JP3217859B2 - 微生物によるｓ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの遺伝子工学的製造方法 - Google Patents
微生物によるｓ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドの遺伝子工学的製造方法Info
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Description
【０００１】本発明は、本方法に適した新規な微生物に
よるＳ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカル
ボキサミドの新規な製造方法に関する。 これらの微生
物は、立体特異性加水分解酵素を形成する新規な遺伝子
で形質転換してあり、そのためにラセミ性Ｒ，Ｓ−
（±）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ド中でＲ−（−）−異性体を相当する酸に生物変換する
ことができ、その際光学活性のＳ−（＋）−２，２−ジ
メチルシクロプロパンカルボキサミドが沈殿する。
よるＳ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプロパンカル
ボキサミドの新規な製造方法に関する。 これらの微生
物は、立体特異性加水分解酵素を形成する新規な遺伝子
で形質転換してあり、そのためにラセミ性Ｒ，Ｓ−
（±）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミ
ド中でＲ−（−）−異性体を相当する酸に生物変換する
ことができ、その際光学活性のＳ−（＋）−２，２−ジ
メチルシクロプロパンカルボキサミドが沈殿する。
【０００２】以下、２，２−ジメチルシクロプロパンカ
ルボキサミドを「２，２−ＤＭＣＰＣＡ」と、２，２−
ジメチルシクロプロパンカルボン酸を「２，２−ＤＭＣ
ＰＣＳ」と略称する。
ルボキサミドを「２，２−ＤＭＣＰＣＡ」と、２，２−
ジメチルシクロプロパンカルボン酸を「２，２−ＤＭＣ
ＰＣＳ」と略称する。
【０００３】光学的に純粋なＳ−（＋）−２，２−ＤＭ
ＣＰＣＡは、腎臓における腎臓デヒドロペプチダーゼに
よる抗生物質の活性低下を防止するために、ペネム−な
いしカルバペネム抗生物質とともに投与される、デヒド
ロペプチダーゼ抑制剤であるシラスタチンを製造するた
めの原料として使用される（文献ＥＰ０４８３０１）。
Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡのための立体特異
性加水分解酵素を形成する微生物の例としては、コマモ
ナス・アシドボランスＡ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３５
１）、バクテリウムｓｐＶＩＩＩ：ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．６３１６）、シュードモナスｓｐ．ＮＳＡＫ：４２
（ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３）およびコマモナス・アシド
ボランスＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）の種の
微生物、ならびにそれらの子孫および突然変異体があ
る。 これらの微生物はすでにヨーロッパ特許出願９２
１０３７８０．０に詳細に記載されている。
ＣＰＣＡは、腎臓における腎臓デヒドロペプチダーゼに
よる抗生物質の活性低下を防止するために、ペネム−な
いしカルバペネム抗生物質とともに投与される、デヒド
ロペプチダーゼ抑制剤であるシラスタチンを製造するた
めの原料として使用される（文献ＥＰ０４８３０１）。
Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡのための立体特異
性加水分解酵素を形成する微生物の例としては、コマモ
ナス・アシドボランスＡ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３５
１）、バクテリウムｓｐＶＩＩＩ：ＩＩ（ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．６３１６）、シュードモナスｓｐ．ＮＳＡＫ：４２
（ＤＳＭ−Ｎｏ．６４３３）およびコマモナス・アシド
ボランスＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）の種の
微生物、ならびにそれらの子孫および突然変異体があ
る。 これらの微生物はすでにヨーロッパ特許出願９２
１０３７８０．０に詳細に記載されている。
【０００４】本発明の課題は、触媒能力ならびにこの加
水分解酵素−遺伝子の発現を既知の方法より著しく高め
ることができる新規な微生物を組換えＤＮＡ技術により
生産品種として提供することである。
水分解酵素−遺伝子の発現を既知の方法より著しく高め
ることができる新規な微生物を組換えＤＮＡ技術により
生産品種として提供することである。
【０００５】本発明により、この課題は、加水分解酵素
−遺伝子に関して暗号付けする新規なＤＮＡにより、こ
のＤＮＡを含む新規なハイブリッドプラスミドにより、
このハイブリッドプラスミドで形質転換した新規な微生
物により、および新規な方法により解決される。
−遺伝子に関して暗号付けする新規なＤＮＡにより、こ
のＤＮＡを含む新規なハイブリッドプラスミドにより、
このハイブリッドプラスミドで形質転換した新規な微生
物により、および新規な方法により解決される。
【０００６】この方法は、本発明により、ラセミ性Ｒ，
Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ中でＲ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡを、立体特異性加水分解酵素を形
成する遺伝子で形質転換してある微生物によりＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに生物変換し、その際光
学活性のＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する
ので、これを分離するように行なう。
Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ中でＲ−（−）−
２，２−ＤＭＣＰＣＡを、立体特異性加水分解酵素を形
成する遺伝子で形質転換してある微生物によりＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳに生物変換し、その際光
学活性のＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する
ので、これを分離するように行なう。
【０００７】形質転換した微生物の 製造 本発明の、立体特異性加水分解酵素を形成する微生物の
製造は、 ａ）本発明の加水分解酵素に関して暗号付けするＤＮＡ
を分離し、 ｂ）この特殊な遺伝子配列を発現ベクター中に導入し、
その際ハイブリッドプラスミドが発生し、その際そのハ
イブリッドプラスミド中でさらに、効果的な発現を可能
にする変性を行なうのが有利な場合があり、 ｃ）このハイブリッドプラスミドを形質転換により、本
発明にとって好適な ｄ）微生物（宿主）中に導入し（形質転換ｅ）、次いで
この形質転換した微生物が ｆ）本発明の方法のための生産品種を（生物変換ｇ）形
成することにより行なう。
製造は、 ａ）本発明の加水分解酵素に関して暗号付けするＤＮＡ
を分離し、 ｂ）この特殊な遺伝子配列を発現ベクター中に導入し、
その際ハイブリッドプラスミドが発生し、その際そのハ
イブリッドプラスミド中でさらに、効果的な発現を可能
にする変性を行なうのが有利な場合があり、 ｃ）このハイブリッドプラスミドを形質転換により、本
発明にとって好適な ｄ）微生物（宿主）中に導入し（形質転換ｅ）、次いで
この形質転換した微生物が ｆ）本発明の方法のための生産品種を（生物変換ｇ）形
成することにより行なう。
【０００８】ａ）立体特異性加水分解酵素−ＤＮＡの分
離 加水分解酵素−ＤＮＡ（以下、「加水分解酵素−ＤＮＡ
（ｒａｄ）」ないし「加水分解酵素−遺伝子（ｒａ
ｄ）」と呼ぶ）の供給源としては、たとえばすでにヨー
ロッパ特許出願９２１０３７８０．０に記載されてい
る、微生物コマ モナス・アシドボランスＡ：１８（ＤＳ
Ｍ−Ｎｏ．６３１５）またはコマモナス・アシドボラン
スＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）の染色体ＤＮ
Ａを使用することができる。
離 加水分解酵素−ＤＮＡ（以下、「加水分解酵素−ＤＮＡ
（ｒａｄ）」ないし「加水分解酵素−遺伝子（ｒａ
ｄ）」と呼ぶ）の供給源としては、たとえばすでにヨー
ロッパ特許出願９２１０３７８０．０に記載されてい
る、微生物コマ モナス・アシドボランスＡ：１８（ＤＳ
Ｍ−Ｎｏ．６３１５）またはコマモナス・アシドボラン
スＴＧ３０８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５２）の染色体ＤＮ
Ａを使用することができる。
【０００９】好ましくは、供給源としてコマモナス・ ア
シドボランスＡ：１８を使用する。加水分解酵素−ＤＮ
Ａは、コマモナス・アシドボランスＡ：１８の直線遺伝
子バンクから、市販の遺伝子バンク−ベクターとしてＢ
ＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｒ）（ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｋ
Ｓ＋またはＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＫ＋）（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．、納入業者Ｇｅｎｏｆｉｔ Ｓ
Ａ、Ｇｅｎｆから入手可能）を有するエシェリシア・コ
リ（Ｅ．コリ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｒ）中に分離するこ
とができる。
シドボランスＡ：１８を使用する。加水分解酵素−ＤＮ
Ａは、コマモナス・アシドボランスＡ：１８の直線遺伝
子バンクから、市販の遺伝子バンク−ベクターとしてＢ
ＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｒ）（ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｋ
Ｓ＋またはＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＫ＋）（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．、納入業者Ｇｅｎｏｆｉｔ Ｓ
Ａ、Ｇｅｎｆから入手可能）を有するエシェリシア・コ
リ（Ｅ．コリ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｒ）中に分離するこ
とができる。
【００１０】これには、たとえばまずコマモナス・アシ
ドボランスＡ：１８の染色体ＤＮＡをＲ．Ｈ．チェスニ
ーらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０（１９７
９）、１６１〜１７３頁）に準じて分離する。 次い
で、このＤＮＡを通常の分子生物学的方法により制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、続いて前もって同様に切断して
おいた発現ベクター−ＤＮＡ ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ
−ＫＳ＋Ｒ中に入れることができる。続いて、この結合
したＤＮＡ（ハイブリッドプラスミド混合物）をたとえ
ばＳ．フィードラーおよびＲ．ウィルスの方法〔Ａｎａ
ｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０（１９８８）、３８〜
４４頁〕により、好適な市販の微生物Ｅ．コリＸＬ１−
Ｂｌｕｅ（Ｒ）中に形質転換することができる。
ドボランスＡ：１８の染色体ＤＮＡをＲ．Ｈ．チェスニ
ーらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３０（１９７
９）、１６１〜１７３頁）に準じて分離する。 次い
で、このＤＮＡを通常の分子生物学的方法により制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、続いて前もって同様に切断して
おいた発現ベクター−ＤＮＡ ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ
−ＫＳ＋Ｒ中に入れることができる。続いて、この結合
したＤＮＡ（ハイブリッドプラスミド混合物）をたとえ
ばＳ．フィードラーおよびＲ．ウィルスの方法〔Ａｎａ
ｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０（１９８８）、３８〜
４４頁〕により、好適な市販の微生物Ｅ．コリＸＬ１−
Ｂｌｕｅ（Ｒ）中に形質転換することができる。
【００１１】遺伝子バンクの「スクリーニング」も、そ
れ自体既知の方法により行なうことができる。 このた
めに、ハイブリッドプラスミド−クローンを、唯一のＮ
供給源としてＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ、
通常のＣ供給源、好適な誘導物質および好適な抗生物質
を有する好適な培養基中で、その成長能力について検査
するのが有利である。 この「スクリーニング」によ
り、ハイブリッドプラスミド−ＤＮＡ上に活性加水分解
酵素−遺伝子を含み、それによって好ましくは唯一のＮ
供給源としてＲ，Ｓ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを
利用できるハイブリッドプラスミド−クローンを選択す
る。 次いで、このハイブリッドプラスミド−クローン
がＲ，Ｓ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを相当する酸
に加水分解する。
れ自体既知の方法により行なうことができる。 このた
めに、ハイブリッドプラスミド−クローンを、唯一のＮ
供給源としてＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ、
通常のＣ供給源、好適な誘導物質および好適な抗生物質
を有する好適な培養基中で、その成長能力について検査
するのが有利である。 この「スクリーニング」によ
り、ハイブリッドプラスミド−ＤＮＡ上に活性加水分解
酵素−遺伝子を含み、それによって好ましくは唯一のＮ
供給源としてＲ，Ｓ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを
利用できるハイブリッドプラスミド−クローンを選択す
る。 次いで、このハイブリッドプラスミド−クローン
がＲ，Ｓ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを相当する酸
に加水分解する。
【００１２】次いで、加水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）
の局在化を、発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｋ
Ｓ＋Ｒおよび約２３ｋｂのＥｃｏＲＩ−「挿入」からな
るハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ１（ハイブリッドプ
ラスミド−クローンから選択）中で行なうのが有利であ
る。
の局在化を、発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｋ
Ｓ＋Ｒおよび約２３ｋｂのＥｃｏＲＩ−「挿入」からな
るハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ１（ハイブリッドプ
ラスミド−クローンから選択）中で行なうのが有利であ
る。
【００１３】次いで本来の加水分解酵素−遺伝子（ｒａ
ｄ）の局在化を、それ自体既知の「サザーン−ブロッ
ト」−ハイブリダイゼーション〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ 『分子生物学における現況』，ジョン・ウイリー
・アンド・サンズ，ニューヨーク，１９８７、２．９
章〕により行なう。 これにはまずハイブリッドプラス
ミドｐＣＡＲ１を制限酵素ＢａｍＨ１、ＰｓｔＩ、Ｐｖ
ｕＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化するのが有利である。そ
の際、生じたＤＮＡ−断片を好ましくは、加水分解酵素
のＮ−末端タンパク質配列に相当する、放射性標識を付
けたＤＮＡ−オリゴマーに対してハイブリダイゼーショ
ンする。 このようにして、２．３ｋｂ大のＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片ないし１．８５ｋｂ大のＰ
ｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ断片が、ハイブリッドプ
ラスミドｐＣＡＲ１上に標識付けされる。
ｄ）の局在化を、それ自体既知の「サザーン−ブロッ
ト」−ハイブリダイゼーション〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ 『分子生物学における現況』，ジョン・ウイリー
・アンド・サンズ，ニューヨーク，１９８７、２．９
章〕により行なう。 これにはまずハイブリッドプラス
ミドｐＣＡＲ１を制限酵素ＢａｍＨ１、ＰｓｔＩ、Ｐｖ
ｕＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化するのが有利である。そ
の際、生じたＤＮＡ−断片を好ましくは、加水分解酵素
のＮ−末端タンパク質配列に相当する、放射性標識を付
けたＤＮＡ−オリゴマーに対してハイブリダイゼーショ
ンする。 このようにして、２．３ｋｂ大のＥｃｏＲＩ
−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片ないし１．８５ｋｂ大のＰ
ｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ断片が、ハイブリッドプ
ラスミドｐＣＡＲ１上に標識付けされる。
【００１４】ハイブリダイゼーションのためのＤＮＡ−
オリゴマーは、専門家には一般的な方法により得ること
ができる。 たとえば、立体特異性加水分解酵素をクロ
マトグラフィーにより濃縮し、Ｎ−末端アミノ酸を決定
し、次いで相当するＤＮＡ配列を合成し、放射性標識を
付ける。 ここで、立体特異性加水分解酵素（ｒａｄ）
に関して暗号付けし、その制限地図を図１に示すＤＮＡ
断片も同様に本発明の構成要素であり、とりわけヌクレ
オチド配列の分析により遺伝コードを経由してアミノ酸
配列全体を決定するために、および本方法に好適な形質
転換微生物を製造するために、制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩにより
ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ１から専門家には一般
的な方法により分離することができる。
オリゴマーは、専門家には一般的な方法により得ること
ができる。 たとえば、立体特異性加水分解酵素をクロ
マトグラフィーにより濃縮し、Ｎ−末端アミノ酸を決定
し、次いで相当するＤＮＡ配列を合成し、放射性標識を
付ける。 ここで、立体特異性加水分解酵素（ｒａｄ）
に関して暗号付けし、その制限地図を図１に示すＤＮＡ
断片も同様に本発明の構成要素であり、とりわけヌクレ
オチド配列の分析により遺伝コードを経由してアミノ酸
配列全体を決定するために、および本方法に好適な形質
転換微生物を製造するために、制限酵素ＢａｍＨＩおよ
びＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩにより
ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ１から専門家には一般
的な方法により分離することができる。
【００１５】したがって、アミノ酸配列を図３に示す、
立体特異性加水分解酵素活性を備えたポリペプチドに関
して暗号付けするＤＮＡ断片も、図３に示すＤＮＡ断片
でハイブリッド化し、このポリペプチドに関して暗号付
けするＤＮＡ断片も本発明の構成要素である。
立体特異性加水分解酵素活性を備えたポリペプチドに関
して暗号付けするＤＮＡ断片も、図３に示すＤＮＡ断片
でハイブリッド化し、このポリペプチドに関して暗号付
けするＤＮＡ断片も本発明の構成要素である。
【００１６】ｂ）発現ベクターにおける特異性遺伝子配
列（加水分解酵素−遺伝子；ｒａｄ）の結合 そのようにして得られた遺伝子配列を、通常の分子生物
学的技術により、前もって同じように切断しておいた発
現ベクター−ＤＮＡと結合させて、ハイブリッドプラス
ミドにすることができる。
列（加水分解酵素−遺伝子；ｒａｄ）の結合 そのようにして得られた遺伝子配列を、通常の分子生物
学的技術により、前もって同じように切断しておいた発
現ベクター−ＤＮＡと結合させて、ハイブリッドプラス
ミドにすることができる。
【００１７】発現ベクターは、通常、好適な多くの場合
調整可能なプロモーターを含む（発現制御配列）。 こ
のプロモーターの後に、好ましくは転写方向に一つ以上
の、制限酵素のための単一切断位置がある。 通常、こ
れらの切断位置に、発現させるべき望ましい遺伝子断片
を挿入する。
調整可能なプロモーターを含む（発現制御配列）。 こ
のプロモーターの後に、好ましくは転写方向に一つ以上
の、制限酵素のための単一切断位置がある。 通常、こ
れらの切断位置に、発現させるべき望ましい遺伝子断片
を挿入する。
【００１８】本発明の方法には、広い宿主範囲を有する
発現ベクターを使用するか、あるいは、たとえば市販の
発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒを使用
することができる。 好ましくは発現ベクターとして、
プロモーターＰＬａｃ（ラクトース−プロモーター）を
有するｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒを使用する。
発現ベクターを使用するか、あるいは、たとえば市販の
発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒを使用
することができる。 好ましくは発現ベクターとして、
プロモーターＰＬａｃ（ラクトース−プロモーター）を
有するｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒを使用する。
【００１９】発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−Ｋ
Ｓ＋Ｒは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩまたは
ＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、生じた制限末端
を、分離した、立体特異性加水分解酵素に関して暗号付
けするＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩまたはＰｖ
ｕＩＩ−ＢａｍＨＩ）と、たとえばＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼで結合するのが有利である。
Ｓ＋Ｒは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩまたは
ＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、生じた制限末端
