PL170598B1

PL170598B1 - Sposób wytwarzania S(+)-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu metoda inzynierii genetycznej PL PL PL

Info

Publication number: PL170598B1
Application number: PL92295408A
Authority: PL
Inventors: Thomas Zimmermann; Karen Robins; Olwen M Birch; Elisabeth Boehlen
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1991-07-26
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1997-01-31
Also published as: MX9204350A; ATE172248T1; CZ232392A3; EP0524604A2; DE59209523D1; DK0524604T3; CA2074681A1; IL102643A0; SK232392A3; JPH05236993A; EP0524604B1; HUT67687A; RU2126450C1; HU215231B; IE922406A1; PL295408A1; RO114152B1; ES2124714T3; CA2074681C; EP0524604A3

Abstract

1. Sposób wytwarzania S(+)-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamidu metoda inzynierii genetycznej, znamienny tym, ze przy pomocy drobnoustrojów transformo wanych genem o sekwencji nukleotydów przedstawionej na fig. 3 i miejscach restrykcyj nych scharakteryzowanych mapa restrykcyjna przedstawiona na fig. 1, wytwarzajacym stereospecyficzna hydrolaze, w racemicznym R,S-(±)-2,2-dimetylocyklopropanokarbo ksamidzie R-(-)-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid biotransformuje sie do kwasu R-(-)-2,2-dimetylocyklopropanokarboksylowego, przy czym powstaje optycznie czynny S-(+)-2,2-dimetylocyklopropanokarboksamid który sie izoluje. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania S-(+))d,2-dimetylocykIopropanokarboksamidu metodą inżynierii genetycznej, przy pomocy nowych drobnoustrojów pr/e/naczonych dla tego sposobu. Drobnoustroje te są transformowane nowym genem, który wytwarza steeeospecyffezną hydrolazę, stąd też zdolne są w raeemie/ny m R,S-(±)-2,2-dlmntylocykdopropanokarboksamidzie biotransfoirnować izomer R-(-) do odpowiedniego kwasu, przy czym wytwarza się optycznie czynny S---l-))d,2-dimntylocyklopropanokaΓboksamid.

Poniżej używany jest skrót 2,2-DMCPCA dla 2,2-dlmetyloeyklopropanokarboksamidu i

2,2-DMCPCS dla kwasu 2,2-dimetylocyklopropanokarboksylowego.

170 598

Optycznie czysty S-(+)-2,2-DMCPCA służy jako materiał wyjściowy do wytwarzania inhibitora dehydropeptydazy cylastatyny, który w terapii stosuje się wraz z antybiotykami penem względnie karbapenem, celem zapobieżenia dezaktywacji tych antybiotyków przez nerkową dehydropeptydazę w nerkach (lit: opis patentowy EP 048 301-.

Przykładami drobnoustrojów, które wytwarzają stereospecylfczną hydrolizę dla R-(---2,2DMCPCA, są drobnoustroje z gatunku Comamonas acidovorans A: 18 (DSM Nr 6351-, Bacterium sp VIII:II (DSM Nr 6316-, Pseudomonas sp NSAK:42 (DSM Nr 6433- i Comamonas acidovorans TG 308 (DSM Nr 6552-, oraz ich komórki potomne i mutanty. Drobnoustroje te są już szczegółowo opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym 92103780.0.

Zadaniem obecnego wynalazku było, przy pomocy technik rekombinacji DNA, postawić do dyspozycji nowe drobnoustroje jako szczepy produkcyjne, w których zdolność katalityczna oraz ekspresja tego genu hydrolazy mogła być znacznie podwyższona w stosunku do znanych sposobów.

Według wynalazku zadanie to zostało rozwiązane przy użyciu nowego DNA kodującego gen hydrolazy, nowych plazmidów hybrydowych zawierających ten DNA, nowych drobnoustrojów transformowanych tym plazmidem hybrydowym, i nowej metody.

Figura 1 przedstawia mapę restrykcyjną genu.

Figura 2 przedstawia schemat plazmidu hybrydowego pCAR6.

Figura 3 przedstawia zarówno sekwencję aminokwasów jak i sekwencję DNA genu, która koduje stereo opecyficzną hydrolazę.

Według wynalazku sposób przeprowadza się tak, że przy pomocy drobnoustrojów, które są transformowanie genem o sekwencji nukleotydów przedstawionej na fig. 3 i miejscach restrykcyjnych scharakteryzowanych mapą ną przedstawioną na fig. 1, wytwarzającym stercoopecyficzną hydrolazę, w racemicznym R,S-(±)-2,2-DMCPCA R-O^l-MCrCA ulega biotransformacji do R© )'2.24)MCPCS, przy czym powstaje optycznie czynny S-(+}-2,2DMCPCA który jest następnie izolowany.

Wytwarzanie transformowanych drobnoustrojów.

Drobnoustroje stosowane w sposobie według wynalazku, które wytwarzają stereospecyficzną hydrolizę, można otrzymać tak, że:

a/ izoluje się DNA kodujący hydrolazę według wynalazku b/ tę swoistą sekwencję genową wprowadza się do wektora ekspresji, przy czym powstaje plazmid hybrydowy, przy czym może być ewentualnie korzystne wprowadzić w plazmidzie hybrydowym dalsze modyfikacje, które umożliwiają bardziej efektywną ekspresję c/ ten plazmid hybrydowy wprowadza się drogą transformacji do przeznaczonego dla omawianego sposobu d/ drobnoustroju (szczep-gospodarz- (transformacja e/-, przy czym ten transformowany drobnoustrój stanowi następnie f/ szczep produkcyjny dla sposobu według wynalazku (biotransformacja g/-. a/ Izolacja DNA stereospecyficznej hydrolazy

Jako źródło DNA hydrolazy, który dalej oznaczony jest jako DNA hydrolazy (radwzględnie gen hydrolazy (rad-, może służyć na przykład chromosomowy DNA drobnoustrojów Comamonas acidovorans A: 18 (DSM Nr 6315- albo Comamonas acidovrans TG 308 (DSM Nr 6552-,, które są już opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym 92103780.0. Jako źródło służy szczególnie Comamonas acidovorans A: 18, DNA hydrolazy można izolować z liniowej puli genów Comamonas acidovorans A: 18, w Escherichia coli (E.coli- XL-Blue^R przy pomocy BLUESCRIPT (BLUESCRPTT-KS+ lub BLUESCRIPT-SK+, dostępne w Stratagene Co,

Lieferant SA, Genf-, jako zwykły handlowy wektor puli genów.

