BRPI0621278A2 - acilases mutantes - Google Patents

Abstract

ACILASES MUTANTES. A presente invenção descreve uma beta-lactama acilase tipo II mutante que é uma variante de um polipeptídeo modelo com a atividade da beta-lactama acilase tipo II, por meio da qual a beta-lactama acilase mutante tem pelo menos uma atividade beta-lactama acilase in vitro 1,5 vez melhorada para a adipil-7-ADCA em comparação com o polipeptídeo modelo com atividade da beta-lactama acilase.

Description

ACILASES MUTANTES

A presente invenção refere-se às acilases beta- lactâmicas tipo II mutantes, aos polinucleotídeos codificando as referidas enzimas e aos microrganismos transformados com os referidos polinucleotídeos assim como aos métodos de produção de beta-lactama tipo II mutante. A invenção, além disso, se refere a um processo para a produção de um composto beta-lactâmico desacilado de interesse usando as acilases beta-lactâmicas tipo II mutantes da invenção.

Antibióticos beta-lactâmicos constituem o grupo mais importante de compostos antibióticos com uma longa história de uso clínico. Dentre esse grupo, os notórios são as penicilinas e as cefalosporinas. As penicilinas são naturalmente produzidas por vários fungos filamentosos tais como Penicillium (por exemplo, P. chrysogenum) . AS cefalosporinas são naturalmente produzidas por vários microrganismos, tais como Acremonium (por exemplo, A. chrysogenum) e Streptomyces (por exemplo, Streptomyces clavuligerus).

Como resultado de técnicas de melhoria de cepas clássicas, os níveis de produção dos antibióticos na P. chrysogenum e A. chrysogenum aumentaram notoriamente no decorrer das últimas décadas. Com o conhecimento crescente das vias biossintéticas que levam às penicilinas e às cefalosporinas e o advento da tecnologia do DNA recombinante, novas ferramentas para a melhoria das cepas de produção se tornaram disponíveis.

A maioria das enzimas envolvidas na biossíntese da beta-lactama foi identificada e seus genes correspondentes foram clonados, conforme pode ser encontrado em Ingolia e Queener, Med Res Rev (1989) 9: 245-264 (via biossintética e enzimas) e Aharonowitz, Cohen e Martin, Ann Rev Microbiol (1992) 46: 461-495 (clonagem de genes).

Os primeiros dois passos na biossíntese da penicilina em P. chrysogenum são a condensação dos três aminoácidos ácido L-5-amino-5-carboxipentanóico (ácido L-alfa-alfa- aminoadípico) (A), L-cisteína (C) e L-valina (V) no tripeptídeo LLD-ACVf seguido pela ciclização desse tripeptídeo para formar a isopenicilina N. Esse composto contém a estrutura beta-lactama típica. O terceiro passo envolve a substituição da cadeia lateral hidrofílica do ácido L-5-amino-5-carboxipentanóico por uma cadeia lateral hidrofóbica pela ação da enzima aciltransferase (AT) .

Na EP-A-0448180, foi descrito que a reação de troca enzimática mediada pela AT ocorre dentro de uma organela celular, o microcorpo. A observação de que quantidades substanciais de desacetoxicefalosporina C (DAOC) podem ser formadas por transformantes de P. chrysogenum não- precursados expressando desacetoxicefalosporina C sintase (EC 1.14.20.1 - DAOCS, adicionalmente aqui indicada como expandase) implica na presença de quantidades significativas de penicilina Ν, o substrato natural para a expandase, em P. chrysogenum (Alvi et al. , J Antibiot (1995) 48: 338-340). Entretanto, as cadeias laterais do D- alfaaminoadipil do DAOC não podem ser facilmente removidas.

As cef alosporinas são muito mais caras do que as penicilinas. Uma razão ê que as cefalosporinas (por exemplo, cefalexina) são feitas a partir das penicilinas por uma variedade de conversões químicas. Outra razão é que, até aqui, as cefalosporinas com uma cadeia lateral de alfa-aminoadipil poderiam ser fermentadas. Cefalosporina C, de longe o material de partida mais importante nesse aspecto, é muito solúvel em água em qualquer pH, dessa forma envolvendo processos de isolamento lentos e caros usando tecnologia de colunas enfadonha e cara. Cefalosporina C obtida dessa forma tem que ser convertida nas cefalosporinas terapeuticamente usadas por uma variedade de conversões químicas e enzimáticas.

Os métodos atualmente favorecidos na indústria para preparar o intermediário ácido 7- aminodesacetoxicefalosporânico (7-ADCA) envolvem passos químicos complexos levando à expansão e derivatização da penicilina G. Um dos passos químicos necessários para produzir 7-ADCA envolve a expansão da estrutura do anel de penicilina de 5 membros, para uma estrutura do anel de cefalosporina de 6 membros (ver, por exemplo, US 4.003.894). Esse processamento químico complexo é tanto caro quanto nocivo ao ambiente. Conseqüentemente, existe um grande desejo de substituir tais processos químicos com reações enzimáticas tais como por catalise enzimática, preferivelmente durante a fermentação. Uma chave para a substituição do processo de expansão química por um processo biológico é a enzima central na via sintética da cefalosporina, a expandase. A enzima expandase da bactéria Streptomyces clavuligerus (S. clavuligerus) foi descoberta como exercendo, em alguns casos, expansões de anel de penicilina. Quando introduzida em P. chrysogenvm, ela pode converter a estrutura do anel da penicilina na estrutura do anel de cefalosporina, conforme descrito em Cantwell et al., Proc R Soc Lond B (1992) 248: 283-289. Uma vez que a enzima expandase catalisa a expansão do anel tiazolidina de 5 membros da penicilina N no anel diidrotiazina de 6 membros da DAOC, essa enzima poderia ser, claramente, uma candidata lógica para substituir os passos de expansão do anel do processo químico. Infelizmente, a enzima funciona no intermediário da penicilina N da via biossintética da cefalosporina, porém não ou muito ineficiente nas penicilinas baratas prontamente disponíveis como produzidas pela P. chrysogenum, como a penicilina V ou a penicilina G. Penicilina N não é comercialmente disponível e mesmo quando expandida, sua cadeia lateral D-alfa-aminoadipil não pode ser facilmente removida pela penicilina acilases.

Foi reportado que a enzima expandase é capaz de expandir as penicilinas com cadeias laterais particulares para o correspondente derivado 7-ADCA. Essa característica da expandase tem sido explorada na tecnologia, conforme revelado na WO 93/05158, WO 95/04148 e na WO 95/04149. Nessas descobertas, a conversão química in vitro convencional da penicilina G em 7-ADCA tem sido substituída pela conversão in vivo de certos derivados do ácido 6- aminopenicilânico (6-ΑΡΑ) nas cepas de Penicillium chrysogenum recombinantes transformadas com um gene da expandase. Mais particularmente, WO 93/05158 ensina o uso in vivo da enzima expandase em P. chrysogenum, juntamente com uma cadeia lateral adipil (adicionalmente referida como adipil) como matéria-prima, a qual é um substrato para a enzima aciltransf erase em P. chrysogenum. Isso leva à formação da adipil - 6-ΑΡΑ, a qual é convertida por uma enzima expandase introduzida na cepa de P. chrysogenum para produzir a adipil-7-ADCA, a qual é excretada pelas células fúngicas no meio ao redor.

Num passo subseqüente, as cadeias laterais dos derivados 7-ADCA correspondentes podem ser removidas por clivagem ou quimicamente ou enzimaticamente por uma enzima acilase, produzindo dessa forma 7-ADCA e a correspondente cadeia lateral. Vários tipos de microrganismos têm sido reportados na literatura como cepas produtoras de acilase úteis para a desacilação dos derivados beta-lactâmicos obtidos por fermentação. Exemplos de tais microrganismos produtores de acilase são certas cepas das espécies Escherichia coli, Kluyvera citrophila, Proteus rettgeri, Pseudomonas sp., Alcaligenes faecalis, Bacillus megaterium, Bacillus sphaerieus e Arthrobaeter viseosus.

De acordo com a literatura, vários tipos de acilases podem ser considerados, baseando-se nas suas estruturas moleculares e na especificidade de substrato (Vandamme E. J. Penicillin acylases and beta-Iactamases" em: "Microbial Enzymes and Bioconversions" Ε. H. Rose (Ed.), Economic Microbiology 5 (1980) 467-552, Acad. Press, Nova Iorque).

Acilases do tipo I são específicas para a penicilina V. Essas enzimas são compostas de quatro subunidades idênticas, cada uma com um peso molecular de 35 KDa. Uma seqüência de nucleotídeos completa do gene clonado de Baeillus sphaerieus tem sido reportada (Ollson A. Appl. Environm. Microb. (1976),203).

Todas as acilases do tipo II compartilham uma estrutura molecular comum: essas enzimas são heterodímeros compostos de uma pequena subunidade alfa (20 a 25 KDa) e de uma grande subunidade beta (60 a 65 KDa). Em relação à especificidade do substrato, acilases do tipo II podem ser ainda divididas em dois grupos.

As acilases do tipo II são muito específicas para a Penicilina G e, dessa forma, geralmente são conhecidas como penicilina acilases. Em geral, elas não são tão específicas para a porção adjacente ao átomo de nitrogênio do grupo amida (esse deve ser um grupo cefem, um grupo fenem, um aminoácido, etc.), porém a especificidade do substrato reside na porção acil do substrato. Essa porção acil deve ser muito hidrofóbica e é preferivelmente benzil ou alquil (curto). Exemplos de substratos que não são hidrolisados pelas acilases do Tipo II-A são aquelas com ácidos dicarboxílicos como porção acil: succinil, glutaril, adipil e aminoadipil, a cadeia lateral da CefC. Exemplos de acilases do tipo IIA são as enzimas da Escherichia coli, Kluyvera citrophila, Proteus rettgeri e Alcaligenes faecalis.

Acilases do tipo IIB tem sido repoprtadas como sendo capazes de hidrolisar as cefalosporinas (incluindo o derivado desacetóxi) com succinil, glutaril, adipil e a- cetoadipil como uma porção acil e mesmo CefC até um grau muito limitado. O grupo das acilases do tipo IIB pode ser dividido em dois grupos com base da homologia da seqüência de aminoácidos. Esses subgrupos serão definidos aqui como o grupo SY77 e como o grupo SE83 e são nomeados depois da acilase de Pseudomonas SY77 e Pseudomonas SE83-acil, respectivamente.