を、分離した、立体特異性加水分解酵素に関して暗号付
けするＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩまたはＰｖ
ｕＩＩ−ＢａｍＨＩ）と、たとえばＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼで結合するのが有利である。
【００２０】ｃ）ハイブリッドプラスミド 本発明はさらに、そのようにして生じた、立体特異性加
水分解酵素−遺伝子配列（ｒａｄ）を含むハイブリッド
プラスミドに関する。
水分解酵素−遺伝子配列（ｒａｄ）を含むハイブリッド
プラスミドに関する。
【００２１】基本的に、本発明の加水分解酵素に関して
暗号付けするＤＮＡ配列を、選択した微生物中で複製し
発現させることができる、すべてのハイブリッドプラス
ミドが適している。
暗号付けするＤＮＡ配列を、選択した微生物中で複製し
発現させることができる、すべてのハイブリッドプラス
ミドが適している。
【００２２】好適なハイブリッドプラスミドは、その本
来の発現ベクターから、完全なレプリコン、およびその
ハイブリッドプラスミドにより形質転換した微生物を表
現型特徴に基づいて選択および確認できる標識遺伝子を
含む。 好適な標識遺伝子は微生物にたとえば抗生物質
に対する耐性を付与する。
来の発現ベクターから、完全なレプリコン、およびその
ハイブリッドプラスミドにより形質転換した微生物を表
現型特徴に基づいて選択および確認できる標識遺伝子を
含む。 好適な標識遺伝子は微生物にたとえば抗生物質
に対する耐性を付与する。
【００２３】ハイブリッドプラスミド中で効果的な発現
を達成するには、加水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）が正
しく（「相」の中で）プロモーターと配列しているのが
有利である。
を達成するには、加水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）が正
しく（「相」の中で）プロモーターと配列しているのが
有利である。
【００２４】Ｅ．コリ中で加水分解酵素−遺伝子を発現
させるのに好適な、そのようなハイブリッドプラスミド
の例は、標識遺伝子ｂｌａ（アンピシリンに対する耐性
を与える；Ａｐ（Ｒ））およびプロモーターＰＬａｃを
有するハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ５およびｐＣＡ
Ｒ６である。 好ましくはｐＣＡＲ５ は、２．３ｋｂ
大のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片（制限地図
図１）および発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−
ＫＳ＋からなる。 好ましくはｐＣＡＲ５は、１．８５
ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片（制限
地図 図１）および発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰ
Ｔ−ＫＳ＋からなる。
させるのに好適な、そのようなハイブリッドプラスミド
の例は、標識遺伝子ｂｌａ（アンピシリンに対する耐性
を与える；Ａｐ（Ｒ））およびプロモーターＰＬａｃを
有するハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ５およびｐＣＡ
Ｒ６である。 好ましくはｐＣＡＲ５ は、２．３ｋｂ
大のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片（制限地図
図１）および発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−
ＫＳ＋からなる。 好ましくはｐＣＡＲ５は、１．８５
ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片（制限
地図 図１）および発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰ
Ｔ−ＫＳ＋からなる。
【００２５】プロモーターＰＬａｃを有するハイブリッ
ドプラスミドｐＣＡＲ６を使用するのが有利であるが、
その場合加水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）の発現は、イ
ソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を有する宿主
品種により誘導される。
ドプラスミドｐＣＡＲ６を使用するのが有利であるが、
その場合加水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）の発現は、イ
ソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を有する宿主
品種により誘導される。
【００２６】ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６は、１
９９１年６月６日にＤＳＭ−Ｎｏ．６５５１でＥ．コリ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｒ）中で、１９９２年４月２１日に
ＤＳＭ−Ｎｏ．７０５３でＥ．コリＤＨ５中で、ドイチ
ェン・ザムルング・フュア・ミクロオルガニズメン・ウ
ント・ツェルクルトゥーレン・ＧｍｂＨ，マシェローデ
ヴェーク１ｂ，Ｄ−３３００，ブラウンシュバイクに寄
託してある。 図２はハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ
６の図式を示す。
９９１年６月６日にＤＳＭ−Ｎｏ．６５５１でＥ．コリ
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｒ）中で、１９９２年４月２１日に
ＤＳＭ−Ｎｏ．７０５３でＥ．コリＤＨ５中で、ドイチ
ェン・ザムルング・フュア・ミクロオルガニズメン・ウ
ント・ツェルクルトゥーレン・ＧｍｂＨ，マシェローデ
ヴェーク１ｂ，Ｄ−３３００，ブラウンシュバイクに寄
託してある。 図２はハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ
６の図式を示す。
【００２７】ｄ）宿主品種 そのようにして得られたハイブリッドプラスミドを、宿
主品種に導入する。
主品種に導入する。
【００２８】「広い宿主範囲」を有するハイブリッドプ
ラスミドの場合には、基質耐性および抽出物耐性の高い
宿主品種、たとえばシュードモナス、コマモナス、アシ
ネトバクター、リゾビ ウム、アグロバクテリウムまたは
エシェリシア 属の微生物を使用するのが有利である。
宿主範囲のせまいハイブリッドプラスミド、たとえば
ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６の場合には、通常、
それが複製する特殊な宿主品種を使用する。
ラスミドの場合には、基質耐性および抽出物耐性の高い
宿主品種、たとえばシュードモナス、コマモナス、アシ
ネトバクター、リゾビ ウム、アグロバクテリウムまたは
エシェリシア 属の微生物を使用するのが有利である。
宿主範囲のせまいハイブリッドプラスミド、たとえば
ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６の場合には、通常、
それが複製する特殊な宿主品種を使用する。
【００２９】したがって、好ましくはハイブリッドプラ
スミドｐＣＡＲ６にはエシェリシア属の微生物、特に表
１に示すＥ．コリ品種の微生物を使用する。
スミドｐＣＡＲ６にはエシェリシア属の微生物、特に表
１に示すＥ．コリ品種の微生物を使用する。
【００３０】ｅ）形質転換 本発明のハイブリッドプラスミドを有する宿主品種の形
質転換は、既知の方法によって行なう。 次いで形質転
換した宿主品種の分離は、ハイブリッドプラスミド中に
含まれる標識遺伝子が耐性を与える抗生物質を加えた選
択性栄養培養基から行なうのが好ましい。 ｂｌａ−遺
伝子を含むハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６を使用す
るのが好ましい場合、それに応じて栄養培養基にアンピ
シリンを加える。
質転換は、既知の方法によって行なう。 次いで形質転
換した宿主品種の分離は、ハイブリッドプラスミド中に
含まれる標識遺伝子が耐性を与える抗生物質を加えた選
択性栄養培養基から行なうのが好ましい。 ｂｌａ−遺
伝子を含むハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６を使用す
るのが好ましい場合、それに応じて栄養培養基にアンピ
シリンを加える。
【００３１】ｆ）生産品種 生産品種としては、本発明では、立体特異性加水分解酵
素−遺伝子を含むハイブリッドプラスミドで形質転換し
たすべての宿主品種を使用できる。 好ましくは、表１
に示す、ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６で形質転換
したＥ． コリ品種の微生物ならびにそれらの子孫および
突然変異体を生産品種として使用する。Ｅ．コリＸＬ１
−Ｂｌｕｅ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５１）およびＥ．コリ
ＤＨ５（ＤＳＭ−Ｎｏ．７０５３）は、上記のように寄
託してある。
素−遺伝子を含むハイブリッドプラスミドで形質転換し
たすべての宿主品種を使用できる。 好ましくは、表１
に示す、ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６で形質転換
したＥ． コリ品種の微生物ならびにそれらの子孫および
突然変異体を生産品種として使用する。Ｅ．コリＸＬ１
−Ｂｌｕｅ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５１）およびＥ．コリ
ＤＨ５（ＤＳＭ−Ｎｏ．７０５３）は、上記のように寄
託してある。
【００３２】たとえば表１から、Ｅ．コリＭＣ４１００
〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９２，１９８３，２
９３〜２９４頁に記載されている〕を宿主品種として使
用する場合、立体選択性加水分解酵素−遺伝子の発現
は、ｌａｃオペロン（ラクトースオペロン）における欠
失（（ａｒｇＦ−ｌａ ｃ）Ｕ１６９の欠失）に基づき、
プロモーターＰＬａｃ構成（永久）の管理の下で行な
う。従って、ｌａｃ抑制遺伝子は形成されない（抑制遺
伝子陰性微生物）。 たとえば表１から、Ｅ．コリＫ１
２（ＤＳＭ−Ｎｏ．４９８で得られる）またはＥ．コリ
ＨＢ１０１〔Ｈ．Ｗ．ボイヤーおよびＤ．ロウランド−
デュッソー，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４１（１９６９），
４５９〜４７２頁〕を宿主品種として使用する場合、加
水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）の発現は、抑制遺伝子ｌ
ａｃＩがないために、ＩＰＴＧにより誘導される（抑制
遺伝子−陽性微生物）。
〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９２，１９８３，２
９３〜２９４頁に記載されている〕を宿主品種として使
用する場合、立体選択性加水分解酵素−遺伝子の発現
は、ｌａｃオペロン（ラクトースオペロン）における欠
失（（ａｒｇＦ−ｌａ ｃ）Ｕ１６９の欠失）に基づき、
プロモーターＰＬａｃ構成（永久）の管理の下で行な
う。従って、ｌａｃ抑制遺伝子は形成されない（抑制遺
伝子陰性微生物）。 たとえば表１から、Ｅ．コリＫ１
２（ＤＳＭ−Ｎｏ．４９８で得られる）またはＥ．コリ
ＨＢ１０１〔Ｈ．Ｗ．ボイヤーおよびＤ．ロウランド−
デュッソー，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４１（１９６９），