W tym celu na przykład izoluje się najpierw chromosomowy DNA z Comamonas acidovorans A: 18, w oparciu o metodę R.H. Chesney i wsp, (J.Mol.Biol. 130, str. 161-173, 1979-. Ten DNA można następnie zwykłymi metodami biologii molekularnej przeciąć enzymem restrykcyjnym EcoRI i następnie poddać insercji do uprzednio podobnie przeciętego DNA wektora ekspresji pBLUESCRPTT-KS+R Następnie ten DNA po ligacji (mieszanina plazmidu hybrydo4

170 598 wego) można, na przykład metodą S. Fiedler i R.Wirth (Analyt. Biochem. 170, str. 38-44,1988), transformować w kompetentnych, dostępnych handlowo drobnoustrojach E. coli XLi-Blue .

Screening puli genów można również przeprowadzić znanymi metodami. W tym celu klony plazmidu hybrydowego celowo sprawdza się na ich zdolność wzrostu w odpowiednim podłożu z R,S-(±:V2.2-D.\-1CPCA jako jedynym źródłem azotu, zwykłym źródłem węgla, odpowiednim induktorem i odpowiednim antybiotykiem. Przy pomocy tego screeningu odpowiednio selekcjonuje się klony plazmidu hybrydowego, które zawierają aktywny gen hydrolazy (rad) w DNA plazmidu hybrydowego i tym samym są zdolne zużywać przede wszystkim R-(--)2,2-DMCPCA jako jedyne źródło azotu. Te klony plazmidu hybrydowego są więc w stame hydrolizować R-(---2,2-DMCPCA do odpowiedniego kwasu.

Lokalizacja genu hydrolazy (rad) następuje więc odpowiednio w plazmidzie hybrydowym pCARl (wyprowadzonym z klonów plazmidu hybrydowego), który składa się z wektora ekspresji pBLUEiSGRIPT-KS+^R oraz msercji EcoRl około 23 kb.

Właściwa lokalizacja genu hydrolazy (rad) następuje odpowiednio przez hybrydyzację znaną metodą Southem-Blot (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York 1987, rozdział 2.9). Najpierw plazmid hybrydowy pCARl trawi się odpowiednio enzymami restrykcyjnymi BamHI, Pstl, PvuII i EcoRI. Powstające przy tym fragmenty DNA hybrydyzuje się następnie odpowiednio z radioaktywnie znakowanymi oligomerami DNA, które odpowiadają N-końcowej sekwencji białek hydrolizy. W ten sposób w plazmidzie hybrydowym pCARl można wyznakować odcinek EcoRI-BamRI-DNA wielkości 2,3 kb względnie odcinek PvuD-BamHI-DNA wielkości 1,85 kb.

Oligomery DNA do hybrydyza.cji można otrzymać metodami znanymi fachowcom. Na przykład podczas chromatograficznego wzbogacania stereospecyficznej hydrolazy, oznaczania N-końcowych aminokwasów i następnie, syntezy i radioaktywnego znakowania odpowiedniej sekwencji DNA. Znany już odcinek DNA, który koduje stereospecyficz.ną hydrolazę (rad) i którego mapę restrykcyjną charakteryzuje fig. 1 może być izolowany z plazmidu hybrydowego pCARI przy pomocy enzymów restrykcyjnych BamHI i EcoRI względnie BamHI i PvuII, metodami znanymi fachowcom, aby między innymi po analizie sekwencji nukleotydów w kodzie genetycznym określić całkowitą sekwencję aminokwasów i aby otrzymać transformowane drobnoustroje przeznaczone do omawianego sposobu.

Odpowiednio do tego, w sposobie według wynalazku biotransformację przeprowadza się przy pomocy drobnoustrojów transformowanych fragmentem DNA kodującym polipeptyd o aktywności stereospecyficznej hydrolazy, którego sekwencja aminokwasów jest przedstawiona na fig. 3, jak również fragmentem DNA, który hybrydyzuje z fragmentem DNA przedstawionym na fig. 3 i koduje ten polipeptyd.

b/ Ligacja swoistej sekwencji genowej (genu hydrolazy, rad) wektorach ekspresji

Tak otrzymaną sekwencję genową można zwykłymi technikami biologii molekularnej poddać ligacji z uprzednio tak samo przeciętym DNA wektora ekspresji, do plazmidu hybrydowego.

Wektory ekspresji zwykle zawierają odpowiedni promotor, przeważnie poddający się regulacji (sekwencja kontrolna ekspresji). Za tym promotorem leżą korzystnie w kierunku transkrypcji jedno lub więcej pojedynczych miejsc cięcia dla enzymów restrykcyjnych. W tych miejscach cięcia następuje zwykle insercja pożądanego odcinka genu, którego ekspresja jest pożądana

Dla sposobu według wynalazku można stosować albo wektory ekspresji o szerokim spektrum gospodarzy (broad host range), albo można użyć na przykład dostępny handlowo wektor ekspresji pBLUESCRPTT-KS+Ε Korzystne jest zastosowanie jako wektora ekspresji pBLUESCRPPT-KS+^K z promotorem Pl ac (promotor laktozy). Celowe jest przecięcie wektora ekspresji pBLUESCRIPT-KS+^R enzymami restry kcyynymi EcoRI i BamHI albo PvuII i BamHI i ligacja, na przykład przy pomocy ligazy T4-DNA, powstających komórek restrykcyjnych z izolowanym odcinkiem DNA (EcoppRI-BamHI albo PVuII-BamHI), który koduje stereospecyficzną hydrolazę.

c/ Plazmidy hybrydowe

170 598

W wynalazku stosuje się plazmidy hybrydowe, które zawierają sekwencję genową (rad) stereospecyficznej hydrolizy.

W zasadzie odpowiednie są wszystkie plazmidy hybrydowe, które są zdolne do replikacji i ekspresji sekwencji DNA kodującej hydrolazę w wybranym drobnoustroju (szczepie produkcyjnym).

Odpowiednie plazmidy hybrydowe zawierają ze swego pierwotnego wektora ekspresji nienaruszony replikon oraz gen-marker, który umożliwia selekcję i identyfikację drobnoustrojów transformowanych plazmidem hybrydowym, na podstawie cechy 'fenotypowe j. Odpowiedni gen-marker nadaje drobnoustrojowi na przykład oporność na antybiotyki.

Aby osiągnąć efektywną ekspresję w plazmidzie hybrydowym, jest korzystne właściwe ułożenie genu hydrolazy (rad) wobec promotora (w fazie). Przykładami takich plazmidów hybrydowych, które są odpowiednie dlaekspresji genu hydrolazy w szczepie E. coli, są plazmidy hybrydowe pCAR5 i pCAR6, z genem-niarkerem bla (warunkuje oporność na ampicylinę; Ap ) i promotorem PLac. Korzystnie plazmid hybrydowy pCAR5 składa się z fragmentu Eco-BamHI-DNA/ o wielkości 2,3 kb mapa restrykcyjna fig. 1) oraz wektora ekspresji pBLUESCRffTKS+. Plazmid hybrydowy pCAR6 korzystnie składa się z fragmentu BamHl-PvuII-DNA o wielkości 1,85 kb (mapa restrykcyjna fig 1) oraz wektora ekspresji pBLUESCRHTT-KS+.