Matsuda et al (J. Bacteriol (1985), 163, 1222 clonaram e seqüenciaram o gene codificando a SY77-acilase e demonstraram que a enzima era ativa para glutaril-7ACA, porém menos para a succinil-7ACA e adipil-7ACA. A estrutura tridimensional para o precursor SY77 é conhecida (J. Biol.Chem. (2002), 277, 2823).

Depois, Matsuda et al. (J. Bacteriol (1987), 169, 5815 e J. Bacteriol. (1987), 169, 5821) clonaram e seqüenciaram o gene codificando a SE83-acil acilase e demonstraram que essa enzima era ativa para (em ordem decrescente) glutaril- 7ACA, adipil-7ACA, succinil-7ACA e CEFC (Cefalosporina C) . Todos os estudos relacionados com SE83 focaram na capacidade da enzima de hidrolisar derivados da 7-ACA, particularmente para hidrolisar CEFC.

Em WO 91/16435, foi demonstrado que a homologia dos aminoácidos entre a SY77 e a SE83-acil é muito baixa: aproximadamente 25% para as subunidades alfa e 28% para as subunidades beta das acilases.

WO 9512680 revela outra acilase do grupo SE83 de Brevundimonas diminuta, nomeada de N176, a qual é aproximadamente 94% homóloga à SE83-acil e a qual foi testada para a sua atividade de CEFC-acilase. Um terceiro membro do grupo SE83 é a V22 da Brevundimonas diminuta V22. As seqüências de aminoácidos dessas acilases são reveladas por Aramori et al no Journal of Fermentation and Bioengineering 72, 232-243 (1991). A Tabela 1 mostra a matriz da identidade da seqüência de comprimento total das seqüências dos aminoácidos das várias acilases do tipo IIB do grupo SE83.

Tabela 1.

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Várias tentativas têm sido feitas para aumentar a atividade da CEFC-acilase de algumas acilases existentes: W02005014821 revela mutantes da SE83-acilase e EP-A-1552175 revela mutantes da N176-acilase, e para melhorar a atividade da CEFC-acilase. Nenhuma das referências citadas focou na melhoria da reação de desacilação com outros compostos beta-lactâmicos acilados de interesse, tal como adipil-7-ADCA. Conseqüentemente, ainda existe uma necessidade urgente por uma acilase com uma atividade desacilante melhorada para a adipil-7ADCA, e a qual pode ser usada vantajosamente num processo para a produção de 7- ADCA a partir de adipil-7-ADCA produzido, por exemplo, pela fermentação de uma cepa Penicillium transformada.

Figura 1: Alinhamento múltiplo das seqüências dos aminoácidos das acilases beta-lactâmicas do tipo II SE83- acyii de Pseudomonas SE83 (SEQ ID No.l), N176 de Brevundimonas diminuta N-176 (SEQ ID No. 2) e V22 de Brevundimonas diminuta V22 (SEQ ID No.3).

Figura 2: Conversão de adipil-7ADCA pela acilase imobilizada em pH = 8.8 e a 30 0C (Figura 2a) e em pH 9,5 e a 40°C (Figura 2b) . Acilase imobilizada do tipo selvagem SE83 ACYii de Pseudomonas (linha sólida) e o mutante da acilase imobilizada L161T (linha tracejada). A taxa (mL de KOH/min no eixo Y) é demarcada como uma função da conversão porcentual (% no eixo X).

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma acilase beta-lactâmica tipo II mutante que é uma variante de um polipeptideo modelo com a atividade da beta- lactama acilase do tipo II, por meio do que a beta-lactama acilase mutante tem pelo menos 1,5 vezes atividade da beta- lactama acilase melhorada in vitro para a adipil-7-ADCA em comparação com o polipeptldeo modelo com atividade da beta- lactama acilase. A determinação da atividade beta-lactama acilase para a adipil-7-ADCA- é descrita em detalhes na seção de Materiais e Métodos. Mais preferivelmente, a atividade da beta-lactama acilase in vitro para a adipil-7- ADCA da beta-lactama acilase do tipo II mutante é melhorada pelo menos duas vezes, mais pref erivelmente pelo menos 2,5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 6 vezes, mais preferivelmente pelo menos 7 vezes, mais pref erivelmente pelo menos 8 vezes, mais pref erivelmente pelo menos 9 vezes, mais pref erivelmente pelo menos 10 vezes, mais preferivelmente pelo menos 11 vezes.

Com "beta-lactama acilase tipo II alterada ou mutante" no contexto da presente invenção se entende uma enzima com atividade acilase, a qual não tem sido obtida de uma fonte natural e para a qual a seqüência de aminoácidos difere das seqüências de aminoácidos completa das enzimas beta-lactama acilase do tipo II natural.

A invenção também proporciona uma beta-lactama acilase do tipo II mutante que é uma variante de um polipeptldeo modelo com a atividade da beta-lactama acilase do tipo II, por meio da qual a beta-lactama acilase do tipo II mutante tenha sido modificada e pelo menos uma posição de aminoácidos selecionada do grupo consistindo das posições 161, 270, 296, 442 e 589 ou do gruo consistindo das posições 10, 29, 274, 280, 314, 514, 645, 694, 706 e 726 ou do grupo consistindo de 10, 29, 161, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 e 726, ou do grupo consistindo de 10, 29, 270, 274, 280, 442, 514, 589, 645, 694 e 726 usando a numeração da posição do aminoácido da seqüência de aminoácidos da SE83-acil-acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1).

Mais preferivelmente, a presente invenção proporciona uma beta-lactama acilase tio Ii mutante que é uma variante de um peptideo modelo com atividade beta-lactama acilase tipo II por meio do que uma beta-lactama acilase mutante tem uma atividade beta-lactama acilase in vitro pelo menos 1,5 vez melhorada para a adipil-7-ADCA em comparação com o polipeptídeo modelo com atividade beta-lactama acilase, mais preferivelmente de pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 2,5 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 5 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 6 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 7 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 8 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 9 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 10 vezes, mais preferivelmente de pelo menos 11 vezes e por meio do qual a beta-lactama acilase tipo II mutante foi modificada em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo das posições 161, 270, 296, 442 e 589, ou do grupo consistindo das posições 10, 29, 274, 280, 314, 514, 645, 694, 706 e 726, ou do grupo consistindo de 10, 29, 161, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 e 726, ou do grupo consistindo de 10, 29, 270, 274, 280, 442, 514, 589, 645, 694 e 726, usando a numeração de posicionamento de aminoácido da seqüência do aminoácido da SE83-acil acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1) .

A presente invenção preferivelmente proporciona uma beta-lactama amilase do tipo II mutante que é uma variante de um polipeptídeo modelo com atividade beta-lactama acilase tipo II, por meio do que a beta-lactama acilase tipo II mutante tenha sido modificada pelo menos na posição 10 ou pelo menos na posição 29, pelo menos na posição 161 ou pelo menos na posição 270, ou pelo menos na posição 274 ou pelo menos na posição 280, ou pelo menos na posição 296 ou pelo menos na posição 314, ou pelo menos na posição 442 ou pelo menos na posição 514, ou pelo menos na posição 589 ou pelo menos na posição 645, ou pelo menos na posição 694 ou pelo menos na posição 706, ou pelo menos na posição 726 usando a numeração da posição de aminoácidos da seqüência de aminoácidos da SE83-acil acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO:1). Numa modalidade, a invenção proporciona beta-lactama acilases do tipo II mutantes que têm uma modificação ou na posição 161 ou na posição 296.

A presente invenção também proporciona uma beta- lactama acilase do tipo II mutante que é uma variante de um polipeptídeo modelo com atividade da beta-lactama acilase do tipo II, por meio do que uma beta-lactama acilase tipo II mutante tenha sido modificada pelo menos numa combinação das posições 161 + 270 ou pelo menos numa combinação das posições 161 + 296, ou pelo menos numa combinação das posições 161 + 442, ou pelo menos numa combinação das posições 161 + 589, ou pelo menos numa combinação das posições 270 + 296, ou pelo menos numa combinação das <table>table see original document page 13</column></row><table>

4 posições selecionadas dos grupos consistindo de 161, 270, 15 296, 442 e 589, ou pelo menos na combinação das posições 161, 270, 296, 442 e 589, e por meio do que as beta-lactama acilases tipo II mutantes podem ter modificações em outras posições de aminoãcidos além daquelas posições e em todas assuas combinações possíveis conforme descrito anteriormente antes do uso da numeração da posição dos aminoãcidos da seqüência de aminoãcidos da SE83-acil acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1) .

O polipeptídeo modelo com atividade de beta-lactama acilase tipo II, conforme usado na presente invenção, é selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo com atividade beta-lactama amilase tipo II, preferivelmente com uma seqüência de aminoãcidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 (isto é, a SE83-acil acilase da espécie SE83 de Pseudomonas) ou com uma seqüência de aminoãcidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 (isto é, a N176-acilase da espécie de Pseudomonas Ν176) ou com uma seqüência de aminoãcidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 (isto é, a V22 acilase de Brevundimonas diminuta V22) e polipeptídeos com atividade de beta-lactama acilase tipo II co uma seqüência de aminoácidos com uma identidade porcentual com a SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70%, de preferivelmente pelo menos 75%, mais pref erivelmente de pelo menos 80%, mais pref erivelmente de pelo menos 85%, mais pref erivelmente de pelo menos 90%, mais pref erivelmente de pelo menos 95% ou com a SEQ ID NO: 2 de pelo menos 70%, de pref erivelmente pelo menos 75%, mais pref erivelmente de pelo menos 80%, mais pref erivelmente de pelo menos 85%, mais pref erivelmente de pelo menos 90%, mais pref erivelmente de pelo menos 95%, ou com a SEQ ID NO: 3 de pelo menos 70%, de pref erivelmente pelo menos 75%, mais pref erivelmente de pelo menos 80%, mais pref erivelmente de pelo menos 85%, mais pref erivelmente de pelo menos 90%, mais pref erivelmente de pelo menos 95%. É mais preferido como polipeptídeo modelo com atividade de beta-lactama acilase tipo II conforme usado na presente invenção um polipeptídeo com atividade de beta-lactama acilase tipo II, com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 ou com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3. Mais preferido como polipeptídeo modelo com atividade beta-lactama acilase tipo II é a SE83-acil acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1).