４５９〜４７２頁〕を宿主品種として使用する場合、加
水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）の発現は、抑制遺伝子ｌ
ａｃＩがないために、ＩＰＴＧにより誘導される（抑制
遺伝子−陽性微生物）。
【００３３】ｇ）生物変換 本発明では、立体特異性加水分解酵素を形成する遺伝子
で形質転換してあり、したがって立体特異的にＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを酸に加水分解するすべ
ての微生物（生産品種）を使用できる。
で形質転換してあり、したがって立体特異的にＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを酸に加水分解するすべ
ての微生物（生産品種）を使用できる。
【００３４】好ましくは、生物変換は、制限地図を図１
に示す加水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）で形質転換した
微生物で行なう。立体特異性加水分解酵素活性を有する
ポリペプチドに関して暗号付けする、アミノ酸配列を図
３に示すＤＮＡ断片で形質転換した微生物も好適であ
る。 同様に、図３に示すＤＮＡ断片でハイブリッド化
し、立体特異性加水分解酵素活性を有するポリペプチド
に関して暗号付けするＤＮＡ断片で形質転換した微生物
も好適である。
に示す加水分解酵素−遺伝子（ｒａｄ）で形質転換した
微生物で行なう。立体特異性加水分解酵素活性を有する
ポリペプチドに関して暗号付けする、アミノ酸配列を図
３に示すＤＮＡ断片で形質転換した微生物も好適であ
る。 同様に、図３に示すＤＮＡ断片でハイブリッド化
し、立体特異性加水分解酵素活性を有するポリペプチド
に関して暗号付けするＤＮＡ断片で形質転換した微生物
も好適である。
【００３５】本方法には、すでに記載したように、ハイ
ブリッドプラスミドｐＣＡＲ５またはｐＣＡＲ６で形質
転換した品種Ｅ．コリ（表１）の微生物、特にハイブリ
ッドプラスミドｐＣＡＲ６で形質転換した微生物がとく
に好適である。
ブリッドプラスミドｐＣＡＲ５またはｐＣＡＲ６で形質
転換した品種Ｅ．コリ（表１）の微生物、特にハイブリ
ッドプラスミドｐＣＡＲ６で形質転換した微生物がとく
に好適である。
【００３６】これらの微生物から得られる無細胞酵素
（立体特異性加水分解酵素）も、同様に好適である。
これらの無細胞酵素は、専門家にとっては通常の微生物
細胞の溶解により得られる。 これにはたとえば超音波
法、フレンチ−プレス法またはリゾチーム法を使用する
ことができる。
（立体特異性加水分解酵素）も、同様に好適である。
これらの無細胞酵素は、専門家にとっては通常の微生物
細胞の溶解により得られる。 これにはたとえば超音波
法、フレンチ−プレス法またはリゾチーム法を使用する
ことができる。
【００３７】これらの無細胞酵素は、本方法を実行する
ために、専門家にとっては一般的な方法により、好適な
キャリヤー物質上に固定することができる。
ために、専門家にとっては一般的な方法により、好適な
キャリヤー物質上に固定することができる。
【００３８】本方法は好ましくは、静止微生物細胞（成
長していない細胞）で行なうが、それらの細胞を前もっ
てそれらの発現機構に応じて誘導しておく。 すなわ
ち、本方法に抑制遺伝子−陽性微生物、たとえばハイブ
リッドプラスミドｐＣＡＲ６で形質転換したＥ．コリＸ
Ｌ１−ＢｌｕｅまたはＥ．コリＤＨ５を使用する場合、
誘導はＩＰＴＧで行なう。 本方法にＥ．コリ種の抑制
遺伝子−陰性（すなわち抑制遺伝子の欠如）微生物、た
とえばＥ．コリＭＣ４１００を使用する場合、加水分解
酵素遺伝子（ｒａｄ）永久（構成）の発現が起る。
長していない細胞）で行なうが、それらの細胞を前もっ
てそれらの発現機構に応じて誘導しておく。 すなわ
ち、本方法に抑制遺伝子−陽性微生物、たとえばハイブ
リッドプラスミドｐＣＡＲ６で形質転換したＥ．コリＸ
Ｌ１−ＢｌｕｅまたはＥ．コリＤＨ５を使用する場合、
誘導はＩＰＴＧで行なう。 本方法にＥ．コリ種の抑制
遺伝子−陰性（すなわち抑制遺伝子の欠如）微生物、た
とえばＥ．コリＭＣ４１００を使用する場合、加水分解
酵素遺伝子（ｒａｄ）永久（構成）の発現が起る。
【００３９】とくに好ましい実施形態では、微生物の特
異的加水分解酵素活性はＣ1〜Ｃ4アルコールにより高め
られる。 Ｃ1〜Ｃ4アルコールとしては、たとえばメタ
ノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール
またはブタノールを使用できる。 好ましくはメタノー
ルまたはエタノールを使用する。
異的加水分解酵素活性はＣ1〜Ｃ4アルコールにより高め
られる。 Ｃ1〜Ｃ4アルコールとしては、たとえばメタ
ノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール
またはブタノールを使用できる。 好ましくはメタノー
ルまたはエタノールを使用する。
【００４０】本方法に使用する媒体としては、この専門
分野で一般的な媒体、たとえば低分子リン酸塩緩衝液、
クラら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１ ３５，（１
９８３），１〜７頁による鉱物塩媒体、またはＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−２’
−エタンスルホン酸）を使用できる。 好ましくは、本
方法は低分子リン酸緩衝液中で行なう。
分野で一般的な媒体、たとえば低分子リン酸塩緩衝液、
クラら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１ ３５，（１
９８３），１〜７頁による鉱物塩媒体、またはＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−２’
−エタンスルホン酸）を使用できる。 好ましくは、本
方法は低分子リン酸緩衝液中で行なう。
【００４１】媒体は、生物変換のためにラセミ性Ｒ，Ｓ
−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを０．２〜５重量％、
好ましくは０．２〜２重量％の量で含むのが有利であ
る。
−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを０．２〜５重量％、
好ましくは０．２〜２重量％の量で含むのが有利であ
る。
【００４２】生物変換は、ｐＨ６〜１１の範囲、好まし
くはｐＨ６．５〜１０の範囲で行なうのが有利である。
くはｐＨ６．５〜１０の範囲で行なうのが有利である。
【００４３】生物変換は、１５〜５５℃、好ましくは２
０〜４０℃の温度で行なうのが有利である。
０〜４０℃の温度で行なうのが有利である。
【００４４】通常、１〜３０時間、好ましくは５〜２５
時間の変換の後、Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡは
完全に相当する酸に変換され、その際光学的に純粋なＳ
−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する。 そのよ
うにして形成されたＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ
は、たとえば抽出、電気透析または乾燥により得られ
る。
時間の変換の後、Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡは
完全に相当する酸に変換され、その際光学的に純粋なＳ
−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡが沈殿する。 そのよ
うにして形成されたＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ
は、たとえば抽出、電気透析または乾燥により得られ
る。
【００４５】
【実施例１】 １．１コマモナス・アシドボラ ンスＡ：１８の染色体Ｄ
Ｎ Ａの調製 新しい一晩培養基（１００ｍｌ栄養酵母肉汁、３０℃）
中のコマモ ナス・アシドボランスＡ：１８の染色体ＤＮ
Ａを、Ｒ．Ｈ．チェスニーら〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１３０（１９７９），１６１〜１７３頁〕の方法の変形
により分離した、すなわち遠心分離した細胞（１５分
間、６，５００Ｘｇ、４℃）をトリス−ＨＣｌ−緩衝液
（２．２５ｍｌ、０．０５モル／ｌ）、ｐＨ８．０、１
０％（ｗ／ｖ）サッカロースに再分散させた。
Ｎ Ａの調製 新しい一晩培養基（１００ｍｌ栄養酵母肉汁、３０℃）
中のコマモ ナス・アシドボランスＡ：１８の染色体ＤＮ
Ａを、Ｒ．Ｈ．チェスニーら〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１３０（１９７９），１６１〜１７３頁〕の方法の変形
により分離した、すなわち遠心分離した細胞（１５分
間、６，５００Ｘｇ、４℃）をトリス−ＨＣｌ−緩衝液
（２．２５ｍｌ、０．０５モル／ｌ）、ｐＨ８．０、１
０％（ｗ／ｖ）サッカロースに再分散させた。
【００４６】３７５μｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／
ｍｌ ０．２５モル／ｌ トリス−ＨＣｌ−緩衝液、ｐ
Ｈ８．０）および９００μｌの０．１モル／ｌ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０を加えた後、この分散液を氷上で１０分
間冷却した。 次いで４５０μｌの５％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓおよび５０μｌのリボヌクレアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ
Ｈ2Ｏ）を加え、３７℃で３０分間培養した。 へら
先端分のプロテイナーゼＫおよび４００μｌのプロナー
ゼ（２０ｍｌ／ｍｌ Ｈ2Ｏ）を加えた後、培養を２時
間続行した。
ｍｌ ０．２５モル／ｌ トリス−ＨＣｌ−緩衝液、ｐ
Ｈ８．０）および９００μｌの０．１モル／ｌ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０を加えた後、この分散液を氷上で１０分
間冷却した。 次いで４５０μｌの５％（ｗ／ｖ）ＳＤ
Ｓおよび５０μｌのリボヌクレアーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ
Ｈ2Ｏ）を加え、３７℃で３０分間培養した。 へら
先端分のプロテイナーゼＫおよび４００μｌのプロナー
ゼ（２０ｍｌ／ｍｌ Ｈ2Ｏ）を加えた後、培養を２時
間続行した。
【００４７】４．３ｇのＣｓＣｌを混合した後、遠心分
離し（３０分間、４０，０００Ｘｇ、２０℃）、２５０
μｌの臭化エチジウム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、超遠
心機（ＶＴｉ６５．２−小管）中で遠心分離した（８時
間以上、２４６，０００Ｘｇ、２０℃）。 長波長ＵＶ
光の下で、小管からＤＮＡ帯を吸引分離した。 ４倍量
のＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）を加えた後、臭
化エチジウムを水で飽和したｎ−ブタノールで３回抽出
した。 ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、ＴＥ緩
衝液に採り、６５℃で１５分間培養した。
離し（３０分間、４０，０００Ｘｇ、２０℃）、２５０
μｌの臭化エチジウム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、超遠
心機（ＶＴｉ６５．２−小管）中で遠心分離した（８時
間以上、２４６，０００Ｘｇ、２０℃）。 長波長ＵＶ
光の下で、小管からＤＮＡ帯を吸引分離した。 ４倍量
のＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ）を加えた後、臭
