KR0180934B1 - 7-아미노세팔로스포란 산 및 이의 유도체를 제조하는 효소적 방법 - Google Patents

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Abstract

고체 매트릭스상에 고정화된 효소를 사용하는 효소적 2단계 방법에 의해 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체 및 염을 7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체로 변형시키는 방법이 기술되어 있다.

Description

7-아미노세팔로스포란산 및 이의 유도체를 제조하는 효소적 방법
제1도는 본 발명의 고정화된 DAO 효소의 안정성 실험 결과이다.
제2도는 포스페이트 완충액중에서의 DAO의 안정성 실험 결과이다.
제3도는 고정화된 DAO의 시간에 따른 활성을 나타내는 그래프이다.
제4도는 포스페이트 완충액중의 G1-7-ACA 아실라제 안정성을 나타내는 그래프이다.
제5도는 Duolite A 568상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제 안정성을 나타내는 그래프이다.
제6도는 글루타릴 유도체의 7-ACA 또는 유도체로 전환시 G1-7-ACA 아실라제 효소의 시간에 따른 안정성을 나타내는 그래프이다.
제7도는 pJC 40의 작제도이다.
제8도는 pJC 200의 작제도이다.
본 발명은 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체로부터 7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체를 효소적으로 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 보다 특정하게, 본 방법은 고체 매트릭스 상에 고정화된 효소를 사용한 2단계 효소적 방법으로 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체 및 염을 7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체로 변형시키는 것이다. 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA)은 세팔로스포린 계열의 항생제 제조에 있어 공지된 중요한 중간체이다.
세팔로스포린 C의 7-ACA로의 전환은 상당 기간 동안 공지되어 왔고 화학적 가수분해 방법(참조:벨기에 왕국 특허 제615955호) 또는 효소 방법에 의해 수행될 수 있다. 화학적 방법은 매우 독성인 공해 반응물(염소계 용매, 클로로실란, 디메틸아닐린) 및 엄격한 공정 조건(-50℃와 같은 매우 저온)을 사용하고 있다.
공지된 효소 방법은 두 그룹, 즉, 예를 들면 슈도모나스(Pseudomonas) 배양물(EP 275901)로부터 수득된, 세팔로스포린 C상에 아실라제 활성 형태의 효소를 사용하여 단일 단계로 수행하는 공정 및 2단계로 수행하는 공정의 두 그룹으로 나눌 수 있다.
후자 방법에 있어 제1단계는 특허[참조:BE 736934, DT 2219454, FR 2133927, JP 125696 및 JP 128295] 문헌에 기술된 트리고놉시스 배리어빌리스(Trigonopsis variabilis), 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실륨(Penicillium), 뉴로스포라(Neurospora), 슈도모나스(Pseudomonas), 세팔로스포륨(Cephalosporium)과 같은 다양한 미생물의 배양물로 부터 수득한 D-아미노산 옥시다제(DAO; EC-1.4.3.3)를 사용하여 세팔로스포린 C를 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산으로 효소 전환시키는 것을 포함한다.
제2단계에서, 상기 글루타릴 유도체는 코마모나스(Comamonas), 슈도모나스(Pseudomonas)(Jp 142761) 또는 아르트로박터(Arthrobacter)(JP 43657) 세균 배양물로부터 수득한 특이 아실라제를 사용하여 7-ACA로 가수분해한다.
본 발명에 따른 방법은 공지된 2-단계 방법에 비해 상당한 수율이 수득되는 혁신적인 기술의 진전을 나타낸다. 이러한 잇점은 특정 부형제 및 공정 조건을 채택함으로써 및 정제되어 반응 매질중 불용성인 고체 매트릭스상에 고정화된 고도의 선택성 효소를 사용하여 수득된다.
본 방법은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
[제1단계]
[제2단계]
상기식에서, R은 -OCOCH3, -H, -OH, 또는 -OCONH2이다.
본 발명에 따른 효소 전환은 세포체 또는 수용액 형태의 효소를 사용하지 않는 대신, 상기 효소를 수성 매질에 불용성인 고정화된 고체 형태로 변형시키며, 이는 세팔로스포린 C의 7-아미노세팔로스포란산(R=-OCOCH3)으로의 산업적 전환에 있어 특히 적합하다.
반응 매질내에서의 이의 불용성으로 인해, 이들 고정화된 효소는 반응 매질로부터의 회수가 용이하고, 수회 사용가능한 잇점을 갖는데, 이는 산업적 방법에 있어 필수불가결한 조건이다.
본 발명의 추가의 중요한 산업적 이점은, 반응물로부터의 효소 회수가 용이하여 최종 생성물의 회수를 간편화시킬뿐만 아니라 제1단계에서 수득된 반응 용액을 제2단계에서 바로 사용가능하도록 한다는 사실이다. 따라서 이와 같은 잇점은 하나의 효소 단계로부터 다른 것으로 공정이 단일 액체 스트림으로 연속적으로 수행되도록 한다.
제1단계: 글루타릴 유도체로의 산화적 탈아미노 반응
본 발명에 따라 세팔로스포란 화합물(Ⅰ)의 전환에 있어서 제1단계 방법은 D-아미노아디프쇄 상의 산화적 탈아미노 반응에 대한 특이 D-아미노산 옥시다제(DAO)의 사용을 기초로 한다.
본 발명의 방법에 사용된 효소는 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis) ATCC 26217 배양물로부터 수득한다.
발효에 의해 수득된 배양물로부터 효소를 분리하고, 방해 효소를 정제하며, 고정화 공정을 수행하여 수성 매질중에 불용성인 형태를 수득한 후 이의 안정성을 증진시킨다.
화합물(Ⅰ)의 글루타릴 유도체(Ⅱ)로의 효소 전환은 염기성 시약을 가해 적합한 pH값을 유지하는 수용액중에서 수행한다.
pH는 7 내지 8.5로 다양할 수 있다. 하지만 알칼리성 환경 중에 세팔로스포란 화합물이 불안정하기 때문에 pH 7.5에서 수행하는 것이 바람직하다. 반응 온도는 20 내지 30℃로 다양할 수 있고 보통 25℃이다.
효소 전환은 대기 또는 산소의 존재하에 이들 기체를 수용액으로 취주시켜 수행되어야 한다. 기체 유동은 0.5 내지 1용적/용액 용적/분으로 다양할 수 있다.
초기 기질(Ⅰ)의 농도는 20 내지 100g/ℓ로 다양할 수 있다. 세팔로스포린 C의 특정한 경우에 있어, 이의 결정화된 나트륨 또는 칼륨염을 사용할 수 있거나, 다른 방편으로 최종 결정화 단계 전에 발효 브로스의 회수로부터 수득된 바와 같이 이의 정제 용액을 직접 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 고정화된 효소는 미세 과립 형태로 사용되고 기계적 교반 또는 공기 또는 산소 유동의 보조로 현탁액 중에 유지된다. 다른 방편으로 고정화된 효소를 여과 컬럼(percolation column)으로 로딩시키고 이를 통해 일정한 pH 7.5에서 산소로 포화시킨 기질 용액을 통과시켜 전환이 수행된다.
완전한 변형에 요구되는 시간은 공정 조건에 따라 0.5 내지 3시간이다. 글루타릴 유도체로의 전환 수율은 높고, 보통 약 90%이다.
반응 말기에 생성물은 여전히, 목적하는 글루타릴 유도체(Ⅱ)로 전환되지 않는 5-케토아디필-7-아미노세팔로스포란산(Ⅳ)을 일부 함유한다.
상기식에서, R은 -OCOCH3, -H, -OH, 또는 -OCONH2이다.
본 발명에 따라, 이 케토아디필 유도체(Ⅳ)는, 고정화된 DAO 효소를 분리한 후 반응 수용액에 변형되는 화합물에 대해 화학양론적 양의 H2O2를 가해 20 내지 25℃ 온도에서 10 내지 15분간 반응시킴으로써 글루타릴 유도체(Ⅲ)로 좀 더 전환시킬 수 있다. 반응 시간을 단축시키기 위해 과량의 H2O2를 사용할 수 있다.
그런 다음 과량의 H2O2는 피루브산 또는 이의 염 또는 알칼리성 설파이트와 가은 적합한 환원제를 사용하여 다음 단계로 이행되기 전에 제거한다.
이와 같은 상기 화합물(Ⅳ)의 실질적인 완전한 제거로 최종 글루타릴 유도체 수율을 약 85%로 수득케할 뿐 아니라 후속적인 효소 가수분해 단계에 있어 큰 이점을 나타낸다. 이점에 있어서, G1-7-ACA 아실라제를 사용하는 가수분해는 글루타릴 유도체에 특이적이고 케토아디필 유도체(Ⅳ)를 인지하지 않아, 이 화합물은 최종 생성물 중 바람직하지 않은 불순물로서 잔류한다.