A presente invenção preferivelmente proporciona mutantes do modelo beta-lactama acilases tipo II selecionados do grupo consistindo da acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: Iea acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 e a acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 e polipeptídeos com atividade da beta-lactama acilase tipo II com uma seqüência de aminoácidos com uma identidade porcentual com a SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70%, de preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95% ou com a SEQ ID NO: 2 de pelo menos 70%, de preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, ou com a SEQ ID NO: 3 de pelo menos 70%, de preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, e por meio do que os mutantes têm modificações pelo menos na posição 10 ou pelo menos na posição 29, pelo menos na posição 161 ou pelo menos na posição 270, ou pelo menos na posição 274 ou pelo menos na posição 280, ou pelo menos na posição 296 ou pelo menos na posição 314, ou pelo menos na posição 442 ou pelo menos na posição 514, ou pelo menos na posição 589 ou pelo menos na posição 64 5, ou pelo menos na posição 694 ou pelo menos na posição 706 ou pelo menos na posição 726. Numa modalidade, a invenção proporciona beta-lactama acilases tipo II mutantes com uma única modificação ou na posição 161 ou na posição 2 96 usando a numeração da posição de aminoácido da seqüência de aminoácidos da SE83-acil acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1).

A modificação numa posição de aminoácidos pode compreender uma substituição por outro aminoácido, selecionado do grupo de 20 aminoácidos L que ocorrem na natureza - ver Tabela 1. Alternativamente, a modificação numa posição de um aminoácido pode compreender uma anulação do aminoácido naquela posição. Além disso, a modificação numa posição de aminoácido pode compreender uma substituição de um ou mais aminoácidos no lado C-terminal ou N-terminal do referido aminoácido.

Tabela 1

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A beta-lactama acilase tipo II mutante da invenção, preferivelmente os mutantes das beta-lactama acilases tipo II selecionadas do grupo consistindo da acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 1, e a acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 e a acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 podem carregar uma ou mais das seguintes modificações:

• Substituição do glutamato (SEQ ID N0.-1) ou alanina (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3) na posição 10 por um resíduo de aminoácido carregado positivamente, tal como lisina ou arginina, ou um pequeno resíduo de aminoácido com preferência conformacional para a formação de a-hélice, tal como alanina, preferivelmente por lisina.

• Substituição da serina na posição 2 9 por um aminoácido com uma cadeia lateral (tipo) aromática tal como fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina ou uma cadeia lateral positivamente carregada ou não-carregada polar maior, tal como asparagina, glutamina, arginina e lisina, preferivelmente por asparagina ou fenilalanina,

• Substituição da leucina na posição 161 por um aminoácido menor e mais polar, tal como treonina, serina, glicina e cisteína, ou um positivamente carregado por volta de pH = 9, tal como arginina e lisina, preferivelmente por serina ou treonina ou glicina, mais preferivelmente por treonina.

• Substituição da histidina na posição 274 por um resíduo de aminoácido que contém pelo menos um átomo de carbono, oxigênio ou enxofre na posição gama da cadeia lateral, e o qual é menor em tamanho em comparação com a histidina tal como leucina, isoleucina, cisteína, treonina, serina, asparagina, valina e prolina, preferivelmente por leucina, isoleucina, cisteína ou treonina. Substituição da arginina na posição 280 por um resíduo de aminoácido que substitui a carga positiva por uma carga negativa, tal como ácido aspártico e ácido glutâmico ou por uma cadeia lateral polar não-ramifiçada e não-carregada tal como glutamina, asparagina e serina, preferivelmente glutamina e asparagina, mais preferivelmente glutamina.

Substituição da histidina na posição 296 por um aminoácido carregado ou polar ou por um resíduo de aminoácido o qual seja capaz de substituir a ligação de hidrogênio existente no modelo da acilase ligando aos átomos N-delta ou N-epsilon do resíduo de histidina, tal como por asparagina ou glutamina, pref erivelmente por glutamina.

Substituição da isoleucina na posição 314 por um resíduo de aminoácido menor com ramificação β, tal como valina ou por uma cadeia lateral polar de tamanho médio, tal como glutamina, asparagina, serina e treonina, preferivelmente por valina ou glutamina.

Substituição do ácido glutâmico na posição 442 por um resíduo de aminoácido sem ou com uma pequena cadeia lateral hidrofóbica, tal como glicina, alanina, leucina, valina e isoleucina, preferivelmente glicina. Substituição da prolina na posição 514 por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral mais polar e/ou mais flexível, a qual seja capaz de contribuir para ligação de hidrogênio adicional, tal como glutamina, asparagina, treonina, serina, cisteína, ácido aspártico e ácido glutâmico, preferivelmente glutamina.

• Substituição da arginina na posição 589 por um resíduo de aminoácido que possa manter uma carga positiva num certo ambiente, tal como histidina e lisina ou por cadeias laterais aromáticas capazes de formar ligações de hidrogênio, tais como tirosina e triptofano ou por resíduos de aminoácidos os quais sejam capazes de substituir a ligação de hidrogênio existente na acilase modelo com os átomos N-delta ou N-epsílon do resíduo de histidina, tal como por asparagina e glutamina, preferivelmente por histidina.

• Substituição da alanina na posição 645 por um resíduo de aminoácido pequeno com uma preferência aumentada pela formação de β-filamentos tais como treonina, valina, serina, cisteína e leucina, preferivelmente por treonina.

• Substituição da asparagina na posição 694 por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral menor do que a asparagina, tal como alanina, treonina, serina, cisteína, valina e glicina, preferivelmente por treonina.

• Substituição da tirosina na posição 706 por um resíduo de aminoácidos sem ou com uma cadeia lateral menor do que a leucina, tal como glicina, alanina, valina, serina, cisteína, treonina e prolina, preferivelmente uma glicina. • Substituição da valina em 726 por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral hidrofõbica maior, tal como isoleucina, leucina e metionina, preferivelmente uma isoleucina.

Modalidades altamente preferidas da presente invenção são mutantes do modelo das beta-lactama acilases tipo II selecionadas do grupo consistindo de acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: lea acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 e a acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 e polipeptídeos com atividade beta-lactama acilase tipo II com uma seqüência de aminoácido com uma identidade porcentual com a SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70%, de pref erivelmente pelo menos 75%, mais pref erivelmente de pelo menos 80%, mais pref erivelmente de pelo menos 85%, mais pref erivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95% ou com a SEQ ID NO: 2 de pelo menos 70%, de pref erivelmente pelo menos 75%, mais pref erivelmente de pelo menos 80%, mais pref erivelmente de pelo menos 85%, mais pref erivelmente de pelo menos 90%, mais pref erivelmente de pelo menos 95%, ou com a SEQ ID NO: 3 de pelo menos 70%, de pref erivelmente pelo menos 75%, mais pref erivelmente de pelo menos 8 0%, mais pref erivelmente de pelo menos 85%, mais pref erivelmente de pelo menos 90%, mais pref erivelmente de pelo menos 95%, e os quais carregam uma das seguintes modificações H296Q, L161G, L161S ou L161T.

Modalidades mais altamente preferidas da presente invenção são mutantes das beta-lactama acilases tipo II selecionados do grupo consistindo de acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: lea acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 2 e a acilase com a seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 3 e polipeptideos com atividade beta-lactama acilase tipo II com uma seqüência de aminoácido com uma identidade porcentual com a SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70%, de preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95% ou com a SEQ ID NO: 2 de pelo menos 70%, de preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, ou com a SEQ ID NO: 3 de pelo menos 70%, de preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, e os quais carregam uma modificação na posição. São mais preferidas as acilases mutantes com modificações nas seguintes combinações de 2 posições: [161 + 10], [161 + 29] ou [161 + 694] OU [161 + 726] ou [161 + 274] ou [161 + 706] OU [161 + 442] ou [161 + 589] ou [161 + 314] ou que tenham modificações nas seguintes combinações de 3 posições: [161 + 29 + 274], [161 + 29 + 706], [161 + 29 + 514], [161 + 274 + 589] ou [161 + 274 + 706] ou nas seguintes combinações de 4 posições: [161 + 29 + 274 + 726], [161 + 274 + 280 + 314], ou nas seguintes combinações em 5 posições: [161 + 29 + 274 + 314 + 694], [161 + 274 + 280 + 514 + 726] ou as seguintes combinações de 6 posições. [161 + 29 + 280 + 314 + 645 + 726].

A presente invenção preferivelmente proporciona mutantes da SE83-acil acilase de pseudomonas (SEQ ID NO:1)

que têm modificações pelo menos numa combinação das posições L161 + M270, OU pelo menos numa combinação das posições L161 + H296, OU pelo menos numa combinação das posições L161 + E442, OU pelo menos numa combinação das posições L161 + R589, OU pelo menos numa combinação das posições M270 + H296, OU pelo menos numa combinação das posições M270 + E442, OU pelo menos numa combinação das posições M270 + R589, OU pelo menos numa combinação das posições H296 + E442, OU pelo menos numa combinação das posições H296 + R589, OU pelo menos numa combinação das posições E442 + R589, OU pelo menos numa combinação das posições L161 + M270 + H296, ou pelo menos numa combinação das posições L161 + M270 + E442; ou pelo menos numa combinação das posições L161 + M270 + R589, ou pelo menos numa combinação das posições L161 + H296 + R589, ou pelo menos numa combinação das posições H296 + E442 + R589, ou pelo menos numa combinação das posições L161 + H296 + E442, ou pelo menos numa combinação das posições L161 + H2 96 + R589, ou pelo menos numa combinação das posições H296 + E442 + R589, ou pelo menos em qualquer combinação de 4 posições selecionadas dos grupos consistindo de L161, M270, H296, E442 e R589, ou pelo menos na combinação das posições L161, M27 0, H296, E442 e R589, e por meio do que as beta- lactama acilases tipo II mutantes podem ter modificações em outras posições de aminoácidos além daquelas posições e todas as combinações possíveis suas conforme descrito anteriormente. Modalidades altamente preferidas das presentes invenções são os mutantes SE83-Acill de Pseudomonas resumidos nas Tabelas de 2 a 5 dos Exemplos.

