ES2643476T3 - Cefalosporina hidroxilasa mutada y su aplicación en la síntesis del ácido desacetilcefalosporánico - Google Patents
Cefalosporina hidroxilasa mutada y su aplicación en la síntesis del ácido desacetilcefalosporánico Download PDFInfo
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Description
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DESCRIPCION
Cefalosporina hidroxilasa mutada y su aplicacion en la smtesis del acido desacetilcefalosporanico Campo de la invencion:
La presente invencion se refiere a una cefalosporina hidroxilasa modificada/mutada de Streptomyces clavuligerus que tiene mejor actividad de hidroxilacion y especificidad aumentada hacia el compuesto de formula (II), que puede incluir acido fenilacetil-7-aminodesacetoxicefalosporanico (fenilacetil-7-ADCA) y desacetoxicefalosporina C (DAOC),
en la que R representa, pero sin limitacion, hidrogeno, fenilacetilo, fenoxiacetilo, aminoadipoflo, glutarilo o cualquier otro grupo adecuado.
La presente invencion describe tambien un bioprocedimiento para preparar acido cefalosporanico de Formula general I mediante la hidroxilacion del correspondiente compuesto de formula (II) usando cefalosporina hidroxilasa mutada de la presente invencion
en la que R representa lo mismo que se describe anteriormente. Dicho procedimiento se lleva a cabo en presencia de acido a-cetoglutarico y acido ascorbico.
La cefalosporina hidroxilasa modificada de Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) y el bioprocedimiento para la smtesis del acido desacetilcefalosporanico son utiles en el procedimiento para la preparacion de acido 7- aminocefalosporanico (7-ACA), desacetil-7-ACA (7-HACA), acido 7-fenilacetamidodesacetilcefalosporanico (fenilacetil-7-HACA), cefam-4-carboxilato de p-metoxibencil-7-fenilacetamido-3-clorometilo (GCLE), acido 7-amino-3- vinil-4-cefalosporanico (CAVA), etc.
Antecedentes de la invencion:
Los antibioticos p-lactamicos tales como penicilinas y cefalosporinas son ampliamente usados para el tratamiento de una variedad de enfermedades infecciosas. Como las cefalosporinas ofrecen mejor proteccion que las penicilinas, particularmente frente a organismos resistentes, se ha dado un impulso significativo a las derivatizaciones de cefalosporinas para ampliar su espectro y potenciar su eficacia. 7-ADCA (acido 7-aminodesacetoxicefalosporanico), 7-HACA y 7-ACA sirven como intermedios fundamentales para la smtesis de numerosas cefalosporinas semisinteticas tales como cefradina, cefalexina, cefadroxilo, cefazolina, cefotaxima, ceftriaxona, cefepima, cefoperazona, cefuroxima, cefoxitina y similares. Actualmente, el 7-ACA se deriva de cefalosporina C mediante la escision de la cadena lateral de 7-aminoadipoMo mediante un procedimiento enzimatico en dos etapas (documento US 5424196) y el 7-ADCA se deriva mediante la hidrolisis de fenilacetil-7-ADCA por penicilina G amidasa, en el que el fenilacetil-7-ADCA se fabrica mediante la qmmica convencional de expansion de anillo de penicilina G. Al ser 7- ADCA o Cef G mas baratos que 7-ACA o Cef C, respectivamente, un procedimiento para convertir viablemente 7- ADCA con o sin un sustituyente en posicion 7-amino, como un grupo fenilacetilo, en el correspondiente acido desacetilcefalosporanico, proporcionana una alternativa mas economica a HACA.
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Se producen penicilinas y cefalosporinas nativas por una variedad de bacterias y organismos fungicos y se ha realizado un progreso significativo en la comprension de su arquitectura reguladora (Aharonowitz, Y., et al., Annu. Rev. Microbiol. 46: 461-495, 1992; Axel A. Brakhage, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 547-585, 1998). Se condensan tres aminoacidos, L-valina, L-a-aminoadipato y L-cistema formando el tripeptido 8-(L-a-aminoadipoil)-L-cisteinil-D- valina, que se cicla entonces formando isopenicilina N. En el caso de los productores de penicilina, se convierte la isopenicilina N en penicilina G, penicilina V, etc. La biosmtesis de cefalosporina por epimerizacion de isopenicilina N a penicilina N en organismos tales como C. acremonium, S. clavuligerus, etc. conduce a compuestos cefemicos tales como cefalosporina C y cefamicina C. La etapa limitante de velocidad, o mas bien comprometida, en la biosmtesis de cefalosporinas es la expansion del anillo de tiazolidina de 5 miembros de penicilina N al anillo de dihidrotiazina de 6 miembros de desacetoxicefalosporina C (DAOC). En procariotas tales como Streptomyces clavuligerus, se cataliza la etapa de expansion de anillo de penicilina N por una enzima llamada desacetoxicefalosporina C sintasa (DAOCS o cefE o expandasa) y se lleva a cabo la hidroxilacion de DAOC por cefalosporina hidroxilasa (desacetilcefalosporina C sintasa o DACS o cefF o hidroxilasa) (Jensen S. E. et al., Journal of Antibiotics. 38, 263-265, 1985). En organismos eucarioticos tales como Cephalosporium acremonium, ambas de estas reacciones se catalizan por una sola enzima bifuncional DAOCS-DACS (expandasa-hidroxilasa o cefEF) (Dotzlaf, J. E. y Yeh, W. K., Journal of Bacteriology, 169, 1611-1618, 1987). Posteriormente, la
desacetilcefalosporina C (DAC) se acetila a cefalosporina C en Cephalosporium acremonium, mientras que en bacterias tales como Streptomyces clavuligerus, aparecen modificaciones adicionales que dan como resultado la cefamicina C.
El gen cefEF que codifica 332 aminoacidos codifica la expandasa-hidroxilasa en C. acremonium (Samson, S. M., et al., Nature Biotechnology, 5, 1207-1215, 1987).
El gen de desacetilcefalosporina C sintasa (cefF) se ha clonado y secuenciado de S. clavuligerus y codifica 318 aminoacidos (Kovacevic, S. y Miller, J. R., Journal of Bacteriology, 173, 398-400, 1991). La hidroxilasa tiene un 54 % de identidad de secuencia aminoaddica con la expandasa-hidroxilasa de C. acremonium. Las enzimas expandasa, expandasa-hidroxilasa e hidroxilasa son oxigenasas dependientes de hierro (II) y a-cetoglutarato y son parte de una subfamilia de enzimas ferrosas mononucleares.
La penicilina N es el sustrato natural para expandasa y expandasa-hidroxilasa y DAOC es el sustrato para hidroxilasa. Sin embargo, se ha detectado una especificidad de sustrato alterada de expandasa-hidroxilasa para diferentes sustratos tales como penicilina G, penicilina V, 6-a-metilpenicilina N y adipoil-6-APA (Lloyd et.al. Journal of Biological Chemistry, 279, 15420-15426, 2004). Como resultado, el desarrollo de tecnologfas verdes para la fabricacion de intermedios de cefalosporina esta por tanto restringido a estas enzimas. Sin embargo, estas enzimas muestran una mala capacidad de conversion de sustratos facilmente disponibles tales como fenilacetil-7-ADCA y, por ello, se requiere genomanipularlas para aplicaciones comerciales. El documento WO 2008/107782 (445/CHE/2007) describe tales manipulaciones para hidroxilasa y su uso en el bioprocedimiento para la preparacion del compuesto de formula (I), algunas de las cepas obtenidas segun esta patente, como MTCC 5739, MTCC 5741 y MTCC 5746 a MTCC 5749, no son industrialmente escalables debido a la mala actividad hidroxilasa y por ello sigue requiriendose identificar un mejor mutante de hidroxilasa con vistas a la produccion industrial.