이미 언급한 바와 같이, 본 발명의 양상은 로도토룰라 그라실리스 ATCC 26217로부터 생성된 DAO효소의 옹도이다. 이것은 세포내 특성을 갖는 FAD 의존성 효소(플라보단백질)로서, 트리고놉시스 배리어빌리스(공급처는 기술 문헌 중 인용되어 있다)로부터 수득될 수 있다. 하지만 로도토룰라 그라실리스로 부터 생성된 DAO는, 낮은 해리 상수(예 2.2×10-8M)로 부터 명백히 알 수 있듯이 FAD와 보다 안정한 결합에 의해 특성화된다.
로도토룰라 그라실리스로부터 생성된 DAO는 효소 단백질의 물리-화학적 특성뿐 아니라 기질로서 취한 D-아미노산에 대한 억제제 및 특이성에 있어서도 상당한 차이가 있다[참조:Pilone Simonetta M. et al., Eur. J. Biochem. 180, 199(1989); Kubicek-Pranz E.M. et al., J. of Appl. Biochem. 7, 104(1985)].
특히, 로도토룰라 그라실리스로부터의 DAO는 이 효소의 특이 기질인 D-알라닌에 대해 수득되는 값과 매우 유사한 Km 및 Vmax치로 세팔로스포린 C에 대한 우수한 특이성을 갖는다.
본 발명은 단순한 컬럼 분별법에 의해, 조 DAO 용액중에 통상적으로 존재하여 세팔로스포린 C가 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산으로 효소적으로 전환함을 방해하는 효소들인 카탈라제(탈카복실화를 궁극적으로 봉쇄하고 게토아디필 유도체로의 반응을 중단시키며 H2O2를 파괴시킴), 에스테라제(R이 OCOCH3인 타입(Ⅰ)의 화합물에서 바람직하지 않는 데스아세틸 유도체의 형성을 초래함) 및 β-락타마제(세팔로스포란 구조를 파괴시키며 β-락탐환을 가수분해시킴)가 실질적으로 유리된 정제된 형태의 D-아미노산 옥시다제 효소를 로도토룰라 그라실리스 배양물로부터 수득 가능케 한다.
따라서 이러한 방식으로 수득된 DAO 용액은 순도 및 촉매적 작용성의 관점에 있어 유효하지만, 용액중의 모든 DAO의 경우에서와 같이 매우 안정하지 않으며, 이러한 형태로는 산업적 가치가 거의 없다. 하지만 본 발명에 따라 수득된 고정화된 형태는 고도의 안정성을 가지며 글루타릴-7-아미노-세팔로스포란산의 제조에 있어 산업적으로 유효하다.
이러한 관점에 있어 제1도에서 고정화된 DAO와 제2도에서 수용액중 효소에 있어서 안정성을 비교하는 다이아그램이 제공되었다.
추가로, 본 발명에 따른 고정화된 DAO는 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체의 산화적 탈아미노화가 매우 장기간 작동되기에 다수의 공정에 대해 작동 조건하에서 고도의 활성을 유지한다. 이 점에 있어서 25℃ 및 pH 7.5의 효소 방법에 있어 사용 시간에 대한 활성(초기 활성%)을 나타내는 제3도의 도면이 참고로서 제시되고 있다.
따라서 본 발명에 따라 정제된 형태로 로도토룰라 그라실리스로부터 수득된 DAO 효소의 사용은, 아실라제의 존재하에 후속적인 효소 방법중 추가의 정제 과정없이 그대로 사용하기에 특히 적합한 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 용액을 수득하는데 있어 기초가 된다.
본 발명의 제1단계에 대해 요구되는 고정화된 효소의 제조는 필수적으로 하기 작동 단계를 기본으로 한다:
1. 로도토룰라 그라실리스 ATCC 26217 세포를 생성하기 위한 발효;
2. 로도토룰라 그라실리스 세포로부터 D-아미노산 옥시다제 효소의 추출 및 정제;
3. 수불용성 고체 매트릭스상에 D-아미노산 옥시다제의 고정;
[1. 로도토룰라 그라실리스 ATCC 26217의 발효]
로도토룰라 그라실리스를 호기성 발효로 배양한다. 배양 브로스 성분은 D 및 DL 아미노산, 펩톤, 효모 추출물, 옥수수 함침액 등과 같은 질소 공급원; 글루코스, 사카로스, 말토오스 및 사탕무우 및 사탕수수 당밀과 같은 탄소 공급원; 염화나트륨, 염화칼슘, 황산아연, 황산마그네슘 등과 같은 무기염을 사용하여 효모 생성에 통상적으로 사용되는 것들이다. 높은 DAO 효소 함량의 로도토룰라 그라실리스 세포를 생성하기에 특히 적합한 배양 브로스는 하기 조성을 갖는다:
발효는 브로스는 120℃에서 멸균시키고 30℃로 냉각시킨 후, 로도토룰라 그라실리스의 생육형 배양물의 접종물을 도입시킨다. 배양물을 24 내지 32℃에서 교반을 유지하고, 분당 0.5 내지 1용적/브로스의 용적 속도로 공기를 균형 취주시켜 통기한다. 배지의 ph를 비-질소화 염기를 가하여 4 내지 6.5, 바람직하게는 5로 유지한다. 발효 지속 시간은 배양 배지의 조성, 교반, 온도와 같은 공정 조건에 따라 24 내지 48시간으로 다양할 수 있다.
[2. 추출 및 정제]
로도토룰라 그라실리스로부터 수득된 D-아미노산 옥시다제는 세포내 효소이다.
발효를 종결시키며 배양 브로스를 원심 분리하여 미립자를 분리 및 회수한다.
세포 페이스트를 물에 재현탁시키고, NaOH를 가해 pH 6 내지 9(바람직하게는 8)로 상승시키며 물리적 수단(초음파 처리)을 사용하여 용해시키거나 화학 처리한다(계면활성제 및 수-불혼화성 용매 부가).
바람직한 방법은 pH 8은 완충된 배지(바람직하게는 소량의 알칼리성 비설파이트 및 세틸피리디늄 클로라이드 같은 양이온성 계면활성제를 부가한 포스페이트 완충액)중에 세포 페이스트를 재현탁시키고 현탁액을 550바아의 압력을 통하거나 볼 밀(ball mill)을 통해 여러번 통과시킨다.
그런 다음 세포 용해물을 응결시키고, 원심분리에 의해 청정화시키며, 한외 여과로 농축시킨 후 황산암모늄을 가해 염화한다. D-아미노산 옥시다제를 함유하는 염화 침전물을 여과에 의해 분리하고 pH 8에서 완충 용액중에 재현탁시킨다.
이러한 방식으로, 소량의 방해 효소, 예를 들면 카탈라제, 에스테라제 및 β-락타마제를 수반하는 조 효소를 이루어진 용액이 수득된다. 그런 다음 조 효소를 공지의 방법으로 정제한다.
이러한 방법으로 수득된 효소를 정제하는 바람직한 방법은 SepharoseR(Pharmacia), TrisacrylR(IBF), ToyopearlR(Toso Haas)와 같은, 이온 작용성으로서 디에틸아미노에틸(DEAE) 그룹을 갖는 이온 교환 수지 및 pH 8의 25mM 포스페이트 완충액을 갖는 컬럼내에서 크로마토그래피 분별화이다.
방해 효소, 특히 에스테라제는 컬럼 수지에 의해 보유됨으로서 정제된 DAO는 바로 침투액으로 통과된다.
이러한 방식으로 15 내지 20U/mg 단백질 특이 활성을 갖고 바람직하지 않은 촉매 활성이 없는 효소가 수득된다.
이와 같이 정제된 DAO는 4℃에서 6일간, -20℃에서 6개월 이상 안정하여, 고정화 공정에 바로 사용할 수 있다.
[3. D-아미노산 옥시다제의 고정화]
본 발명에 따른 방법은 고형 지지체, 즉 통상적으로 시판되는 이온 교환 수지상에 D-아미노산 옥시다제를 고정화시키는 것으로 이루어진다.
이온 교환 수지상에 효소를 고정시키는 것은 오랫동안 공지되어 왔으나 로도토룰라 그라실리스로부터 생성된 DAO에 대해서는 기술되거나 연구된 바 없다.
본 발명에 있어 하기가 매트릭스로서 사용된다:
Amberlite IRA 900(Rhm and Haas)와 같은, 4급 아민 작용기를 갖는 거대 망상 폴리스티렌 구조의 강염기성 수지;
Duolite A 365(Ahm and Haas)와 같은, 1급 아미노 작용기를 갖는 거대 망상 폴리스티렌 구조의 약 염기성 수지;
Duolite A 568 또는 Duolit A 7(Rohm and Haas)과 같은 2급 및 3급 아민 작용기를 갖는 다중 축합된 페놀포름알데하이드 구조의 중염기성 수지.
