JP2001524805A - 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 良好な安定性を有し、二環式ラクタムである2-アザビシクロ[2,2,1]ヘプト-5-エン-3-オンの一方のエナンチオマーを加水分解して(-)ラクタムおよび(+)アミノ酸とすることのできるラクタマーゼ酵素が、コマモナス・アシディボランス(Comamonas acidivorans）のある株に見出された。この株を単離し、クローン化し、その構造を同定した。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物、該微生物より得られるラクタマーゼ酵素、およびその使用 技術分野 本発明は微生物、当該微生物より得られるラクタマーゼ酵素およびその使用に 関する。 背景技術 二環式γ−ラクタム、2-アザビシクロ[2,2,1]ヘプト-5-エン-3-オンは、近年 治療剤として有用であるとされてきた炭素環式ヌクレオシドの調製に有用である 。かかるヌクレオシドのターゲットとして文献に記載されている領域には、抗ウ イルス（例えばヴィンスとフア、ジェイ・メド・ケム(J．Med．Chem.)33:17-21( 1990)，例えば抗ＨＩＶ）および心臓血管拡張剤（アデノシンアゴニスト）が含 まれる。かかる剤における炭素環式環の主な有用性は、この化合物が体内の酵素 による分解に対して抵抗性であるということである。これに比べて、天然由来の リボシルヌクレオシドはヌクレアーゼによってより切断されやすく、そして生理 活性が失われやすくなる。 炭素環式ヌクレオシドは天然由来のものも知られており、例えばストレプトマ イセス・シトリカラー(Streptmyces citricolor)由来のアリステロマイシンが挙 げられるが、天然から得られる量は少なく、また、単離された生成物はさらによ り有用な化合物を得るために処理される。より経済的な経路は、所望の化合物を 、γ-ラクタムから出発し、化学的に合成することである。しかしながら、化学 合成されたγ-ラクタムはラセミ体である。従来の合成によって、最終的に得ら れる薬品もまたエナンチオマーの混合物であり、一方のエナンチオマーが非常に 活性ではなく、あるいは副作用を示すような場合には、規制の問題を生じる。し たがって、ラセミ体のシントンの二つのエナンチオマーのうちのいずれかを分離 でき、残存成分が薬剤として構築されるようにする必要性がある。 このことを実現するための有用な手段は、一方のエナンチオマーのアミド結 合を選択的に加水分解して環状アミノ酸とし、もう一方のエナンチオマーをその ままとする酵素を用いることである。残ったラクタムを次いでジクロロメタン中 へ抽出し、結晶化して精製し、そして所望の薬品を構築するために用いることが できる。正しい酵素を注意深く選択することによって、高い選択性を持って一方 のラクタムエナンチオマーのみに選択的である酵素を見出して、例えば50％より わずかに高い転換率まで転換させれば高いｅｅ（＞９０％）のラクタムを得られ る。２つのエナンチオマーのいずれにも選択的な酵素は，見出されている。 ＥＰ−Ａ−０４２４０６４は上述の分割を行うための方法を開示し、異なった 選択性を有するふたつの酵素を産生する微生物を提供する。ロドコッカス(Rhodo coccus)のある株は(-)ラクタムを加水分解することによって、(+)ラクタムを単 離して別の用途に用いることを可能とする。一方シュードモナス菌(Pseudomonad )のある株は(+)ラクタムを加水分解して、(-)ラクタムの単離を可能にする。 かかる選択的加水分解を行う他の酵素は文献に開示されている。即ち、タイラ ーら、テトラヘドロン：アシメトリー4(6):1117-1128(1993)はシュードモナス・ フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)から得られた(+)ラクタムの加水分解 に特異的な酵素およびアウレオバクテリウム(Aureobacterium)のある株から得ら れた(-)ラクタムの加水分解に特異的な酵素を開示する。(+)ラクタムを選択的に 加水分解する他の酵素が、ブラッバン(Brabban)らジェイ・インド・マイクロバ イオロジー16:8-14(1996)に記載されている。 