Num segundo aspecto, a invenção proporciona um polinucleotideo codificando a beta-lactama acilase tipo II mutante da presente invenção, A invenção proporciona também polinucleotideos codificando a subunidade alfa da beta- lactama acilase tipo II mutante, assim como polinucleotideos codificando a subunidade beta da beta- lactama acilase tipo II mutante. WO 2005/014821 revela na página 8 e 9 que genes codificando as acilases do grupo SE83 codificam um polipeptideo composto de uma subunidade a, um peptídeo espaçador, e uma subunidade β, naquela ordem. A acilase derivada de Pseudomonas sp. SE83 é gerada na forma de um polipeptideo de cadeia individual inativo com cerca de 84 KDa de tamanho depois de sofrer transcrição e tradução numa célula hospedeira. Depois disso, duas autodigestões ocorrem entre os aminoácidos na posição 23 0 e 231, e na posição 23 9 e 24 0 na seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, o que resulta na remoção do peptídeo espaçador consistindo de 9 aminoácidos, e na separação numa

subunidade α de 25 KDa e numa subunidade β de 58 KDa. Uma subunidade α está ligada a uma subunidade β através de interações hidrofóbicas, para formar um heterodímero de cerca de 83 KDa com atividade acilase. Conforme é geralmente conhecido, o primeiro códon (ATG) codificando a metionina N-terminal é necessário para o início da tradução durante a síntese de proteína num procarioto. A metionina é removida depois da tradução.

O polinucleotideo codificando a beta-lactama acilase tipo II mutante ou a subunidade alfa ou a subunidade beta de acordo com a presente invenção pode ser qualquer polinucleotídeo que codifica a própria seqüência de aminoácidos de acordo com a invenção. Alternativamente, o polinucleotídeo da invenção pode compreender uma seqüência codificadora na qual o cõdon de uso para os vários aminoácidos se desvia do códon de uso em Pseudomonas. Por exemplo, o códon de uso pode ser adaptado ao cõdon de uso de uma célula hospedeira particular, a qual irá ou foi transformada com o fragmento de DNA codificando a beta- lactama acilase tipo II alterada.

Num terceiro aspecto, a invenção proporciona um vetor de expressão ou um cassete de expressão compreendendo o polinucleotídeo da invenção, conforme definido mais acima.

Num quarto aspecto, a invenção proporciona uma célula hospedeira transformada, transformada com o polinucleotídeo da invenção ou o vetor de expressão ou o cassete de expressão da invenção. A célula hospedeira transformada pode ser usada para a produção da beta-lactama acilase tipo II mutante da invenção.

Células hospedeiras para a produção da beta-lactama acilase tipo II mutante da invenção são preferivelmente células hospedeiras as quais são conhecidas na técnica pela sua eficiente produção de proteína ou enzima, seja extracelularmente ou intracelularmente, por exemplo, microrganismos tais como fungos, leveduras e bactérias. Exemplos de células hospedeiras preferidas compreendem, porém não estão limitadas, aos seguintes gêneros: Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. oryzea) , Penicillium (por exemplo, P. emersonii, P. chrysogenum) , Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) , Kluyveromyces (por exemplo, Κ. lactis), Bacillus (por exemplo, Β. subtilis, Β. licheniformis, Β. amyloliquefaciens). Escherichia, (Ε. coli), Streptomyces (por exemplo, S. clavuligerus), Pseudomonas.

Num quinto aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção da beta-lactama acilase tipo II mutante da invenção, compreendendo o cultivo da célula hospedeira transformada de acordo com a invenção sob as condições contribuintes para a produção da expandase mutante e, opcionalmente, a recuperação da expandase mutante.

Num sexto aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção de um composto beta-lactama desacilado de interesse compreendendo o passo de desacilação de um precursor acilado do composto beta-lactama de interesse usando a beta-lactama acilase tipo II mutante da invenção. Compostos beta-lactama desacilados de interesse podem ser derivados de penicilinas ou cefalosporinas de ocorrência natural tais como 6-APA, 7-ACA, 7-ADCA, 7-ADAC, ácido 7- amino-3-carbamoiloximetil-3-cefem-4-carboxílico (por exemplo, WO 2004/106347) e outros. Preferivelmente, o composto beta-lactama desacilado de interesse é 7-ADCA ou 7-ACA, mais preferivelmente é 7-ADCA. Precursores acilados do composto beta-lactama de interesse podem ter um acil pertencendo ao grupo consistindo de ácidos dicarboxílicos. Grupos acil preferidos são succinil, glutaril, adipil, alfa-cetoadipil e aminoadipil. São mais preferidos o adipil e o aminoadipil, altamente preferido é o adipil. Precursores acilados preferidos do composto beta-lactama de interesse são adipil-7-ADCA, adipil-7-ACA, aminoadipil-7- ADCA e aminoadipil-7-ACA, o último sendo conhecido como CEFC/ mais preferido é o adipil-7-ADCA.

0 processo da invenção para a produção de um composto beta-lactama desacilado de interesse pode ser executado num modo em lote, por meio do qual a beta-lactama acilase tipo II mutante é usada num estado dissolvido numa solução compreendendo o precursor acilado do composto beta-lactama de interesse.

Mais preferivelmente, a beta-lactama acilase tipo II mutante é usada como uma forma imobilizada. A sua vantagem é que a beta-lactama acilase tipo II mutante pode ser recuperada depois do completamento da reação de desacilação e ser reusada para outras reações de desacilação. Dessa forma, o custo no uso da beta-lactama acilase tipo II mutante pode ser reduzido significativamente, aumentando dessa forma a atratividade econômica do processo de desacilação. As condições para a reação de desacilação, assim como a imobilização da enzima são conhecidos na técnica anterior (por exemplo, Kallenberg, A.I. et ai. Adv. Synth. Catai. (2005), 347, 905-926).

Num sétimo aspecto, a presente invenção se refere ao uso da beta-lactama acilase tipo II mutante da invenção num processo para a produção de um composto beta-lactama desacilado de interesse, cujo processo compreende o passo de desacilação de um precursor acilado do composto beta- lactama de interesse. Compostos beta-lactama desacilados de interesse podem ser derivados de penicilinas ou de cefalosporinas de ocorrência natural, tais como 6APA, 7- ACA, 7-ADCA, 7-ADAC, ácido 7-amino-3-carbamoiloximetil-3- cefem-4-carboxíIico e outros. Preferivelmente, o composto beta-lactama desacilado de interesse é 7-ADCA ou 7-ACA, mais preferivelmente ê 7-ADCA. Precursores acilados do composto beta-lactama de interesse podem ter um acil pertencendo ao grupo consistindo de ácidos dicarboxilicos. Grupos acil preferidos são succinil, glutaril, adipil, alfa-cetoadipil e aminoadipil. Os mais preferidos são o adipil e o aminoadipil, sendo altamente preferido o adipil. Os precursores acilados mais preferidos do composto beta- lactama de interesse são adipil-7-ADCA, adipil-7-ACA, ácido adipil - 7 -amino-3 -carbamoiloximetil-3 -cef em-4 -carboxí lico, alfa-cetoadipil-7-ADCA, alfa-cetoadipil-7-ACA, aminoadipil- 7-ADCA, aminoadipil-7-ACA, o último sendo conhecido como CEFC. O processo da invenção para a produção de um composto beta-lactama desacilado de interesse pode ser executado de modo em lote, por meio do que a beta-lactama acilase tipo II mutante é usada num estado dissolvido numa solução compreendendo o precursor acilado do composto beta-lactama de interesse. Mais preferivelmente, a beta-lactama acilase tipo II mutante é usada numa forma imobilizada.

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação da acilase

Plasmideos com o gene tipo selvagem ou genes mutantes foram transformados para as células E. coli Top 10 (Invitrogen). As células foram inoculadas em frascos de 100 mL usando 20 mL de meio 2 χ TY contendo 50 μg/mL de zeocina a 37°C e 280 rpm. Depois de 24 horas, os frascos com 100 mL de meio 2 χ TY, 50 μg/mL de zeocina e 0,05% de arabinose foram inoculados com 50 μΐ. da cultura 1:1000 e crescidos a 25°C e 280 rpm. As culturas foram centrifugadas e congeladas a -20 °C. Para preparar um extrato livre de células, os péletes foram ressuspensos em tampão de extração (Tris 50 mM/HCl, 0,1 mg/mL de DNAse 1, 2 mg/mL de lisozima, DTT 10 mM (ditiotreitol), MgSO4 5 mM) e incubados. Depois de 3 0 minutos, o extrato foi centrifugado e o sobrenadante contendo a atividade acilase foi usado para medições de atividade.

O conteúdo de acilase foi determinado usando eletroforese em gel SDS-PAGE e cromatografia de exclusão de tamanho HPLC analítica efetuada numa coluna TSK 3000SWxI com tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 como eluente. Condições cromatograficas aplicadas: taxa de fluxo de 1,0 mL/min e detecção a 280 nm. Pela comparação das áreas observadas dos picos de acilase, uma pessoa pode comparar o conteúdo de proteína de diferentes amostras. 0 conteúdo de proteína acilase é calculado a partir da OD280 usando um coeficiente de extinção molar de 154350 (M"1. cm"1) . No caso de picos adicionais no cromatograma de HPLC, o valor de E28 0 da amostra é corrigido para a contribuição dos picos adicionais.

Purificação

Péletes de células de 100 mL de culturas foram ressuspensos com 1 mL de Tris pH 8 20 mM. Depois de 9 χ 10 segundos de ultra-som (Soniprep 150 I-BU03) com uma amplitude de 10μ em gelo (quebras de 15 segundos) a suspensão de células foi centrifugada por 5 minutos em 14000 rpm e 4 °C em tubos de microcentrí fuga. Depois o sobrenadante foi levado até pH de 5,3 a 5,4 com HCl 0,1 M, ele foi centrifugado para remover o precipitado. Subseqüentemente, o sobrenadante foi titulado de volta até pH = 8 com NaOH. Cerca de 100 a 400 μL foram aplicados numa coluna MonoQ de 1 mL, a qual foi equilibrada com Tris pH 8 20 mM contendo NaCl 10%. Tampão A (Tris 20 mM pH 8) e tampão B (Tris pH 8 20 mM + NaCl 1 M) foram misturados como a seguir durante a eluição: de 0 a 1 minuto 10% de B/90% de A; de 1 a 5 20% de B/80% de A; de 5 a 9 40% de B/60% de A;

de 9 a 12 60% de B/40% de A; de 12 a 15 100% de B. As frações do pico contendo atividade acilase foram coletadas e aplicadas numa coluna de filtração a gel, TSKGel 3000SWxI, a qual foi equilibrada com tampão fosfato de sódio pH 7 100 mM. As frações dos picos foram coletadas e estocadas para uso posterior.