본 발명에 따라 상기 타입의 수지는 0.1M 포스페이트 완충액으로 pH 6 내지 9, 바람직하게는 pH 8에서 완충된다. 효소 단백질과 작용화된 매트릭스 사이에 가교-결합을 형성할 수 있는 이작용성 제제의 용액을 완충된 수지에 가한다. 적합한 이작용성 제제는 글루타르알데하이드 및 말론알데하이드와 같은 지방족 디알데하이드이다.
보통 pH 87 내지 9, 일반적으로 pH 8의 포스페이트 완충액 중의 글루타르알데하이드 용액을 1 내지 4%, 통상적으로 2% 농도로 사용한다. 4℃ 내지 30℃의 온도에서 15 내지 60분후, 바람직하게는 20℃에서 30분후, 상등액을 경사시켜 분리하고 25mM 포스페이트 완충액중 pH 6 내지 9, 바람직하게는 8의 DAO 효소 용액을 습식 수지에 가한다. 4 내지 20℃의 온도에서 2 내지 24시간, 보통 4℃에서 12시간 동안 접촉후, 고정화된 효소를 지닌 수지를 여과 분리한다.
본 발명은 또한 하기와 같은 매트릭스상에 DAO를 고정화시키는 것에 관한 것이다.
Eupergit CR(Rhm-Pharma)와 같은, 특히 에폭사이드 말단 그룹을 갖는 폴리아크릴 구조의 매트릭스; UOP IPS-200R(UOP-USA)와 같은, 폴리에틸렌아민 및 글루타르알데하이드와 복합체로 함침된 다공성 알루미나와 같은 무기 매트릭스.
표 1은 본 발명에 따라 사용된 매트릭스의 특성, 고정화된 DAO의 결합 용량 및 활성을 나타낸다.
각각의 매트릭스에 대해 세가지 고정화 시험이 나타나는데, 지지체의 완전한 포화를 수득하기 위해 효소의 양을 증가시켜 수행한다. 지지체로 결합 후 최고 활성은 50 내지 75U/g 지지체이다.
보통 습식 지지체 g당 200U가 결합됨으로써 부착이 완료되고, 결합후 활성은 약 40 내지 500U/g 습식 지지체이고, 상응하는 유리 효소의 활성 %로서 고정화된 효소 활성의 측면에서 작용성은 20 내지 30%이다.
고정화된 DAO의 큰 이점은 이의 안정성으로, 25℃, pH 7.5의 효소 방법 중 타입(Ⅰ)의 세팔로스포란 화합물을 글루타릴 유도체(Ⅱ)로 전환시키는데 있어 200시간 이상 사용 가능케 한다(제3도 참조).
[D-아미노산 옥시다제(CAO) 활성의 측정]
D-아미노산 옥시다제 효소의 활성은 37℃에서 산소로 표화된 pH 7.5의 100mM 포스페이트 완충액중의 D-알라닌 기질상에서의 효소를 발생하는 H2O2양을 측정함으로써 평가한다.
H2O2는 변형된 트린더 반응(Trinder reaction)[참조: J. Clin. Path. 22, 246, 1969]에 의해 퍼옥시다제-기본 반응물인 4-아미노펜아존 및 2, 4-디클로로페놀설포네이트를 사용하여 역학적으로 측정할 수 있다. 발색되는 적색(퀴논이민)은 시험중 발생되는 과산화수소에 비례하고 510nm에서 분광광도 측정하여 평가된다.
D-아미노산 옥시다제 1단위는 방법중 사용된 조건하에 효소(유리 또는 고정화된)의 양이 1μmole/분의 H2O2를 생성시키는 단위이다.
[단백질 측정]
효소 용액의 단백질 함량은 브래드포드 방법[Bradford method; Anal. Biochem. 72, 248, 1976]에 의해 쿠마시 브릴리언트 블루 G250을 사용하여 표준 소 알부민 커브에 대해 분광학적으로 측정한다.
제2단계:글루타릴 유도체의 탈아실화
세팔로스포린 C 또는 이의 유도체 및 염을 7-아미노세팔로스포란산 또는 유도체로 전환시키는 방법에 있어서 제2단계는 고정화된 특정 아실라제를 사용하여 글루타릴 유도체(Ⅱ)의 탈아실화를 촉매함을 기초로 한다.
하기에 G1-7-ACA 아실라제(글루타릴-7-ACA 아실라제)로서 언급되는 이 효소는, 이의 생산자(producer)인 아시네토박터(Acinetobacter)종의 어떠한 미생물로부터 분리한 G1-7-ACA 아실라제의 유전자를 클론시킨 β-락타마제 비생성 에스케리챠 콜라이 컬렉션 균주로부터 수득된 유전자 조작된 미생물의 배양물로부터 생성된다.
재조합 DNA 기술을 사용한 이와 같은 미생물의 제조방법은 본 특허원의 출원인인 안티바이오티코스 에스. 피. 에이. 의 방계 회사인 안티바이오티코스 에스. 에이. 명의의 1990년 8월 3일 스페인 특허원 제9002109호에 기술되어 있다. G1-7-ACA 아실라제 생성에 특히 적합한 이들 미생물은 이. 콜라이 ATCC 9637(pJC200) 및 이.콜라이 P-3(pJC200)(NCIMB 40433)로서, 이들은 예를 들면, 이 효소의 생산자인 미생물 아시네토박터 ATCC 53891로부터 수득된 G1-7-ACA 아실라제 유전자가 클론된 이.콜라이 ATCC 9637 및 이.콜라이 P-3(NCIMB 40432)의 각각의 자손이다.
이 미생물을 사용하여 발효 조건을 최적화함으로써 β-락타마제없이 소량의 에스테라제만이 함유하는 G1-7-ACA 아실라제가 고 생산률로 수득가능케 되었다.
본 발명에 따라 G1-7-ACA 아실라제를 컬럼 크로마토그래피에 의해 에스테라제로부터 정제시키고 고체 매트릭스 상에 정제된 효소를 고정화시킨다.
효소 반응은 하기와 같이 반응 도식으로 나타낼 수 있다.
상기식에서, R은 -OCOCH3, -H, -OH, 또는 -OCONH2이다.
이와 같은 제2단계에 있어 제1단계에서 수득한 글루타릴 유도체(Ⅱ)의 수용액은 제1전환 단계에서 고선택성이 주어진 어떠한 예비 정제 과정을 필요로 하지 않으므로 제2단계에서 기질로서 바로 사용된다.
용액중 글루타릴 유도체(Ⅱ)의 농도는 10 내지 30g/ℓ로 다양할 수 있다.
효소 전환은 글루타릴 유도체(Ⅱ)의 용액을 고체 지지체 상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제 효소와 20 내지 35℃의 작동 온도에서 접촉시킴으로써 수행된다. 공정중 글루타릴 유도체 용액의 pH는 수산화암모늄, 알칼리성 수산화물, 지방족 아민(예:트리에틸아민) 또는 알칼리성 포스페이트 타입의 완충 용액과 같은 무기 또는 유기 염기를 가함으로써 7 내지 9, 바람직하게는 약 8로 유지된다. 공정 조건에 따라 전환 기간은 30 내지 120분으로 다양할 수 있다.
효소 전환은 글루타릴 유도체(Ⅱ)의 용액중 분산된 고정화된 효소를 유지시킴으로써 비연속적으로 수행될 수 있다.
바람직하 방법은 지지된 효소를 컬럼(또는 일렬로 작동하는 다수의 컬럼)에 로딩시키고 이를 통해 기질 요액을 연속적으로 통과시키는 것이다.
최종 생성물의 등전점에 따라 염산, 황산 또는 인산과 같은 무기산을 사용하여 pH 3 내지 3.5로 산성화시킨 후 결정화에 의해 수득된 반응 용액으로부터 7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체를 분리한다.
공지된 기술에 비해 중요한 혁신적 진보는, 매우 순수한 형태로 수득되는 점은 차치하고 상기 효소가 세포체 또는 수용액 형태로 사용되는 것이 아니고 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산의 7-ACA로의 산업적 전환에 특히 적합한 수성 환경하에 불용성인 고정화된 고체형태로 변형된다는 점이다.
반응 매질 중에서의 이의 불용성으로 인해, 이 고정화된 효소는 반응 매질로부터 용이하게 회수가능하고 수회 반복하여 사용할 수 있는데, 이는 산업 공정에 있어 필수불가결한 조건이다.