Tambien en publicaciones como Baker, B. J., et al., Journal of Biological Chemistry 266, 5087-5093, 1991; Coque, J. J. R., et al., Applied Microbiology and Biotechnology 44, 605-609, 1996, se ha descrito la conversion de acido 7- aminoadipoildesacetoxicefalosporanico en el correspondiente acido desacetilcefalosporanico. Cuando se ensayaron, estos procedimientos no convertfan mas de un 5 % del sustrato a concentraciones muy bajas. Estos procedimientos no eran por tanto practicos ni escalables. En la tecnica anterior no se divulga un procedimiento escalable para la hidroxilacion de desacetoxicefalosporinas.
El documento EP 465189 proporciona compuestos de ADN que codifican la actividad hidroxilasa de S.clavuligerus. Esta patente divulga el procedimiento para expresar la actividad hidroxilasa de S. clavuligerus en una celula hospedadora recombinante. El compuesto de ADN que codifica la actividad hidroxilasa se aislo del ADN genomico de S. clavuligerus y se usa para construir un vector de expresion de ADN recombinante llamado pOW399. El gen de hidroxilasa clonado se usa en la hidroxilacion de compuestos de cefalosporina; sin embargo, la actividad de la enzima es insatisfactoria para fabricacion industrial.
El documento US 6.180.361 trata sobre compuestos de ADN, vectores de clonacion y expresion de ADN recombinantes que codifican la actividad DAOCs y DACS. El compuesto de ADN que codifica las actividades DACS/DAOCS se aislo de ADN genomico de Cephalosporium acremonium y se usa para construir vectores de expresion de ADN recombinante. Esta invencion divulga tambien un procedimiento para expresar un polipeptido de desacetoxicefalosporina C sintetasa/hidroxilasa de Cephalosporium en una celula hospedadora recombinante.
El documento WO01/85951 describe una expandasa modificada y polinucleotidos que codifican la expandasa modificada, y en particular una expandasa tal como penicilina N expandasa que tiene una especificidad aumentada por un sustrato tal como penicilina G frente al tipo silvestre.
Por ello, existe la necesidad de identificar una cefalosporina hidroxilasa con actividad potenciada para la hidroxilacion del compuesto de formula (II), que sea economica e industrialmente escalable. Como la cefalosporina
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hidroxilasa nativa muestra mala afinidad por el compuesto de Formula (II), la utilidad industrial demanda el desarrollo de una hidroxilasa modificada para potenciar su actividad. Como resultado, la presente invencion esta relacionada con el desarrollo de una hidroxilasa modificada de S. clavuligerus que tenga especificidad de sustrato aumentada por sustratos tales como el compuesto de Formula (II), en comparacion con la hidroxilasa de tipo silvestre. La invencion actual proporciona tambien un procedimiento escalable para la hidroxilacion de acido desacetoxicefalosporanico catalizada por la cefalosporina hidroxilasa modificada o cualquier hidroxilasa dependiente de acido a-cetoglutarico.
Sumario de la invencion:
Segun un primer aspecto de la invencion, se proporciona una hidroxilasa mutante que porta sustituciones aminoaddicas en las posiciones de residuo de la hidroxilasa de tipo silvestre de secuencia seleccionadas de:
i) P72L, T90A, V206I, A210V, A311 V
ii) P7L, P72L, T90A, A237V, A311V
iii) T51M, P72L, T90A, A311V
iv) A40V, P72L, T90A, A311 V
v) P72L, T90A, A237V, A311 V
vi) P72L, T90A, M233I, A311V
vii) P72L, T90A, E258K, A311V
viii) P72L, T90A, F195L, A311V
ix) P72L, T90A, R250L, A311V
x) P72L, T90A, V226I, A311 V
xi) P72L, T90A, V206I, A210V, T273A, A311 V
xii) P7L, P72L, T90A, A237V, T273A, A311V
xiii) P7L, P72L, T90A, T273A, A311 V
xiv) P72L, T90A, A237V, T273A, A311V
xv) T51M, P72L, T90A, T273A, A311V
xvi) A40V, P72L, T90A, T273A, A311V
xvii) P72L, T90G, A237V, T273A, A311V
xviii) T51M, P72L, T90A, A237V, T273A, A311V
xix) A40V, P72L, T90A, A237V, T273A, A311V
xx) T51M, P72L, T90A, M229I, T273A, A311V
xxi) A40V, P72L, T90A, M229I, T273A, A311V
xxii) A40V, P72L, T90A, M229I, F267L, T273A, A311V
xxiii) A40V, P72L, T90A, A177V, M229I, F267L, T273A, A311V
xxiv) A40V, P72L, T90A, F195L, M229I, F267L, T273A, A311V
xxv) A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M229I, T273A, A311V
xxvi) A40V, P72L, T90A, V171L, M229I, T273A, A311V
xxvii) A40V, P72L, T90A, Q209E, M229I, V249I, T273A, A311V
xxviii) A40V, P72L, T90A, Q209E, M229I, T273A, A311V
xxix) A40V, P72L, E82D, T90A, Q209E, M229I, L236V, V249I, T273A, A311V
xxx) A40V, P72L, T90A, V221P, M229I, T273A, A311V
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xxxi) A40V, P72L, T90A, V221H, M229I, T273A, A311V
xxxii) A40V, P72L, T90A, R182S, M229I, T273A, A311V
xxxiii) A40V, P72L, T90A, A177V, M229I, T273A, A311V
xxxiv) A40V, P72L, T90A, V171M, M229I, T273A, A311V
xxxv) A40V, P72L, T90A, M229I, S260G, T273A, A311V
xxxvi) A40V, P72L, T90A, M229I, S251F, T273A, A311V
xxxvii) A40V, P72L, T90A, F195L, M229I, T273A, A311V
xxxviii) A40V, P72L, T90A, V226I, M229I, T273A, A311V
xxxix) A40V, P72L, T90A, M229I, R250L, T273A, A311V xl) A40V, P72L, T90A, M229I, E258K, T273A, A311V xli) A40V, P72L, T90A, M229I, M233I, T273A, A311V
xlii) A40V, P72L, T90A, F195L, V226I, M229I, T273A, A311V
xliii) A40V, P72L, T90A, F195L, R250L, M229I, T273A, A311V
xliv) A40V, P72L, T90A, V226I, M229I, R250L, T273A, A311V
xlv) A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M229I, F267L, T273A, A311V
xlvi) A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M233I, M229I, F267L, T273A, A311V
xlvii) A40V, P72L, T90A, V 171 L, M229I, F267L, T273A, A311 V
xlviii) A40V, P72L, T90A, V171L, F195L, M229I, F267L, T273A, A311V
xlix) A40V, P72L, T90A, V171L, M229I, M233I, F267L, T273A, A311V
l) A40V, P72L, T90A, V171L, M229I, E258K, F267L, T273A, A311V
li) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V
lii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V, N313D
liii) A40V, P72L, T90A, V171L, A177V, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V, N313D
liv) A40V, P72L, T90A, R91G ,V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V
Iv) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, A280S, T273A, A311V,
lvi) A40V, M53L, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311M
lvii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, V226I, M229I, F267L, T273A, A311V
lviii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A, V307A, A311 V
lix) A40V, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V
lx) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311M
lxi) A40V, P72L, T90A, T96S, I149T, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V
lxii) A40V, P72L, T90A, V171L, A177V, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V
lxiii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, S251F, F267L, T273A, A311V
lxiv) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, S260G, F267L, T273A, A311V
lxv) A40V, P72L, T90A, R91G, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A, V307A, A311V
lxvi) A40V, P72L, T90A, R91G, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, T273A, A280S, A311V
Ixvii) A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, T273A, A280S, A311V
Ixviii) A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A,V307A, A311V
Ixix) A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V
Ixx) A40V, P72L, T90A, G108D, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V.
5 Segun un segundo aspecto de la invencion, se proporciona una molecula de acido nucleico que codifica la hidroxilasa mutante del primer aspecto de la invencion.
Segun un tercer aspecto de la invencion, se proporciona un vector que contiene la molecula de acido nucleico del segundo aspecto de la invencion.
Segun un cuarto aspecto de la invencion, se proporciona el microorganismo portador del vector recombinante del 10 tercer aspecto de la invencion, capaz de expresar el gen.