化エチジウムを水で飽和したｎ−ブタノールで３回抽出
した。 ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、ＴＥ緩
衝液に採り、６５℃で１５分間培養した。
【００４８】１．２染色体ＤＮＡの制限 および結合 ５μｇのコマモナス・アシドボランスＡ：１８（ＤＳＭ
−Ｎｏ．６３１５）−ＤＮＡおよび４．５μｇのベクタ
ー−ＤＮＡ（ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒ）を、
それぞれ２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで１００μｌの
総量制限緩衝液中で切断した（３７℃において６．５時
間）。 ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、スピード・バ
ック（Ｒ）濃縮機で乾燥させた。 沈殿物を結合緩衝液
（２０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−緩衝液、１０ｍｍｏｌ／
ｌ ＤＤＴ（ジチオトレイトール）、１０ｍｍｏｌ／ｌ
ＭｇＣｌ2、０．６ｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ（アデノシン
トリリン酸塩、ｐＨ７．２）に採り、一つに合わせた
（結合体積１００μｌ）。１単位のＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼを加えた後、１３℃で一晩培養した。
−Ｎｏ．６３１５）−ＤＮＡおよび４．５μｇのベクタ
ー−ＤＮＡ（ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒ）を、
それぞれ２０単位の制限酵素ＥｃｏＲＩで１００μｌの
総量制限緩衝液中で切断した（３７℃において６．５時
間）。 ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、スピード・バ
ック（Ｒ）濃縮機で乾燥させた。 沈殿物を結合緩衝液
（２０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−緩衝液、１０ｍｍｏｌ／
ｌ ＤＤＴ（ジチオトレイトール）、１０ｍｍｏｌ／ｌ
ＭｇＣｌ2、０．６ｍｏｌ／ｌ ＡＴＰ（アデノシン
トリリン酸塩、ｐＨ７．２）に採り、一つに合わせた
（結合体積１００μｌ）。１単位のＴ４−ＤＮＡ−リガ
ーゼを加えた後、１３℃で一晩培養した。
【００４９】結合混合物のＤＮＡをイソプロパノールで
沈殿させ、形質転換のために３０μｌの水中に入れた。
沈殿させ、形質転換のために３０μｌの水中に入れた。
【００５０】１．３Ｅ．コリＸＬ１−Ｂ ｌｕｅ（Ｒ）の
形質転換お よび選択 Ｅ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ （Ｒ ）の適正細胞をエレクト
ロポレーションにより、Ｓ．フィードラーおよびＲ．ウ
ィルスの方法〔Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０
（１９８８），３８〜４４頁〕に従って結合混合物で形
質転換した。プラスミド確認のために、栄養寒天上にア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、また「挿入」確認の
ために、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシド）およびｘ−Ｇａｌ（３０
μｇ／ｍｌ、５−ブロム−４−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で３７℃の培養で選択
した。 １．７ｘ１０8ｃｆｕ／ｍｌ（「コロニー形成
単位」＝生きている細胞）の形質転換頻度で、ほとんど
すべてのクローンがＥｃｏＲＩ−「挿入」を有し
形質転換お よび選択 Ｅ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ （Ｒ ）の適正細胞をエレクト
ロポレーションにより、Ｓ．フィードラーおよびＲ．ウ
ィルスの方法〔Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０
（１９８８），３８〜４４頁〕に従って結合混合物で形
質転換した。プラスミド確認のために、栄養寒天上にア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、また「挿入」確認の
ために、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＩＰＴＧ（イソプロピル
−β−Ｄ−チオガラクトシド）およびｘ−Ｇａｌ（３０
μｇ／ｍｌ、５−ブロム−４−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で３７℃の培養で選択
した。 １．７ｘ１０8ｃｆｕ／ｍｌ（「コロニー形成
単位」＝生きている細胞）の形質転換頻度で、ほとんど
すべてのクローンがＥｃｏＲＩ−「挿入」を有し
【００５１】ていた。
【実施例２】 ２．Ｒ−特異性アミダーゼ遺伝子によるコマモナス・ア
シドボランスＡ：１８−遺伝子バンクのスクリーニング ハイブリッドプラスミド（ＥｃｏＲＩ−「挿入」）を有
するクローンを、寒天最少培地上で、Ｈ．クラら〔Ａｒ
ｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５（１９８３），１−
７〕により、Ｃ供給源として０．２％（ｖ／ｖ）グリセ
リン、唯一のＮ供給源として０．１５％（ｗ／ｖ）の
Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ、およびｌａｃ
プロモーターの誘導物質として０．５ｍｍｏｌ／ｌのＩ
ＰＴＧ、ならびにプラスミド安定化のためのアンピシリ
ン（５μｇ／ｍｌ）で、その成長能力を試験した。 完
全な加水分解酵素−遺伝子ｒａｄをプラスミド中のＤＮ
Ａ−「挿入」上に含むクローンだけがＲ−（−）−２，
２−ＤＭＣＰＣＡをＮ供給源として利用し、これを必要
とするＲ−酸に変換し、この最少培地上で成長すること
ができた。そのようにして選択したクローンはすべてベ
クターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒからのハイブ
リッドプラスミドを含み、ＥｃｏＲＩ−「挿入」は約２
３ｋｂであった。
シドボランスＡ：１８−遺伝子バンクのスクリーニング ハイブリッドプラスミド（ＥｃｏＲＩ−「挿入」）を有
するクローンを、寒天最少培地上で、Ｈ．クラら〔Ａｒ
ｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５（１９８３），１−
７〕により、Ｃ供給源として０．２％（ｖ／ｖ）グリセ
リン、唯一のＮ供給源として０．１５％（ｗ／ｖ）の
Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ、およびｌａｃ
プロモーターの誘導物質として０．５ｍｍｏｌ／ｌのＩ
ＰＴＧ、ならびにプラスミド安定化のためのアンピシリ
ン（５μｇ／ｍｌ）で、その成長能力を試験した。 完
全な加水分解酵素−遺伝子ｒａｄをプラスミド中のＤＮ
Ａ−「挿入」上に含むクローンだけがＲ−（−）−２，
２−ＤＭＣＰＣＡをＮ供給源として利用し、これを必要
とするＲ−酸に変換し、この最少培地上で成長すること
ができた。そのようにして選択したクローンはすべてベ
クターｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒからのハイブ
リッドプラスミドを含み、ＥｃｏＲＩ−「挿入」は約２
３ｋｂであった。
【００５２】プラスミドｐＣＡＲ１を分離し、詳細に調
査した。
査した。
【００５３】
【実施例３】 ３．１コマモナス・アシドボラ ンスＡ：１８からのＲ−
特 異性加水分解酵素の分離およびＮ−末端ペプチド分析 ａ）無細胞抽出物の調製 あらかじめＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡで誘
導した、３７℃における加水分解酵素活性が０．６ｇＲ
−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳ／ｌ／ｈ／６５０ｎｍ
における光学密度（ＯＤ650）＝１のコマモナス・アシ
ドボランスＡ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）の無細
胞分散物１６リットルを、７００ｍｌ（ＯＤ650＝３
３．５）に濃縮した。 続いて細胞を何度も遠心分離
し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再分散させ、その後ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（４０ｍｌ）中に採ったが、その際、細胞分散
物全体の体積は９５ｍｌ（ＯＤ650＝２１０）になっ
た。 加水分解酵素活性は３０℃で測定して、０．３４
ｇ生成物／ｌ／ｈ／ＯＤ650＝１であった。 続いて細
胞をフレンチプレス中で１２００バールの圧力で２回溶
解させた。 無細胞抽出物を得るために、この分散物を
２００００Ｘｇで２０分間遠心分離した。 タンパク質
量（ブラッドフォード法で測定）が３９．３ｍｇ／ｍｌ
で、加水分解酵素活性が３０℃で１２．５ｇＲ−（−）
−２，２−ＤＭＣＰＣＳ／ｌ／ｈ／ｍｇタンパク質の抽
出物が、５０ｍｌ得られた。
特 異性加水分解酵素の分離およびＮ−末端ペプチド分析 ａ）無細胞抽出物の調製 あらかじめＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡで誘
導した、３７℃における加水分解酵素活性が０．６ｇＲ
−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳ／ｌ／ｈ／６５０ｎｍ
における光学密度（ＯＤ650）＝１のコマモナス・アシ
ドボランスＡ：１８（ＤＳＭ−Ｎｏ．６３１５）の無細
胞分散物１６リットルを、７００ｍｌ（ＯＤ650＝３
３．５）に濃縮した。 続いて細胞を何度も遠心分離
し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再分散させ、その後ＨＥＰＥ
Ｓ緩衝液（４０ｍｌ）中に採ったが、その際、細胞分散
物全体の体積は９５ｍｌ（ＯＤ650＝２１０）になっ
た。 加水分解酵素活性は３０℃で測定して、０．３４
ｇ生成物／ｌ／ｈ／ＯＤ650＝１であった。 続いて細
胞をフレンチプレス中で１２００バールの圧力で２回溶
解させた。 無細胞抽出物を得るために、この分散物を
２００００Ｘｇで２０分間遠心分離した。 タンパク質
量（ブラッドフォード法で測定）が３９．３ｍｇ／ｍｌ
で、加水分解酵素活性が３０℃で１２．５ｇＲ−（−）
−２，２−ＤＭＣＰＣＳ／ｌ／ｈ／ｍｇタンパク質の抽
出物が、５０ｍｌ得られた。
【００５４】ｂ）クロマトグラフィー この粗製細胞抽出物（５０ｍｌ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液
（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に対して平衡化した
Ｑ−セファロース（ファーマシア）充填カラムの上に置
いた。 このカラムを同じ緩衝液でさらに２回流し、次
いでタンパク質をＨＥＰＥＳ−緩衝液−勾配（０．１〜
１ｍｏｌ／ｌ）で溶離させた。 全部で、ＨＥＰＥＳ緩
衝液（１ｍｏｌ／ｌ）で１４０ｍｌの加水分解酵素活性
を有するタンパク質溶液が溶離したので、これを限外濾
過（アミコン−薄膜ＹＭ１０）により濃縮した。 この
酵素溶液のタンパク質量は１３１ｍｇ／ｍｌで、加水分
解酵素活性は１μｍｏｌ／分／ｎｇタンパク質になっ
た。
（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に対して平衡化した
Ｑ−セファロース（ファーマシア）充填カラムの上に置