Korzystne jest stosowanie plazmidu hybrydowego pCAR6 z promotorem PLac, przy czym ekspresja genu hydrolazy (rad), zależnie od szczepu gospodarza, jest indukowana izopropylotiogalaktozydem (IPTG).

Plazmid hybrydowy pCAR6 został zdeponowany dnia 6.06.1991 pod numerem DSM Nr 6551 w E. coli XL1-Blue ,jak również dnia 21.04.1992 pod numerem DsM Nr 7053 w E. coli DH5, w Niemieckiej Kolekcji Drobnoustrojów i Hodowli Komórkowych (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Macherodeweg 1b, D-3300 Baunschweig). Fig. 2 pokazuje schemat plazmidu hybrydowego pCAR.6.

d/ Szczepy gospodarze

Tak otrzymane plazmidy hybrydowe wprowadza się odpowiednio do szczepów gospodarzy. W przypadku plazmidów hybrydowych o szerołdm spektrum gospodarzy (broad host rangę), korzystnie jest stosować szczepy-gospodarze o wysokiej tolerancji na substraty i wyciągi, jak na przykład drobnoustroje z rodzaju Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium lub Escherichia. W przypadku plazmidów hybrydowych wykazujących wąskie spektrum gospodarzy, jak na przykład plazmid hybrydowy pCAR6, stosuje się zwykle określone (specyficzne) szczepy-gospodarzy w których się one replikują.

Stosownie do tego dla plazmidu hybrydowego pCAR6 korzystne jest użycie drobnoustrojów z rodzaju Escherichia, w szczególności z gatunku E. coli, które są przedstawione w tabeli 1.

e/ Transformacja

Transformacja szczepów-gospodarzy plazmidami hybrydowymi w sposobie według wynalazku następuje znanymi sposobami. Transformowane szczepy-gospodarze izoluje się następnie przede wszystkim z wybiórczych podłoży, do których dodaje się antybiotyk na który występuje oporność warunkowa przez gen-marker zawarty w plazmidzie hybrydowym. W szczególności gdy używa się plazmidu hybrydowego pCAR6, który zawiera gen bla, do podłoża dodaje się ampicylinę.

f/ Szczep produkcyjny

Jako szczepy produkcyjne mogą w sposobie według wynalazku służyć wszystkie szczepy-gospodarze transformowane plazmidem hybrydowym, który zawiera gen specyficznej hydrolazy. Jako szczepy produkcyjne służą zwłaszcza drobnoustroje z gatunku E.coli, podane w Tabeli I, które są transformowane plazmidem hybrydowym pCAR6, jak również ich komórki potomne i mutanty.

Drobnoustroje E. coli XL-Blue (DSM Nr 6551) i E. coli DH5 (DMS Nr 7053) zostały zdeponowane, jak już wspomniano.

Jeśli na przykład jako szczep-gospodarz zostaje zastosowany E. coli MC4100 z Tabeli I (opisany w Mol. Gen. Genet. 192, str. 293-229-, 1983), ekspresja stereoselektywnego genu (rad) hydrolazy zachodzi pod kontrolą promotora PLac konstruktywnie (w sposób ciągły), na zasadzie

170 598 delecji w operonie lac (operon laktozy), (delecja arqF-lac) U169. Zatem nie wytwarza się gen represorowy lacI (gen represorowy - drobnoustrój negatywny). Jeśli na przykład użyje się jako szczepów-gospodarzy E. coli K12 (dostępny pod DSM-Nr 498) alboE. coli HBIol (H.W. Boyer i D. Roulland-Dussoix, J. Mol. Biol. 41, str. 459-472, 1969), ekspresja genu (rad) hydrolazy jest indukowana IPTG, na zasadzie obecności genu represorowego lacI (gen represorowy-drobnoustrój pozytywny).

g/ Biotransformacja

Według wynalazku do biot.ransformacji można użyć wszystkie drobnoustroje (szczepy produkcyjne) transformowane genem wytwarzającym stereospecyficzną hydrolazę, które w związku z tym stereospecyficznie hydrolizują R-(-))2,2-DMCPCA do kwasu.

Korzystnie przeprowadza się biotransformację drobnoustrojów transformowanych genem (rad) hydrolazy, którego charakterystyka jest podana na fig. 1. Odpowiednie są również drobnoustroje transformowane fragmentem DNA kodującym polipeptyd o aktywności stereosoecw· ficznej hydrolazy, którego sekwencja aminoikwasów jest przedstawiona na fig. 3. Równie odpowiednie są drobnoustroje transformowane fragmentem DNA który hybrydyzuje z fragmentem DNA przedstawionym na fig. 3 i koduje polipeptyd o aktywności stereospccyficznej hydrolazy.

Jak to już opisano, dla omawianego sposobu szczególnie przydatne są drobnoustroje z gatunku E. coli (Tabela 1) transformowane plazmidem hybrydowym pCAR5 albo pCAR6, zwłaszcza te które są transformowane plazmidem hybrydowym pCAR6. Równie przydatne są bezkomórkowe enzymy (stereospecyficzne hydrolazy) z tych drobnoustrojów. Te bezkomórkowe enzymy można otrzymać zwykłymi dla fachowców metodami, przez rozbicie komórek drobnoustroju. W tym celu można stosować na przykład ultradźwięki, prasę Frencha lub metodę lizozymową.

Do przeprowadzenia omawianego sposobu te bezkomórkowe enzymy można następnie unieruchomić na odpowiednim materiale nośnikowym metodami znanymi fachowcom.

Omawiany sposób przeprowadza się przede wszystkim przy pomocy drobnoustrojów w fazie spoczynkowej (nie rosnących), które uprzednio poddano indukcji odpowiednio do ich układu ekspresji. To znaczy że jeśli do omawianego sposobu użyje się drobnoustrojów pozytywnych pod względem genu represorowego, jak na przykład E. coli XL1-Błue albo E. coli DH5, transformowanych plazmidem hybrydowym pCAR6, indukcja następuje pod wpływem IPTG. Jeśli do omawianego sposobu użyje się na przykład drobnoustrojów z gatunku E. coli negatywnych pod względem genu represorowego (to jest w których brak genu represorowego), jak na przykład E. coli MC4100, ekspresja genu (rad) hydrolazy następuje w sposób ciągły (konstytutywnie).

W jednej ze szczególnie korzystnych form wykonania, aktywność specyficznej hydrolazy jest podwyższona przy pomocy alkoholi C1-C4.

Jako alkohole C1-C4 można stosować na przykład metanol, etanol, propanol, izopropanol lub butanol. Korzystnie stosuje się metanol i etanol.