이들 모든 이점은 본 공정을, 현탁액중 유지된 효소를 사용하여 교반된 반응기내에서 뱃치식으로 작동 수행되도록 하거나, 제1단계에서 바로 수득된 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산이 고정된 베드 컬럼을 통해 연속적으로 통과하는 작동이 수행되도록 할 수 있다.
본 발명의 또다른 중요한 산업적 이점은 반응물로부터의 효소 분리의 용이성이 최종 생성물의 회수를 단순화시키는 점이다. 본 발명에 따라 고정된 G1-7-ACA 아실라제를 사용하여 수득한 보다 중요한 이점은 하기와 같다:
고정화된 효소의 고선택성은 통상 약 80 내지 90%의 고전환율 및 수율을 초래하여 실험실 정제 과정을 필요로 하지 않는 고순도의 최종 생성물을 수득케 하고; 세포 페이스트 또는 수용액 형태의 효소돠는 달리, 이의 불용성으로 인해 고정화된 효소는 최종 생성물을 변색시키거나 순도를 저하시킬 수 있는 불순물을 반응 매질내로 방출하지 않는 점이다.
재조합 DNA 기술에 의해 수득된 미생물 배양물을 사용하는 본 발명에 따른 G1-7-ACA 아실라제의 제조방법은 하기 공정 단계를 특징으로 한다.
1) 하기 통상의 도식에 따라 β-락타마제 비생성 이.콜라이 중에 G1-7-ACA아실라제에 대한 유전자를 클로닝한다.
a) 플라스미드 제조;
b) G1-7-ACA 아실라제 생성에 대한 유전 정보를 함유하는 DNA 공여체 제조;
c) DNA 공여체 단편을 a)의 플라스미드로 삽입;
d) G1-7-ACA 아실라제 유전자에 대한 운반 플라스미드를 선별;
e) 최종 벡터 작제;
f) β-락타마제 비생성 이.콜라이 균주를 e)의 벡터로 형질전환.
2) 1)에서 수득한 미생물의 발효
클론화된 이.콜라이는 호기적 발효로 배양한다. 글루코스, 사카로스, 전분 등과 같은 탄소 공급원; 아미노산, 단백질 가수분해물, 효모 추출물, 옥수수 함침액, 콩 곡분과 같은 질소 공급원; 및 염화나트륨, 인산칼륨 등과 같은 무기염을 사용하여 배지를 제조한다.
브로스를 120℃에서 멸균시키고 21 내지 28℃로 냉각 후 발효를 수행한 후, 클로르암페니콜을 300mg/ℓ로 멸균적으로 도입한다.
생육형 미생물 배양물을 클로르암페니콜을 함유하는 멸균 브로스에 가한다.
21 내지 28℃의 온도에서 교반시킨 배양물을 분당 0.5 내지 1용적/브로스의 용적 속도로 공기를 취주시켜 통기시킨다.
실예로, 실험영역 내 통상적인 브로스 조성은 하기와 같다:
발효 시간은 공정 조건에 따라 24 내지 72시간으로, 약 3000U/1의 G1-7-ACA 아실라제를 수득한다.
3) G1-7-ACA 아실라제 효소의 추출 및 정제
G1-7-ACA 아실라제는 세포내 효소이다. 발효후 배양물 브로스를 원심분리하고 세포막의 용해를 위해 세포를 화학 처리(수-불용성 용매 및 계면활성제 부가) 또는 물리 처리(가압 또는 불밀)한다.
바람직한 방법은 알칼리성 포스페이트를 가함으로써 pH 8로 완충시킨 수용액 중에 세포체를 재현탁시킨 후 500 내지 600바아에서 만톤-가울린 프레스(Manton-Gaulin press) 중에서 용해시키는 것이다. 양이온성 다가전해질을 가함으로써 세포 용해물을 응결시키고 재원심분리한다.
조효소를 함유하는 맑은 용액을 한외여과로 정제하고 염화시키며 수성상에 불용성인 용매로 추출한다.
바람직한 기술은 원심분리후 이온성 작용기로서 디에틸아미노에틸 그룹을 갖는 이온 교환 수지를 함유하는 컬럼(DEAE 타입)을 통해 맑은 용액을 바로 정제하는 것이다.
매우 유효한 것으로 입증된 크로마토그래피 수지는 Sepharose DEAE fast flow(Pharmacia)이다. 염화나트륨 스칼라(Scalar) 양으로 용출시킴으로써 G1-7-ACA 아실라제는 에스테라제가 없는 특히 순수한 형태로 수득될 수 있다.
이러한 방식으로 수득된 정제된 G1-7-ACA 아실라제는 매우 안정하다. 이것은 25℃에서 10일 또는 4℃에서 1개월 이상에서도 활성의 손실을 나타내지 않는다(제4도 참조).
4) G1-7-ACA 아실라제 효소의 고정화
이 방법은, 글루타릴 유도체(Ⅱ)가 7-아미노세팔로스포란산(Ⅲ)으로 효소 전환하는데 사용되는 수성 환경 중에 불용성인 인공 중합체 및 무기 물질과 같은 고체 지지체상에 상기 효소를 고정화시키는 것으로 이루어진다.
아실라제를 고정화시키기 위해 적합한 수지는 Amberlite 900 및 Amberlite 904와 같은 거대 망상형 강염기성 폴리스티렌 구조 타입의 수지, 또는 Duolite A 7 및 Doulite A 568 같은 2급 또는 3급 아미노 작용기를 갖는 페놀포름알데하이드 수지 같은 것들이다.
본 발명에 따라 효소를 수지와 접촉시켜 고정시키고 글루타르알데하이드와 같은 지방족 디알데하이드 타입의 이작용성 제제에 의해 효소 단백질과 매트릭스간에 가교 결합을 통해 안정화시킨다.
아실라제를 고정화시키기에 적합한 다른 수지는 Duolite A 365와 같이, 디비닐벤젠과 가교 결합되고 1급 아미노 그룹과 작용화하는 폴리아크릴 구조의 수지이다.
G1-7-ACA 아실라제는 또한 Eupergit C(Rohm Pharma)과 같은 에폭사이드 작용기를 갖는 아크릴성 수지 또는 알루미나 및 특히 UOP IPS-200(UOP-USA)과 같은 폴리에틸렌이민/글루타르 알데하이드 복합체로 함침된 알루미나와 같은 무기 지지체상에 고정화된다.
표 2는 사용된 매트릭스의 주요 특성 및 상응하는 고정화 데이타를 나타낸다.
습식 지지체 g당 10 내지 20U 범위의 효소를 선택할 때 부착이 실질적으로 완전하고 고정화된 효소의 작용성은 유리 효소의 활성%로서 표현시 70 내지 80%이다.
보통 G1-7-ACA 아실라제 20U가 지지체 g당 결합하여, 글루타릴 유도체가 7-아미노세팔로스포란산으로 변형하는데 우수한 공정을 보장하기에 충분한 결합후 가장 바람직한 고정비 및 활성을 수득한다.
제5도의 그래프에 나타낸 바와 같이, 고정화된 G1-7-ACA 아실라제는 4°및 25℃에서 매우 안정하다. 제6도의 그래프로부터 명백한 바와 같이, 타입(Ⅱ)의 세팔로스포란 화합물(글루타릴 유도체)이 타입(Ⅲ)의 화합물(7-ACA 또는 유도체)로 전환하는데 있어 200시간 이상의 공정 시간이 소요될 수 있다.
[G1-7-ACA 아실라제 활성의 측정]
G1-7-ACA 아실라제 효소의 활성은 37℃에서 pH 7.8의 0.1M 포스페이트 완충액 중에서 글루타릴-7-ACA 의 7-ACA로의 가수분해율을 측정함으로써 평가된다. 7-ACA는, 불라싱햄 방법(Bulasingham method; Biochem. Biophys. Acta 276, 250, 1972)을 변형시켜 p-디메틸아미노벤즈알데하이드 시약을 사용하여 발생하는 황색[쉬프(Schiff) 염기]을 410nm에서 측정함으로써 표준 커브에 대해 분광계에 의해 측정된다.
1단위의 아실라제는, 공정 조건 하에서 1분내에 1μmol의 7-ACA를 생성하는 효소(용액중 또는 고정화된)의 양으로 규정한다.
하기 실시예 및 제밥은 본 발명의 효소 방법의 제1 및 제2단계 모두의 실시를 설명하기 위해 제시된 것이다.
[실시예 1]
로도토룰라 그라실리스 ATCC 26217 배양물로부터 D-아미노산 옥시다제의 생성
하기 조성을 갖는 브로스 70ℓ로 100ℓ 발효조를 채운다:
배지를 2N H2SO4로 pH 5.6으로 조절하고, 120℃에서 20분간 멸균한 후 30℃로 냉각한다. 여기에 생육형 배양물 로도토룰라 그라실리스 ATCC 26217을 접종하고 200rpm으로 교반하며 0.51/1/분으로 통과시키며 30℃에서 28시간 동안 발효한다. 발효중에 pH를 자발적으로 5로 낮추는데 여기서 10% NaOH를 자동부가함으로써 일정하게 유지시킨다.