いた。 このカラムを同じ緩衝液でさらに２回流し、次
いでタンパク質をＨＥＰＥＳ−緩衝液−勾配（０．１〜
１ｍｏｌ／ｌ）で溶離させた。 全部で、ＨＥＰＥＳ緩
衝液（１ｍｏｌ／ｌ）で１４０ｍｌの加水分解酵素活性
を有するタンパク質溶液が溶離したので、これを限外濾
過（アミコン−薄膜ＹＭ１０）により濃縮した。 この
酵素溶液のタンパク質量は１３１ｍｇ／ｍｌで、加水分
解酵素活性は１μｍｏｌ／分／ｎｇタンパク質になっ
た。
【００５５】続いて、このタンパク質要液２ｍｌを、Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に対
して平衡化したセファロース−１２（ファーマシア）充
填カラムの上に置いた。 この緩衝液で合計３６ｍｌの
タンパク質溶液が溶離した。この溶液も同様に限外濾過
（アミコン−薄膜ＹＭ１０）により濃縮した。 タンパ
ク質量は２０．１ｍｇ／ｍｌで、加水分解酵素活性は
１．２μｍｏｌ／分／ｎｇタンパク質になった。
ＥＰＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．５）に対
して平衡化したセファロース−１２（ファーマシア）充
填カラムの上に置いた。 この緩衝液で合計３６ｍｌの
タンパク質溶液が溶離した。この溶液も同様に限外濾過
（アミコン−薄膜ＹＭ１０）により濃縮した。 タンパ
ク質量は２０．１ｍｇ／ｍｌで、加水分解酵素活性は
１．２μｍｏｌ／分／ｎｇタンパク質になった。
【００５６】次いで、そのようにして得られたタンパク
質溶液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ
７．５）に対して平衡化した、アニオン交換樹脂Ｌｉキ
ロスファー２０００ＴＭＡＥ（トリメチルアンモニウム
−エチル塩）（メルク）を充填したカラムの上に置い
た。 このカラムを同じ緩衝液で流した後、このタンパ
ク質溶液を同じ緩衝液中ＮａＣｌ−勾配（０〜１ｍｏｌ
／ｌ）で溶離させた。タンパク質濃度は１５ｍｇ／ｍｌ
で、加水分解酵素活性は１．２μｍｏｌ／分／ｎｇタン
パク質になった。
質溶液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ
７．５）に対して平衡化した、アニオン交換樹脂Ｌｉキ
ロスファー２０００ＴＭＡＥ（トリメチルアンモニウム
−エチル塩）（メルク）を充填したカラムの上に置い
た。 このカラムを同じ緩衝液で流した後、このタンパ
ク質溶液を同じ緩衝液中ＮａＣｌ−勾配（０〜１ｍｏｌ
／ｌ）で溶離させた。タンパク質濃度は１５ｍｇ／ｍｌ
で、加水分解酵素活性は１．２μｍｏｌ／分／ｎｇタン
パク質になった。
【００５７】ｃ）１次元および２次元電気泳動による加
水分解酵素の確認 粗製細胞抽出物中で、加水分解酵素−タンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより確認した。 その際、誘導していな
いものを、誘導した細胞抽出物でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
比較した（Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡで誘
導）。
水分解酵素の確認 粗製細胞抽出物中で、加水分解酵素−タンパク質をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより確認した。 その際、誘導していな
いものを、誘導した細胞抽出物でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
比較した（Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡで誘
導）。
【００５８】誘導された細胞抽出物中で、分子量が約４
６０００のタンパク質帯が確認された。 クロマトグラ
フィーにより得られた、加水分解酵素活性を有するタン
パク質画分も同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
分子量が約４６０００のタンパク質をこのクロマトグ
ラフィー精製により濃縮したが、その際３回目のクロマ
トグラフィーの後で約８０％に濃縮された。 次いで、
この８０％純度の試料を２次元電気泳動（２−Ｄ ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）により分析した。 この方法により、加
水分解酵素の分子量に相当する約４６０００の分子量を
有するタンパク質の「スポット」が確認された。
６０００のタンパク質帯が確認された。 クロマトグラ
フィーにより得られた、加水分解酵素活性を有するタン
パク質画分も同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
分子量が約４６０００のタンパク質をこのクロマトグ
ラフィー精製により濃縮したが、その際３回目のクロマ
トグラフィーの後で約８０％に濃縮された。 次いで、
この８０％純度の試料を２次元電気泳動（２−Ｄ ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）により分析した。 この方法により、加
水分解酵素の分子量に相当する約４６０００の分子量を
有するタンパク質の「スポット」が確認された。
【００５９】ｄ）配列化 ２−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより得られたタンパク質
「スポット」をＰＶＤＦ（ポリニフッ化ビニリデン）−
薄膜上にブロットし、薄膜から切り取った。 続いて、
このタンパク質を、ホッホシュトラッサーらの方法〔Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ 『応用および理論電気泳
動』１，７３〜７６頁，１９８８，「プラズマおよび脳
脊髄液中のＨＤＬ粒子に伴うタンパク質」〕により直接
配列化した。 この方法により、Ｎ−末端アミノ酸配列
の２１個のアミノ酸（ＡＳ）が確認された。
「スポット」をＰＶＤＦ（ポリニフッ化ビニリデン）−
薄膜上にブロットし、薄膜から切り取った。 続いて、
このタンパク質を、ホッホシュトラッサーらの方法〔Ａ
ｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ 『応用および理論電気泳
動』１，７３〜７６頁，１９８８，「プラズマおよび脳
脊髄液中のＨＤＬ粒子に伴うタンパク質」〕により直接
配列化した。 この方法により、Ｎ−末端アミノ酸配列
の２１個のアミノ酸（ＡＳ）が確認された。
【００６０】
【実施例４】 ４．クローン化したＥｃｏＲＩ断片上における加水分解
酵素遺伝子（ｒａｄ）の局在化 ４．１ｐＣＡＲ１の大まかな制 限地図 従来の方法〔『分子生物学の現況』ジョン・ウイリー・
アンド・サンズ、ニューヨーク，１９８７，第２章〕に
よる制限分析により、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、Ｋｓｐ
Ｉ、ＳｍａＩ、ＰｓｔｕＩ、ＢａｍＨＩに関する大まか
な制限地図を作成した。
酵素遺伝子（ｒａｄ）の局在化 ４．１ｐＣＡＲ１の大まかな制 限地図 従来の方法〔『分子生物学の現況』ジョン・ウイリー・
アンド・サンズ、ニューヨーク，１９８７，第２章〕に
よる制限分析により、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、Ｋｓｐ
Ｉ、ＳｍａＩ、ＰｓｔｕＩ、ＢａｍＨＩに関する大まか
な制限地図を作成した。
【００６１】４．２加水分解酵素のＮ− 末端ペプチド配
列に基づく 混合ＤＮＡオリゴマーの形成 遺伝子暗号に基づいて、コマモナス・アシドボランス
Ａ：１８加水分解酵素のＮ−末端ペプチド配列に対して
２種の混合ＤＮＡオリゴマーを構成し、ＤＮＡ合成機械
により合成することができた。
列に基づく 混合ＤＮＡオリゴマーの形成 遺伝子暗号に基づいて、コマモナス・アシドボランス
Ａ：１８加水分解酵素のＮ−末端ペプチド配列に対して
２種の混合ＤＮＡオリゴマーを構成し、ＤＮＡ合成機械
により合成することができた。
【００６２】ＤＮＡ−オリゴマー（混合） Ｔ Ｔ ＴＣＴ Ａ Ｔ Ｔ Ｔ ５’ ＡＴＧ ＡＡＣ ＧＡＣ ＡＧＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＡ ３’ Ｃ Ｃ Ａ Ａ ＡＳ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ ＡＳＤＮＡ−「アンチセンス」 オリゴマー（混合） Ａ Ｃ Ｔ Ｔ Ｔ Ｔ ５’ ＴＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＣＧ ＣＣＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ３’ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ａ ＡＳ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ ＡＳ ４．３プラスミドｐＣＡＲ１の 制限断片の「サザーンブ
ロ ット−ハイブリダイゼーション」 ｐＣＡＲ１の種々の制限（ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ）により得られたアガロースゲル−電気泳動
（０．６％）で分離したＤＮＡ断片を既知の「サザーン
ブロット法」によりニトロセルロース上に移した。
〔『分子生物学における現況』ジョン・ウイリー・アン
ド・サンズ，ニューヨーク，１９８７、第２章９頁以
降〕。
ロ ット−ハイブリダイゼーション」 ｐＣＡＲ１の種々の制限（ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、Ｅｃ
ｏＲＩ）により得られたアガロースゲル−電気泳動
（０．６％）で分離したＤＮＡ断片を既知の「サザーン
ブロット法」によりニトロセルロース上に移した。
〔『分子生物学における現況』ジョン・ウイリー・アン
ド・サンズ，ニューヨーク，１９８７、第２章９頁以
降〕。
【００６３】ＤＮＡオリゴマーは〔32Ｐ〕−ガンマ−Ａ
ＴＰで同様に末端標識を付けた。すなわち、４００ｎｇ
のＤＮＡオリゴマー、２２μＣｉ32Ｐ−ガンマ−ＡＴ
Ｐ、１１単位のポリヌクレオチドキナーゼ無リン酸塩
を、合計２５μｌのポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
（０．０５ｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
０．０１ｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ
ＤＴ）中で３７℃で３０分間培養した。 その後、セフ
ァデックスＧ−２５−ゲル濾過（ファーマシア）により
精製し、既知の方法（上記の文献）により「サザーンブ
ロット」に対してハイブリダイゼーションした。
ＴＰで同様に末端標識を付けた。すなわち、４００ｎｇ
のＤＮＡオリゴマー、２２μＣｉ32Ｐ−ガンマ−ＡＴ
Ｐ、１１単位のポリヌクレオチドキナーゼ無リン酸塩
を、合計２５μｌのポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
（０．０５ｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、
０．０１ｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ
ＤＴ）中で３７℃で３０分間培養した。 その後、セフ
ァデックスＧ−２５−ゲル濾過（ファーマシア）により
精製し、既知の方法（上記の文献）により「サザーンブ
ロット」に対してハイブリダイゼーションした。
【００６４】Ｎ−末端タンパク質配列に相当するヌクレ
オチド−オリゴマーに対するハイブリダイゼーションに
より、ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ１上の２．３ｋ