Segun un quinto aspecto de la invencion, se proporciona un procedimiento para la preparacion del compuesto de formula (I) que comprende hacer reaccionar el compuesto de formula (Il) con la enzima reivindicada en la reivindicacion 1 en presencia de acido a-cetoglutarico, acido ascorbico y sulfato ferroso en un medio acuoso a una temperatura de entre 5 y 25 °C con un pH de 6 a 8,
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en las que R representa hidrogeno, fenilacetilo, fenoxiacetilo, aminoadipoMo y glutarilo.
Descripcion de la Figura:
Figura 1: Se da la secuencia aminoaddica de tipo silvestre de hidroxilasa de S. clavuligerus en la SEQ ID No: 1. Figura 2: Se da la secuencia nucleotfdica y aminoaddica de hidroxilasa de S. clavuligerus en la SEQ ID No: 1.
20 DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona una cefalosporina hidroxilasa mutante que exhibe una actividad aumentada y mayor especificidad por sustratos tales como fenilacetil-7-ADCA que la hidroxilasa de tipo silvestre de la bacteria S. clavuligerus. Se clono esta enzima y el correspondiente gen (gen cefF) y se caracterizo (Kovacevic S. y Miller J. R., Journal of Bacteriology, 173, 398-400, 1991). Se da la secuencia nucleotfdica y aminoaddica de tipo silvestre de 25 hidroxilasa de S. clavuligerus en la SEQ ID No: 1 (Figura 2).
Las mutaciones de la presente invencion proporcionan una hidroxilasa mutada que tiene actividad de hidroxilacion potenciada por sustratos tales como fenilacetil-7-ADCA.
La hidroxilasa modificada segun la presente invencion tiene la siguiente sustitucion aminoaddica espedfica en los residuos aminoaddicos correspondientes a la hidroxilasa de tipo silvestre para el grupo de residuos
30 - la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en
posicion 206 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 210 es sustituida por valina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5740)
- la prolina en posicion 7 es sustituida por leucina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 237 es sustituida por valina, la alanina en posicion 311
35 es sustituida por valina (MTCC 5742)
- la treonina en posicion 51 es sustituida por metionina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5743)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5744)
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- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 237 es sustituida por valina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5745)
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 233 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5750)
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, el acido glutamico en posicion 258 es sustituido por lisina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5751)
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5752)
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la arginina en posicion 250 es sustituida por leucina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5753)
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 226 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5754)
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 206 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 210 es sustituida por valina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la prolina en posicion 7 es sustituida por leucina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 237 es sustituida por valina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la prolina en posicion 7 es sustituida por leucina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 237 es sustituida por valina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la treonina en posicion 51 es sustituida por metionina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311
es sustituida por valina
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por glicina, la alanina en posicion 237 es sustituida por valina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la treonina en posicion 51 es sustituida por metionina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 237 es sustituida por valina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 237 es sustituida por valina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la treonina en posicion 51 es sustituida por metionina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en
posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5755)
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la valina en posicion 226 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 250 es sustituida por leucina, la alanina
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en posicion 311 es sustituida por valina
- la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, el acido glutamico en posicion 258 es sustituido por lisina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5757)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 177 es sustituida por valina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 184 es sustituida por isoleucina, la isoleucina en posicion 193 es sustituida por valina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5756)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5758)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la glutamina en posicion 209 es sustituida por acido glutamico, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la valina en posicion 249 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la glutamina en posicion 209 es sustituida por acido glutamico, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, Gel acido glutamico en posicion 82 es sustituido por acido aspartico, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la glutamina en posicion 209 es sustituida por acido glutamico, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la leucina en posicion 236 es sustituida por valina, la valina en posicion 249 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5759)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 221 es sustituida por prolina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 221 es sustituida por histidina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la arginina en posicion 182 es sustituida por serina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5760)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 177 es sustituida por valina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5761)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
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- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la serina en posicion 260 es sustituida por glicina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5763)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la serina en posicion 251 es sustituida por fenilalanina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5764)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 226 es sustituida por isoleucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la arginina en posicion 250 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, el acido glutamico en posicion 258 es sustituido por lisina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la metionina en posicion 233 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la valina at posicion 226 es sustituida por isoleucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por Valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 250 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 226 es sustituida por isoleucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la arginina en posicion 250 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 184 es sustituida por isoleucina, la isoleucina en posicion 193 es sustituida por valina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la metionina en posicion 184 es sustituida por isoleucina, la isoleucina en la posicion 193 es sustituida por valina, la metionina en posicion 233 es sustituida por isoleucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229
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- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la fenilalanina en posicion 195 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la metionina en posicion 233 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la metionina en posicion 229 esta sustituida por isoleucina, el acido glutamico en posicion 258 es sustituido por lisina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5766)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina, la asparagina en posicion 313 es sustituida por acido aspartico (MTCC 5767)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina at position 171 es sustituida por leucina, la alanina en posicion 177 es sustituida por valina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina, la asparagina en posicion 313 es sustituida por acido aspartico
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la arginina en posicion 91 es sustituida por glicina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es
sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es
sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5768)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la glicina en posicion 255 es
sustituida por acido aspartico, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la alanina en posicion 280 es
sustituida por serina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5769)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la metionina en posicion 53 es sustituida por leucina, la prolina en
posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es
sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es
sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por metionina (MTCC 5770)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la valina en posicion 226 es sustituida por isoleucina, la metionina en posicion 229 es
sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es
sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 241 es
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- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en
posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en
posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267
es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es
sustituida por metionina (MTCC 5772)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la treonina en posicion 96 es sustituida por serrina, la isoleucina en posicion 149 es sustituida por treonina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es
sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es
sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5773)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en
posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la alanina en posicion 177 es sustituida por valina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es
sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es
sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la serina en posicion 251 es sustituida por fenilalanina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la serina en posicion 260 es sustituida por glicina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la arginina en posicion 91 es sustituida por glicina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 241 es sustituida por valina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la valina en posicion 307 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5774)
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la arginina en posicion 91 es sustituida por glicina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la glicina en posicion 255 es sustituida por acido aspartico, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 280 es sustituida por serina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la treonina en posicion 96 es sustituida por serina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la glicina en posicion 255 es sustituida por acido aspartico, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 280 es sustituida por serina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la treonina en posicion 96 es sustituida por serina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la alanina en posicion 241 es sustituida por valina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la valina en posicion 307 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
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- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la treonina en posicion 96 es sustituida por serina, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina
- la alanina en posicion 40 es sustituida por valina, la prolina en posicion 72 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 90 es sustituida por alanina, la glicina en posicion 108 es sustituida por acido aspartico, la valina en posicion 171 es sustituida por leucina, la arginina en posicion 182 es sustituida por triptofano, la metionina en posicion 229 es sustituida por isoleucina, la fenilalanina en posicion 267 es sustituida por leucina, la treonina en posicion 273 es sustituida por alanina, la alanina en posicion 311 es sustituida por valina (MTCC 5775).
Es otra realizacion de la invencion proporcionar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la hidroxilasa mutada. Esta molecula de acido nucleico aislada se obtiene mutando la hidroxilasa de tipo silvestre. La tecnica de mutagenesis podna ser qmmica, PCR con tendencia a error o enfoque dirigido a sitio. Puede seleccionarse la tecnica de mutagenesis adecuada y usarse para introducir mutaciones y puede clonarse y expresarse la molecula de acido nucleico mutada y puede estudiarse la propiedad del polipeptido.
El acido nucleico mutado puede fusionarse con la secuencia de peptido senal de p-lactamasa y expresarse la protema de fusion para una expresion de protema soluble potenciada.
En otro aspecto de la invencion, puede incorporarse la molecula de acido nucleico mutada a un vector recombinante que es capaz de expresion o replicacion cuando se transfiere a una celula hospedadora. La expresion del polipeptido puede controlarse por una secuencia reguladora, probablemente un promotor.
El vector recombinante puede introducirse en una cepa hospedadora produciendo la desacetilcefalosporina C sintasa mutada.