발효 말기에 배양 브로스 72ℓ를 OD660=39로, D-아미노산 옥시다제 활성 4600U/1로 수득한다.
브로스를 웨스트팔리아 챔버 원심분리기(Westfalia chamber centrifuge) 중에서 5000g로 원심분리한다.
D-아미노산 옥시다제 320,000U에 상응하는 세포 페이스트 3.1kg을 수득한다(약 80% 수분).
[실시예 2]
[D-아미노산 옥시다제의 추출 및 정제]
실시예 1에서 기술한 바와 같이 수득한 세포 페이스트 1kg(103,000U DAO)를 0.5g/1 나트륨 메타비설파이트 및 0.5g/1 세틸피리디늄 클로라이드를 함유하는 pH 8의 25mM 포스페이트 완충액 3ℓ에 분산시킨다.
현탁액을 4℃로 냉각시키고 550바아로 만톤-가울린 프레스를 통과시킨다.
양이온성 다가전해질(Nymco 2045C) 20ml를 가해 균질화된 생성물(4.3ℓ)을 응결시킨다. 응결물을 하이플로(Hyflo)를 통해 여과하여 청정화한다. 청정화된 생성물(4.9ℓ)을 분자량 30,000의 폴리설폰 막을 통해 4℃에서 한외여과함으로써 농축시킨다.
암모늄 설페이트 262g을 한외여과로 수득한 농축물(0.750ℓ)로 가한다.
침전물을 원심분리로 상등액으로부터 분리하고 0.5g/1 나트륨 메타비설파이트를 함유하는 pH 8의 25mM 포스페이트 완충액 300ml 중에 재용해한다.
용액(320ml)을 분자량 30,000의 막을 통해 한외여과하여 격리 여과(diafilter)한다.
이 여액(340ml)는 224U/ml 농도로 조 DAO를 함유한다.
Scpharose DEAE 금속 유동 컬럼(베드 용적 800ml, ψ5cm, h 40cm)를 통해 조 효소 용액을 공급하고 동일한 pH 8의 25mM 포스페이트 완충액으로 용출시킴으로써 D-아미노산 옥시다제를 정제한다. DAO는 수지에 보유되지 않으나 이동이 감속되어 여과액으로 통과한다.
방해 효소, 특히 에스테라제는 pH 8의 25mM 완충액으로 용출되지 않으며 0.5M NaCl로 컬럼을 재생하는 동안 제거된다.
52U/ml 활성 및 19U/mg 단백질 특이 활성을 갖는 정제된 D-아미노산 옥시다제 1230ml 용적을 회수한다.
총 63920U에 상응하는 총 정제 수율은 62%이다.
정제된 D-아미노산 옥시다제는 4℃에서 6일 이상 및 -20℃에서 6개월 이상 안정하다.
[실시예 3]
[Duolite A 365상의 D-아미노산 옥시다제의 고정화]
100내지 200㎛의 입자 크기를 갖는 Duolite A 365 수지 35g을 pH 8의 100mM 인산칼륨 완충액 0.5ℓ로 처리한다. 교반 15분 후 10% H3PO4(6ml)를 연속 부가하여 pH를 조정한다. pH가 8에서 일정해지면 상등액을 여과제거한다. pH 8의 25mM 인산칼륨 완충액중 2% 글루타르알데하이드 400ml를 습식 수지에 가한다. 30분간 20 내지 25℃의 온도에서 교반하며 정치시킨 후, 상등액을 여과 분리하여 습식 고형물을 수득한다.
실시예 2와 같이 정제한 D-아미노산 옥시다제 용액(52U/ml; 19U/mg 단백질) 386ml를 습식 활성화된 수지제로 가한다. 시스템을 4℃에서 12시간 온화하게 교반시키며 유지한다. 소모된 상등액 농도로 계산시 고정화 수율은 100%이다.
생성물을 여과하고 습식체를 pH 8의 25mM 인산카륨 완충액 중에 이후 pH 7.5의 25mM 인산칼륨 완충액 중에서 0.5M NaCl로 세척한다.
고정화된 D-아미노산 옥시다제 103g을 습식 생성물 g당 48U의 활성으로 수득한다.
[실시예 4]
[Eupergit C상의 D-아미노산 옥시다제의 고정화]
Eupergit C(150㎛) 4.5g을 교반하에 4℃로 냉각시킨 pH 8의 1M 인산칼륨 완충액 120ml로 가한 후 실시예 2에서 수득한 D-아미노산 옥시다제 용액(58U/ml; 17U/mg 단백질) 55ml를 가한다. 시스템을 4℃에서 2시간 온화하게 교반하여 정치시키고 생성물을 여과 회수한다. Eupergit C상에 고정화된 습식 D-아미노산 옥시다제 15.7g을 58U/g 습식 생성물의 활성으로 최종적으로 수득한다.
[실시예 5]
[UOP IPS-200상의 D-아미노산 옥시다제의 고정화]
실시예 2에서 정제한 바와 같은 D-아미노산 옥시다제 용액 80ml(45U/ml; 17U/mg 단백질)를 pH 7.5의 1M 인산칼륨 완충액 80ml로 희석한다.
4℃에서 용액을 UOP IPS-200 20g을 함유하는 컬럼(ψ 2cm;h 8cm)을 통해 4시간 동안 600ml/시간으로 재순환시킨다. 이후 91%의 D-아미노산 옥시다제 활성이 고정화된다. 여과된 습식체 19g을 21U/g의 활성으로 수득한다.
[실시예 6]
[Duolit A 365 상에 고정화된 D-아미노산 옥시다제를 통한 세팔로스포린 C의 글루타릴-7-ACA로의 변형]
A) 뱃치식 전환
세팔로스포린 C 나트륨염 이수화물(순도 90.9%) 66g을 나트륨 메타비설파이트 0.5g을 함유하는 25mM 농도의 pH 8 인산칼륨 완충액 2ℓ중에 용해시킨다.
세팔로스포린 C 용액을 실시예 3에서와 같이 Duolite A 365 상에 고정화된 습식 D-아미노산 옥시다제 150g과 함께 3ℓ 반응기로 공급한다.
경미하게 교반시키고 저부 확산기를 통해 1용적/용적/분으로 산소를 유동시키며 25℃에서 배양을 수득한다.
5% 암모니아를 자동적으로 가해 pH를 7.5로 유지한다.
75분 이내에 세팔로스포린 C가 완전히 변형된다. 세팔로스포린 변형 생성물의 조성 %는 다음과 같다:
잔사 케토아디필-7-ACA를 글루타릴-7-ACA로 변형하기 위해, 배양후 수득한 용액을 여과에 의해 고정화된 효소체로부터 분리한다. 각각의 여액 ℓ에 대해 3.5% 과산화수소 10ml를 교반하에 가한다. 혼합물을 25℃에서 15분간 정치시킨 후 피루브산나트륨 0.5g을 가한다.
처리 종결시 조성 %는 하기와 같다:
75 내지 120분의 기간에 걸쳐 효소 로드(load)를 100회 주기로 시험한다.
총 새산량은 고정화된 효소 g당 글루타릴-7-ACA 31.7g과 동량인 글루타릴-7-ACA 4760g이다.
B) 연속 컬럼 전환
pH 8의 0.1M 포스페이트 완충액 중 나트륨 염 이수화물 형태의 세팔로스포린 C 15g/1용액을 Duolite A 365(실시예 3)상에 고정화된 DAO 100g(150ml 용적)을 각각 함유하는 5개 컬럼(ψ 40mm)을 통해 1ℓ/시간의 속도로 통과시킨다.
컬럼이 일련으로 연결되어 연속적으로 작동하는 전체 시스템은 25℃에서 온도-조절되어 각각의 컬럼에 산소 주입하여 3바아로 유지된다.
제5번 컬럼의 출구에서 세팔로스포린 C 잔사는 약 1%이고, 그루타릴-7-ACA로의 전환율은 화학양론적 양의 92%이다(11.2g/l).
[실시예 7]
[Eupergit C상에 고정화된 D-아미노산 옥시다제를 통한 세팔로스포린 C의 글루타릴-7-ACA로의 변형]
실시예 6에서와 같이 제조한 세팔로스포린 C 용액 2ℓ를 Eupergit C(실시예 4)상에 고정화된 D-아미노산 옥시다제 150g과 함께 배양한다. 배양은 산소 스트림 중 25℃에서 수행된다.
pH 7.5에서 60분 후, 세팔로스포린 C는 91%의 글루타릴-7-ACA 및 5.8%의 케토아디필-7-ACA의 수율로 완전히 변형된다.