Reagentes

Adipil-7ADCA pode ser preparado a partir de ácido adípico e 7-ADCA por síntese enzimática, conforme descrito em W09848037. Além disso, adipil-7ADCA pode ser preparado por síntese química conforme descrito por Shibuya et al. em Agric. BioI. Chem., 1981, 45(7), 1561-1567, partindo do anidrido adípico ao invés do anidrido glutárico.

Uma solução estoque 8% (p/v) de substrato adipil-7ADCA foi preparada no tampão apropriado e ajustada até o pH desejado com NaOH 4 N.

O reagente de cor 4-(dimetilamino)-benzaldeído (p- DMBA) foi recentemente preparado pela dissolução de 2 00 mg em 100 mL de ácido cítrico (315,5 g de ácido cítrico monoidratado dissolvido em 1 litro de etanol).

Medições de atividade na faixa de pH = 8,0 até pH 10,0 foram executadas em tampão CHES 0,2 M (ácido 2-(N- cicloexilamino)etanossulfônico) ajustado até o pH desejado com HCl 4 N ou NaOH 4 N conforme necessário.

Medição da atividade da acilase

180 μL do tampão apropriado foi misturado com 2 00 μL de solução estoque de substrato no tampão correspondente e 20 μL de solução de enzima e incubados durante 20 minutos na temperatura desejada, geralmente na temperatura ambiente, a não ser que seja estabelecido de outra forma. A adição de 600 μL de reagente de cor interrompeu a reação. Depois de 10 minutos em temperatura ambiente, a absorvância foi medida a 415 nm. As medições do branco foram feitas pela adição de solução colorida ao ensaio antes da enzima ser adicionada. A atividade da acilase é calculada como o aumento na densidade ótica (OD) por minuto (delta OD/min). Para calcular as atividades absolutas numa linha de calibração de 7-ADCA na faixa de 0,1 a 1 g de ADCA por litro foi usada.

Determinações de Km e curvas de pH

As determinações de Km foram executadas usando o ensaio conforme descrito. Entretanto, a concentração de adipil-7-ADCA variou de 0,5 a 4% (p/v) de adipil-7ADCA.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Atividade acilase de mutantes SE83 ACYii

A atividade acilase dos mutantes com adipil-7-ADCA como substrato foi determinada em pH = 8,5 e pH = 9,5. Os resultados estão mostrados na Tabela 2.

Tabela 2: Atividades relativas do tipo selvagem e acilases mutantes na adipil-7ADCA ajustando a atividade do tipo selvagem em pH = 8,5 até 1. Entre parênteses, as atividades relativas à atividade do tipo selvagem em pH = 9,5; O ensaio foi executado em temperatura ambiente. As taxas iniciais foram medidas na presença de adipil-7ADCA 4% (p/v). <table>table see original document page 31</column></row><table>

Em pH = 8,5, assim como em pH 9,5, a atividade dos mutantes é significativamente maior em comparação com a acilase tipo selvagem. Além disso, ao comparar a atividade em pH = 9,5 com a atividade em pH = 8,5, fica claro que a atividade da acilase mutante em pH = 9,5 é relativamente maior em comparação com a do tipo selvagem. 0 perfil de atividade do pH de mutantes foi alterado para um pH maior, tornando esses mutantes particularmente adequados para uso em pH elevado. Isso é de particular importância porque o rendimento da conversão irá aumentar num pH mais alto devido ã alteração do equilíbrio termodinâmico adicionalmente para o completamento da reação de hidrólise.

Uma vez que durante o processo de conversão de adipil- 7ADCA em 7-ADCA e ácido adípico, a concentração do último irá aumentar, a inibição do produto poderia reduzir as melhorias dos mutantes medida sob condições de taxa inicia. Conseqüentemente, a atividade das acilases do tipo selvagem e mutantes foi medida na presença de 1,5% (p/v) de ácido adípico. A Tabela 3 mostra que sob essas condições a atividade dos mutantes é significativamente mais alta em comparação com a acilase o tipo selvagem em pH = 8,5 assim como em pH = 9,5. O perfil de atividade do pH para esses mutantes não foi alterado para um pH mais alto.

A atividade da acilase do tipo selvagem e s acilases mutantes usando adipil-7-ADCA como substrato foi determinada em pH = 8,6, pH = 9,1 e em pH = 9,5 na presença de ácido adipico 1,5% (p/v). Os resultados estão mostrados na Tabela 4.

A Tabela 4 mostra que em pH = 8,6, em pH 9,1, assim como em pH = 9,5, a atividade dos mutantes é significativamente mais elevada em comparação com a acilase do tipo selvagem. Ao comparar a melhoria de atividade em pH = 9,1 com a melhoria de atividade em pH 8,6 (colunas com proporção de atividades), fica claro que a atividade das acilases mutantes em pH 9,1 é relativamente mais elevada em comparação com o tipo selvagem. O perfil de atividade do pH dos mutantes foi alterado para um pH mais elevado, tornando esses mutantes particularmente adequados para uso em pH elevado. Ao comparar o pH = 9,5coopH= 8,6, a atividade da maioria das acilases mutantes é ainda mais melhorada em pH = 9,5 do que em pH = 8,5 em comparação com o tipo selvagem.

Tabela 3: Atividades relativas do tipo selvagem e das acilases mutantes no adipil-7ADCA ajustando a atividade do tipo selvagem em pH = 8,5 até 1. Entre parênteses estão as atividades relativas à atividade do tipo selvagem em pH = 9,5. O ensaio foi executado em temperatura ambiente. A concentração de substrato inicial foi de 4% (p/v) de adipil-7ADCA. A atividade inicial foi medida na presença de 1,5% de ácido adipico (p/v).

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Tabela 4: Atividades relativas das acilases tipo selvagem e mutantes no adipil-7ADCA ajustando a atividade do tipo selvagem em pH = 8,6 até 1. Entre parênteses, as atividades relativas à atividade do tipo selvagem em pH = 9,1 e pH = 9,5, respectivamente. O ensaio foi executado em temperatura ambiente. A concentração de substrato inicial foi de 2% (p/v) de adipil-7 ADCA. A atividade inicial foi medida na presença de ácido adipico 1,5% (p/v).

<table>table see original document page 33</column></row><table> <table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table> Exemplo 2

Afinidade do substrato indicada pela medição do Km dos

mutantes SE83 ACYii

Tabela 5 mostra os valores de Km medidos para uma variedade de mutantes em relação ao tipo selvagem. A constante de Michaelis Km representa a concentração de substrato na qual a enzima opera a 50% de sua capacidade máxima. Em concentrações de substrato abaixo do Km, a enzima fica mais lenta, em concentrações de substrato acima do Km as enzimas operam de modo mais rápido até uma concentração de substrato elevada a enzima ficar completamente saturada e operar numa velocidade máxima. No final de uma conversão enzimática, onde o substrato é exaurido, um baixo Km é crucial para manter a atividade substancial. No caso de o Km relativo para um mutante ser < do que 1,00, isso significa que em concentrações de substrato inferiores, por exemplo, no final da conversão, o mutante tem uma vantagem em relação ao tipo selvagem na manutenção de uma atividade substancialmente maior.

Tabela 5. Afinidades de substrato relativas representadas como valores de Km relativos. As determinações de Km foram feitas usando o ensaio conforme descrito anteriormente. A concentração de adipil-7ADCA variou de 0,5 até 4% de adipil-7ADCA.

<table>table see original document page 36</column></row><table> <table>table see original document page 37</column></row><table>

Exemplo 3

Atividade acilase de mutantes SE83 ACYii imobilizados

A imobilização foi executada conforme descrito em WO 97/04 08 6 usando gelatina e quitosana como agentes gelificantes e dialdeído glutárico como agente de ligação cruzada. O desempenho da acilase do tipo selvagem imobilizada e das acilases mutantes foi medido efetuando-se uma hidrõlise completa do adipil-7ADCA numa temperatura e pH controlados num reator de 100 mL. Os experimentos foram efetuados em 3,2% de adipil-7-ADCA. A enzima imobilizada foi dosada de tal forma que pelo menos 90% da conversão pôde ser obtida em 120 minutos sob as condições desejadas. As conversões foram executadas em pH = 8,8 a 30°C e em pH 9,5 a 40°C. A mesma quantidade (em peso) da acilase mutante e do tipo selvagem foi usada para as conversões. Durante a reação, o pH foi mantido constante pela adição de uma solução de KOH 1 Μ. A atividade da acilase imobilizada é expressa como mL de KOH por minuto. Nas Figuras 2a e 2b a taxa, expressa como mL de KOH por minuto, como função da conversão é mostrada.

A média de 6 corridas foi tomada empH = 8,8 e 30°C. Os dados da primeira conversão de 3 0% não foram incluídos porque o sistema não foi completamente estabilizado, gerando um grande espalhamento dos dados. Em pH = 9,5 e a 40 °C, a média de duas corridas foi tomada. Conseqüentemente, a variação é maior. Entretanto, a inclinação calculada proporciona uma boa indicação da atividade. As Figuras 2a e 2b mostram que a atividade da acilase mutante é significativamente maior durante toda a conversão.

A estabilidade das acilases imobilizadas foi determinada pela medição de 20 conversões subseqüentes de 180 minutos com o mesmo lote de acilase imobilizada. A taxa entre 30 e 50% de conversão de cada incubação foi medida. A atividade residual de uma acilase imobilizada é aqui definida como a atividade da 20a incubação em comparação com a taxa da primeira incubação.

A Tabela 6 resume os resultados. Foi observado que particularmente sob as condições que mudam o equilíbrio termodinâmico da reação de hidrólise para uma conversão mais completa (temperatura elevada e alto pH), a estabilidade da acilase modificada é substancialmente melhorada em comparação com o tipo selvagem.

Como conseqüência dessa maior atividade hidrolítica e da maior estabilidade da acilase modificada, a produtividade por grama de enzima acilase modificada foi consideravelmente aumentada.

Tabela 6: Atividade residual depois de 20 conversões nas condições indicadas.

<table>table see original document page 38</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table> LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA.