La hidroxilasa mutada, cuando se expresa en la cepa hospedadora, puede ser capaz de convertir el sustrato fenilacetil-7-ADCA de formula general (II) en fenilacetil-7-HACA de formula general (I) por hidroxilacion. El fenilacetil- 7-HACA puede conducir a 7-HACA por hidrolisis enzimatica usando Pen G amidasa o a 7-ACA despues de acetilacion por acetil transferasa o conversion qmmica adecuada seguida de hidrolisis enzimatica usando Pen G amidasa.
Segun la presente invencion, el peptido modificado tiene una secuencia aminoaddica diferente de la de SEQ ID NO:
1. Este polipeptido es uno que tiene actividad de hidroxilacion, es decir cataliza la hidroxilacion de la cadena lateral de 3-metilo de fenilacetil-7-ADCA hasta 3-hidroximetilo. La actividad de hidroxilacion del polipeptido se modifica o aumenta y tambien se aumenta la actividad catalizadora por un sustrato distinto que su sustrato natural. La hidroxilasa modificada tiene una actividad catalttica potenciada o especificidad aumentada por otros sustratos tales como fenilacetil-7-ADCA cuando se compara con la hidroxilasa de tipo silvestre.
Los polipeptidos asf producidos a partir de la secuencia nucleotidica mutada pueden usarse para producir quimeras a partir de porciones de otros peptidos de expandasa-hidroxilasa, expandasa e hidroxilasa.
Los polipeptidos pueden purificarse con un nivel variable de homogeneidad y pueden usarse con otros fines.
La invencion puede usarse para la fabricacion de cefalosporinas modificadas mediante tecnologfas enzimaticas o basadas en la fermentacion in vivo. Pueden encontrarse en la bibliograffa los procedimientos detallados, tales como la transformacion y fermentacion de tales celulas, la purificacion y aislamiento.
Es aun otra realizacion de la invencion proporcionar un procedimiento para producir y elaborar dicha protema para catalizar la hidroxilacion de acido desacetoxicefalosporanico.
Las cepas Escherichia coli BL21 (DE3) con hidroxilasa modificada pueden expresarse en un matraz o fermentador con una temperatura de preinduccion de 25 °C o menos. El cultivo a mas de 25 °C antes de la induccion conduce a cuerpos de inclusion y podfa encontrarse la expresion optima en forma activa y soluble 12-25 horas despues de la induccion. Las celulas pueden inducirse con IPTG y recolectarse las celulas en cualquier momento entre 12 y 30 horas despues de la induccion, preferiblemente entre 14 y 20 horas y aun mas preferiblemente 16-20 horas. La DO600 nm de induccion puede ser preferiblemente superior a 60, mas preferiblemente superior a 80 y aun mas preferiblemente superior a 120.
El sedimento celular obtenido mediante fermentacion puede lisarse despues de la adicion de una cantidad adecuada de tampon de resuspension mediante cualquier procedimiento no limitado a sonicacion, homogeneizacion a alta presion, molino de perlas, liofilizacion o mediante la adicion de cualquier producto qmmico.
La enzima producida por fermentacion puede enriquecerse para obtener enzima utilizable para la catalisis de la hidroxilacion del acido desacetoxicefalosporanico mediante uno o una combinacion de procedimientos. Los procedimientos pueden implicar la union de la protema a cualquier matriz con dietilaminoetilo (DEAE) u otro grupo
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funcional de intercambio anionico debil en presencia de tampon Tris o tampon fosfato y eluyendo con una solucion de cloruro de sodio (NaCI) 0,4 M. Un procedimiento alternativo puede implicar la adicion de polietilenimina (PEI) al 0,3 % (v/p) al lisado celular y el atrapamiento de la enzima en el sedimento formado, o la liberacion de la enzima del sedimento a la solucion con la adicion de NaCl 0,4 M. En aun otro procedimiento alternativo, puede anadirse PEI al 0,1 % (v/v) agitando durante un tiempo adecuado, preferiblemente 1 hora, y centrifugando. Puede anadirse al centrifugado sulfato de amonio al 60 % (p/p), seguido de agitacion durante un periodo de tiempo y centrifugado. El sedimento obtenido con la protema activa puede usarse para elaboracion adicional. La protema activa asf obtenida de cualquiera de los procedimientos anteriores puede usarse en forma de solucion o en forma de solido liofilizado o en forma de solido inmovilizado o en forma de granulo.
Es aun otra realizacion de la presente invencion proporcionar un procedimiento escalable para la preparacion de acidos desacetilcefalosporanicos (formula I)
en la que R puede ser cualquier grupo de, pero sin limitacion, hidrogeno, fenilacetilo, aminoadipoMo, glutarilo, etc.
Los microorganismos a partir de los cuales puede obtenerse hidroxilasa o expandasa/hidroxilasa son, por ejemplo, Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans (antiguamente conocido como Streptomyces lactamdurans), Xanthomonas lactamgenus, Flavobacterium sp, Streptomyces organanencis, Streptomyces lactamgens, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces ofivaceus y Cephalosporium acremonium.
La concentracion inicial del sustrato acido desacetoxicefalosporanico en la reaccion puede ser de 0,5-10 %, preferiblemente de 1-10 %, mas preferiblemente de 2-10 %, aun mas preferiblemente de 3-10 %, aun mas preferiblemente de 4-10 % y aun mas preferiblemente de 5-10 %.
Un ejemplo de un procedimiento para la preparacion de acidos desacetilcefalosporanicos (formula I) comprende las siguientes etapas de:
1. disolver el acido desacetoxicefalosporanico de formula general (II) en un medio acuoso;
2. anadir una relacion molar de 1-3 de acido a-cetoglutarico, y una relacion molar de 0,1-1 de acido ascorbico en comparacion con el acido desacetoxicefalosporanico y sulfato ferroso;
3. anadir la enzima cefalosporina hidroxilasa;
4. llevar a cabo la reaccion a pH 5-8,5 y una temperatura entre 5-25 °C;
5. aislar el compuesto de formula (II).
El acido desacetoxicefalosporanico puede anadirse completamente al inicio de la reaccion o anadirse durante un periodo durante el transcurso de la reaccion. Puede usarse cualquier base como amoniaco, bicarbonato de sodio o hidroxido de sodio para solubilizarlo en agua.
Puede anadirse una relacion molar 1-3 de acido a-cetoglutarico a la reaccion, preferiblemente una relacion molar 1-2 y aun mas preferiblemente una relacion molar 1-1,5 toda al inicio o durante el transcurso de la reaccion. Puede anadirse una relacion molar 0,1-1 de acido ascorbico a la reaccion, preferiblemente puede anadirse 0,2-0,8 todo al inicio o durante el transcurso de la reaccion.
La adicion de enzima puede usarse en forma de solucion o de solido, en forma libre o atrapada o inmovilizada sobre una matriz y puede anadirse toda al inicio o durante el transcurso de la reaccion.
La reaccion puede llevarse a cabo en cualquier intervalo de pH entre 5 y 8,5, preferiblemente entre 6,0 y 8, mas preferiblemente de 6,5 a 7,5 y a una temperatura entre 5 y 25 °C, preferiblemente entre 10 y 25 °C y aun mas preferiblemente entre 15 y 25 °C.
Se depositaron cepas Escherichia coli BL21 (DE3) que conteman genes de hidroxilasa modificada en la Microbial Type Culture Collection del centro Chandigarh, India de acuerdo con el tratado de Budapest y se les asignaron los
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numeros de acceso (MTCC 5740, MTCC 5742 a MTCC 5745, MTCC 5750 a MTCC 5775) (indicado con la senal ± en la Tabla 1).