Jako podłoże dla omawianego sposobu mogą służyć podłoża zwykłe w tej dziedzinie, jak na przykład niskomolowy bufor fosforanowy, podłoże z solami mineralnymi według Kulla i wsp., Arch. Microbil. 135, str. 1-7 (1983), albo także bufor HEPES (kwas N-2-hydroksyetflopiperazyno-2'^^tt^r^(^sr^ll^(^^owy). Procedurę przeprowadza się przede wszystkim w niskomolowym buforze fosforanowym.

Podłoże do biotransformacji zawiera celowo racemiczny R,S-(±)-D,2-DMCPCA, w ilości od 0,2 do 5% wagowych, zwłaszcza 0,2 do 2% wagowych.

Biotransformację przeprowadza się korzystnie w zakresie pH od 6 do 11, przede wszystkim w zakresie pH od 6,5 do 10.

Temperatura biotransformacji leży korzystnie między 15 i 55°C, szczególnie między 20 i 40°C.

Po zwykłym okresie inkubacji od 1 do 30 godzin, w szczególności od 5 do 25 godzin, R-(-))D,2-DMCPCA zostaje całkowicie przekształcony w odpowiedni kwas, przy czym wytwa170 598 rza się optycznie czysty S-(+)-2,2-DMCPCa. Tak powstały S-(+)-2,2-DMCPCA można następnie otrzymać na przykład -przez ekstrakcję, elektrodializę albo przez suszenie.

Przykład I. 1.1-Preparacja chromosomowego DNA Comamonas acidovorans A: 18.

Chromosomowy dna świeżej (przez noc- hoaowli comamonas acidovorans a: 18 (100 mi Nutrient Yeast Broth, 30°C- izolowano zmodyfikowaną metodą R.H. Chesney i wsp (J. Mol. Biol. 130, 161-173, 1979-: Odwirowane komórki (15 minut, 6500 x g, 4^ÓC- zawieszono ponownie w buforze Tris-HCl (2,25 ml, 0,05 mol/l- pH 8,0, z dodatkiem 10% (wag/objsacharozy.

Po dodaniu 375 μl roztworu lizozymu (10 mg/ml 0,25 mol/l bufor Tns-HCl, pH 8,0- i 900 μl 0,1 mol/l EDTA pH 8,0, zawiesinę chłodzono przez 10 minut na lodzie. Następnie dodano 450 μl 5%o (wag/obj- SDS i 50 μΐ rybonukleazy (10 mg/ml H2O- inkubowano w 37°C przez 30 minut. Po dodaniu małej ilości (na czubku szpatułki- proteinazy K i 400 μl pronazy (20 ml/ml H2Oinkubowano dalej przez 2 godziny. Po zmieszaniu z 4,3 g CsCl wirowano (30 minut, 40 000 x g, 20°C-, rozpuszczano w 250 μl bromku etidianu (10 mg/ml- 1 wirowano w ultrawirówce (probówki VTi 65.2- (ponad 8 godzin, 246 000 x g, 20°C-. Pod światłem UV o długiej fali prążki DNA odciągano z probówek. Po dodaniu 4-krotnej objętości buforu TE (10 mmoli Tris-HCl, pH 8,0, 1 mmol/EDTA- bromek etidianu trzykrotnie ekstrahowano n-butanolem nasyconym wodą. DNA precypitowano izopropanolem, rozpuszczano w buforze TE i inkubowano przez 15 minut w 65°C. Preparat można było przechowywać w 4°C.

1.2 Restrykcja i ligacja chromosomowego DNA μg DNa Comamonas acidovorans A: 18 (DSM Nr 6315- i 4,5 μg DNA wektora (pBLUESCRIPT-KS+R- cięto dodając do każdego po 20 jednostek enzymu restrykcyjnego EcoRI, w całkowitej objętości buforu restrykcyjnego 100 μl (6,5 godziny w 37°C-. Kwasy DNA strącono etanolem i suszono w koncentratorze Speed Vac^R Osady rozpuszczano w buforze do ligacji (20 mmol/l Tris, 10 mmo/1 DTT/ditiotreitol/, 10 mmoH MgCl2, 0,6 mol/l ATP /trójfosforan adenozyny/ pH 7,2- i łączono (objętość ligacji 100 μ^. Po dodaniu 1 jednostki ligazy T4 DNA inkubowano przez noc w 13⁰C.

DNA mieszaniny ligacyjnej strącono izopropanolem i rozpuszczono w 30 μl wody do transformacji.

1.3 Transformacja E. coli XLl-Blue^R i selekcja .

Kompetentne komórki E. coli XL1-Blue^K transformowano przy pomocy elektroporacji mieszaniną ligacyjną, według opisanej metody S. Fiedler i R. Wirth (Analyt. Biochem. 170, 38-44, 1988-.

Do badania plazmidów przeprowadzono selekcję na podłożu agarowym (Nutrient Agarz ampicyliną (100 μg/ml), a do badania Insercji zastosowano 0,5 mmol/l IPTG (izopropyloβ-D-tiogalaktozyd- i x-Gal (30 μg/ml, 5-bromo-4f2hk>ro-2-inndliio-2-D-2alaktopiranozyd-, przy inkubacji w 37°C.

Przy częstothwości transformacji 1,7 x 10⁸ cfu/ml (colony forming units - jednostki tworzące kolonie = żywe komórki- prawie wszystkie klony posiadały msercję EcoRI.

Przykład II. 2. Screening puli genów Comamonas acidovorans A. 18 pod względem genu R-specylicznej amidazy.

Klony z plazmidami hybrydowymi (insercja- EcoRI- sprawdzano na ich zdolność wzrostu na minimalnym podłożu agarowym według Kulla 1 wsp (Arch. Microbiol. 135, 1-7, 1983-, zawierającym 0,2% (obj/obj- gliceryny jako źródło C, 015% (wag/obj- R,S-(±)-2,2-DMCPCA jako jedyne źródło N i 0,5 mmo/1 IPTG jako induktor promotora lac, jak również ampicylinę (5 μ g/ml- dla stabilizacji plazmidów. Tylko klony, które zawierały nienaruszony gen rad hydrolazy na insercji DNA w plazmidzie, były zdolne zużywać R-(---2,2-DMGPCA jako źródło N, przetwarzać go w pożądany kwas R- i rosnąć na tym minimalnym podłożu. W ten sposób wyselekcjonowane klony wszystkie zawierały plazmid hybrydowy z wektora pBLUESCRIPT-KS+^R z insercją EcoRI około 23 kb.

Plazmid pCARl został izolowany 1 scharakteryzowany bliżej.