強力な産業用バイオトランスフォーメーション系を開発するためには、比較的 安定な酵素もしくは全細胞バイオ触媒を用いることが望ましい。こうすることに よって、バイオ触媒を固定化してリサイクルおよび再利用が可能となり、バイオ 触媒のコストをかなり下げ、そしてバイオ触媒を顕著な活性のロス無く大容量の もとで取り扱うことが可能となる。より安定なバイオ触媒は、高基質および／ま たは生成物濃度下においても不活性化されることなく耐えられるということもし ばしば認められる。これによって、バイオトランスフォーメーションが、与えら れた動態学および取り扱い条件下において可能な限りの最も高 い濃度の反応物のもとで行われることが可能となる。このことによって、二つの 有利な点がある：ひとつは、最小の反応体積でよいこととなり、そして生成物を 産生する際に少ない体積の液体でよいという点である。 タイラーら、既出、はアウレオバクテリウム種からのラクタマーゼが高温下で 非常に安定であり、選択的に(-)γ-ラクタムを加水分解して、(+)γ-ラクタムと (-)アミノ酸を生成物として提供することを示す。この微生物からの酵素を固定 化したものは、数ヶ月にわたる使用において安定性を保持している。ブラッバン 、既出、が数多くの異なる単離物をスクリーニングしたにもかかわらず、良好な 安定性を有し、かつ上記と反対の選択性を有する酵素は知られていない。シュー ドモナス菌タイプの微生物を用いる先の研究では必要なラクタマーゼ活性を有す る微生物は不安定であることが示されている。残念なことに、より自然に近い立 体化学を有しており、その機能を確立するのが例えばアウレオバクテリウムのラ クタマーゼの活性により生成される(-)アミノ酸より容易であるのが、より有用 なシントンである(-)γ―ラクタムである。したがって、(+)二環式γ-ラクタム に対してより高い選択性を有する安定なγ-ラクタマーゼの出現が望まれている のである。 発明の開示 驚くべきことに、環境から単離されたコマモナス・アシドボランズ（Comamona s acidovorans）が所望のγ-ラクタムの分割の工業的工程に用いるための、高い 可能性を有する酵素を産生することが見出された。この酵素は以前に同定された (+)γ-ラクタマーゼより、非常に高い温度安定性を示すだけでなく、この酵素を 用いれば非常に高い基質／生成物濃度下においてもバイオ分割が可能になる。こ の微生物はイギリス、アバディーン、セイント・マーチャーストリート２３番地 、NCIMBに１９９６年８月３０日、微生物の国際寄託のためのブダペスト協定に 基づき寄託し、寄託番号NCIMB 40827が付与された。 γ-ラクタマーゼをコード化する遺伝子を単離、配列決定した（配列番号1参照 ）、そして酵素のアミノ酸配列を誘導した（配列番号2参照）。本発明はこの構 造を有する化合物、および当業者には容易に理解される同じ活性を有するこのフ ラグメントに関する。新規酵素はその安定性に特徴付けられる。即ち本 発明の新規酵素は以下の点のいくつかを満たす： 40℃にて4時間置いた後に85％を超える活性を保持しているか、または60℃に て4時間置いた後に30％を越える活性を保持している。 ラクタムのラセミ体100gと緩衝液300mlという初期濃度のものを加水分解し、 少なくとも90％の(+)ラクタムを分解するまで加水分解しつづけ、その一方、(-) ラクタムの加水分解が5％未満である。 発明の詳細な説明 新規酵素は、必要なγ-ラクタマーゼエナンチオマー混合物、すなわちラセミ 体混合物をエナンチオマー特異的に加水分解するのに有用である。反応後、残存 する(-)ラクタムは加水分解により調製された(+)アミノ酸から容易に分離するこ とができる。この反応の両方は、当業者に知られた条件下において実施される。 酵素としては全細胞を用いても単離されたものを用いてもよい。また、酵素は 所望により固定化してもよく、固定化方法は当業者に公知である。 酵素は寄託した微生物から調製し得る。または、酵素は組換え技術により調製 してもよい。 本出願にて開示したDNAおよびアミノ酸配列を用いて、当業者は容易にここに 開示した遺伝子および酵素のフラグメントもしくは変異体を構築し得る。かかる フラグメントおよび変異体であって、具体的に示された酵素の活性を有するもの は、本発明の範囲内である。