Materiales:
Todos los productos qmmicos y reactivos se adquirieron en Sigma-Aldrich Chemicals Pvt. Ltd o USB, EE.UU. Los oligonucleotidos se sintetizaron y suministraron por Eurofins Genomics, Bangalore, India. Las enzimas de restriccion, el vector pUC19 para clonacion y las cepas se obtuvieron de New England Biolabs Inc, EE.UU. El vector pET24a para expresion, la cepa hospedadora de expresion Escherichia coli BL21 (DE3) y el reactivo Bugbuster eran de Novagen, EE.UU. Se obtuvo Streptomyces clavuligerus de la American Type Culture Collection, EE.UU. (ATCC). Se adquirio el reactivo de Bradford en Biorad, EE.UU. Se obtuvieron las columnas C18 (50 x 4,6 mm, 5|j, Xterra) de Waters, EE.UU. Se suministraron el kit de aislamiento DNeasy Plant mini gDNA y el kit de extraccion en gel QIAEX II por Qiagen, Alemania y se obtuvieron los componentes de medios de cultivo de Becton Dickinson, EE.UU.
Condiciones de crecimiento de Streptomyces clavuligerus:
Se hizo crecer la cepa de S. clavuligerus (ATCC No.27064) en medio YMG que contema extracto de levadura 4 g, extracto de malta 10 g y glucosa 4 g rellenado hasta 1 litro con agua destilada a pH 7. Se incubo el cultivo a 25 °C y 180 rpm durante 48 horas. Una vez la DO600 nm alcanzo 3, se recolectaron los micelios y se recogieron los sedimentos celulares despues de centrifugacion a 16.000 rpm durante 15 minutos.
Reaccion en cadena de la polimerasa:
Se aislo el ADN genomico de los micelios usando el kit de aislamiento DNeasy Plant mini gDNA (Qiagen) de acuerdo con el protocolo proporcionado con el kit. Se amplifico el gen que codifica la hidroxilasa (cefF) (numero de acceso: M63809) usando 20 pmol de cebadores 5' GCATATGGCGGACACGCCCgTacC 3' y 5' CCCGGCTTGAATGCAACGACGAGCAT 3', dNTP 200 jM, 10 % de DMSO, tampon de ADN polimerasa Deep vent, 2 U de enzima ADN polimerasa Deep vent, MgSO4 1 mM y agua en un volumen de reaccion final de 100 jl. Las condiciones de PCR consisten en una desnaturalizacion inicial durante 5 min a 95 °C seguida de 24 ciclos consistentes en desnaturalizacion a 95 °C durante 40 s, reasociacion a 60 °C durante 1 min, extension a 72 °C durante 5 min con una extension final a 72 °C durante 15 min. Se verifico un producto amplificado de una longitud de aproximadamente 1 kb de fragmento del gen cefF por electroforesis en gel de agarosa.
Clonacion en pUC19 y pET24a:
Se purifico el fragmento de gen de hidroxilasa observado despues de amplificacion por el kit de extraccion en gel QIAEX II (Qiagen) y se clono en el vector pUC19 mediante ligamiento de extremo romo usando el sitio de restriccion Smal, proporcionando pOBTF. Posteriormente, se libero el fragmento de gen de hidroxilasa por digestion con NdeI/EcoRI y se ligo en pET24a (+) digerido de forma similar dando el vector pOCPLF y se transformo en la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) competente para expresion adicional.
Generacion de la protema de fusion de p-lactamasa:
Se obtuvo un cebador que contema el gen del peptido senal de p-lactamasa y los codones iniciales del gen cefF (de Sigma Aldrich) y se fusiono con el gen cefF realizando una PCR sin cebadores durante 30 ciclos. Posteriormente, se uso este producto de PCR como molde para otro conjunto de PCR (30 ciclos) en el que el cebador de codificacion tema una parte de la secuencia senal de p-lactamasa y el cebador inverso tema amplificada la secuencia de cefF (del extremo 3'). Las condiciones de PCR permanecen iguales que las descritas anteriormente para amplificar el gen cefF. Se sometio a electroforesis la mezcla de PCR en un gel de agarosa y se extrajo el producto genico del gel usando el kit de extraccion en gel obtenido de Sigma Aldrich, Bangalore. Se clono el producto genico fusionado aislado en pBSK mediante ligamiento de extremo romo usando el sitio de restriccion Smal y usando protocolos de biologfa molecular estandares. Posteriormente, se libero la senal de p-lactamasa-fragmento del gen cefF (BF) mediante digestion con Ncol y Hind y se ligo en pET24a digerido de forma similar dando el vector pBFP y se transformo en la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) competente para expresion adicional del constructo de fusion. Las medidas de expresion y actividad indicaban una actividad dos veces mayor que el constructo original correspondiente.
Mutagenesis y creacion de coleccion:
El vector pOBTF servfa como molde inicial de mutagenesis aleatoria y dirigida a sitio para generar variantes del gen cefF. Se realizo la mutagenesis aleatoria amplificando el gen cefF por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) empleando condiciones mutagenicas que favorecen la incorporacion de nucleotidos no complementarios durante la smtesis de ADN por la ADN polimerasa (mutagenesis con tendencia a error). Esto puede conseguirse eligiendo la ADN polimerasa apropiada (p.ej., se ha usado ADN polimerasa Taq en varios estudios para mutagenesis aleatoria) y/o modificando la composicion de la mezcla de reaccion de pCr para acentuar la actividad polimerasa con tendencia a error (p.ej., al sesgar la concentracion de dNTP en lugar de usar una mezcla equimolar de los cuatro dNTP). Puede hacerse referencia al artfculo de Cirino PC, et al., “Generating mutant libraries using error-prone PCR”, Methods Mol Biol. 2003; 231: 3-9 y a las referencias en el mismo para un protocolo detallado. Se clonan las
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copias mutantes de los genes cefF as^ obtenidos en el vector de expresion pET24a y se transforman en la cepa de expresion E. coli B121 (DE3), creando una coleccion de clones que expresan mutantes/variantes de la protema cefF. Se hacen crecer colonias individuales obtenidas en la transformacion en placas de cultivo de 96 pocillos y se almacenan como soluciones madre en glicerol a -80 °C. La propiedad deseada puede mejorarse tambien generando combinaciones de los mutantes obtenidos mediante mutagenesis aleatoria empleando procedimientos como transposicion de ADN (combinaciones aleatorias) [Joem JM. “DNA shuffling”, Methods Mol Biol. 2003; 231: 85-89] y/o mutagenesis dirigida a sitio (combinaciones espedficas). Los mutantes pueden optimizarse adicionalmente tambien incorporando aminoacidos distintos de los obtenidos por mutagenesis aleatoria mediante procedimientos como mutagenesis por saturacion de sitio y/o mutagenesis dirigida a sitio. Los protocolos detallados pueden encontrarse en los artmulos de Georgescu R, et al., “Saturation mutagenesis”, Methods Mol Biol. 2003; 231:75-83 y Miyazaki K. “Creating random mutagenesis libraries by megaprimer PCR of whole plasmid (MEGAWHOP)”, Methods Mol Biol. 2003; 231 23-28 y las referencias en el mismo. Una vez se identifica un mutante con las propiedades deseadas (actividad mejorada en este caso), puede servir como molde para la siguiente ronda de evolucion dirigida que implica algunos o todos los procedimientos descritos anteriormente.
Expresion de clones de coleccion para cribado:
Se inocularon las soluciones madre en glicerol que contienen los presuntos genes mutantes cefF en el vector pET24a (+) en la cepa E.coli BL21 (DE3) en placas de 96 pocillos que contienen medio LB con kanamicina (75 |jg/ml) para crecimiento durante una noche a 37 °C a 260 rpm. Se subcultivo el cultivo de una noche de nuevo en placas de 96 pocillos profundos que contienen 1 ml de medio LB y se hicieron crecer a 37 °C hasta que la DO600 nm alcanzo de 0,4 a 0,6 y se llevo a cabo la induccion con p-D-tiogalactopiranosido de isopropilo (IPTG) 0,1 mM. Despues de la induccion, se dejo crecer el cultivo durante 5 horas a 25 °C y se recolectaron las celulas mediante centrifugacion en una centnfuga de microplacas a 4.000 rpm durante 10 min a 4 °C. Se almacenaron los sedimentos a -80 °C hasta uso adicional.
