5). Proteina cu activitate de hidrolază care este eluată cu gradientul de NaCI între 40 și 80% este apoi concentrată prin ultrafiltrare (Amicon Membran YM10) și 3 o desărată prin filtrare pe gel [PD-10, Sephadex G-25M, Pharmacia LKB). Volumul final a fost apoi de 47 ml în tampon de fosfat de potasiu (0,1 molar, pH=7,0) conținând 67 mg proteină/ml 35 cu o activitate de hidrolază la 37°C de
0,69 pmol R-(-)-2,2-DIVICPCA/min mg proteină. Apoi această hidrolază stereospecifică prepurificată este imobilizată pe Eupergit C ca material purtător (Rohm Pharma GmbH, Weiterstadt, Germania). In acest caz, grupele de oxiran ale materialului purtător insolubil sunt legate covalent la grupele libere amino ale proteinei de hidrolază. Imobilizarea este efectuată 90 h, la temperatura mediului ambiant în tampon de fosfat de potasiu (1-molar, pH=8,5). Se obțin 10,2 mg proteină imobilizată/g greutate umedă Eupergit C, cu o activitate de hidrolază la 37°C de 1,5 pmol R-(-)-2,2-DMCPCA /min g greutate umedă Eupergit C. Stabilitatea hidrolazei imobilizate la 37°C în tamponul de fosfat de potasiu (10 mmolar, pH=8,5) conținând 0,5% în greutate R,S-(±)-2,2-DMCPCA este reprezentată în tabelul 3.
Tabelul 3
| Durata h | Activitatea hidrolazei imobilizate [ pmol R-(-)-2,2-DIVICPCA/min g greutate în stare uscată Eupergit C) |
| 0...90 | 1,5 |
| 90...185 | 0,68 |
RO 114152 Bl
Claims (14)
- Revendicări1. Procedeu de obținere a S-(+J-
- 2,2-dimetilciclopropan-carboxiamidei, caracterizat prin aceea că, din ames- 5 tecul racemic R,S-(±)-2,2-dimetilciclopropancarboxiamidă, se realizează biotransformarea R-(-)-2,2-dimetilciclopropan-carboxiamidei în acid R-(-]-2,2-dimetilciclopropancarboxilic, cu microorganisme io transformate genetic, încât să producă o hidrolază stereospecifică, într-un mediu conținând de la 0,2 până la 5% în greutate amestec racemic, la un pH cuprins între 6,0 și 11,0 și la o temperatură de 15 15 până la 55°C, în urma biotransformării, separându-se S-(+)-2,2-dimetilciclopropan-carboxiamida, care se izolează.2. Procedeu conform revendicării1, caracterizat prin aceea că, bio- 2o transformarea se realizează cu o hidrolază stereospecifică imobilizată.
- 3. Procedeu conform revendicării1, caracterizat prin aceea că, biotransformarea se realizează cu micro- 25 organisme din speciile Escherichia, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Rhizobium sau Agrobacterium.
- 4. Procedeu conform revendicării1, caracterizat prin aceea că, bio- 3 0 transformarea se realizează cu microorganisme din specia Escherichia coli.
- 5. Procedeu conform revendicării1, caracterizat prin aceea că, biotransformarea se realizează cu micro- 3 5 organisme din specia Escherichia coli XL1-Blue-DSM-nr.6551 sau cu descendenții sau mutanții acesteia.
- 6. Procedeu conform revendicării1, caracterizat prin aceea că, bio- 40 transformarea se realizează cu microorganisme din specia Escherichia coli DH5-DSM-nr.7O53 sau cu descendenții sau mutanții acesteia.
- 7. Fragment DNA care codifică pentru o hidrolază stereospecifică, caracterizat prin aceea că are harta de restricție prezentată în fig. 1 și o secvență de nucleotide prezentată în fig. 3.
- 8. Fragment DNA, conform revendicării 7, caracterizat prin aceea că este conținută în plasmida hibridă pCAR6 depusă în Escherichia coli XL1Blue-DSM-nr.6551.
- 9. Fragment DNA, conform revendicării 7, caracterizat prin aceea că este conținută în plasmida hibridă pCAR6 depusă în Escherichia coli DH5DSM-nr.7O53.
- 10. Plasmidă hibridă pCAR6, caracterizată prin aceea că conține fragmentul DNA definit în revendicarea 7, în vectorul de expresie pBLUESCRIPT-KS+ și prezintă harta de restricție din fig. 2.
- 11. Plasmidă conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că este depusă în Escherichia coli XL1-BlueDSM-nr.6551.
- 12. Plasmidă conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că este depusă în Escherichia coli DH5DSM-nr.7O53.
- 13. Mutant de Escherichia coli, caracterizat prin aceea că este transformat cu plasmida hibridă pCAR6 definită în revendicarea 10 și este depusă în colecția DSM sub denumirea de Escherichia coli XL1-Blue-DSM-nr.6551.