ｂ大のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片または
１．８５ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断
片を標識付けすることができた。
オチド−オリゴマーに対するハイブリダイゼーションに
より、ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ１上の２．３ｋ
ｂ大のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片または
１．８５ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断
片を標識付けすることができた。
【００６５】４．４加水分解酵素（ｒａ ｄ）のサブクロ
ーニング化 コマモナス・アシドボラン ス Ａ：１８からのＲ−特異性
加水分解酵素に関して暗号付けする、２．３ｋｂ大のＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片、または１．８５
ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片を、同
じように消化したベクター−ＤＮＡ ｐＢＬＵＥＳＣＲ
ＩＰＴ−ＫＳ＋ＲまたはｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＫ
＋Ｒ中に挿入した。
ーニング化 コマモナス・アシドボラン ス Ａ：１８からのＲ−特異性
加水分解酵素に関して暗号付けする、２．３ｋｂ大のＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片、または１．８５
ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片を、同
じように消化したベクター−ＤＮＡ ｐＢＬＵＥＳＣＲ
ＩＰＴ−ＫＳ＋ＲまたはｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＳＫ
＋Ｒ中に挿入した。
【００６６】プロモーターＰＬａｃに対する「挿入物」
のただ一つの指向だけがクローン中でＩＰＴＧ誘導の後
必要とする加水分解酵素活性を示した。
のただ一つの指向だけがクローン中でＩＰＴＧ誘導の後
必要とする加水分解酵素活性を示した。
【００６７】２．３ｋｂ大のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−
ＤＮＡ−断片を有するｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋
ＲをハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６と呼ぶ。 １．
８５ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片を
有するｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒをハイブリッ
ドプラスミドｐＣＡＲ５と呼ぶ。
ＤＮＡ−断片を有するｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋
ＲをハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６と呼ぶ。 １．
８５ｋｂ大のＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＤＮＡ−断片を
有するｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ−ＫＳ＋Ｒをハイブリッ
ドプラスミドｐＣＡＲ５と呼ぶ。
【００６８】
【実施例５】 ５．Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ−加水分解酵素
の活性測定 加水分解酵素の活性測定を行なうために、微生物分散物
の光学密度を６５０ｎｍで０．５に調節した。 媒体と
して、０．２重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣ
ＰＣＡを含むリン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）、ｐ
Ｈ７．０を使用した。 この分散物を振とうしながら３
０℃で４時間培養した。 加水分解酵素により放出され
たＮＨ4＋またはＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを
測定し、１ｍｍｏｌの形成されたＮＨ4＋＝１ｍｍｏｌ
の変換されたＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡに相当
するとして、活性を、変換されたＲ−（−）−２，２−
ＤＭＣＰＣＡのｇ／ｌ／ｈ／６５０ｎｍにおける光学密
度として表わした。
の活性測定 加水分解酵素の活性測定を行なうために、微生物分散物
の光学密度を６５０ｎｍで０．５に調節した。 媒体と
して、０．２重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣ
ＰＣＡを含むリン酸塩緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）、ｐ
Ｈ７．０を使用した。 この分散物を振とうしながら３
０℃で４時間培養した。 加水分解酵素により放出され
たＮＨ4＋またはＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを
測定し、１ｍｍｏｌの形成されたＮＨ4＋＝１ｍｍｏｌ
の変換されたＲ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡに相当
するとして、活性を、変換されたＲ−（−）−２，２−
ＤＭＣＰＣＡのｇ／ｌ／ｈ／６５０ｎｍにおける光学密
度として表わした。
【００６９】
【実施例６】Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭ ＣＰＣＡの製造 ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６を有するＥ．コリＫ
１２は、０．２％（ｖ／ｖ）のグリセリンおよび０．１
５重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを含
む鉱物塩媒体中で、ＩＰＴＧ誘導後に１．２ｇＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳ／ｌ／ｈ／ＯＤ650の特
異的加水分解酵素活性を示した。 Ｒ−（−）−２，２
−ＤＭＣＰＣＡのＲ−（−）−酸への変換はＮＨ4＋放
出およびＧＣ分析により証明された。 目的とする物質
Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡはラセミ性混合物中
に変化せずに存在していた。
１２は、０．２％（ｖ／ｖ）のグリセリンおよび０．１
５重量％のＲ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを含
む鉱物塩媒体中で、ＩＰＴＧ誘導後に１．２ｇＲ−
（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＳ／ｌ／ｈ／ＯＤ650の特
異的加水分解酵素活性を示した。 Ｒ−（−）−２，２
−ＤＭＣＰＣＡのＲ−（−）−酸への変換はＮＨ4＋放
出およびＧＣ分析により証明された。 目的とする物質
Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡはラセミ性混合物中
に変化せずに存在していた。
【００７０】Ｅ．コリＫ１２に対応して、表１に示す微
生物を培養したが、変換結果を表１に示す。
生物を培養したが、変換結果を表１に示す。
【００７１】 表１ 各Ｅ．コリ品種における立体特異性加水分解酵素活性 品種 特異 ファク 安定性 最大 総活性 活性 ター OD650nm g/l/h g/l/h/OD ％ 4) コマモナス アシドボランス （本発明と無関係） Ａ：１８1) ０．５ １ − ６ ３．０E.コリ Ｋ12/pCAR62) １．２ ２．４ ９０ ｎｔ −E.コリ HB101/pCAR62) ０．２５ ０．５ ｎｔ ｎｔ −E.コリ MC4100/pCAR63) ０．５３ １ ８９ ｎｔ −E.コリ XL1BLUE/pCAR65) (DSM-No.6551) ０．５ １ ９０ ３０ １５．０E.コリ DH5/pCAR65) (DSM-No.7053) ２．１ ４．２ １００ ３０ ６３．０ １）アミドで誘導、２）ＩＰＴＧで誘導、３）構成、
４）２４ｈ後のプラスミド安定性、抗生物質の選択な
し、ｎｔ＝試験せず、５）誘導せず
４）２４ｈ後のプラスミド安定性、抗生物質の選択な
し、ｎｔ＝試験せず、５）誘導せず
【００７２】
【実施例７】Ｃ 1〜Ｃ 4アルコールによる活性試験 活性試験はまずコマモナス・アシドボランスＡ：１８を
使用し、３７℃で、０．５％Ｒ，Ｓ−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡにより、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中でｐＨ
７．０で行なった。 比較試料は溶剤を使用せず、試験
は５〜１６体積％の溶剤を使用した。 特異活性の計算
は実施例５に記載するようにして行なった。
使用し、３７℃で、０．５％Ｒ，Ｓ−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡにより、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中でｐＨ
７．０で行なった。 比較試料は溶剤を使用せず、試験
は５〜１６体積％の溶剤を使用した。 特異活性の計算
は実施例５に記載するようにして行なった。
【００７３】 溶剤 ｇＲ−２，２−ＤＭＣＰＣＡ／ｌ／ｈ／ＯＤ 650 （体積％） ｎｍの変換をおこなうための活性 −−− ０．６４ エタノール（１０） １．２４ イソプロパノール（１０） １．８５ メタノール（５） １．７９ メタノール（１０） １．５４ メタノール（１６） １．６６ ２０リットルの発酵器における２〜３％のＲ，Ｓ−２，
２−ＤＭＣＰＣＡ（３７℃、１０ｍＭ、リン酸カリウム
緩衝液、ｐＨ７．０）による生物変換で、５〜７．５体
積％のメタノールまたはエタノールを加えることによ
り、変換時間を短縮し、Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡの収量を高くすることができた（選択性の増加）。
同じ効果は、加水分解酵素遺伝子を有するＥ．コリ品
種ＸＬ１−Ｂｌｕｅでも観察された。 結果を表２にま
とめて示す。
２−ＤＭＣＰＣＡ（３７℃、１０ｍＭ、リン酸カリウム
緩衝液、ｐＨ７．０）による生物変換で、５〜７．５体
積％のメタノールまたはエタノールを加えることによ
り、変換時間を短縮し、Ｓ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰ
ＣＡの収量を高くすることができた（選択性の増加）。
同じ効果は、加水分解酵素遺伝子を有するＥ．コリ品
種ＸＬ１−Ｂｌｕｅでも観察された。 結果を表２にま
とめて示す。
【００７４】 表２（各品種から同じ活性（水中の）を設定した） 品種 R,S-2,2- 溶剤 期間 ｅｅ 収量 DMCPCA(%) （体積％） (h) (%) (%)*) Ａ：１８ 2.0 --- 22 99 41.5 Ａ：１８ 2.3 メタノール(7.5) 15 99.2 47 XL1/pCAR6 2.8 --- 24 100 36 XL1/pCAR6 2.8 メタノール(7.5) 7 98.2 46XL1/pCAR6 2.8 エタノー ル(5) 7 98.6 44 *)使用したＲ，Ｓ−ＤＭＣＰＣＡに対するＳ−（＋）−２，２−ＤＭＣＰＣＡの 収量
【００７５】
【実施例８】Ｅ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ ／ｐＣＡＲ６の立体特異性 加