Przykład HI 3. 1 Izolacja R-specyficznej hydrolazy z Comamonas acidovorans A: 18 i analiza N-końcowych peptydów/

170 598 a/ Przygotowanie ekstraktu bezkomórkowcgo

1 zawiesiny komórek Comamonas acidovorans A: 18 (DSM Nr 6315), o aktywności hydrolazy [rrzy 37^OC 0,6 g R-(-))2,2-DMCIP2S/l/godz/ gęstość optyczna przy 650 nm (OD650) = 1 która uprzednio została indukowana R,S-(±)-DMCPCA, zatężono do 700 ml (OD650 = 33,5). Następnie komórki wielokrotnie wirowano, zawieszając je w buforze HEPES, i na koniec zawieszono w 40 ml buforu HEPES, przy czym całkowita objętość zawiesiny komórek wyniosła 95 ml (OD650 = 210). Aktywność hydrolazy oznaczono przy 30^OC i wyniosła ona 0,34 g produktu/l/godz/OD650 = 1 Na koniec komórki dwukrotnie poddano obróbce w prasie Frencha przy ciśnieniu 1200 barów. Aby otrzymać ekstrakt bezkomórkowy, zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 20000 x g. Otrzymano 50 ml ekstraktu o zawartości białka (mierzonej metodą Bradforda) 39,3 mg/ml i aktywności hydrolazy przy 30°C 12,5 g R-(2)2^^-2>D^(^l^(CS^1/godz/mg białka.

b/ Chromatografia.

Ten surowy ekstrakt komórkowy (50 ml) nałożono na kolumnę wypełnioną Q-Sefarozą (Pharmacia), która została zrównoważona buforem HEPES (0,1 mol/l, pH 7,5). Tę kolumnę jeszcze dwukrotnie przepłukano tym samym buforem i następnie białka wymyto gradientami buforu HEPES (0,1-1 mol/l). W sumie eluowano buforem HEPES (1 mol/l) 140 ml roztworu białka o aktywności hydrolazy, które następnie zatężono przez ultrafiltrację (błona Amicon YM10). Ilość białka w tym roztworze enzymu wynosiła 131 mg/ml, przy czym aktywność hydrolazy wynosiła 1 pmol/min/ng białka.

Następnie 2 ml tego roztworu białka naniesiono na kolumnę wypełnioną Superose-12 (Pharmacia), która została zrównoważona buforem HEPES (0,1 mol/l, pH 7,5). W sumie eluowano tym buforem 36 ml roztworu białka, który następnie zatężono przez ultrafiltrację (Amicon, błona YM10). Ilość białka wynosiła 20,1 mg/ml, zaś aktywność hydrolazy 1,2 p.mol/mm/ng białka. Tak otrzymany roztwór białka nałożono na kolumnę wypełnioną wymieniaczem anionowym Li Chirospher 2000 TMAE (sól trimetyloamonoetylowa, Merck), zrównoważoną buforem HEPES (0,1 mol/l, pH 7,5). Po przepłukaniu kolumny tym buforem, roztwór białka eluowano gradientami NaCl w tym samym buforze. Stężenie białka wynosiło 15 mg/ml, zaś aktywność hydrolazy 1,2 pmol/min/ng białka.

c/ Identyfikacja hydrolazy za pomocą jedno- i dwukierunkowej elektroforezy.

W surowym ekstrakcie komórkowym identyfikowano białko hydrolazy za pomocą SDSPAGE. Przy tym porównano w SDS-PAGE ekstrakt komórkowy nieindukowany z indukowanym (indukcja IESpAE-E-DMCPCA).

W indukowanym ekstrakcie komórkowym stwierdzono prążek białka o ciężarze cząsteczkowym 46000. Otrzymane za pomocą chromatografii frakcje białkowe o aktywności hydrolazy, również analizowano w SDS-PAGE. Białko o ciężarze cząsteczkowym 46000 zostało przez to chromatograficzne oczyszczanie wzbogacone, przy czym po trzeciej chromatografii było wzbogacone do około 80%. Tę próbę o 80% czystości analizowano w elektroforezie dwukierunkowej (2-D SDS-PAGE). Tą metodą stwierdzono spot (plamę) białka o ciężarze cząsteczkowym 46000, która odpowiadała spot (plamie) hydrolazy.

d/ Sekwencjonowame.

Otrzymana w 2-D SDS-PAGE plama (spot) białka została następnie umiejscowiona na błonie PVDF (poliwinylidendifluorek) i wycięta z tej błony. Białko to poddano sekwencjonowaniu bezpośrednio według metody Hochstrasser i wsp (Applied and Theoretical Electrophoresis 1, str. 73-76, 1988, HDL particle-associated proteins in plasma and cerebrospinal fluid).

Tą metodą zidentyfikowano 21 aminokwasów (AS) N-końcowej sekwcncjiaminokwasów.

Przykład IV. 4. Lokalizacja genu (rad) hydrolazy na klonowanym fragmencie EcoRI

4.1 Zgrubna mapa restrykcyjna pCARl

Drogą analizy restrykcyjnej według przyjętego postępowania (Current Protocols Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, 1987, rozdział 2) ustalono zgrubną mapę restrykcyyną pCARI odnośnie EcoRV, PvuII, KspI, SmaI, PstI, StuI, BamHI.

4.2 Określenie wzoru mieszanych oligomerów DNA polegające na N-końcowej sekwencji peptydów hydrolazy

170 598

Na podstawie kodu genetycznego można było określić wzór i zsyntetyzować w syntezatorze DNA dwa zmieszane oligomery DNA dla N-końcowej sekwencji peptydów hydrolazy Comamonas acidovorans A: 18.

Oligomer dna (mieszanina)

5'	ATG	T AAC	T GAC	TCT AGC c A	A GAG	T T CTC C A	T CAC
AS	Met	Asn	Asp	Ser	Glu	Leu	His

Nonsensowny oligomer DNA (mieszanina)

	A	C	T	T	T	T
5'	TG GAT	TTC	CCG	CCC	CACC	CTC	3’
			G	G	G
				A	A
AS	He	Glti	Arg	Gy	Val	Glu	AS

4.3 Hybrydyzacja Southern Biot fragmentów restrykcyjnych plazmidu pCARI.

Fragmenty DNA rozdzielone elektroforezą w' żelu agarozowym (0,6%;), które otrzymano po różnych restrykcjach z pCARl (BamHI, PstI, EcoRI), przeprowadzono przez znaną procedurę Southern Blot na nitrocelulozie (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York 1987, rozdział 2.9ff).

Podobnie oligomery DNA wyznakowano końcowo /r/-gionma-ATP: 400 ng oligomerów DNA, 22 LiCi ³²P-gamma-ATP, 11 jednostek kinazy polinukleotydowej wolnej od fosforanów inkubowano przez 30 minut w 37°C w całkowitej objętości 25 μl buforu dla kinazy polinukleotydowej (0,05 mol/l Tris-HCl, pH 7,5, 0,01 mol/l MgCl2, 5 mmol/l DTT). Następnie oczyszczanie przez sączenie w żelu Sephadex G-25 (Pharmacia) i hybrydyzacja wobec Southern Blots według znanego postępowania (wyżej podana pozycja literatury).