여과에 의해 고정화된 효소로부터 용액을 분리한다.
여액 1ℓ를 3.5% 과산화수소 10ml 및 15분 후 나트륨 메타비설파이트 0.25g으로 처리한다.
변형 생성물의 최종 조성은 하기와 같다:
효소 로드를 100회 주기로 시험한다. 총 생성량은 31g/g의 고정화된 효소에 상응하는 글루타릴-7-ACA 4700g이다.
[실시예 8]
[UOP IPS-200상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제를 사용한 세팔로스포린 C의 글루타릴-7-ACA의 변형]
세팔로스포린 C 나트륨염 이수화물(순도 91.3%) 6.57g을 물 200ml중에 용해한다. KH2PO40.68g 및 나트륨 메타비설파이트 0.1g을 용액에 가하고 pH를 5% NaOH로 7.5로 조정한다.
이 세팔로스포린 용액을, 25℃ 조절되고 UOP IPS-200(ψ 3cm; h 4cm; 베드 용적 28ml)상에 고정화된 D-아미노산 옥시다제 20g을 함유하는 컬럼을 통해 펌핑시킨다. 유동률은 50ml/분으로 유지한다. 컬럼을 흐르는 용액을 용기에 모으고 산소 확산기로 산소화시키며, pH 7.5로 조정하고 2시간 동안 재순환시킨다. 재순환 2시간 후 세팔로스포린 C 전환이 완결된다.
용액(100ml)를 3.5% H2O21ml 및 15분 후 피루브산 나트륨 50mg으로 처리한다.
변형 생성물이 조성 %는 하기와 같다:
실험은, 14g/g 고정화된 효소와 동량인 총 글루타릴-7-ACA 280g을 생성하며 60회 주기로 수행된다.
[실시예 9]
[이.콜라이 ATCC 9637(pJC 200) 배양물을 통한 G1-7-ACA 아실라제의 생성]
1) 미생물 이.콜라이 ATCC 9637(pJC 200)의 제조
2) 플라스미드 pACYC 184의 제조
플라스미드 벡터 pACYC 184(TetR, CamR)을 함유하는 균주 이.콜라이 ATCC 37033을 10g/l 박토 트립톤 디프코, 5g/l 박토 효모 추출물 디프코 및 10g/l NaCl을 함유하는 LB 배양 배지 0.5ℓ중에서 37℃로 16시간 배양한다.
수득한 세포를 침강시키고, 세척하며, 용해시키고, 알칼리 방법으로 플라스미드를 분리한다[참조:T. Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lanoratory, 1982]. 그런 다음 수득한 플라스미드 DNA를 CsCl 구배로 원심분리하여 정제한다.
b) 글루타릴-7-ACA 아실라제 생성에 대한 유전 정보를 함유하는 DNA 공여체의 제조
G1-7-ACA 아실라제를 생성하는 아시네토박터 ATCC 53891 균주 종을 5g/l산 글루탐산나트륨, 1.5g/l KH2PO4, 5g/l NaCl, 25g/l 콜라겐 가수분해물, 5g/l 옥수수 함침액 및 2g/l 글루코스를 함유하는 배지 중에 배양한다. 시스템을 25℃에서 48시간 배양한다.
그런 다음 수득된 세포를 침강시키고, 세척하며 1% SDS, 20mM EDTA 및 0.1mg/ml 프로테이나제-K로 용해시킨다.
용해된 혼합물을 55℃에서 3시간 가열한 후 페놀 및 클로로프롬-이소아밀 알콜로 수회 추출한다. DNA를 에탄올에 의해 수성상으로 침전시킨다.
침전된 DNA를 100% 에탄올 및 70% 에탄올로 세척하고, 1mM EDTA를 함유하는 pH 7.5의 10mM 트리스-HCl 완충액 중 용해시킨다.
c) 벡터내로 DNA 공여체 단편의 삽입
아시네토박터 종 ATCC 53891 균주로부터 수득한 DNA 1μg을 함유하는 다양한 샘플을 37℃에서 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고 샘플을 65℃로 10분간 가열함으로써 상이한 시간에서 반응을 차단한다. 이러한 방식으로 상이한 부분 DNA 분해물이 수득되고, 이들은 아가로스 겔상에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 발색에 의해 나타난다.
플라스미드 pACYC 184 DNA 2μg을 함유하는 다양한 샘플을 37℃에서 1시간 동안 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 분해한 후 65℃로 10분간 가열하여 반응을 봉쇄한다.
아시네토박터 DNA의 부분 BamHI 분해물의 각각의 샘플을 ATP, Mg2+이온 및 2-머캅토에탄올의 존재하에 T4 DND 리가제에 의해 pACYC 184 플라스미드의 BamHI 분해물의 샘플과 14℃에서 16시간 동안 결합시킨다.
플라스미드 aACYC 184로 삽입된 아시네토박터 ATCC 53891 종의 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터의 다양한 컬렉션을 이러한 방법으로 수득한다.
d) G1-7-ACA 아실라제 효소 활성에 암호화 유전자를 위한 운반 플라스미드의 선별
이.콜라이 HB101을 G1-7-ACA 아실라제 생성자 균주인 아시네토박터 종의 유전자 라이브러리로 형질전환시키고, 0.2g/dl 글루코스, 0.1mg/dl 티아민-HCl, 100mg/dl 프롤린, 5mg/dl 글루타릴-류신 및 5mg/dl 클로로암페니콜이 가해진 염기성 배지 M9 중에서 37℃에서 생장하는 능력에 대해 G1-7-ACA 아실라제 유전자 운반 형질전환체를 선별한다[참조:T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]. 이러한 방식으로 균주 이.콜라이 HB101(pJC 11)이 수득된다.
플라스미드 pJC 11은 클로르암페니콜 내성 유전자 및 테트라시이클린 내성에 대한 유전자 프로모터 조절하에 발현되는 G1-7-ACA 아실라제 유전자(BamHI으로 부분 분해된 약 8.5kb의 DNA 단편중 위치함)를 갖는 것으로 특성화된다[참조:Bolivar et al., (1977) Gene 2:95].
EcoRV 및 Hpal 엔도뉴클레아제로 pJC 11 DNA 5μg을 분해하고 3kb G1-7-ACA 아실라제 유전자 운반 단편을 정제한 후, 이를 미리 BamHI로 분해시켜 탈인산화시켜 플라스미드 pUC 18로 결합시킨다. 결핍된 플라스미드 pJC 40으로 명명한다(제7도).
플라스미드 pDR 540[de. Boer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21] 5μg을 BamHI 엔도뉴클레아제로 분해한 후 문헌[참조:T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]에 기술된 조건하에 탈인산화시킨다.
pJC 40으로부터 출발하여 3kb 부분 BamHI G1-7-ACA 아실라제 유전자 운반 단편을 정제하고 플라스미드 pDR 540의 BamHI 부위로 결합한다.
수득한 벡터를 pJC 54011로 명명한다(제8도).
e) 플라스미드 pJC 200의 작제
플라스미드 pACYC-184 5μg을 문헌[참조:Biochemicals Catalogue, Boehringer Mannheim GmbH(1987)]중 기술된 조건하에 XbaI 및 Hind Ⅲ 제한 엔도뉴클레아제로 분해한 후 pJC 54011로부터 유도한 DNA XbaI-Hind Ⅲ G1-7-ACA 아실라제 유전자 운반 단편에 결합시킨다. 수득된 플라스미드를 pJC 200으로 명명한다(제8도). 이들 DNA 처리에 관한 모든 기술이 문헌[참조:T. Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]중 기술되어 있다.
플라스미드 pJC 200은 이.콜라이내의 선별 마커로서 클로프암페니콜 내성 유전자 및 tac 프로모터의 조절하에 발현되는 아시네토박터 ATCC 53891종의 G1-7-ACA 아실라제 활성에 대한 암호화 유전자를 소유하는 것으로 특성화된다.
f) 고발현 벡터 pJC 200으로 이.콜라이 ATCC 9637의 형질전환
플라스미드 pJC 200의 β-락타마제 비생성 이.콜라이 ATCC 9637로의 도입은 문헌[참조:Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983)]중 기술된 방법으로 수행된다.
이.콜라이 ATCC 9637 세포를 먼저 OD600이 0.45가 될 때까지 37℃에서 250rpm으로 SOB 배지 중에서 성장시킨다. 그런 다음 배양물을 3000g로 4℃에서 10분간 원심분리하고 세포를 RF1의 초기 용적의 1/3으로 재현탁시킨다. 얼음중에서 15분간 배양하고 동일 조건하에서 원심분리 후 세포를 RF2의 초기 용적의 1/12.5로 재현탁시킨다. 혼합물을 얼음중에서 15분간 재배양한다.