Ensayo para el cribado de actividad:
Se libero la enzima de los clones expresados usando el reactivo Bugbuster y se ensayo la reaccion de hidroxilacion con acido a-cetoglutarico 45 mM, ascorbato 9 mM, sulfato ferroso 0,1 mM, Tris-HCl 355 mM y 0,56 % de fenilacetil- 7-ADCA en un volumen de reaccion de 200 jl a 25 °C durante 180 minutos con agitacion a 220 rpm. Se inactivo la reaccion con 200 jl de metanol y se analizo por HPLC. Se han tabulado los datos de actividad en la Tabla 1 con la enzima de tipo silvestre referenciada como 100 %
Monitorizacion por cromatograffa liquida de alta resolucion de la actividad hidroxilasa:
Se recogieron todos los datos de HPLC en un Shimadzu 2010C. Se equilibro una columna C18 Xterra con tampon que contema 3,12 g de fosfato de sodio en 800 ml de agua y 200 ml de acetonitrilo con el pH ajustado a 2,4 usando acido orto-fosforico. Se eluyeron los componentes del ensayo usando tampon A a un caudal de 2,5 ml/min. Se inyectaron 20 jl de muestra y se detectaron los componentes a 260 nm. Los tiempos de retencion de los compuestos en estas condiciones son de 0,65 min y 1,3 min para fenilacetildesacetil-7-ACA y fenilacetil-7-ADCA, respectivamente.
Expresion de protema a gran escala:
Se preparo el medio de fermentacion como se describe por Lee SY. y Chang HN., Biotechnology Letters, 15, 971974, 1993.
Se transfirio un inoculo de semilla al 4-5 % crecido durante 6-8 horas en matraz agitado en medio R/2 a un fermentador y se cultivo a 25 °C con agitacion para mantener el oxfgeno disuelto al menos al 40 %. Tras el agotamiento de la glucosa residente, se inicio la alimentacion para mantener una glucosa residual de 0,1 g/l. Al alcanzar la DO600 nm aproximadamente de 40 a 150, se anadio ipTG 0,1 mM para inducir la produccion de protema. Se cultivaron adicionalmente las celulas durante 12-18 horas despues de la induccion y entonces se recolectaron.
Lisis celular:
Se tomo el sedimento celular (20 g) de la fermentacion a alta densidad celular y se resuspendio en 200 ml de tampon de resuspension (Tris 50 mM pH 8,0, DTT 1 mM y 10 % de glicerol). Despues de completar la resuspension, se anadieron 200 jl de lisozima 100 mg/ml y se agito durante 20 min. Se lisaron las celulas por sonicacion durante 15 min, como alternativa pueden lisarse usando un homogeneizador.
Elaboracion enzimatica:
Se elabora la enzima por uno cualquiera de los procedimientos siguientes o combinacion de los procedimientos siguientes.
a) Purificacion en columna:
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Se centrifugo el lisado celular a 13000 rpm durante 15 min, se retuvo el sobrenadante y se desecho el sedimento. Se purifico en columna el sobrenadante como a continuacion usando el purificador AKTA de GE healthcare.
Columna: XK26/20
Matriz: DE52 whatmann o cualquier matriz con dietilaminoetilo (DEAE) o grupo funcional de intercambio anionico debil.
Caudal: 5 m/min
Tampon de inicio: Tris 50 mM pH 8,0, DTT 1 mM y 10 % de glicerol
Tampon de elucion: Tris 50 mM pH 8,0, DTT 1 mM y 10 % de glicerol+ NaCl 0,4 M
Se lavo la columna con 10 volumenes de columna de agua y se equilibro entonces con 10 volumenes de columna de tampon de inicio. Se cargo la muestra en la columna y se lavo con el tampon de inicio hasta que el flujo a traves no mostro absorbancia de UV. Se eluyo la protema con el tampon de elucion.
b) Precipitacion de protema por PEI
Procedimiento 1: Se anadio al lisado PEI al 0,3 % (v/p) y se agito durante 60 min. Se centrifugo la muestra durante 10 min a 4000 rpm, se retuvo el sedimento y se desecho el sobrenadante.
Procedimiento 2: Se centrifugo el lisado celular a 13000 rpm durante 15 min, se retuvo el sobrenadante y se desecho el sedimento. Se anadio al sobrenadante PEI al 0,3 % (v/p) y se agito durante 60 min. Se centrifugo la muestra durante 10 min a 4000 rpm, se retuvo el sedimento y se desecho el sobrenadante.
Procedimiento 3: Se centrifugo el lisado celular a 13000 rpm durante 15 min, se retuvo el sobrenadante y se desecho el sedimento. Se anadio al sobrenadante PEI al 0,3 % (v/p) y se agito durante 60 min. Se centrifugo la muestra durante 10 min a 4000 rpm, se retuvo el sedimento y se desecho el sobrenadante. Se resuspendio el sedimento en tampon de elucion (Tris 50 mM pH 8,0, DTT 1 mM y 10 % de glicerol+ NaCl 0,4 M) durante 15 min y entonces se centrifugo a 4000 rpm durante 10 min. Se retuvo el sobrenadante para la reaccion.
Fraccionamiento con sulfato de amonio
Se tomo el sedimento celular (20 g), se resuspendio en 200 ml de tampon de resuspension (Tris 50 mM pH 8,0, DTT 1 mM y 10 % de glicerol). Despues de completar la resuspension, se anadieron 200 pl de lisozima de una solucion madre 100 mg/ml y se agito durante 20 min. Se sometio a sonicacion la muestra (nivel de potencia 0,5 y amplitud de 60 %) durante 15 min. Se anadio PEI al 0,1 % y se agito durante 60 min. Se centrifugo la muestra durante 10 min a 4000 rpm, se tomo el sobrenadante y se desecho el sedimento. Se anadio sulfato de amonio (60 % p/p) al sobrenadante y se agito durante una noche. Se centrifugo entonces la solucion a 13000 rpm durante 10 min. Se uso el sedimento con la protema activa para reaccion adicional. Se llevaron a cabo todas las etapas anteriores a 4 °C.
Liofilizacion de protema:
Se resuspendieron 20 g de sedimento en 100 ml de tampon fosfato 50 mM a pH 7,0 con 100 pl de lisozima (100 mg/ml). Se liso la suspension celular por sonicacion. Se centrifugo la solucion a 10.000 rpm durante 30-40 min y se tomo el sobrenadante. Se anadieron a este 2,5 ml de PEI (de la solucion madre al 10 %) y se agito durante 2 horas. Se centrifugo al solucion a 10.000 rpm durante 15 min, se anadio al sobrenadante PEG 6000 al 1 % y se agito durante 2 horas. Se centrifugo la solucion a 10000 rpm durante 15 min y se anadio al sobrenadante PEG 6000 al 1 % y se agito durante 10-30 min. Se congelo la muestra y se fijo para liofilizacion. Se obtuvo protema liofilizada en forma de solido fluido en 20-25 horas.
Monitorizacion de la reaccion:
Se llevo a cabo la reaccion de hidroxilacion usando 360 mg de fenilacetil-7-ADCA, 239 mg de acido a-cetoglutarico, 95 mg de acido ascorbico y 2,64 mg de sulfato ferroso, usando 120 mg de la enzima a pH 7,3 en un volumen de reaccion de 20 ml con agitacion constante a 15 °C durante 300 minutos. Se monitorizo la reaccion por HPLC tomando 10 pl de la mezcla de reaccion, se inactivo con 20 pl de metanol y 90 pl de agua, se centrifugo y se analizo el sobrenadante. Se denota el punto final cuando la reaccion llega a un 95-97 % de terminacion.
Tabla 1: Detalles de los mutantes que muestran una hidroxilacion mejorada
Se comparo la actividad relativa de cada mutante con la actividad de la enzima de tipo silvestre (Fig. 1) que se fija como 100 %.