- 14. Mutant de Escherichia coli, caracterizat prin aceea că este transformat cu plasmida hibridă pCAR6 definită în revendicarea 10 și este depusă în colecția DSM sub denumirea de Escherichia coli DH5-DSM-nr.7O53.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH224791 | 1991-07-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO114152B1 true RO114152B1 (ro) | 1999-01-29 |
Family
ID=4229309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO92-01033A RO114152B1 (ro) | 1991-07-26 | 1992-07-24 | PROCEDEU DE OBTINERE A S (+) 2,2 DIMETILCICLOPROPANCARBOXAMIDEI, FRAGMENT DNA CARE CODIFICA PENTRU O HIDROLAZA STEREOSPECIFICA, PLASMIDA HIBRIDA pCAR6, SI MUTANTI DE ESCHERICHIA COLI PENTRU REALIZAREAACESTUI PROCEDEU |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5427934A (ro) |
| EP (1) | EP0524604B1 (ro) |
| JP (1) | JP3217859B2 (ro) |
| AT (1) | ATE172248T1 (ro) |
| CA (1) | CA2074681C (ro) |
| CZ (1) | CZ279498B6 (ro) |
| DE (1) | DE59209523D1 (ro) |
| DK (1) | DK0524604T3 (ro) |
| ES (1) | ES2124714T3 (ro) |
| HU (1) | HU215231B (ro) |
| IE (1) | IE922406A1 (ro) |
| IL (1) | IL102643A0 (ro) |
| MX (1) | MX9204350A (ro) |
| PL (1) | PL170598B1 (ro) |
| RO (1) | RO114152B1 (ro) |
| RU (1) | RU2126450C1 (ro) |
| SK (1) | SK279048B6 (ro) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG72731A1 (en) * | 1996-03-15 | 2000-05-23 | Nabe Seiyaku Co Ltd | Process for preparing optically active trans-3-phenylglycidamide compounds |
| BR0209843A (pt) * | 2001-05-18 | 2004-08-24 | Ranbaxy Lab Ltd | Processo para a preparação de cilastatina sódica amorfa |
| KR100511534B1 (ko) * | 2002-07-05 | 2005-08-31 | 임광민 | 아미드 화합물의 새로운 제조방법 |
| KR100650797B1 (ko) * | 2005-12-12 | 2006-11-27 | (주)케미코월드 | 광학활성 사이클로프로판 카복사미드의 제조방법 |
| CN102250934A (zh) * | 2010-05-17 | 2011-11-23 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种酰胺水解酶的高效表达及应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2511867A (en) * | 1949-12-19 | 1950-06-20 | Method fob separating enantiomers | |
| US3897308A (en) * | 1971-05-07 | 1975-07-29 | Exxon Research Engineering Co | Immobilized enzymes and method for preparation |
| JPS5685298A (en) * | 1979-12-14 | 1981-07-11 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Preparation of 7-aminocephem compound |
| DE48301T1 (de) * | 1980-09-24 | 1983-01-20 | Merck & Co., Inc., 07065 Rahway, N.J. | 2-(cyclopropancarboxamido)-2-alkensaeuren, deren ester und salze und daraus bestehende bakterienhemmende zusammensetzungen mit einer verbindung des typs thienamycin. |
| JPS6056936A (ja) * | 1983-09-06 | 1985-04-02 | Sumitomo Chem Co Ltd | 光学活性２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸及びその誘導体の製法 |
| EP0488999B1 (en) * | 1986-04-16 | 1997-07-09 | Sumitomo Chemical Company Limited | A method for producing optically active cyclopropane carboxylic acid |
| DE3929570A1 (de) * | 1989-09-06 | 1991-03-07 | Degussa | Mikrobiologisch hergestellte n-acyl-l-prolin-acylase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung |
| FR2655660B1 (fr) * | 1989-12-11 | 1992-03-20 | Rhone Poulenc Sante | Nouveaux polypeptides, sequences d'adn permettant leur expression, procede de preparation et leur utilisation. |
| CA2056840A1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-06-18 | Thomas Meul | Process for the production of dimethylcyclopropanecarboxylic acid |
| RU2096460C1 (ru) * | 1991-03-06 | 1997-11-20 | Лонца Аг | Способ получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида, штаммы бактерий comamonas acidovorans, pseudomonas sp., bacterium sp., предназначенные для получения s-(+)-2,2-диметилциклопропанкарбоксамида (варианты) |
-
1992
- 1992-07-21 EP EP92112446A patent/EP0524604B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-21 DE DE59209523T patent/DE59209523D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-21 AT AT92112446T patent/ATE172248T1/de active
- 1992-07-21 ES ES92112446T patent/ES2124714T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-21 DK DK92112446T patent/DK0524604T3/da active
- 1992-07-23 IE IE240692A patent/IE922406A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 CZ CS922323A patent/CZ279498B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 US US07/918,023 patent/US5427934A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-24 PL PL92295408A patent/PL170598B1/pl unknown