컴피턴트로서 공지된, 이와 같이 수득한 세포는 큰 효율로 외인선 DNA를 수용하는 이들의 능력으로 특성화된다.
이 DNA를 플라스미드 pJC 200 10ng을 컴피턴트 세포 100㎕와 혼합함으로써 도입시킨 후 혼합물을 얼음중에서 30분간 배양한다.
42℃에서 60초간 열소크를 가한 후, SOB 배지 800㎕를 가하고 시스템을 37℃에서 200rpm으로 60분간 배양한다.
형질 전환체의 선별은 30μg/ml의 클로르암페니콜을 가하여 LB 배지 중에서 종결짓는다.
고 G1-7-ACA 아실라제 생성 능력을 지니는 수득된 미생물을 이.콜라이 ATCC 9637(pJC 200)으로 명며한다.
LB, SOB, RF1 및 RF2 조성은 문헌[참조:Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]중에 기술되어 있다.
2) 발효
a) 생육상
이.콜라이 ATCC 9637(pJC 200) 세포를, 트립톤(10g/l), 효모 추출물(5g/l), NaCl(5g/l), 크로로암페니콜(30mg/l) 및 아가(15g/ℓ)를 포함하는 고체 배지중 180×10mm 사면상에서 pH 7.5로 28℃에서 24시간 성장시킨 후 멸균 생리용액 5ml 중 용해한다.
이 세포 현탁액 0.5ml를, 하기 조성의 생육형 배지 100ml를 함유하는 500ml 플라스크로 이전시킨다: 트립톤(12g/l), 효모 추출물(24g/l), 글루코스(5g/l), KH2PO4(1.1g/l), K2HPO4(6.2g/l) 및 클로르암페니콜(30mg/l).
배양물을, OD600이 15 내지 18이 될 때까지 28℃에서 250rpm으로 24시간 동안 성장시킨다.
b) 증식상
산 나트륨 글루타메이트(6g/l), 효모 추출물(3g/l), 콜라겐 가수분해물(20g/l), 옥수수 함침액(3g/l), KH2PO4(1.1g/l) 및 K2HPO4(6.2g/l)의 조성을 갖는 브로스 58ℓ를 함유하는 100ℓ 발효조를 120℃에서 20분간 멸균시키고 23℃로 냉각한 후 별도로 멸균된 글루코스(6g/l) 및 클로르암페니콜(30mg/l)를 가한다.
배지를 상기 섹션에서와 가이 수득된 생육형 배양물 2%로 접종한다. 0.5V/V/분 통기시키고, 200rpm으로 교반하며, 12시간마다 3g/l 글로코스를 부가하며 23℃에서 72시간 동안 발효를 수행한다.
발효 말기에, pH 8, OD600값이 28인 G1-7-ACA 아실라제 활성이 2790U/l인 배양 브로스 63ℓ가 수득된다.
6000g로 원심분리시 세포 페이스트 1.8kg(습도 80%)이 G1-7-ACA 아실라제 총 166980U에 상응하여 회수된다.
[실시예 10-a]
[G1-7-ACA 아실라제의 추출 및 정제]
실시예 9에 기술한 바와 같이 수득한 세포 페이스트(G1-7-ACA 아실라제 92766U) 1kg을 pH 8의 25nM 인산칼륨 완충액 2ℓ 중에 분산시킨다. 현탁액을 4℃로 냉각시키고 550바아로 만톤-가울린 프레스를 통해 2회 통과시킨다. pH 8의 25mM 인산칼륨 완충액으로 용해물을 6ℓ가 되게 하고 Nymco 2045 C 양이온 다가전해질 6ml를 가해 응결시킨다. 응결물을 6000g로 원심분리하여 정화한다.
맑은 생성물 5.5ℓ를 총 76532U에 동량인 G1-7-ACA 아실라제 활성 13915U/l로 수득한다.
맑은 생성물을 분자량 50000인 폴리설폰막을 통해 한외여과로 농축시킨다.
조 농축물 1580ml(G1-7-ACA 아실라제=48U/ml; 단백질=45mg/ml)를 pH 8의 25mM 인산칼륨 완충액으로 평형화된 Sepharose DEAE 1ℓ를 함유하는 컬럼을 통해 공급한다.
G1-7-ACA 아실라제를, 0.15M NaCl이 가해진 동일한 완충액으로 2170ml의 용적으로 용출시킨다.
정제된 효소는 20.3U/ml의 활성 및 2.6U/mg 단백질 특이활성을 갖는다.
[실시예 10-b]
[에스케리챠 콜라이 P-3(pJC 200)(NCIMB 40433)의 배양물을 통한 G1-7-ACA 아실라제의 생성]
등록번호 NCIMB 40432의 이.콜라이 P-3(β-락타마제 비생성 미생물)에 등록번호 ATCC 53891의 아시네토박터종으로부터 분리된 G1-7-ACA 아실라제 유전자를 클론시킨다. 이와 같이 수득된 이.콜라이 P-3(pJC 200)(NCIMB 40433)을 TB 배지[참조:실시예 9에서 언급한 Maniatis et al.의 문헌] 중에서 21℃로 48시간 동안 발효한다. 세포 침강후 효소 G1-7-ACA 아실라제를 초음파 철를 통해 세포 페이스트로부터 분리한다.
이같이 수득된 G1-7-ACA 아실라제의 활성은 2U/mg 단백질이다.
[실시예 11]
[Duolite A 568상의 G1-7-ACA 아실라제의 고정화]
입자 크기 100 내지 300㎛인 Duolite A 568 수지 40g을 pH 8의 100mM 인산칼륨 완충액 0.6 로 처리한다.교반한지 15분 후 10% H3PO4(12ml)를 연속 부가하여 pH를 조정한다. pH가 8로 일정해지면 상등액을 여과 제거한다. 2% 글루타르알데하이드 500ml를 습식 수지에 가한다. 시스템을 주위 온도에서 15분간 교반시키고, 이후 여과에 의해 액체를 분리하여 습식 고체물을 수득한다.
실시예 10에서와 같이 정제한 G1-7-ACA 아실라제 용액(10.8U/ml; 2.4U/mg 단백질) 200ml를 습식 활성화된 질량체로 가한다. 시스템 4℃에서 12시간 온화하게 교반하며 유지한다. 그런 다음 25% 글루타르알데하이드 5ml를 가하고 4℃에서 6시간 이상 교반을 지속한다.
그런 다음 생성물을 여과하고 pH 8의 25mM 인산칼륨 완충액중 0.5M NaCl 500ml로, 이후 염화나트륨이 유리된 동일한 완층액으로 습식체를 세척한다.
활성 19U/g 및 부착 수율 100%로 고정화된 G1-7-ACA 아실라제 108g(습식 질량)을 수득한다.
고정화된 효소를 pH 8의 25mM 인산칼륨 완충액하에 저장하면 25℃에서 1개월 이상 및 4℃에서 6개월 이상 안정하다.
[실시예 12]
[Eupergit C 상의 G1-7-ACA 아실라제의 고정화]
Eupergit C(150㎛)10g을 pH 8의 1M 인산칼륨 완충액 250ml에 20℃에서 가한 후, 실시예 10에서 수득한 G1-7-ACA 아실라제 용액(10.8U/ml; 2.4U/mg 단백질) 120ml를 가한다. 시스템을 20℃에서 6시간 동안 온화하게 교반시키며 정치시키고 수지를 여과 회수한다. 습식체를 pH 8의 25mM 인산칼륨 완충액으로 세척한다. 고정화 효소 활성 81%에 상응하는, 활성 31U/g의 습식 고정화된 G1-7-ACA 아실라제 34g이 최종적으로 수득된다.
[실시예 13]
[UOP IPS-200상의 G1-7-ACA 아실라제의 고정화]
실시예 10에서와 같이 정제된 G1-7-ACA 아실라제 용액(16.4U/ml, 2.2U/mg 단백질) 25ml를 pH 7.5의 1M 인산칼륨 완충액 75ml로 희석한다. 4℃에서 효소 요액을 UOP IPS-200 20g을 함유하는 컬럼(ψ 2cm; h 8cm)를 통해 1ℓ/시간으로 재순환한다.
재순환한지 4시간 후 컬럼을 pH 8의 25mM 인산칼륨 완충액으로 세척한다.
습식 고정화된 효소 질량체(22g)은 반응물에 공급된 초기 효소의 75%의 상응하는 14U/g의 활성을 갖는다.