Przez hybrydyzację wobec oligomerów nukleotydów, odpowiadających N-końcowej sekwencji białka, można było wyznakować w' plazmidzie hybrydowym pCARI fragment w EcoRI-BamHI--WA wielkości 2,3 kb, albo fragment PvuII-BamHJ-DNA wielkości 1,85 kb.

4.4 Subklonowanie genu (rad) hydrolazy.

Fragment EcoRI-Bam! Π-DNA wielkości 2,3 kb, albo fragment PvuII-BamHI-DNA wielkości 1,85 kb, który koduje Ρ-specjy'iczną hydrolazę Comamonas acidovorans A: 18, poddano insercji do Dodobnie trawionego DNA wektora pBLUESCRIPT-KS+^K lub pBLUESCRIPT-SK+^R

Tylko jedno ukierunkowanie insercji w stosunku do promotora PLac wykazywało poszukiwaną aktywność hydrolazy w klonach po indukcji IPTG.

Wektor pBLUESCR!PT-KS+^R z fragmentem EcoRI-BamHI-DNA wielkości 2,3 kb został oznaczony jako plazmid hybrydowy pCAR6. Wektor pBLUESCRP?T-KS+^R z fragmentem PvuII-BamHEDNA został oznaczony jako plazmid hybrydowy pCAR5.

Przykład V. 5. Oznaczenie aktywności hydrolazy R-(--)2,2-DMCPCA.

Dla oznaczenia aktywności hydrolazy zawiesinę drobnoustrojów nastawiono na gęstość optyczną 0,5 przy 650 mm. Jako środowisko służył bufor fosforanowy (10 mmol) pH 7,0, zawierający 0,2 % wagowych R.S-Ę Ε-ΕΕ-ΜίΤΕ'Α. Tę zawiesinę inkubowano przez 4 godziny w 30°C, wstrząsając. Uwolniony przez hydrolazę NH+4 albo Ρ-(-2-2,2-DMGPCS mierzono i aktywność wyrażano jako g Ρ-(--)2,2-DMCPCA przetworzonego na 1/godz/gęstość optyczną przy 650 nm, zakładając że 1 mmol wytworzonego NH+4 odpowiada 1 mmol przetworzonego Ρ-ΕΡ-ΕυΜΟΡΟΑ.

Przykład VI. Wytwarzanie S-(+))2,2-D\1CPCA.

W podłożu z solami mineralnymi, zawierającym 0,2% (obj/obj) gliceryny i 0,15 %wagowych ^-(1)^,d-MCrCA, E. coli K12 z plazmidem hybrydowym pCAR6 wykazywała po indukcji IPTG aktywność specyficznej hydrolazy 1,2 g R-(-)-2,2-DMCPCS/l/godz/OD650· Przetworzenie R-ET-^-DDlCPCA do kwasu R-(-) potwierdzono uwalnianiem NH⁺4 1 analizą GC. Produkt docelowy S-(+))2,2-DMCPCA pozostawał niezmieniony w mieszaninie racemicznej.

170 598

Odpowiednio do E. coli K12, drobnoustroje umieszczono w tabeli 1 hodowano i wyniki przemian przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Aktywność sti^i^t^e^i^f^t^t^c/ficznej hydrolazy różnych szczepów E. coli

Szczep	specyf. aktywność g/1/godz/OD	współczynnik	stabilność w %⁴-	maks OD650nm	całkowita aktywność g/1/godz
Comamonas acidovorans (me wg wynalazku- A. 18 1-	0,5	1	-	6	3,0
E coli K12/pCAR6 2-	1,2	2,4	90	nt	-
E coli HBIOl/pCAR6 2-	0,25	0,5	nt	nt	-
E. coli MC4100/pCAR6 ³⁾	0,53	1	89	nt	-
E coli XLlBLUE/pCAR6 ⁵⁾(DSM Nr 6551-	0,5	1	90	30	15,0
E. coli DH5/pCAR6 ⁵(DSM Nr 7053-	2,1	4,2	100	30	63,0

1- indukcja amidem,

2- indukcja IPTG,

3- konstytutywnie,

4- stabilność plazmidu po 24 godzinach, bez selekcji antybiotykami, nt = nie badano,

5- bez indukcji

Przykład VII. Test aktywności z alkoholami C1- C4.

Testy aktywności przeprowadzono najpierw z Comamonas acidovorans A: 18, w 37°C z 0,5% R, S-2.2-DMCPCA w 10 mM buforze z fosforanem potasu przy pH 7,0. Kontrole bez rozpuszczalnika, próby testowe z 5 do 16 obj% rozpuszczalnika. Specyficzną aktywność obliczano jak opisano w przykładzie V.

Rozpuszczalnik Akty wność [rzenia^il·.

(obj%-	g R-2,2-DMCPCA/1/godz/OD650 m
—	0,64
Etanol (10-	1,24
Izopropanol(10-	1,85
Metanol (5-	1,79
Metanol (10-	1,54
Metanol (16-	1,66
Przy biotransformacjach w fermentorze 201, z 2 do 3% R,S-2,2-DMCPCA (37°C, 10

mM, bufor z fosforanem potasu, pH 7,0-, przy dodatku 5- 7,5 obj% metanolu lub etanolu można było osiągnąć skrócenie czasu przemiany i wyższą wydajność S-(+)-2,2-DMCPCA (podwyższenie selektywności). T aki sam efekt obserwowano w przypadku szczepu E. coli XLI-B lue z genem hydrolazy. Wyniki są zebrane w tabeli 2.

Tabela 2

Wprowadzono dla każdego szczepu te same aktywności (w wodzie-

Szczep	R,S-2,2DMCPCA (%-	Rozpuszczalnik (obj%j	Czas (godz-	ee (%-	Wydajność (%- *-
A 18	2,0	—	22	99	41,5
A: 18	2,3	Metanol (7,5-	15	99,2	47
XLI/pCAR6	2,8	...	24	100	36
XLI/pCAR6	2,8	Metanol (7,5-	7	98,2	46
XLI/pCAR6	2,8	Etanol (5-	7	98,6	44

*- S-łb-A-MCrCA w odniesieniu do wprowadzonego R.S-DMCPCA

170 598

Przykład VIII. Unieruchamianie stereospecyficznej hydrolazy E. coli XLIBlue/pCAR6.