- 1992-07-24 HU HU9202439A patent/HU215231B/hu unknown
- 1992-07-24 RO RO92-01033A patent/RO114152B1/ro unknown
- 1992-07-24 RU SU5052419A patent/RU2126450C1/ru active
- 1992-07-24 JP JP19871792A patent/JP3217859B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-24 SK SK2323-92A patent/SK279048B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 MX MX9204350A patent/MX9204350A/es unknown
- 1992-07-26 IL IL102643A patent/IL102643A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-07-27 CA CA002074681A patent/CA2074681C/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL170598B1 (pl) | 1997-01-31 |
| EP0524604A3 (ro) | 1994-05-04 |
| MX9204350A (es) | 1993-02-01 |
| DK0524604T3 (da) | 1999-06-23 |
| IE922406A1 (en) | 1993-01-27 |
| HU215231B (hu) | 1999-01-28 |
| IL102643A0 (en) | 1993-01-14 |
| CA2074681C (en) | 2000-11-28 |
| CZ279498B6 (cs) | 1995-05-17 |
| HUT67687A (en) | 1995-04-28 |
| US5427934A (en) | 1995-06-27 |
| EP0524604A2 (de) | 1993-01-27 |
| PL295408A1 (en) | 1993-03-22 |
| JP3217859B2 (ja) | 2001-10-15 |
| ATE172248T1 (de) | 1998-10-15 |
| CA2074681A1 (en) | 1993-01-27 |
| ES2124714T3 (es) | 1999-02-16 |
| CZ232392A3 (en) | 1993-02-17 |
| DE59209523D1 (de) | 1998-11-19 |
| HU9202439D0 (en) | 1992-10-28 |
| JPH05236993A (ja) | 1993-09-17 |
| SK279048B6 (sk) | 1998-06-03 |
| RU2126450C1 (ru) | 1999-02-20 |
| SK232392A3 (en) | 1995-11-08 |
| EP0524604B1 (de) | 1998-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Beaty et al. | Tzs, a nopaline Ti plasmid gene from Agrobacterium tumefaciens associated with trans-zeatin biosynthesis | |
| EP2612913B1 (en) | Novel hydrolase protein | |
| KR100312456B1 (ko) | 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자 | |
| CN114350692A (zh) | 一种全细胞催化制备脱羧肌肽的方法 | |
| AU631696B2 (en) | Novel polypeptides, the DNA sequences allowing their expression, method of preparation, and utilization | |
| HU194316B (en) | Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone | |
| ES2296350T3 (es) | Vector de alta expresion en escherichia coli. | |
| Tokuyama et al. | Overexpression of the gene for N-acylamino acid racemase from Amycolatopsis sp. TS-1-60 in Escherichia coli and continuous production of optically active methionine by a bioreactor | |
| JP3036775B2 (ja) | ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼの製造法 | |
| RO114152B1 (ro) | PROCEDEU DE OBTINERE A S (+) 2,2 DIMETILCICLOPROPANCARBOXAMIDEI, FRAGMENT DNA CARE CODIFICA PENTRU O HIDROLAZA STEREOSPECIFICA, PLASMIDA HIBRIDA pCAR6, SI MUTANTI DE ESCHERICHIA COLI PENTRU REALIZAREAACESTUI PROCEDEU | |
| CN110423787B (zh) | 一种均一性褐藻三糖的制备方法 | |
| KR102433234B1 (ko) | L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-시트룰린의 생산 방법 | |
| KR940005598B1 (ko) | 아스코르빈산-2-인산의 제조법 | |
| AU637317B2 (en) | Gene and gene product for preparing beta-lactam compounds | |
| JPH07213280A (ja) | 耐熱性エステラーゼ | |
| KR100449456B1 (ko) | 신규한 ｄ-입체특이적 아미노산 아미다아제, 그의 유전자, 그의 제조방법, 이를 이용한 ｄ-아미노산의 제조방법 | |
| CN114181288A (zh) | 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质 | |
| US4988622A (en) | Recombinant plasmid DNA pVN 22 coding biosynthesis of human leukocyte interferon alpha-I1 and strain Pseudomonas sp. 31 (pVN 22) - producer of human leukocyte interferon alpha-I1 containing same | |
| JPH07222587A (ja) | 新規セファロスポリンｃアシラーゼ及びその製造方法 | |
| JP3012919B2 (ja) | アミノアシラーゼおよびカルボキシペプチダーゼ活性を有する耐熱性酵素、及びそれをコードする遺伝子 | |
| RU2081172C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк pesg, способ получения рекомбинантной плазмидной днк pesg и штамм бактерий escherichia coli, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pesg, используемый для получения гибридного белка, состоящего из 485 а.к., обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеина вируса т-клеточного лейкоза человека первого типа | |
| HU223164B1 (hu) | S-(+)-2,2-dimetil-ciklopropánkarboxamid előállítására képes transzformált mikroorganizmusok, valamint előállításukhoz alkalmas hibridplazmidok és DNS-fragmensek | |
| JPH08205864A (ja) | 新規セファロスポリンｃアシラーゼおよびその製造方法 | |
| JPH08238087A (ja) | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 | |
| JP2961245B2 (ja) | 耐熱性アシルペプチド加水分解酵素、及びそれをコードする遺伝子 |