- N° de muestra
- ID de mutante N° de mutaciones Mutaciones Mejora en veces
- 1
- G3 5 P72L, T90A, V206I, A210V, A311V 260 %
- 2
- G56 5 P7L, P72L, T90A, A237V, A311V 280 %
- 3
- G71 4 T51M, P72L, T90A, A311V 300 %
- 4
- G73 4 A40V, P72L, T90A, A311V 320 %
- 5
- G74 4 P72L, T90A, A237V, A311V 340 %
- 6
- TMD 3G05 4 P72L, T90A, M233I, A311V 400 %
- 7
- TMD 1A12 4 P72L, T90A, E258K, A311V 400 %
- 8
- TMD 9B07 4 P72L, T90A, F195L, A311V 410 %
- 9
- TMD 9B09 4 P72L, T90A, R250L, A311V 380 %
- 10
- TMD 10F11 4 P72L, T90A, V226I, A311V 380 %
- 11
- G3Q 6 P72L, T90A, V206I, A210V, T273A, A311V 360 %
- 12
- G56A 6 P7L, P72L, T90A, A237V, T273A, A311V 360 %
- 13
- G56B 5 P7L, P72L, T90A, T273A, A311V 340 %
- 14
- G56C 5 P72L, T90A, A237V, T273A, A311V 280 %
- 15
- G71Q 5 T51M, P72L, T90A, T273A, A311V 360 %
- 16
- G73Q 5 A40V, P72L, T90A, T273A, A311V 360 %
- 17
- G74Q-TG 5 P72L, T90G, A237V, T273A, A311V 340 %
- 18
- G71-G74Q 6 T51M, P72L, T90A, A237V, T273A, A311V 340 %
- 19
- G73-G74Q 6 A40V, P72L, T90A, A237V, T273A, A311V 320 %
- 20
- G71-G40Q 6 T51M, P72L, T90A, M229I, T273A, A311V 420 %
- 21
- G73-G40Q / M 6 A40V, P72L, T90A, M229I, T273A, A311V 340 %
- 22
- G134 7 A40V, P72L, T90A, M229I, F267L, T273A, A311V 620 %
- 23
- 134 + 177V 8 A40V, P72L, T90A, A177V,M229I, F267L, T273A, A311V 610 %
- 24
- 134 + 195L 8 A40V, P72L, T90A, F195L,M229L F267L, T273A, A311V 500 %
- 25
- G148 8 A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M229I, T273A, A311V 620 %
- 26
- G151 7 A40V, P72L, T90A,V171L, M229I, T273A, A311V 620 %
- 27
- G169 8 A40V, P72L, T90A, Q209E, M229I, V249I, T273A, A311V 620 %
- 28
- G179 7 A40V, P72L, T90A, Q209E, M229I, T273A, A311V 620 %
- 29
- G182 10 A40V, P72L, E82D, T90A, Q209E, M229I, L236V, V249I, T273A, A311V 620 %
- 30
- M+V221-A 7 A40V, P72L, T90A, V221P, M229I, T273A, A311V 530 %
- 31
- M+V221-B 7 A40V, P72L, T90A, V221H, M229I, T273A, A311V 530 %
- 32
- M+ R182 7 A40V, P72L, T90A, R182S, M229I, T273A, A311V 580 %
- 33
- M 38A11 7 A40V, P72L, T90A, A177V, M229I, T273A, A311V 620 %
- 34
- M 38B10 7 A40V, P72L, T90A, V171M, M229I, T273A, A311V 620 %
- 35
- M 2A11B 7 A40V, P72L, T90A, M229I, S260G, T273A, A311V 660 %
- 36
- M 78C12 7 A40V, P72L, T90A, M229I, S251F, T273A, A311V 750 %
- 37
- M+195 7 A40V, P72L, T90A, F195L, M229I, T273A, A311V 630 %
- 38
- M+226 7 A40V, P72L, T90A, V226I, M229I, T273A, A311V 560 %
- 39
- M+250 7 A40V, P72L, T90A, M229I, R250L, T273A, A311V 560 %
- 40
- M+258 7 A40V, P72L, T90A, M229I, E258K, T273A, A311V 380 %
- 41
- M+233I 7 A40V, P72L, T90A, M229I, M233I, T273A, A311V 360 %
- 42
- M195L + 226V 8 A40V, P72L, T90A, F195L, V226I,M229I, T273A, A311V 540 %
- 43
- M195L+250R 8 A40V, P72L, T90A, F195L, R250L,M229I, T273A, A311V 380 %
- 44
- M226V +250R 8 A40V, P72L, T90A, V226I, M229I, R250L, T273A, A311V 340 %
- 45
- P 9 A40V, P72L, T90A, M184I, I193V ,M229I, F267L, T273A, A311V 500 %
- 46
- P+233I 10 A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M233I,M229I, F267L, T273A, A311V 380 %
- 47
- R 8 A40V, P72L, T90A, V171L,M229I, F267L, T273A, A311V 800 %
- 48
- R+195L 9 A40V, P72L, T90A, V171L, F195L,M229I F267L, T273A, A311V 680 %
- 49
- R+ 233I 9 A40V, P72L, T90A, V171L,M229I M233I, F267L, T273A, A311V 560 %
- 50
- R+258E 9 A40V, P72L, T90A, V171L,M229I E258K, F267L, T273A, A311V 720 %
- 51
- S 9 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V 1000 %
- 52
- G234 10 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V, N313D 1200 %
- 53
- G234 +177V 11 A40V, P72L, T90A, V171L, A177V, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V, N313D 800%
- 54
- G248 10 A40V, P72L, T90A, R91G,V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V 1300 %
- 55
- G283 11 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, G255D,F267L, A280S, T273A, A311V, 1300 %
- 56
- G295 10 A40V, M53L, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311M 1200 %
- 57
- G304 10 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, V226I, M229I, F267L, T273A, A311V 1100 %
- 58
- G315 11 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A, V307A, A311V 1500 %
- 59
- G325 8 A40V, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V 1200 %
- 60
- G344 9 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A,A311M 1200 %
- 61
- G350 11 A40V, P72L, T90A, T96S, I149T,V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V 1200 %
- 62
- S+177V 10 A40V, P72L, T90A, V171L, A177V, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V 900%
- 63
- S+ 251F 10 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, S251F,F267L, T273A, A311V 1000 %
- 64
- S +260G 10 A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, S260G,F267L, T273A, A311V 1000 %
- 65
- T 12 A40V, P72L, T90A, R91G, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A, V307A, A311V 1700 %
- 66
- G248 + G283 12 A40V, P72L, T90A, R91G, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, T273A , A280S, A311V 1200 %
- 67
- G350+ G283 12 A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, T273A, A280S, A311V 1300 %
- 68
- G350 + G315 12 A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A, V307A, A311V 1500 %
- 69
- G350 + S 10 A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V 1200 %
- 70
- GOS3 10 A40V, P72L, T90A, G108D, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V 1900 %
La tabla anterior indica claramente que la hidroxilasa mutada de la presente invencion tiene una actividad de hidroxilacion significativamente mayor hacia el compuesto de formula (II) que el correspondiente tipo silvestre. Como la hidroxilasa mutada de la presente invencion tiene una actividad mas de 10 veces mayor que la hidroxilasa nativa, 5 la presente invencion proporciona bioprocedimientos para la preparacion del compuesto de formula (I) a escala de fabricacion a bajo coste. Debido a la identificacion de la hidroxilasa mutada, la presente invencion proporciona un procedimiento verde ecologico para la preparacion de una serie de farmacos/intermedios de cefalosporina.