Bezkomórkowy ekstrakt (288 ml) E. coli XLI-Blue/pCAR6, zawierający 28 mg białka/ml o aktywności hydrolazy w 37°C 0,29 (imola R-).D)D,2-DMCPCA/mm mg białka najpierw wstępnie oczyszczono przez chromatografię kolumnową na Q-Sepharose (Pharmacia). Białko hydrolazy eluowano gradientami NaCl (0 - 1 mol/l) w buforze Tris HCl (0,1 molowy, pH 7,5). Białko o aktywności hydrolazy, które eluowało się między 40% i 80% gradientu NaCl, zatężono przez ultrafiltrację (Amicon, błona YMIO) i odsoiono przez filtrację w żelu (FD-10, Sephadex G-25M, Pharmacia LKB). Końcowa objętość wynosiła 47 ml w buforze z fosforanem potasu (0,1 molowy, pH 7,0) i zawierała 67 mg białka/ml o aktywności hydrolazy w 37°C 0,69 μmola R-(D)D,2-DMCPCA/mm mg białka. Ta wstępnie oczyszczona stereospecyficzną hydrolaza została unieruchomiona na preparacie Eupergit C jako materiale nośnikowym (Rohm Pharma GmbH, Weiterstadt, RFN). Nastąpiło przy tym kowalencyjne wiązanie grup oksyranu (Oxiran ggruppen) nierozpuszczalnego materiału nośnikowego z wolnymi grupami aminowymi białka hydrolazy. Unieruchomienie przeprowadzono przez 90 godzin w temperaturze pokojowej, w buforze z fosforanem potasu (1 molowy, pH 8,5). Otrzymano 10,2 mg unieruchomionego białka/g wilgotnej masy Eupergit C, o aktywności hydrolazy w 37°C 1,5 μmola R-(-)-2,2DMCPCA/min g wilgotnej masy Eupergit C. Stabilność unieruchomionej hydrolazy w 37°C w buforze z fosforanem potasu (10 mmolowy), pH 8,5), zawierającej 0,5 wagowych % R,S-(±)2,2-DMCPCA, jest przedstawiona w tabeli 3.

Tabela 3

Czas godz.	Aktywność unieruchomionej hydrolazy (pmol R-(--)D,2-DMCPCA'mln g wilgotnej masy Eupergit C)
0-90	1,5
90-185	0,68

170 598

FIG. 2

ΓΩ tn •Η (Κ

170 598

4 υ

»t- - »33 u .. _ »33

u 4 85

8h W O

X 4 W “f Ul

X 0» o u P X

U 3 P 4 P u

P 4 X P X

P 4 O -X P X

X 3 G3

X 0 P u V °-

x x p er p —« PU <5 ρ p x

y

x er p u tj X

er tr

u u Ο»

5 χ o o

U ć X X υ o

&3

P w X 4 O x

u er O U υ x

p er υ u O X

P >· 83

X er P u P X

p ά P u P 0»

xx p er ρ χ pu P P P X

O 4 P x P- P

< » M 2S

8

tr u w

U o o s gj

U 4 H x X X

O 4 υ χ o x

U οχ 4 P X

Ś3

o c X ”Ί υ ρ

P o. X 4 P X

U 4 P X P X

P 3 δ3

Η x H 4 p X P -< P P P X

P 4 P -« P X

x er p u υ x

E;

Al σ» u

»35 » O«J

8? O <

u · t— X X

H C 33

^33

ΟΧ δί

u er 0 w υ x

u 0 0 u U A.

P er 83

P 0 P u P As

U XH p er P-. p u p p (Q p X

Ρ χ P P P

P 3 GJ

P δ;

σ» er 4

o u 3 u · ^υ < Ul

O 4 υ χ o x

O 3 X X P o

o α u u Η H

^3

U 3 t U

P >* P X O P

82 X X

P c X X P P

P « 8Ϊ

X ° 0 uCOp m po. Ρ Ο-

P 0 u u O eu

Ρ Ο» U U P X

P o X '

4 U er

» U O. - 33

o 3 gj

U 4 83

$3

U >· 83

U 4 P X X «X

P 4 33

83 P >

X X P X ΟχΡ

υ 4 pa χ -r p U U X Η H

O χ P -* P P

Ei

8 P

u X» X»

S 33

Ei

p α X 4 P X

U 4 33

§3

Hp er trto u e^u< ”83

U U U 4 P m

X 0 U P P a.

32 p o*

δ2 P X

P 4 X □ 8ί_Μδ3

U 4 X -« P X

X 4 83

8 P

U O O

SEi

U 4 33

u 4 83

U 4 33

G2 u 0.

£3

X >» P -X P P

P C 33

0 0» Ρ M P X

X cr3P X p U 7; P -M p X-Mp P

Ej

8d P P

8

er 4 0»

er r> u ρ θ ο»

82 U X

8? P X

u o u u U O-

H 4 X X υ X

Ei

0 0 u u U Oe

δ2 P 0»

P >. P X P P

X x P X P P

u u^x er 0 4 PU Pm Ρ x

X X P X P P

H 4 X -4 U X

y

υ u er

er xi U 4 « o

υ U U £ 4 H

82 U X

δ? u X

P er 0 u u X

gj P X

P 4 X -X O X

O -X δί

u u X X ł* P

δ3 x p

H 3 P 4 Η 4 P X bu o x

0 er p u o X

P u P £ X H

P 3

<4 U XI

er λ er «

P X r· 4 b >

U 4 83_w

u >» p *x O u

υ er 0 u U X

32 P a.

83

P er P M U X

P 0 P u p 0.

P X 83

PO pu PU P £ PA. X P

p 0 0 u p 0-

Ś3

H X P

Λ» U O

er tr o er 5

O 3 X X P P

u α du o X 4 co u P X Ε_υ ft, rn

0 er 83

82* U X

8 0

υ x 83

X >» 83

§3 2o

P 4 83

S3

P 3

υ σ»

Ρ ο ο □

GJ

Ο X

Μ 3 &

>?

υ α δ3

Ο 3 X X Ο ο

8? Ο X

G5

X Η δ3 δ

X >·

Ο ο Ο U U ο» υ 4 χ χ ρ X

er er u

4 4 0

υ er er

p u 8J

Ei

E

X 4 >

X P υ

er u X

Ej

O 4 33

x er p u 0 X

P 0 P u p X

P 0 u u p A.

X 4 83

Ei

GJ P X

P 0 P u p a.

P 3

er XI 4

4 tr

er u u

0 u P 4 P V>

P 4 83

δ

4 X X

p 8

4 X X

0 0 u u p A.

X >. 83

Ej

X X 83

δ2 P X

P 4 X -J P X

33 P X

P >· 83

§

er 0 u

O 4 u

0» 4 tr

£2 X χ

P c 33

c P

O U A.

δ

4 X X

35 P P

O 4 35

82 P X

P X 83

P 4 35

P c 33

82 P X

P 4 P X P x

Eo

P 3

AJ u

AJ O

0* (l

P er

P c

X

>.