<11G> OSM IP Assets 8.V

<120> Acilases Mutantes

<130> 24988WO

<160> 3

<17Q> Patentm version 3.3

<210> 1

<211> 3141

<212> DNA

<213> Pseudomonas sp, SE83

<220>

<221> CDS

<222> (562)..(2886)

<400> 1

aagcttgcga tcgcggacgc cgctgccgcc ctgaagaaga ccgcctacaa gggcgagccg 60 gtggtcttcc tgacggtcgc cgggtcgatc tcgeagacgg ccggcgcggt tctggccagc 120 aatatgcgca aggccggctt cacegtggac gagcaggtga tggactgggg caeggtgctc 180 gcacgccggg ccaagaagga cggttggagc gtcttcccgg tctacgccaa cggeatcgac 240 atgatgtcgc cgctgacgca tttctacatc ggcaacaact gcgcgaacta tgccggctgg 300 agctgcgaeg ccgteatcac ccaaaagctc gccgcctatg ccaaggcgec tgatccggcc 360 acccgcaagc gcatcgcggc cgagatcagg tcgaggccta taaggacacg ccctccgtga 420 tgtggggcca gttcâgcegg ecggccggat accgcetgcg ccteaaagac atcgtccagt 480 ceagcttccg atcttctggc agctcacgct cgacgcgtga gctcgtccag ateccgataa 540 geaacgaggi ccagacagag a atg acg atg gcg gcc Met Thr Met Ala Ala aag acc gat cgc gag Lys Thr Asp Arg Glu 591

1 S 10

gcc ctg cag gcg gcg ctg ccg ccg ctt tcc gac age ctc tcc att cec 639 Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro Pro Leu ser Giy ser teu ser Ile Pro 15 20 25

gga ttg age gcg ccg gtç cgt gtc cag cgc gat ggc tgg ggc ate ccg 687 Gly Lêu ser Ala Pro Val Arg vai Gln Arg Àsp Gly Trp Gly Xle Pro 30 35 40

eat ate aag gcc tcg ggc gag gcc gat gcc tat cgc gcg ctg ggc ttc 735 His Ile Lys Ala ser Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe 45 50 55

gtc cat gcg cag gac cgc Ctt ttc cag atg gaa ctg acg cgc cgc aag 783

vai His Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys 60 65 70

gcg ctg ggt cgc gcg gcc gaa tgg ctg ggc gcc gag gea gcc gag gcc 831 Ala Leu Gly Arg Ala Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala 75 80 85 90

gat ate ttg gtg cgc cgg ctc ggc atg gaa aaa gtc tgc cgg cgc gat 879 Asp lie Leu vai Arg Arg Leu Gly Met Glu Lys vai Cys Arg Arg Asp 95 100 105

ttc gag gcc ctg ggt gcc gag gcg aag gac atg ctg cgg gcc tat gtc 927 Phe Glu Ala Leu Giy Ala Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr vai 110 115 120

gcc ggc gtg aac gcg ttc ctg gct tcc ggt gct cct ttg ccc ate gaa 975 Ala Gly Val Asn Ala Phe Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu 125 130 135 tat gac ctg ctc ggc 9CC 9aa cc9 9a9 ccc *99 9aa ccc tSS cac a9c 1023 Tyr Gly Leu teu Gly Ala Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser 140 14S 150

ate gcc gtg atg cgg cgg ctg ggg etc ctg atg ggc tcc gtc tgg ttc 1071 Ile Ala vai Met Arg Arg Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser vai Trp Phe 155 160 165 170

aag ctc tgg cgg atg ctg gcg ctg ccg gtg gtc gga gcc gcg aat gcg 1119 Lys Leu Trp Arg Met Leu Ala Leu Pro vai vai Gly Ala Ala ash Ala 175 180 185

ctg aag ctg cgc tat gac gat ggc ggc caa gac ctg ctc tgc ate ccg 1167 Leu Lys Leu Arg Tyr Asp Asp Giy Gly Gln Asp teu Leu Cys Ile Pro 190 195 200

ccg ggt gtc gag gcc gag cgg ctc gaa gcg gat ctc gcg gcg ctg agg 1215 Pro Gly Val Glu Ala Glu Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg 205 210 215

ccc gcg gtt gat gcc ctg ctg aaa gcg atg ggc ggc gac gcc tcc gat 1263 Pro Ala vai Asp Ala Leu Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp 220 225 230

gcg gcc ggc ggc ggc age aac aac tgg gcg gtc gcg ccg ggc cgc acg 1311 Ala Ala Gly Gly Gly Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr 235 240 245 250

gcg acg ggc cgg ccc ate ctc gcg ggc gat ccg cat cgc gtc ttc gaa 1359 Ala Thr Gry Arg Pro Xle Leu Ala Giy Asp Pro His Arg vai Phe Glu 255 260 265

ate ccc ggc atg tat gcg cag cat cac ctg gcc tgc gat cgg ttc gac 1407 Ile Pro Gly Met Tyr Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp 270 275 280

atg ate ggt ctg acc gtg ccg ggt gtg ccg ggc ttc ccg cat ttc gcg 1455 Met Ile Gly Leu Thr Val Pro Giy Vas Pro Gly Phe Pro His Phe Ala 285 290 295

cat: aac ggc aag gtc gcc tac tgc gtc acc cat gcc ttc atg gac att 1503 His Asn Gly Lys Val Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe «et Asp Ile 300 305 310

cac gat ctc tat ctc gag caa ttc gcg gag gac ggg cgc acg gcg cgg 1551 His Asp Leu Tyr Leu Glu Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg 315 320 325 330

ttc ggc aac gag ttc gag ccc gta gcc tgg cgc cga gac cgt ate gcg 1599 Phe Gly Asn Glu Phe Glu Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg lie Ala 335 340 345

gtc cgg ggt ggc gcc gat cgc gaa ttc gat ate gtc gag acg cgc cat Val Arg Gly Gly Ala Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His 350 355 360

1647

ggc ccc gtc ate gcg ggc gat ccg ctc gag gga gea gcg ctc acg ctg 1695 Gly Pro vai Ile Ala Giy Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu 365 370 375

cgc tcg gtc cag ttc gcc gag acc gac ctt tcc ttc gat tgc ctg acg 1743 Arg ser vai Gln Phe Ala Glu Thr Asp Leu ser Phe Asp Cys Leu Thr 380 385 390

cgg atg ccg ggc gea tcg acc gtq gcg cag ctt tac gac gcg acg cgc 1791 Arg Met Pro Gly Ala Ser Thr vai Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Ar 395 400 405 4H

ggc tgg ggc ctg ate gac cat aat ctc gtc gcc ggg gat gtc gcg ggc 1839 Gly Trp Gly Leu Ile Asp His Asn Leu vai Ala Giy Asp Val Ala Gly 415 420 425

tcg ate qgc cat ctg gtc cgc gcc cgc gtc ccg tcc cgc ccg cgc gag 1887 Ser lie Gly His Leu Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu 430 435 440 aac ggc tgg ctg ccg gtg ccg ggc tgg tcc ggc gag cat gaa tgg cgc 1935 Asn Gly Trp Leu Pro Vai Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg 445 450 455

ggc tgg att ccg cac gag gcg atg ccg cgc gtc ate gat ccg ccg ggc 1983 Gly Trp Ile Pro His Glu Ala Met Pro Arg vai lie Asp Pro Pro Gly 460 465 470

ggc etc ate gtc acg gcg aac aac cgc gtc gtg gcc gat gat cat ccc 2031 Gly Leu Ile vai Thr Ala Asn Asn Arg Val vai Ala Asp Asp His Pro 475 480 485 490

gat tat ctc tgt acc gat tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gaa cgg ate 2079 Asp Tyr Leu Cys Thr Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala 6lu Arg Ile 49S 500 505

atg gag cgc ctg gtc gcc agt ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcg gcc 2127 Met Glu Arg Leu Val Ala ser Pro Ala Phe Ala vai Asp Asp Ala Ala 510 515 520

gcg ate cac gcc gat acg ctg tcc ccc cat gtc ggc ttg ctg cgc gcg 2175 Ala Ile His Ala Asp Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala 525 530 535

agg ctc gaa gcg ctc gga ate cag ggc agt ctc cct gcc gaa gag ttg 2223 Arg Leu Glu Ala Leu Giy Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu 540 545 550

agg cag acc etc ate gcc tgg gac ggc cgc atg gat gct ggc tcg cag 2271 Arq Gln Thr Leu Ile Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln 555 560 565 570

gcg gct tcc gct tat aat gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gta 2319 Ala Ala Ser Ala Tyr Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu vai 575 580 585

acg gcc cgc age ggg ctg gag caa gcg ata gcg cat ccc ttc gcg gcc 2367 Thr Ala Arg Ser Gly Leu Glu Gln Alá Ile Ala His Pro Phe Ala Ala 590 595 600

gtc ccg ccc ggc gtc tcg ccg cag ggg cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg 2415 vai Pro Pro Gfy Val Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala vai Pro 605 610 615

acc ctg ctg cgc aae gac gat gcc ggg atg ctg aaa gqc tgg age tgg 2463 Thr Leu Leu Arg Asn Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp ser Trp 620 625 630

gac gag gcc ttg tcg gag gcc ctg tcc gtc gcg acg cag aac ctg acc 2511 Asp Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr 635 640 645 650

ggg cgc ggc tgg ggc gag gag cat cgg ccg cgt ttc acg cac ccg ctc 2559 Giy Arg Gly Trp Gly Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu 655 660 665

tcc gcg cag ttc ccg gcc tgg gcc gcg ctg ctg aac ccg gtt tcg cgc 2607 Ser Ala Gln Phe Pro Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn pro vai ser Arg 670 675 680

ccg ate ggc ggc gat ggc gac acc gtg ctg gcg aac ggg etc gtc cca 2655 Pro lie Gly Gly Asp GÍy Asp Thr Val Léu Ala Asn Gly Leu Val Pro 685 690 695

tcg gcc gga cct gag gcg acc tat ggc gcc ctg tcg cgc tac gtc ttc 2703 Ser Ala Gly Pro Glu Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe 700 705 710

gat gtc ggc aat tgg gac aat age cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc 2751 Asp vai Gly Asn Trp ASp Asn ser Arg Trp vai vai Phe His Gly Ala 715 720 725 730

tcg ggg cat ccg gcc age ccc cac tat gcc gac cag aat gcg cca tgg 2799 Ser Gly His Pro Ala Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp 73S 740 745 age gac tgc gcg atg gtg ccg atg ctc tat age tgg gac agg ate gcc 2847 Ser Asp Cys Ala Met Val Pro Het Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala 750 755 760

gcg gag gcc gtg acc tcg cag gaa ctc gtc ccg gcc tga ggggcaaggc 2896 Ala Glu Ala vai Thr Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala 765 770