Figura 1: Alineamiento de cefF (SEQ ID NO 1)
MADTPVPIFNLAALREGADQEKFRECVTGMGVFYLTGYGAGDKDHRLATDTAMDFFANGT EAEKAAVTTDVPTMRRGYSALEAESTAQVTRTGSYTDYSMSFSMGISGNVFPSPEFERVW EPRRMAPHYDLSIITFIHQTPCANGFVSLQAEIGGELVSLPWEDAVWMCGAMAPLATQ GALPAPRHHVRSPGAGMREGSDRTSSVFFLRPTTDFSFSVAKARSYGLAVDLDMETATFG DWIGTNYVTMHAKNE PQAG
Figura 2: Secuencia nucleotidica y su correspondiente secuencia aminoaddica (SEQ ID NO 1)
1 atggcggacacgcccgtaccgatcttcaacctcgccgcactgcgggaaggcgccgatcag MADTPVPI FNLAALREGADQ^ 61 gagaagttccgcgagtgcgtgaccgggatgggggtcttctacctcaccgggtacggcgcc E K F R E C V T G MG V F Y L T G Y G A
121 ggggataaggaccaccggctggccacggacacggcgatggacttcttcgcgaacggcacc GDKDHRLATDTAMDFFANGT 181 gaggccgagaaggcggccgtgaccacggacgtcccgaccatgcggcgcggctactccgcg EAEKAAVTTDVPTMRRGYSA 241 ctggaggccgagagcaccgcccaggtgaccaggaccggttcctacacggactactcgatg L E A E S T A Q V T R T G S Y T 6 Y S M
301 tccttctccatgggcatctcgggcaacgtcttcccctcgccggagttcgagcgggtgtgg S FSMG I SGNVFPS PE FE R V W ~
361 acggagtacttcgacaagctctacgcggcggcccaggagacggcgcggctggtgctgacc TEYFDKLYAAAQETA RLVLT 421 gcgagcggcggctatgacgcggagatcgtcggaagcctggacgagctgctggacgccgac ASGGYDAEIVGSLDEL LDAD 481 cccgtgctgcggctgcggtacttccccgaggtgcccgagcaccggtccgccgagcacgag PVL rlryfpevpehrsaehe' 541 ccgcgccggatggccccgcactacgacctgtcgatcatcaccttcatccaccagacgccg PRRMAPHYDLSIITFIHQTP" 601 tgcgccaacggcttcgtcagcctccaggccgagatcggcggcgaactggtgagcctgccc CANGFVSLQAEIGGELVSLP 661 gtcgtggaggacgccgtcgtcgtgatgtgcggcgcgatggccccgctggcgacccagggc VVEDAVVVMCGAMAPLATQG 721 gcgctgcccgcgccccggcaccacgtccggtcccccggcgccggtatgcgcgagggcagc ALPAPRHHVRSPGAGMREGS 781 gaccgcacgtcgagcgtcttcttcctgcgccccacgaccgacttctcgttctcggtggcc DRTSSVFFLRPTTDFSFSVA 841 aaggcccgcagctacggcctcgccgtcgacctcgacatggagacggccaccttcggcgac KARSYGLAVDLDMETATFGD 901 tggatcggcaccaactacgtcaccatgcacgcgaagaacgagccgcaggccgga 954 WIGTNYVTMHAKNEPQAG
Claims (4)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1.- Una hidroxilasa mutante que porta sustituciones aminoaddicas en las posiciones de residuo de la hidroxilasa de tipo silvestre de secuencia SEQ ID NO: 1 seleccionadas de:i) P72L, T90A, V206I, A210V, A311Vii) P7L, P72L, T90A, A237V, A311Viii) T51M, P72L, T90A, A311Viv) A40V, P72L, T90A, A311Vv) P72L, T90A, A237V, A311Vvi) P72L, T90A, M233I, A311Vvii) P72L, T90A, E258K, A311Vviii) P72L, T90A, F195L, A311Vix) P72L, T90A, R250L, A311Vx) P72L, T90A, V226I, A311Vxi) P72L, T90A, V206I, A210V, T273A, A311Vxii) P7L, P72L, T90A, A237V, T273A, A311Vxiii) P7L, P72L, T90A, T273A, A311Vxiv) P72L, T90A, A237V, T273A, A311Vxv) T51M, P72L, T90A, T273A, A311Vxvi) A40V, P72L, T90A, T273A, A311Vxvii) P72L, T90G, A237V, T273A, A311Vxviii) T51M, P72L, T90A, A237V, T273A, A311Vxix) A40V, P72L, T90A, A237V, T273A, A311Vxx) T51M, P72L, T90A, M229I, T273A, A311Vxxi) A40V, P72L, T90A, M229I, T273A, A311Vxxii) A40V, P72L, T90A, M229I, F267L, T273A, A311Vxxiii) A40V, P72L, T90A, A177V, M229I, F267L, T273A, A311Vxxiv) A40V, P72L, T90A, F195L, M229I, F267L, T273A, A311Vxxv) A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M229I, T273A, A311Vxxvi) A40V, P72L, T90A, V171L, M229I, T273A, A311Vxxvii) A40V, P72L, T90A, Q209E, M229I, V249I, T273A, A311Vxxviii) A40V, P72L, T90A, Q209E, M229I, T273A, A311Vxxix) A40V, P72L, E82D, T90A, Q209E, M229I, L236V, V249I, T273A, A311Vxxx) A40V, P72L, T90A, V221P, M229I, T273A, A311Vxxxi) A40V, P72L, T90A, V221H, M229I, T273A, A311Vxxxii) A40V, P72L, T90A, R182S, M229I, T273A, A311Vxxxiii) A40V, P72L, T90A, A177V, M229I, T273A, A311Vxxxiv) A40V, P72L, T90A, V171M, M229I, T273A, A311V5101520253035xxxv) A40V, P72L, T90A, M229I, S260G, T273A, A311Vxxxvi) A40V, P72L, T90A, M229I, S251F, T273A, A311Vxxxvii) A40V, P72L, T90A, F195L, M229I, T273A, A311Vxxxviii) A40V, P72L, T90A, V226I, M229I, T273A, A311Vxxxix) A40V, P72L, T90A, M229I, R250L, T273A, A311V xl) A40V, P72L, T90A, M229I, E258K, T273A, A311V xli) A40V, P72L, T90A, M229I, M233I, T273A, A311Vxlii) A40V, P72L, T90A, F195L, V226I, M229I, T273A, A311Vxliii) A40V, P72L, T90A, F195L, R250L, M229I, T273A, A311Vxliv) A40V, P72L, T90A, V226I, M229I, R250L, T273A, A311Vxlv) A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M229I, F267L, T273A, A311Vxlvi) A40V, P72L, T90A, M184I, I193V, M233I, M229I, F267L, T273A, A311Vxlvii) A40V, P72L, T90A, V171L, M229I, F267L, T273A, A311Vxlviii) A40V, P72L, T90A, V171L, F195L, M229I, F267L, T273A, A311Vxlix) A40V, P72L, T90A, V171L, M229I, M233I, F267L, T273A, A311Vl) A40V, P72L, T90A, V171L, M229I, E258K, F267L, T273A, A311Vli) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311Vlii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V, N313Dliii) A40V, P72L, T90A, V171L, A177V, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V, N313Dliv) A40V, P72L, T90A, R91G ,V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311VIv) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, A280S, T273A, A311V,lvi) A40V, M53L, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311Mlvii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, V226I, M229I, F267L, T273A, A311Vlviii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A, V307A, A311Vlix) A40V, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311Vlx) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311Mlxi) A40V, P72L, T90A, T96S, I149T, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311Vlxii) A40V, P72L, T90A, V171L, A177V, R182W, M229I, F267L, T273A, A311Vlxiii) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, S251F, F267L, T273A, A311Vlxiv) A40V, P72L, T90A, V171L, R182W, M229I, S260G, F267L, T273A, A311Vlxv) A40V, P72L, T90A, R91G, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A, V307A, A311Vlxvi) A40V, P72L, T90A, R91G, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, T273A , A280S, A311Vlxvii) A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, G255D, F267L, T273A, A280S, A311Vlxviii) A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, A241V, F267L, T273A,V307A, A311Vlxix) A40V, P72L, T90A, T96S, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311Vlxx) A40V, P72L, T90A, G108D, V171L, R182W, M229I, F267L, T273A, A311V.
- 2. - Una molecula de acido nucleico que codifica la hidroxilasa mutante de la reivindicacion 1.
- 3. - Un vector que contiene la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 2.4-. El microorganismo portador del vector recombinante de la reivindicacion 3, capaz de expresar el gen.
- 5.- Un procedimiento para la preparacion del compuesto de formula (I) que comprende hacer reaccionar el 5 compuesto de formula (II) con la enzima reivindicada en la reivindicacion 1 en presencia de acido a-cetoglutarico,acido ascorbico y sulfato ferroso en un medio acuoso a una temperatura de entre 5 y 25 °C con pH de 6 a 8:
imagen1
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