P

e

δ 2

P X

p tr

82

ρ χ

0 >·

P 0*

X 0

P 9

fi

AJ

U

υ

83

33

P

X

3

P X

p u

P X

px

P U

υ u

Γ. Έ

P

p

O X

P P

0 X

P X

P o

P P

P X

ρ χ

P u

P

AJ Ol

4 er

u u

ej er

0 -

5

c

P

a

0 0

P 4

X 0

82 P X

P 0

8Λ P P

X 4

X 9

S! *-

3

Γ»

AJ

er

p u P X

83

3

X P

8

X X

P u p cu

83

0 u O X

8 i:

83

GJ

85

P

er AJ 4

CJ er u

0 tr er

0 u P 4 f. M

Ei

G4 P X

δ

X X P

Eo

O o Px X *-·

P 0 P u O x

P 4 33

O 4 85

G2 P X

P X ρ χ P P

X er P U P X

P 4 X X P x

E

U tr u

AJ er er

P c 33

P X δί

P P P

>- X P

P P u

tr 3

P 4 33

82 O X

P 3 X X P P

§3

0 2 p X

P 4 83

32 P X

P 4 X P X

p er P u P x

0 u P

er u

4 4

u

P 4

P u

δ P

er

u

4

P a

ρ x

p er

82 ρ X

X 4

p tr

p er

P 0

2

AJ

U

4

P X X »-»

P £ X P

3

X X

33

Ej

83

p u P X

83

P u P X

p u P X

υ u CJ a.

D

AJ O

er 4

U

P □

p-j

0

4

P

4

x er

P X

P c

P 4

9 3

p >

o a

P X

H >-

P

U

er

4

X X P P

G5

8

>» P

8

X U

83

Ei

33

δ3

Ej

83

X 4 P X

Gi

83

3

0» er

AJ U

U O*

82 p -i

O u

P

4

X

tr

0 u

F⁴ *

P >·

P 4

£J X M

P X

X X

G2 P A.

1· *

X

u

U

aJ

P P

8

X X

P X

3

85

p X O P

33

83

G

er er 4

er u u

tr 4 u

8d P P

5S X vt

P P X

U £ P

X 8

>. X P

32 P A.

§3

P 3 GJ

85 X *»

82 P X

E3

§3

p >. ρ χ P P

δ3

P 8

tr U U

0* er AJ

u U «J

Ei

U 4 35

E

4 X P

P 3

4 X

32 U A.

u χ 83

P 4 X χ P X

82 P X

P 4 83

δ 2 P x

82 P X

δ3

G5 Η ΙΛ

δ

4 er

O er

AJ

P 3

8 P

tr

P

O

X tr

0 X

P 4

p a

p r.

P X

83 P P

X >·

f*

Al

AJ

υ

X X P P

5 J

u X

0 P

U 0.

83

Εδ

X 4 P X

83

Ei

83

3

er u er

O U er

tr er u

Ej

P er 85 «_

P δ A

X 4 >

P 8

u 4 vt

82 P X

O 4 33

^3

32 P X

P a X 4 P X

33 P X

δ3

G2 p a.

δ3

§

ο 4 ο

8-Η Μ4θ .

χ VI Ρ · ρ afc4 ο ·< 8:

Ο Α.

Ε:

Ρ ο U U ρ ο8?

8Λ ρ ρ

SS §3 ρ 4 ι« υ ρ c

Η 4

U >· χ >* §5 §3

Ρ >·

Ρ 4

Ο □ gj χ σ» ο u ρ χ

Η (X X «ί

Ρ <.

$3 8 υ tr Ε ρ u Π ρ χ Ο

Ε· δ

Al* Val Leu Gly His ila Ala Leu His Leu Pro Val Arę Pro His Gly Gin Pro His Asp His Ale Ala Arg Arg Thr His Phe —cgc gcc cgt ggc ctt cca gtt egt ggc ccc ega ctt ccg ega aga cet get ggt gcg ege ggg ctg ggc gtt cca gca gge cac gga etę ges cag aca gca ccc tgc tgc ctg age tgc ctg age cgc cag gcc ggt ggc gcg aca cgg gcc tgt cac aca gcc ttc eta gac tgg cgc

Pstl BaimHI gat gtc ctt gat ega gat gga agg tgt cgc caa gtc ctg ggg cgg cac cac ggc get gca ggc get gga tet gcg cat tga aec cgg atc

170 598

FIG. 1 ρ-EcoRI - 0,45 EcoRV - 0,43 — Pvu It 0

- 0,29 — Kspl 0,50 — Smai 0,55 — Pstl 0,66 — Smal 0,74

D

O.

-Stul 1,28 ^Smal 1,29

1,57

- Pstl 1,81 BamHI 1,85

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania S(+)-2,2-dlmntylocyklopropanokarboksarmdu metodą inżynierii genetycznej, znamienny tym, że przy pomocy drobnoustrojów transformowanych genem o sekwencji nukleotydów przedstawionej na fig. 3 i miejscach restrykcyjnych scharakteryzowanych mapą przedstawioną na fig. 1, wytwarzającym stceOoofpeyficzną hydrolazę, w racemicznym R,S-(dy)--..Zdimeeylocyklopropariokarboksamid/.ie R-(---d,2-dimntylocyklopropanokarboksamid biotransformuje się do kwasu R-(d-d,2-dimetylocyklopropanokarboksylowego, przy czym powstaje optycznie czynny S-(+))d,2-dimntylocykloprrp^mokarboksamid który się izoluje.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy pomocy drobnoustrojów transformowanych fragmentem DNA, kodującym polipeptyd o aktywności stereospecyficznej hydrolazy, którego sekwencja aminokwasów jest przedstawiona na fig. 3.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy pomocy drobnoustrojów transformowanych fragmentem DNA, który hybrydyzuje z fragmentem DNA przedsiawionym na fig. 3 i który koduje polipeptyd o aktywności stereo5pecyflc/nej hydrolazy.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy pomocy drobnoustrojów z rodzaju Escherichia, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Rhizobium lub Agrobacterium.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy pomocy drobnoustrojów z gatunku Escherichia coli.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy pomocy drobnoustrojów z gatunku Escherichia coli XLI-Blue (DSM-Nr 6551), które są transformowane plazmidem hybrydowym pCAR6, albo ich komórek potomnych i mutantów.

7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, ze biotransformację przeprowadza się przy pomocy drobnoustrojów z gatunku Escher^ichia coli DH5 (DSM-Nr 7053), które są transformowane plazmidem hybrydowym pCAR6, albo ich komórek potomnych i mutantów.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy pomocy unieruchomionej stereospecyficznej hydrolazy.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się w środowisku, zawierającym rayemiy/ny R,S-(±)-d,2-dimntylocyklopropanokarboksamid w ilości od 0,2 do 5% wagowych.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biotransformację przeprowadza się przy pH od 6 do 11 i w temperaturze od 15 do 55°C.