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ccgccgtcga cggtcaggac ggcgccgttc acatagctcg ácgegtcgga caggagccag 3016

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agctgctcca gccgcagcgg gtcggccagc accttgtcca tcatccgcgt cgcgatctgc 3136

ccggg 3141

<210> 2

<211> 2847

<212> ONA

<213> Brevundinionas diminuta N-176

<220>

<221> CDS

<222> (483).,(2801)

<400> 2

eccggggatc tcgcagacgg ctggcgcggt cctggccagc aatatgcgca aggccggctt 60 cacggtggaa cagcaggtga tggattgggg cacggtgctc gcccgccggg ccaagaagga 120 cggctggagc gttttcccgg tctacgccaa cggcatcgac atgatgtcgc cgctgacgca 180 tttctacatc ggcaacaact gcgtgaacta tgcgggctgg agctgcgacg ccgtcatcac 240 cgaaaagctc gccgcctatg ccaaggcgcc cgatccggct accegcaaac gcatcgcggc 300 cgaaatccag gtcgaggcct acaaggacac gccctccgtg atgtggggcc agttcagccg 360 gccggcgggc taccgcctgc gcctcaagaa catcgtccag tccagcttcc cgatcttctg 420 gcagctcacg ctcgacgcgt gagcttgccc agattccgac aagcaatgag. gtcccgaegc 480 ga atg act Met Thr atg gcg gcc aac acc gat cgc gcg gtc ttg cag gcg gcg Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala vai Leu Gln Ala Ala 527

10 15

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gtc cgc gtc cgg cgc gat gcc tgg ggc ate ccg cat ate aag gcc tcg 623 vai Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His ile Lys Ala Ser 35 40 45

ggc gag gce gat gcc tat cgg gcg ctg ggc ttc gtc cat tcg cag gac 671 Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp 50 55 60

cgt ctt ttc cag atg gag ctg acg cgt cgc aag gcg ctg gga cgc gcg 719 Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala 65 70 75

gcc gaa tgg ctg ggc gcc gag gcc gcc gag gcc gat ate ctc gtg cgc 767

Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp 21e Leu vai Arg 80 85 90 95

cgg ctc gga atg gaa aaa gtc tgc egg cgc gac ttc gag gcc ttg ggc 815 Arg Leu GIy Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly 100 105 110 gtc gag gcg aag gâc atg ctg cgg gct tat gtc gcc ggc gtg aac gca Val Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr vai Ala Gly vai Asn Ala 115 120 125

863

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gct tcc Ala Ser 130

gct Ala

ccc ctg cct Pro Leu Pro 135

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tac gga Tyr Giy 140

trtg ctc gga Leu Leu Giy

911

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ccg gag ccc tgg Pro Glu Pro Trp

gag cct tgg Glu Pro Trp 150

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ate gcg Ile Ala 155

gtg atg cgc VaT Met Arg

959

cgg ctg Arg Leu 160

H

c ctg ctt atg Gly Leu Leu Met Gly Se 165

ggt tcg gtg Giy ser vai

tgg ttc Trp Phe 170

aag ctc Lys Leu

tgg cgg ate Trp Arg Ile 175

1007

ctg gcg Leu Ala

ctg ccg gtg gtc Leu Pro Val Val 180

gga gcc gcc Gly Ala Ala

aat gcg Asn Ala

185

ctg aag Leu Lys

ctg cgc tat Leu Arg Tyr 190

1055

gac gat Asp Asp

ggc ggc cgg gat Gly Giy Arg Asp 195

ttg ctc tgc Leu Leu Cys 200

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ccg ggc Pro Gly

gcc gaa gcc Ala Glu Ala

205

1103

gat cgg Asp Arg

ctc gag gcg gat Leu Glu Ala Asp 210

ctc gcg acc Leu Ala Thr 215

ctg cgg Leu Arg

ccc gcg Pro Ala 220

gtc gat gcg vai Asp Ala

1151

ctg ctg Leu Leu 225

aag gcg atg ggc Lys Ala Met Gly

c gat gcc y Àsρ Ala 230

tcc gat ser Asp

gct gcc Ala Ala 235

ggc ggc gg Gly Gly Gl

1199

age aac aac tgg gcg gtc gct ccg Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro 240 245

cgc acg

Arg Thr 250

gcg acc Ala Thr

ggc agg ccg Gly Arg Pro 255

1247

ate ctc Ile Leu

gcg ggc gat ccg Ala Gly Asp Pro 260

cat cgc gtc His Arg vai

ttc gaa Phe Glu 265

ate ccg Ile Pro

ggc atg tat Gly Met Tyr 270

1295

gcg cag cat cat ctg gcc tgc gac cgg ttc gac atg ate ggc ctg acc Ala Gln His His Leu Ala cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr 275 280 285

1343

ccg Val Pro

ggc gtg ccg goc Gly Val Pro Gly

Gly 290

ttc ccg cac Phe Pro His 295

ttc gcg Phe Ala

cat aac His Asn 300

ggc aag gtc Gly Lys vai

1391

gcc tat Ala Tyr 305

tgc gtc acc cat Cys vai Thr His

gcc ttc atg Ala Phe Met 310

gac ate Asp Ile

cac gat His Asp

315

ctc tat ctc Leu Tyr Leu

1439

gag cag Glu Glrl 320

ttc gcg Phe Ala

ggg gag Giy Glu 325

ggc cgc act Gly Arg Thr

gçg cgg Ala Ar 33

ttc ggc Phe Gly

aac gat ttc Asri Asp Phe 335

1487

gag ccc Glu Pro

gtc gcc vai Ala

tgg age Trp Ser 340

cgg gac cgt Arg Asp Arg

ate gcg Ile Ala 345

gtc cgg vai Arg

ggt ggc gcc Gly Gly Alá 350

1535

gat cgc Asp Arg

gag ttc Glu Phe 355

gat ate

ASp Ile

gtc gag acg Val Glu Thr 360

cgc cat Arg His

fc ccg Gly Pro

gtt ate gcg vai ile Ala 365

1583

ggc gat Gly Asp

ccg cgc Pro Arg 370

gat ggc Asp Gty

gca gcg ctc Ala Ala Leu 375

acg ctg Thr Leu

cgt tcg Arg Ser 380

gtc cag ttc Val Gln Phe

1631

gcc gag Ala Glu 385

acc gat Thr Asp

ctg tcc Leu Ser

ttc gac tgc Phe Asp Cys 390

ctg acg Leu Thr

cgg atg Arq Met 395

ccg ggc gca Pro Gly Ala

1679

tcg acc Ser Thr 400

gtg gcc cag etc Val Ala Gln Leu 405

tac gac gcg Tyr Asp Ala

acg cgc Thr Arg 410

c tgg V Trp

ggc ctg ate Gly Leu lie 415

1727 gac cat ASp HlS

aac etc Asn Leti

gtc gcc Val Ala 420

gat gtc Asp vai

gcg ggc Ala Gly 425

tcg ate ggc ser He Gly

cat ctg His Leu 430

1775

gtc cgc Val Arg

gcc cgc Ala Arg 435

gtt ccg tcc vai Pro Ser

cgt ccg Arg Pro 440

cgc gaa Arg Glu

aac ggc tgg Asn Gly Trp 445

ctg ccg Leu Pro

1823

ccg Pro

c tgg y Trp 450

tcc ggc gag Ser Giy Glu

cat gaa His Glu 455

tgg cgg Trp Arg

c tgg att y Trp Ile 460

ccg cac Pro His

1871

gag gcg Glu Ala 465

atg ccg Met Pro

cgc gtg ate Arg vai lie 470

gat ccg Asp Pro

ccg ggc Pro Gly

ggc ate ate Giy Ile Ile 475

gtc acg vai Thr

1919

gcg aat Ala asη 480

aat cgc Asn Arg

gtc gtg gcc vai vai Ala 485

gat gac Asp Asp

cat ccc His Pro 490

gat tat ctc Asp Tyr Leu

tgc acc Cys Thr 495

1967

gat tgc Asp cys

cat ccg His pro

ccc tac cgc Pro Tyr Atg 500

gcc gag Ala Glu

cgc ate Arg Ile 505

atg aag cgc Met Lys Arg

ctg gtc Leu vai 510

2015

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acg ctg Thr Leu

gga gcc Gly Ala 545

ccg gct Pro Ala

515

tcg ccc Ser Pro

530

cgc gac Arg Asp

ttc gcc gtc Phe Ala vai

cat gtc gqg His vai Gly

gae tcc gcg Asp ser Ala 550

gac gat Asp Asp 520

ttg ctg Leu Leu 535

gcc gaa Ala Glu

gcc gcc Ala Ala

cgc cgg Arg Arg

999 ctg Gly Leu

gcg ate cat Ala lie His 525

agg ctc gag Arg Leu Glu 540

agg cag atg Arg Gln Met 555

gcc gat Ala ASp

gcg ctt Ala Leu

ctc gtc Leu vai

2063

2111

2159

gcc tgg Ala Trp 560

gac ggc Asp Gly

cgc atg gat Arg Met ASp 565

§cg gct Ala Ala

tcg gag Ser Glu 570

gtc gcg tCt vai Ala Ser

gcc tac Ala Tyr 575

2207

aat gcg Asη Ala

ttc cgc Phe Arg

agg gcg ctg Arg Ala Leu 580

acg cgg Thr Arg

ctg Leu 585

acg gac cgc Thr Asp Arg

age ser 590

2255

ctg gag Leu Glu

cag gcg Gln Ala 595

ata tcg cat Ile Ser His

ccc ttc Pro Phe 600

gcg gct Ala Ala

gtc gcg ccg vai Ala Pro 605

c gtc y vai

2303

tca ccg ser Pro

caa gac 61» Gly 610

cag gtc tgg Gln vai Trp

tgg gcc Trp Ala 615

gto ccg vai Pro

acc ctg ctg Thr Leu Leu 620

cgc gac Arg Asp

2351

gac gat

ASP ASf

gcc gga Ala Gly

atg ctg aag Ket Leu Lys 630

9?c tgg Gly Trp

age tgg Ser Trp

gac cag gcc ASp Gln Ala 635

ttg tet Leu ser

2399

gag gcc Glu Ala 640

CtC tcg Leu ser

gtc gcg tcg vai Ala Ser 645

cag aac Gln ASη

ctg acc Leu Thr 650

ggg cga age Gly Arg Ser

tgg ggc Trp Gly 655

2447

gaa gag Glu Glu

cat cgg His Arg

ccg cgc ttc Pro Arg Phe 660

acg cat Thr His

ccg ctt pro Leu 665

gcc acg caa Ala Thr Gln

ttc ccg Phe Pro 670

2495

gcc tgg Ala Trp

jc gat Iy Asp

gcg gqg Ala Gly 675

acc gtg Thr vai 690

ctg ctg aat Leu Leu Asn

ctg gcg aac Leu Ala Asn

ccg gct Pro Ala 680

ggg ctc Gly Leu 695

tcc cgt ser Arg

gtc ccg vai Pro

ccg ate ggt Pro ile Giy 685

tca gcc ggg Ser Ala Giy 700

ggc gat Gly ASp

ccg cag Pro Gln

2543

2591

gcg acc

Ala Thr 705

tat ggt Tyr Gly

gcc ctg tcg Ala Leu ser 710

cgc tac Arg Tyr

gtc ttc vai Phe

gat gtc ggc Asp Val Gly 715

aat tgg Asn Trp

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2687

age gcc cat tat gcc gat cag aat gcg ccc tgg age gac tgt gcg atg 2735 Ser Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp ser Asp Cys Ala Met 740 745 750