さらに、遺伝子コードは重複しているため、様々な 異なるＤＮＡ配列がここに開示するアミノ酸配列をコード化し得る。かかる別の ＤＮＡ配列であつて同じ、もしくは類似の酵素をコード化するものがあることは 当業者のよく知るところである。かかるDNA配は本発明の範囲内である。本明細 書におて「本質的に同一」の配列とは、活性に重大な影響を与えないアミノ酸の 置換、欠失、付加または挿入を有していることをいう。活性を保持しているフラ グメントもまた、この定義に含まれる。 本発明の遺伝子は、公知の方法により単離し得、広く様々な微生物宿主に導入 することができる。遺伝子の発現により、直接あるいは間接的に酵素が細胞内で 産生され、維持される。遺伝子は適当なベクターを介して微生物の宿主に 導入すればよい。 導入する遺伝子を安定に維持し、発現させることのできる条件において微生物 宿主に遺伝子を導入するには、広く様々な方法を用いることができる。ＤＮＡ構 築物には遺伝子の発現のための転写および翻訳調節シグナル、これらの調節コン トロール下の遺伝子および宿主微生物内の配列とホモロガスなＤＮＡ配列を有し 得、これによってインテグレーションが生じ、および／または宿主の複製系機能 が働いてインテグレーションもしくは安定な維持がなされる。 コードもしくはセンス配列の転写の方向において、つまり5’から3’の方向に おいて、DNA構築物は、転写調節領域（あれば）およびプロモーター、調節領域 はこのプロモーターの5’または3’のいずれかにあってもよい、リボソーム結合 部位、開始コドン、この開始コドンと同相のオープンリーディングフレームを有 する構造遺伝子、終結コドン、ポリアデニル化シグナル部位（あれば）、そして ターミネ-ター領域が含まれ得る。二本鎖としてのこの配列はそれ自身を微生物 の形質転換に用いてもよいが、通常はマーカーを含むＤＮＡ配列に含まれる。 遺伝子は、転写／翻訳イニシエーションおよびターミネーション領域の間に導 入して、開始領域の調節支配下に置くようにできる。かかる構築物を、少なくと も1の複製系を有するプラスミドに導入する。複製系は1以上であってよく、かか る場合には、1の複製系がプラスミドの増殖に使われ得る間、第2のプラスミドが 最終的な宿主内で機能を発揮するのに必要となる。さらに、1または複数のマー カーも、上述のごとく存在させてもよい。インテグレーションを所望する場合、 プラスミドが宿主ゲノムとホモロガスな配列を有していることが望ましい。 形質転換体は所望の微生物を非改変微生物、すなわち形質転換しようとする微 生物から選択できる従来の方法により単離すればよい。次いで、形質転換体の活 性を測定する。 好ましい宿主細胞には原核細胞および真核細胞が含まれる。一例として、大腸 菌(E．coli)が挙げられる。 以下、実施例により本発明を説明する。 １．γ-ラクタマーゼ産生の可能性のある株の単離 およそ1gの排水溝の汚泥を20mlの50mM燐酸カリウム緩衝液、pH７、によく混合 し、室温で30分間振とうした。この懸濁液0.4％を三角フラスコ内の25mlの濃縮 培地へ接種し、30℃にて41時間振とうした。以下の濃縮培地を用いた： （gl^-1） 酵母抽出物 0.1 NH₄Cl 2.0 KH₂PO₄ 7.0 Na₂O₄ 2.0 MgSO₄ 0.4 CaCl₂ 0.2 微量物質溶液 0.2 二環式γ-ラクタムのラセミ体 2.0 5M NaOH pH7に調節 微量物質溶液は以下の成分からなる： （gl^-1） CaCl₂・2H₂O 3.6 ZnO 2.0 CuCl・2H₂O 0.85 Na₂MoO・2H₂O 4.8 MnCl₂・4H₂O 2.0 FeCl₃・6H₂O 5.4 H₃BO₃ 0.3 COCl₂・6H₂O 2.4 濃HCl 250ml 次いで、この接種液0.5%を第2の濃縮培地フラスコ(25ml)(培地組成は上記と同 一である)に移し、さらに94時間培養した。この時点において、このフラスコか ら取った試料を10mMの燐酸緩衝液(pH7)で希釈し、以下の培地上へ蒔いた。 （gl^-1） 酵母抽出物 0.1 NH₄Cl 2.0 KH₂PO₄ 7.0 Na₂HPO₄ 2.0 MgSO₄ 0.4 CaCl₂ 0.2 微量物質溶液 0.2 ノーブル寒天 2.0 5M NaOH pH7に調節 上記培地をオートクレーブにかけ、冷却して2.0g/1 N-アヤチル-L-フェニルア ラニンを濾過滅菌したものを添加した後にプレートに注いだ。