[실시예 14]
[Duolite A 568 상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제를 사용한 글루타릴-7-ACA의 변형]
Duolite A 568(실시예 11)상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제 500g을 5개 컬럼(ψ 2mm)으로 로딩한다. 효소 로드는 하기 비율로 분포시킨다. 제1컬럼 50g; 제2컬럼 75; 제3컬럼 100g; 제4컬럼 125g; 제5컬럼 150g, 고정화된 D-아미노산 옥시다제를 사용한 세팔로스포린 C의 효소 변형으로 수득된 글루타릴-7-ACA 용액(22.8g/l; pH 8; 25℃)을 2ℓ/시간의 속도로 일련의 제1컬럼을 통해 펌핑시킨다. 제1컬럼으로부터의 여과액을 pH 8로 라인 중에 재수거하고 제2컬럼을 통해 펌핑시킨다.
모든 일련의 컬럼에 대해 작동을 반복해 연속 유동 전환시킨다.
제5컬럼 배출구에서 용액은 하기 조성을 갖는다:
200시간 후 7-ACA 생성량은 5480g이다. 총 변형 수율은 83.5%이다.
7-ACA-결정은 하기와 같이 회수돤다: 제5컬럼의 잔존하는 용액 10ℓ를 2M HCl로 pH 6으로 조절하고 4℃에서 삼투에 의해 용적 4.5ℓ로 농축시킨다. 농축물의 pH를 3.5로 조종하고 여과에 의해 결정을 회수한다. 결정화 수율:84.5%, 7-ACA 결정의 순도; 97%.
[실시예 15]
[Eupergit C 상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제로 글루타릴-7-ACA의 7-ACA로의 변형]
실시예 12에 상응하게 Eupergit 상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제 12g을 고정화된 7-아미노산 옥시다제로 세팔로스포린 C를 효소 변형시켜 수득된 글루타릴-7-ACA 용액(20.3g/l) 150ml에 가한다.
시스템을, 5% 암모니아를 자동 부가하여 pH를 8로 유지하며 25℃에서 교반하며 배양한다.
최대 변형은 7-ACA 번환 수율 86%로 50분 후에 수득된다.
[실시예 16]
[UOP 200 IPS-200 상에 고정화된 G1-7-ACA 아실라제로 글루타릴-7-ACA의 7-ACA로의 변형]
실시예 13에서와 같이 UOP IPS-200상에 고정화된 효소 아실라제 50g(습식 중량)을 컬럼ψ 4cm; h 5cm)에 로딩한다.
1% 글루타릴-7-ACA 용액 500ml를 50ml/분의 속도로 컬럼을 통해 재순환한다.
5% 암모니아를 자동 부가하여 pH를 7.8로 일정하게 유지한다. 60분 후 글루타릴-7-ACA 93%가 7-ACA로 변형된다. 효소 질량체로 부터 분리된 용액에 2N HCl을 가해 pH를 3.5로 조정하고 밤새 4℃에서 정치시킨다. 7-ACA 3.7g이 회수된다. 순도 98%.

Claims (12)

1a) 26+30℃ 및 pH 4.8 내지 5.5에서, 로도토룰라 그라실리스(Rhodotorula gracilis) ATCC 26217 배양물로부터 세포 페이스트를 용해시켜, 수성 분산액으로부터 D-아미노산 옥시다제(DAO) 효소를 분리하여, 코로마토그래피에 의해 정제하고, 가능하게는 적합한 이작용성 제제에 의해 효소 단백질과 가교결합을 형성하기 적합한 작용기를 함유하는 수성 매질에 불용성인 불활성 고체 지지체상에 정제된 효소를 고정화시켜, 효소 D-아미노산 옥시다제(DAO)를 준비하는 단계; 1b) 1a)에서 수득된 고정화된 효소를 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체(Ⅰ)의 20 내지 60g/l 농도의 수용액과 접촉시켜 pH 7 내지 8 및 20 내지 30℃의 온도에서 산소 또는 대기중에서 상기 화합물을 산화적으로 탈아미노화시키는 단계; 1c) 수성 반응 혼합물로부터 지지된 효소를 분리하고, 케토아디필세팔로스포란산이 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산으로 전환되는데 필요한 화학양론적 양과 동량 또는 과량의 과산화수소를 상기 혼합물에 가하는 단계; 1d) 피루브산 또는 이의 염 또는 알칼린 설파이트와 같은 적합한 환원제를 용액에 가함으로써 과량의 과산화수소를 제거하는 단계; 1e) 21 내지 28℃의 온도에서 호기적 조건하에 발효시키고, 세포체를 용해시키며, DEAE 수지상에서 크로마토그래피로 정제하여, 가능하게는 적합한 이작용성 제제에 의해 효소 단백질과 가교 결합을 형성하기에 적합한 작용기를 함유하는 수성 매질에 불용성인 불활성 고체 지지체상에 정제된 효소를 고정화시키는 단계에 의해, G1-7-ACA 아실라제의 생산자인 아시네토박터(Acinetobacter)종의 어떠한 미생물로부터 분리한 G1-7-ACA 아실라제 유전자를 클론시킨 β-락타마제 비생성 에스케리챠 콜라이 컬렉션 균주로부터 수득한 유전자 조작된 미생물 배양물로부터 효소 G1-7-ACA 아실라제를 제조하는 단계; 1f) 1e)에서 수득한 고정화된 효소를 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체(Ⅱ)의 10 내지 30g/l 수용액과 pH 7 내지 9 및 20 내지 30℃의 온도에서 접촉시켜 상기 화합물을 탈아실화시키는 단계들로 이루어짐을 특징으로 하여, 하기 반응 도식에 따라 세팔로스포란계 화합물(Ⅰ)에 대해 활성 형태이고 방해 효소(interfering enzymes)를 거의 함유하지 않는, 로도토룰라 그라실리스 ATCC 26217 배양물로부터 수득한 효소 D-아미노산 옥시다제(DAO)를 통해 세팔로스포린 화합물(Ⅰ)을 글루타릴 유도체(Ⅱ)로 전환시키고, 유전자 조작된 β-락타마제 비생성 미생물로부터 생성된 효소 글루타릴-7-ACA 아실라제를 통해 글루타릴 유도체(Ⅱ)를 7-아미노세팔로스포란산(Ⅲ)으로 연속적으로 변형(transformation) 시켜, 세팔로스포린 C 또는 이의 유도체로부터 7-아미노세팔로스포란산 또는 이의 유도체를 제조하는 효소적 방법.
상기식에서, R은 -OCOCH3, -H, -OH 또는 -OCONH2이다.
제1항에 있어서, G1-7-ACA 아실라제의 생산자인 아시네토박터종의 어떠한 미생물로부터의 상기 효소의 유전자가 클론되는, β-락타마제 비생성 메스케리챠 콜라이 P-3 균주(등록 번호 NCIMB 40432)로부터의 미생물 에스케리챠 콜라이 P-3(pJC 200)(등록 번호 NCIMB 40433)을 사용하여 효소 G1-7-ACA 아실라제의 제조(단계 1e)를 수행하는 방법.
제2항에 있어서, 단계 1e)에서 사용된 G1-7-ACA 아실라제의 유전자가 아시네토박터종(등록 번호 ATCC 53891)의 미생물로부터 분리되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1e)가 G1-7-ACA 아실라제의 생산자인 아시네토박터 종의 어떠한 미생물로부터의 상기 효소에 대한 유전자가 클론된 β-락타마제 비생성 이.콜라이 ATCC 9637의 자손인 이.콜라이 ATCC 9637(pJC 200)을 사용함을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 아세네토박터 종의 미생물이 ATCC 53891인 방법.
제1항에 있어서, 단계 1a) 및 1e)가 DEAE 수지상에서 크로마토그래피에 의해 효소 DAO 및 G1-7-ACA 아실라제를 정제시킴을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 DAO 및 G1-7-ACA 아실라제의 고정화에 관련된 단계 1a) 및 1e)가, a) 아민 타입의 거대망상 이온교환수지(예:Duolite A 365, Duolite A 7, Duolite A 568, Amberlite IRA 900); b) 유퍼지트(Eupergit) C 타입의, 에폭사이드 결합 작용기가 있는 폴리아클릴 수지; c) UOP IPS-200 타입의, 폴리아민 글루타르알데하이드로 함침된 무기 매트릭수를 지닌 수지 유형의 지지체상에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1a) 및 1e)가 효소 고정화를 위한 가교 결합제로서 글루타르알데하이드를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1b)가 고정화된 효소를 기질 수용액 중 분산액으로 유지시켜 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1b)가 컬럼 중에 배열된 고정화된 효소상에 기질 수용액을 통과시킴으로써 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1f)가 고정화된 효소를 기질 수용액 중에 분산액으로 유지시켜 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1f)가 컬럼 중에 배열된 고정화된 효소상에 기질 수용액을 통과시킴으로써 수행되는 방법.
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