水分解酵素の固定 ２８ｍｇタンパク質／ｍｌを含み、３７℃で０．２９μ
ｍｏｌ Ｒ，Ｓ−２，２−ＤＭＣＰＣＡ／分・ｍｇタン
パク質の加水分解酵素活性を有するＥ． コリＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ／ｐＣＡＲ６の無細胞抽出物（２８８ｍｌ）を、
まずカラムクロマトグラフィーを通してＱ−セファロー
ス（ファーマシア）で精製した。 次いでトリス−ＨＣ
ｌ−緩衝液（０．１モル、ｐＨ７．５）中ＮａＣｌ勾配
（０〜１ｍｏｌ／ｌ）で加水分解酵素−タンパク質を溶
離させた。 次いで、４０％〜８０％のＮａＣｌ勾配で
溶離した、加水分解酵素活性を有するタンパク質を限外
濾過（アミコン薄膜ＹＭ１０）により濃縮し、ゲル濾過
（ＰＤ−１０、セファデックスＧ−２５Ｍ、ファーマシ
アＬＫＢ）で脱塩した。 最終体積はリン酸塩緩衝液
（０．１モル、ｐＨ７．０）中４７ｍｌで、３７℃で
０．６９μｍｏｌ Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ
／分・ｍｇタンパク質の加水分解酵素活性を有する６７
ｍｇタンパク質／ｍｌを含んでいた。 続いて、この前
精製した立体特異性加水分解酵素を、キャリアー物質と
してユーペルギットＣ（ローム・ファーマＧｍｂＨ，ヴ
ァイターシュタット，ドイツ）上に固定した。 このた
めに、不溶性キャリヤー物質のオキシラン基を加水分解
酵素−タンパク質の遊離アミノ基に共有結合させた。
この固定化はリン酸カリウム緩衝液（１モル、ｐＨ８．
５）中、室温で９０時間かけて行なった。 ３７℃で
１．５μｍｏｌ Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ／
分・ｇ湿重量ユーペルギットＣの加水分解酵素活性を有
する、１０．２ｍｇ固定タンパク質／ｇ湿重量ユーペル
ギットＣが得られた。３７℃におけるリン酸カリウム緩
衝液（１０ｍｍｏｌ、ｐＨ８．５）中に０．５重量％
Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを含む固定加水
分解酵素の安定性を表３に示す。
水分解酵素の固定 ２８ｍｇタンパク質／ｍｌを含み、３７℃で０．２９μ
ｍｏｌ Ｒ，Ｓ−２，２−ＤＭＣＰＣＡ／分・ｍｇタン
パク質の加水分解酵素活性を有するＥ． コリＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ／ｐＣＡＲ６の無細胞抽出物（２８８ｍｌ）を、
まずカラムクロマトグラフィーを通してＱ−セファロー
ス（ファーマシア）で精製した。 次いでトリス−ＨＣ
ｌ−緩衝液（０．１モル、ｐＨ７．５）中ＮａＣｌ勾配
（０〜１ｍｏｌ／ｌ）で加水分解酵素−タンパク質を溶
離させた。 次いで、４０％〜８０％のＮａＣｌ勾配で
溶離した、加水分解酵素活性を有するタンパク質を限外
濾過（アミコン薄膜ＹＭ１０）により濃縮し、ゲル濾過
（ＰＤ−１０、セファデックスＧ−２５Ｍ、ファーマシ
アＬＫＢ）で脱塩した。 最終体積はリン酸塩緩衝液
（０．１モル、ｐＨ７．０）中４７ｍｌで、３７℃で
０．６９μｍｏｌ Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ
／分・ｍｇタンパク質の加水分解酵素活性を有する６７
ｍｇタンパク質／ｍｌを含んでいた。 続いて、この前
精製した立体特異性加水分解酵素を、キャリアー物質と
してユーペルギットＣ（ローム・ファーマＧｍｂＨ，ヴ
ァイターシュタット，ドイツ）上に固定した。 このた
めに、不溶性キャリヤー物質のオキシラン基を加水分解
酵素−タンパク質の遊離アミノ基に共有結合させた。
この固定化はリン酸カリウム緩衝液（１モル、ｐＨ８．
５）中、室温で９０時間かけて行なった。 ３７℃で
１．５μｍｏｌ Ｒ−（−）−２，２−ＤＭＣＰＣＡ／
分・ｇ湿重量ユーペルギットＣの加水分解酵素活性を有
する、１０．２ｍｇ固定タンパク質／ｇ湿重量ユーペル
ギットＣが得られた。３７℃におけるリン酸カリウム緩
衝液（１０ｍｍｏｌ、ｐＨ８．５）中に０．５重量％
Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ＤＭＣＰＣＡを含む固定加水
分解酵素の安定性を表３に示す。
【００７６】表３ 期間 固定加水分解酵素の活性（μｍｏｌＲ−（−）−２，２− ＤＭＣＰＣＡ ／分・ｇ湿重量ユーペルギ ットＣ） ０〜９０ １．５９０〜１８５ ０．６８
【図１】遺伝子の制限地図。
【図２】ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６の図。
【図３】立体特異性加水分解酵素に関して暗号付けす
る、遺伝子のアミノ酸配列ならびにＤＮＡ配列。
る、遺伝子のアミノ酸配列ならびにＤＮＡ配列。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 41/00 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 41/00 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:41） Ｃ１２Ｒ 1:41） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 オルウェン エム バーチ スイス国 カントン・ヴァリス ナーテ アス ダムヴェク 11Ｄ (72)発明者 エリザベス ベーレン スイス国 カントン・ヴァリス ナーテ アス ダムヴェク 11Ｄ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 41/00 C12N 1/20 C12N 15/55 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (19)
- 【請求項１】 Ｓ−（＋）−２，２−ジメチルシクロプ
ロパンカルボキサミドの製造方法であって、コマモナス
属、シュードモナス属、およびバクテリウム属の微生物
の少なくとも一に由来し、かつ２.３ｋｂのＤＮＡ断片
を示す下記の制限地図（図１）により特徴付けられる、
立体特異性加水分解酵素を形成する遺伝子で形質転換し
た微生物により、ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）−２，２−ジ
メチルシクロプロパンカルボキサミド中でＲ−（−）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドを、Ｒ
−（−）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸
に生物変換し、これにより光学活性のＳ−（＋）−２，
２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドを得、これ
を分離することを特徴とする方法。 【図１】 - 【請求項２】 生物変換を、立体特異性加水分解酵素活
性を有し、図３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片により形質転換した微生物で
行なうことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 生物変換を、エシェリシア、シュードモ
ナス、コマモナス、アシネトバクター、リゾビウムまた
はアグロバクテリウム属の微生物で行なうことを特徴と
する請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 生物変換を、エシェリシア・コリ種の微
生物で行なうことを特徴とする請求項１〜３の何れか１
項記載の方法。 - 【請求項５】 生物変換を、ハイブリッドプラスミドｐ
ＣＡＲ６で形質転換したエシェリシア・コリＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５１）種の微生物またはそ
れらの子孫、または前記微生物（即ち、寄託された微生
物）と同じ立体特異性加水分解酵素活性を有する前記微
生物のランダムな突然変異体で行なうことを特徴とする
請求項１〜４の何れか１項記載の方法。 - 【請求項６】 生物変換を、ハイブリッドプラスミドｐ
ＣＡＲ６で形質転換したエシェリシア・コリＤＨ５（Ｄ
ＳＭ−Ｎｏ．７０５３）種の微生物またはそれらの子
孫、または前記微生物（即ち、寄託された微生物）と同
じ立体特異性加水分解酵素活性を有する前記微生物のラ
ンダムな突然変異体で行なうことを特徴とする請求項１
〜４の何れか１項記載の方法。 - 【請求項７】 生物変換を、固定化した立体特異性加水
分解酵素で行なうことを特徴とする請求項１〜６の何れ
か１項記載の方法。 - 【請求項８】 生物変換を、ラセミ性Ｒ，Ｓ−（±）−
２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキサミドを０．
２〜５重量％の量で含む媒体中で行なうことを特徴とす
る請求項１〜７の何れか１項記載の方法。 - 【請求項９】 生物変換を、ｐＨ６〜７、および温度１
５〜５５℃で行なうことを特徴とする請求項１〜８の何
れか１項記載の方法。 - 【請求項１０】 コマモナス属、シュードモナス属、お
よびバクテリウム属の微生物の少なくとも一に由来し、
かつ２.３ｋｂのＤＮＡ断片を示す下記の制限地図（図
１）により特徴付けられる、立体特異性加水分解酵素を
コードするＤＮＡ。 【図１】 - 【請求項１１】 立体特異性加水分解酵素活性を有し、
図３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片。 - 【請求項１２】 エシェリシア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ
（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５１）中に寄託された、ハイブリ
ッドプラスミドｐＣＡＲ６中の、請求項１０または１１
記載のＤＮＡまたはＤＮＡ断片。 - 【請求項１３】 エシェリシア・コリＤＨ５（ＤＳＭ−
Ｎｏ．７０５３）中に寄託された、ハイブリッドプラス
ミドｐＣＡＲ６中の、請求項１０または１１記載のＤＮ
ＡまたはＤＮＡ断片。 - 【請求項１４】 発現ベクターからなり、その中に挿入
された請求項１０または１１記載のＤＮＡまたはＤＮＡ
断片を有するハイブリッドプラスミド。 - 【請求項１５】 請求項１０または１１記載のＤＮＡま
たはＤＮＡ断片および発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩ
ＰＴ−ＫＳ＋からなり、エシェリシア・コリＸＬ１−Ｂ
ｌｕｅ（ＤＳＭ−Ｎｏ．６５５１）中に寄託されたハイ
ブリッドプラスミドｐＣＡＲ６。 - 【請求項１６】 請求項１０または１１記載のＤＮＡま
たはＤＮＡ断片および発現ベクターｐＢＬＵＥＳＣＲＩ
ＰＴ−ＫＳ＋からなり、エシェリシア・コリＤＨ５（Ｄ
ＳＭ−Ｎｏ．７０５３）中に寄託されたハイブリッドプ
ラスミドｐＣＡＲ６。 - 【請求項１７】 請求項１４、１５または１６記載のハ
イブリッドプラスミドで形質転換した微生物。 - 【請求項１８】 ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６で
形質転換したエシェリシア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｄ
ＳＭ−Ｎｏ．６５５１）種の、請求項１７記載の微生物
またはそれらの子孫、または前記微生物（即ち、寄託さ
れた微生物）と同じ立体特異性加水分解酵素活性を有す
る前記微生物のランダムな突然変異体。 - 【請求項１９】 ハイブリッドプラスミドｐＣＡＲ６で
形質転換したエシェリシア・コリＤＨ５（ＤＳＭ−Ｎ
ｏ．７０５３）種の、請求項１７記載の微生物またはそ
れらの子孫、または前記微生物（即ち、寄託された微生
物）と同じ立体特異性加水分解酵素活性を有する前記微
生物のランダムな突然変異体。
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