30℃にて6日間の インキュベーションの後、コロニーを摘出し、さらに寒天平板培地上で精製し、 スクリーニングに用いた。 ２．得られた単離物のスクリーニング 単離したコロニーは以下の培地内で増殖させた： （gl^-1） 酵母抽出物 5.0 NH₄Cl 2.0 KH₂PO₄ 7.0 Na₂HPO₄ 2.0 MgSO₄ 0.4 CaCl₂ 0.2 微量物質溶液 1.0 二環式γ-ラクタムのラセミ体 2.0 グルコース 10.0 5M NaOH pH7に調節 コロニーを、滅菌プラスチック容器に入れた４ｍｌのフィルター滅菌済み培地 内へ接種し、30℃で約24時間振とうして増殖させた。 培養物は遠心分離して、ペレットを1mlの50mM燐酸緩衝液、pH７に再度希釈し た。この懸濁液に二環式γ-ラクタムのラセミ体を同じ緩衝液に希釈して100g/l としたものを1ml添加した。反応は30℃にて振とう下で行った。試料は7日間にわ たって取り、ラクタムの転化をHPLCにて調べた。この反応で顕著な加水分解、エ ナンチオマー過剰（ｅｅ）がＧＣにて検出された。 所望の性質を有する1つの株が単離された。最初のスクリーニングにおいて、 この株は144時間のバイオトランスフォーメーションの後、添加した基質52％を 転化し、残りのラクタムは(-)エナンチオマーであった。エナンチオマー過剰度( ee)は＞99％であった。NCIMBによる同定では、この微生物はコマモナス・アシド ボランス(Comamonas acidovorans)の株であると示された。この株は上記の通りN CIMBに寄託している。 以下の分析方法を用いた： 加水分解度(HPLC)。試料を適当な濃度に希釈し、20μｌを15cmクロマシルC-8 カラム上に注入した。溶離液：50％メタノールの10mM燐酸緩衝液、pH７。流速： 1ml/分、測定時間：5分間。検出はλ＝225nmにて行った。 反応性生物のｅｅ（ＧＣ）。試料は酢酸エチル内に抽出し、無水硫酸マグネシ ウムにて乾燥させ、50m CPシクロデキストリン・キャピラリー・カラムへ注入し た。オーブンの温度を分析の間に、最初の140℃から200℃まで上げた。 ３．醗酵 種フラスコを以下の培地を用いて調製した： （gl^-1） 酵母抽出物 1.0 (NH₄)₂SO₄ 1 KH₂PO₄ 5 MgSO₄・7H₂O 0.1 CaCl₂・2H₂O 0.05 微量物質溶液 0.1 NaOH pH7に調節 微量物質溶液は濃HClの量が333ml/lであること以外は上記と同じ物を用い た： 75mlの培地を500ml容の三角フラスコ内に調製した。フラスコへ微生物を接種 し、これを25℃にて振とうして吸光度(520nm)が3.5から7の間に到達するまで、 インキュベートした。以下の滅菌培地1.5Lを含有する醗酵槽へ、得られた細胞0. 1%を接種し、培養した。： （gl^-1） 酵母抽出物 2.0 (NH₄)₂SO₄ 2 KH₂PO₄ 5 MgSO₄・7H₂O 0.5 CaCl₂・2H₂O 0.1 微量物質溶液 1.0 コハク酸 10 PPG 2025 2ml NaOH pH7に調節 最初の温度を25℃とし、ｐＨは7.1に調節した。空気流入速度を約0.5vvmに保 持し、500から1000rpmにて攪拌して好気性の条件を保持した。18.6時間後、濃縮 酵母抽出物のゆっくりした供給を、2gの酵素抽出物を、出発体積1リットル、1時 間あたり添加するのに等しい速度、すなわち1時間につき3gの添加、を開始した 。醗酵を24時間後に終了し、細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペーストとし て将来の使用に備えてフリーザー内へ保存した。総バイオマス約82g湿細胞を回 収し、最終醗酵活性収率は0.45U/mlであった(1Uは1μモルのγ-ラクタムを1時間 に加水分解する)。 ４．温度安定性 35.8gの細胞ペーストを解凍し、10mM燐酸ナトリウム(pH7)、10mM EDTA, 0.1% トリトン-Ｘ-100、5mMジチオスレイトールおよび1mg/mlのリゾチームを含む70 0m1の溶菌バッファーへ添加した。この溶菌バッファーを室温で5.5時間攪拌し、 次いで37mlの5%ポリエチレンイミン溶液であってｐＨを7にＨＣｌにて調節した ものを添加し、さらに4時間攪拌し、遠心分離により上澄を回収し た。 500mlの上澄へ、よく攪拌しながら174gの硫酸アンモニウムをゆっくりと添加 し、この塩を溶解させた。20分後、沈殿を遠心分離により回収し、100mlの10mM 燐酸ナトリウム、pH７に再懸濁させた。これを、次いで5Lの10mM燐酸ナトリウム ｐＨ7.1に対して2度透析をし、フリーザー内に保存した。 温度安定試験のためには、冷凍した透析物を融解し、2×25mlの試料のバッフ ァーを35ml燐酸緩衝生理的食塩水(PBS)または10mMトリス緩衝液（pH8.0）と、セ ファデックスG-25ゲル濾過カラムを用いて交換した。バッファーを10mMトリスに 交換すると、沈殿(いくらか活性を有する)が生成したが、これは遠心分離にて除 いた。各調製物の試料を次いで60℃のホットブロック内、40℃の水槽内または25 ℃のインキュベーター内に置いた。1、2および4.3時間にサンプルを取り、残存 ラクタマーゼ活性の分析に供した。以下の結果は4.3時間のインキュベーション 後のものである： 緩衝液 温度 残存活性 （℃） （出発物質の％） ＰＢＳ 25 97 ＰＢＳ 4.0 87 ＰＢＳ 60 32 トリス(pH8) 25 110 トリス(pH8) 4.0 105 トリス(pH8) 60 45 これに比べて、シュードモナス・フルオレセンスγ-ラクタマーゼは、ブラッ バンら（既出）によると37℃で4時間置くと70-80％までの活性を失ってしまうと いうことである。新規酵素は明らかに高い温度安定性を有している。この高い温 度安定性により酵素の固体支持体上への固定化が可能となり、そして多くのバイ オトランスフォーメーションにおいて再利用することが可能であり、これによっ て大いにコストを下げることができる。 ５．全細胞バイオトランスフォーメーション 最終酵素収量が0.67U/mlである以外は、上記実施例3と同じ醗酵によって得た 冷凍細胞ペースト(25g)を解凍し、50mM KH₂PO₄(300ml，pH7)内で攪拌し、ここへ 固体γ-ラクタム(100g)を加え、反応物を25℃で24時間攪拌した。セライト(28g) 次いでポリエチレンイミン(5％水溶液を28ml)を添加し、続いてイソプロパノー ル(175ml)を添加した。さらに10分間攪拌した後、固体を濾過により除き、濾液 を真空下で蒸発させて200mlとした。水相をジクロロメタン(200ml)にて５回抽出 し、次いで有機抽出物を無水MgSO₄にて乾燥させた。フィルターケーキをアセト ン(150ml)にて洗浄し、抽出物を乾燥（無水MgSO₄)し、全ての有機フラクション を合わせて真空下で乾固するまで蒸発させた。収量は43.3g、オフホワイト固体 として得られたものは、ee>99％の(-)ラクタムであった。 このバイオトランスフオーメーションは、非常に高い基質濃度において（3ml のバッファーに対して1gの基質）実施し得、そして該濃度においても(+)ラクタ ムエナンチオマーの完全な加水分解を行い得る。これによって、高い容量-効果 が得られ、最少体積内にて(-)ラクタムを製造することが可能となり、こうして 液体処理の必要が減少し、バッチバイオトランスフォーメーションにおける反応 槽の容積を減らすこともできる。 ６．遺伝子の同定および単離 一定量の細胞ペースト(500mg)を、リゾチーム(1.5mg/ml)を添加したTESSバッ ファー(50mM トリスHCl[pH8.0]，10mM EDTA，25mM NaCl，25% w/vシュクロース) にて処理した。処理は37℃で1時間行い、得られたスフェロプラストを10％SDSを 添加して(最終濃度1.5%)溶菌した。この細胞溶菌物へ固体塩化セシウムを1g/ml となるよう、添加した。溶解させた後、エチジウムブロミドを最終濃度80μg/ml となるよう添加した。懸濁液をソーブオール・ウルトラクリンプ（Sorvall Ultr acrimp）超遠心管に入れ、30,000rpm 20℃にて72時間遠心して密度勾配を確立し た。分割されたものの強いエチジウムブロミドのバンドを可視化した後、ゲノム ＤＮＡをシリンジにて分取した。エチジウムブロミドは塩化セシウムのブタノー ル内飽和溶液にて抽出して除いた。最終的に、得られた染色体ＤＮＡを10,000体 積部のＴＥバッファー(10mM トリスHCl，1mM EDTA[pH8.0])にて2回透析した。 染色体ＤＮＡライブラリーをSau3AI（プロメガ社）制限エンドヌクレアーゼを 用いた時間依存性部分制限消化によって調製した。水平アガロースゲル電気泳動 によって1.0から4.0kbの範囲にあるＤＮＡフラグメントを分割した。これらのフ ラグメントは、TBE(16mMトリスHCl[pH8.0]，8mMホウ酸，400μM EDTA)内で25mA の電流をかけて電気泳動を行うことによって切り出した。溶離されたDNAフラグ メントは等体積のトリス緩衝フェノール：クロロホルムによる抽出およびエタノ ールによる沈殿にて精製した。Sau3AI部分染色体DNAフラグメントをpUC19内へラ イゲートした（ヤニシュ-ペロンら、ジーン33：103-119(1985)参照）。クローニ ングベクターpUC19は先にBamHI（プロメガ社）の制限酵素消化によって直鎖状と し、5'-燐酸気をウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（プロメガ社）によって除い て再ライゲーションを防止した。ライゲーション反応物は、マックス・エフィシ エンシー大腸菌DH5α(ギブコBRLライフサイエンス)内へ形質転換し、形質転換さ れた大腸菌は、アンピシリン(100μg/ml)、X-Gal(50μg/ml)および1mM IPTGを添 加したトリプトン大豆寒天（オキソイド・リミテッド）上に播いた。37℃にて一 晩インキュベートした後、形質転換された大腸菌のコロニーを、20mg/mlの(+)- ラクタムのメタノール溶液を含ませたホワットマン2フィルター・ペーパー・デ ィスク上に吸い取った。フィルターを室温で4時間ィンキュベートし、2％ｗ／ｖ ニンヒドリンのアセトン溶液で現像した。60℃にて現像した後の、紫色のバック グラウンド上にできた褐色の円はそれぞれがアミノ酸が生成していることを示し 、明らかに単一コロニーの周囲に認められる。単一ラクタマーゼ発現クローンを 単離し、ラクタマーゼ活性をアキラル／キラルHPLCアッセイによって確認した。 ７．ラクタマーゼ遺伝子の性質と配列 プラスミドＤＮＡをラクタマーゼ発現クローンより調製した。制限消化分析に より、1.9ｋｂのSau3AI制限フラグメントの存在が認められた。挿入されたフラ グメントのＤＮＡ配列の分析から、このフラグメントが1.6ｋｂのオープン・リ ーディング・フレーム(ＯＲＦ)を取りこんでおり、これはpUC19の上流ｌａｃプ ロモーターにて操作される際に、575残基のタンパク質（61ｋＤａ） に翻訳されるものであることが示された、配列表参照。翻訳されたＯＲＦ配列か ら演繹されるアミノ酸配列はマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacteri um smegmatis)およびメチロフィラス・メチロトロフュス(Methylophilus methyl otrophus)のアセトアミダーゼと65％を超えるホモロジーを有していた。これら の酵素は短鎖脂肪アシルアミドを加水分解することが報告されている（ドラパー 、ジェイ.ジェン.マイクロバイオール46:111-123(1969)参照。 配列表を参照すると、1.9ｋｂのラクタマーゼフラグメントが、２つの保存さ れたBamHI制限部位に存在していることがわかる。5'から挿入部分の配列には、p UC19のlacプロモーターおよびリボソーム結合部位が含まれている。 ラクタマーゼ遺伝子を有するpUC19構築物を次いで野生型大腸菌プラスミドCol E 1のcerエレメントを挿入して改変した。この構築物をpPET1と命名した。 容易に理解されるように、大腸菌プラスミドpPET1はpUC19から誘導されたもの であり、コマモナス・アシドボランスの1.9ｋｂのSau3AI染色体フラグメントがB amHＩ制限部位にライゲートされた構造を有している。野生型プラスミドColE1の cerスタビリティーエレメントは、BamHI（部分）およびNdeI制限を介してラクタ マーゼフラグメントの3'側に挿入された。 ８．組換えラクタマーゼの増殖 組換え大腸菌株は、アンピシリン(100μg/ml)含有TSB培地(オキソイド・リミ テッド)を含有する1リットル容の調節振とうしているフラスコ内に接種した。フ ラスコおよび接種物を16時間、37℃、オービタルシェーカー内（行程25mm）で30 0rpmにて振とうしながら培養した。種培養物を1.5リットルのTSB培地を含有する 2.8リットル容の実験用バイオリアクター槽に接種(1％)した。温度を25℃に保ち 、ｐＨ7.0溶解Ｏ₂分圧を＞50％に保った。生育は520ｎｍの光学密度をＴＳＢ培 地のブランクに対して測定してモニターした。24時間生育させた後、細胞を遠心 分離により回収した(5000g,4℃、10分間)。細胞は-20℃にて必要となるまで保存 した。 ９．組換え細胞の利用 プラスミドpPET1を含んでいる大腸菌株を上述の通り増殖させ、保存した。 細胞を10％ w/vとなるよう、100mMのトリスHCl、pH7.5内に再懸濁させた。ラク タムのラセミ体を100mg/mlとなるよう、100mMのトリスHCl、pH7.5内に再懸濁さ せた。(+)ラクタムバイオトランスフォーメーションの反応条件は、10mg/mlのラ クタムのラセミ体を100mMトリスHCl,pH7.5に懸濁した0.1%w/v組換え細胞液と混 合するというものである。懸濁液は25℃にて225rpmで振とうしながら1時間反応 させた。1時間の反応後のHPLC分析では、30％の(+)ラクタムが95％ee以上の選択 性をもって酸へと転換されていた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｅ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ブラウン，ロバート・クリストファー イギリス、シービー４・４ダブリューイ ー、ケンブリッジ、ミルトン・ロード、ケ ンブリッジ・サイエンス・パーク、カイロ サイエンス・リミテッド内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の1または複数の特徴を有する： 40℃にて4時間置かれた後に85％を超える活性を保持するか、または60℃で4時 間置かれた後に30％を越える活性を保持する、 ラクタムのラセミ体100gと緩衝液300mlの初期濃度のものを加水分解し、少な くとも90％の(+)ラクタムを加水分解するまで加水分解を続け、一方で(-)ラクタ ムの加水分解は5％未満である、 二環式ラクタムである2-アザビシクロ[2,2,1]ヘプト-5-エン-3-オンのエナンチ オマーを加水分解し得る酵素。 ２．同初期濃度を加水分解し、少なくとも98％の(+)ラクタムが加水分解される まで加水分解を続ける一方、(-)ラクタムの加水分解が2％未満であることに特徴 付けられる、請求項１記載の酵素。 ３．コマモナス・アシディボランス(Comamonas acidivorans)から得られる、二 環式ラクタムである2-アザビシクロ[2,2,1]ヘプト-5-エン-3-オンのエナンチオ マーを加水分解し得る酵素。 ４．コマモナス・アシディボランス(Comamonas acidivorans)NCIMB 40827から 得られる請求項３記載の酵素。 ５．配列表2に記載のアミノ酸配列もしくは、そのフラグメントを有し、二環式 ラクタムである2-アザビシクロ[2,2,1]ヘプト-5-エン-3-オンのエナンチオマー を加水分解し得る酵素。 ６．前記各項いずれかに記載の酵素を固定化した、固定化酵素。 ７．請求項５記載の酵素をコード化する、単離されたヌクレオチド分子。 ８．配列番号1記載の配列を有する、請求項７記載の酵素。 ９．請求項５記載の酵素を発現し得る、微生物。 １０．コマモナス・アシデイボランス(Comamonas acidivorans)NCIMB 40827の 本質的な性質を有している、請求項９記載の微生物。 １１．請求項９または１０記載の微生物を培養することを含む、請求項１から５ いずれかに記載の酵素を製造する方法。 １２．2-アザビシクロ[2,2,1]ヘプト-5-エン-3-オンのエナンチオマーの混合物 と、請求項１から５いずれかに記載の酵素もしくは請求項９または１０記載の微 生物を接触させる行程を含む、二環式ラクタムである2-アザビシクロ[2,2,1]ヘ プト-5-エン-3-オンのエナンチオマーの選択的加水分解方法。 １３．加水分解により生成された(+)アミノ酸から残存する(-)ラクタムを分離す る行程をさらに含む、請求項１２記載の方法。