gtg ccg atg ctc tat age tgg gac agg ate gcg gea gag gcc gtq acg 2783 vai Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala vai Thr 755 760 76S

tcg cag gaa etc gtc ccg gcctgagggc cgggcctgtt gteageetgc 2831

Ser Gln Glu Leu Val Pro 770

cgcagctcte ttcggc 2847

<210> 3

<211> 2325

<212> DMA

<213> Brevundimonas diminuta v22 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(2322)

<400> 3

atg act atg gct gcc aac acc gat cgc gcc gtc ttg cag gcg gcg ctg 48

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ccg ccg ctt tcc ggc age ctc ccc att ccc gaa ttg age gcg tcg gtc 96

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cct ate cag cgc gat gcc tgg ggc ate ccg eat ate aag gcc tcc ggc pro lie Gln Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala ser çíy 35 40 45

144

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ctt tte cag atg gag ctg acg cgt cgc aag gcg ctg gaa cgc gcg gcc 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 80

gaa tgg ctg ggt gcc gag gcc gcc gag gcc gat ate ctc gtg cgc cgg 288

Glu Trp Leu Giy Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu vai Arg Arg 85 90 95

ctc ggt atg gaa aaa gtc tgc cga cgc gat ttc gag gcc ctg gge gcc 336

Leu Gly Met Glu Lys vai Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala 100 105 110

gag gcg aag gac atg ctc cgg gcc tae gtc gcc gac gtg aac gea ttc 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr vai Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125

ctg gct tcc ggt gtt ccc ctg cct gtc gaa tac gga ttg ctc gga gea 432 Leu Ala Ser Gly vai Pro Leu Pro vai Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala

130 135 140

gag ccg gag ccc tgg gag cct tgg cac age ate gcg gtg atg cgc cgg 480

Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser lie Ala vai Met Arg Arg 145 150 155 160

ctg ggc ctg ctg atg ggt tcg gtc tgg ttc aag ctc tgg cgg atg ctg 528

Leu Gly Leu Leu «et Gly ser vai Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 165 170 175

gcg ctg ccg gtg gtc gga gcc gcg aat gcg ctg aag ctg cgc tat gac 576 Ala Leu Pro

gat ggc ggc Asp Gly Gly 195

vai vai Gly 180

cgc gat ttg Arg Asp Leu

Ala Ala Asn 185

ctc tgc ate Leu Cys Ile 200

Ala Leu

ccg ccg Pro Pro

Lys Leu Arg 190

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Tyr Asp

gcg gat Ala Asp

624

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ctg aag gcg Leu Lys Ala 225

gcg gat ctc Ala Asp Leu

atg ggc ggg Met Gly Gly

230

gcg acc ctg Ala Thr Leu 215

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cgg ccc Arg Pro

gat gcc Asp Ala 235

gcg gtc gat Ala Val ASp 220

gcc gat ggc Ala Giy Gly

gçg ctg

Ala Leu

ggc age Gly Ser 240

672

720

aac aac tgg Asn Asrt Trp

gcg gtc gcg Ala Val Ala 245

ccg ggc cgt Pro Gly Arg

açg gcg Thr Ala 250

acc ggc cgg Thr Gly Arg

ccg ate

Pro lie 255

768

ctc gcg ggc

Leu Ala Gly

cag cat cat Gln His His

275

ccg ggc gtg Pro Gly vai

290

tac tgc gtc Tyr Cys vai 305

gat ccg cat Asp Pro His 260

ctg gcc tgc Leu Ala Cys

ccg ggt ttt Pro Gly Phe

acc cat gcc Thr His Ala

310

cgc gtc ttc Arg Val Phe 265

gat cgc ttc Asp Arg Phe 280

ccg cat ttc Pro His Phe 295

ttc atg gac Phe Met Asp

cag ate Gln lie

gac atg ASp Met

gcg cat Ala His

att cac ile His 315

ccc ggc atg Pro Gly Met 270

ate ggc ctg ile Giy Leu 285

aac ggc aag Asn Gly Lys 300

gat ctc tac Asp Leu Tyr

tat gcc Tyr Ala

acc gtg Thr Val

gtc gcc vai Ala

ctt gag Leu Glu 320

816

864

912

960

cag ttc gcg Gln Phe Ala

ccc gcc gcc Pro Ala Ala

cgc gaa ttc Arg Glu Phe 355

gag gag ggc Glu Glu Gly 325

tgg age cgg Trp ser Arg 340

gat ate ate Asp Ile Ile

cgc agg gcg Arg Arg Ala

gac cgt ate Asp Arg Ile 345

gag acg cgc <31 u Thr Arg 360

cgg ttc Arg Phe 330

gcg gtc Ala vai

cat

His Gly

99t Gly

ggc aac gat Gly Asrt Asp

cgg ggt ggt Arg Gly Gly 350

ccc gtc ata Pro vai ile 365

ttc gag Phe Glu

335

gcc gac Ala Asp

gea ggc Ala Gly

1008

1056

1104

gat ccg cgc Asp Pro Arg 370

gag acc gat Glu Thr ASp 385

acc gtg gcg Thr vai Ala

gat ggc gea Asp Gly Ala

ctg tcc ttc Leu Ser Phe 390

cag ctc tac Gln Leu Tyr 405

gcg ctc acg Ala Leu Thr 375

gat tgc ctg Asp cys Leu

gac gcg acg Asp Ala Thr

ctg cgc Leu Arg

acg cgg

Thr Arg 395

tcg gtc cag Ser Val Glr» 380

atg ccg ggc Met Pro Gly

ttc gcc Phe Ala

gea tcg Ala Ser 400

cgc ggc Arg Gly 410

tgg ggc ctg ate gac Trp Gly Leu ile Asp 415

1152

1200

1248

cat aat ctc His Asn Leu

gtc gcc ggg vai Ala Gly 420

gat gtc ggg Asp vai Gly 425

ic tcg Iy Ser

ate ggc cat ile Gly hís 430

ctg gtc Leu Val

1296

ege gcc cgt

Arg Ala Arg 435

ccg ggc tgg Pro Gly Trp 450

gtc ccg tcc vai Pro Ser

tec ggc gag ser Gly Glu

cgc tcg cgc Arg ser Arg 440

cat gaa tgg His Glu Trp 45S

gaa aac Glu Asn

cgg ggt

Arg Gly

»

c tgg ctg Gly Trp Leu 445

tgg att ccg Trp Zle Pro 460

ccg gtg Pro vai

cac gag His Glu

1344

1392

gcg atg ccg Ala Met Pro 465

cgc gtg ate Arg vai Ile 470

gat ccg ccg Asp Pro Pro

ggc ggc Gly Gly 475

ate ate gtc Ile ile vai

acg gcg Thr Ala 480

1440

aat aat cgc gtc gtg gcc gat gac cat ccc gat tat ctc tgc acc gat

1488 Aso Asn Arg vai Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 485 490 495

tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gag ccc ate atg aag cgc ctg gtc gçc 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Pro Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510

aat ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcc gcc gcg ate cat gcc gat acg 1584 Asn pro Ala Phe Ala vai Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525

ctg tcg ccc cat gtc ggg ttg ctg cgc cgg agg ctc gag gcg ctt gga 1632 Leu ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Giy 530 535 540

gcc cgc gac gac tcc gcg gcc gaa ggg ctg agg cag atg ctc gtc gcc 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Glri Met Leu vai Ala 545 550 555 560

tgg gac ggc cgc atg gat gcg gct tcg gag gtc gcg tet gcc tac aat 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala ser Glu vai Ala Ser Ala Tyr Asn 565 570 575

gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gtg acg gac cgc age ggg ctg 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg teu vai Thri Asp Arg Ser Cly Leu 580 585 590

gag cag gcg ata tcg cat ccc ttc gcg gct gtc gcg ccg ggc gtc tca 1824 Glii Gln Ala lie Ser His Pro Phe Ala Ala vai Ala Pro Gly vai ser 595 600 605

ccg caa ggc cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg acc ctg ctg cgc gac gac 1872 Pro Gln Gly Gln vai Trp Trp Ala vai Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620

gat gcc gga atg ctg aag ggc tgg age tgg gac cag gcc ttg tet gag 1920 ASp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 640

gcc ctc tcg gtc gcg tcg cag aac ctg age cgg cga age tgg ggc gaa 1968 Ala Leu ser vai Ala ser Gln Asn Leu Ser Arg Arg ser Trp Gly Glu 645 650 655

gag cat cgg ccg cgc ttc acg cat ccg ctt gcc acg caa ttc ccg gcc 2016 Gilu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670

tgg gcg ggg ctg ctg aat ccg gct tcc cgt ccg ate ggc ggc gat ggc 2064 Trp Ala GTy Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Giy Asp Gly 675 680 685

gac acc gtg ctg gcg aac ggg ctc gtc ccg tca gcc ggg ccg cag gcg 2112 Asp Thr vai Leu Ala Asn Gly Leu vai Pro ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700

acc tat ggc gcc ctg tcg cgc tac gtc ttt gat gtc ggc aat tgg gac 2160 Thr Tyr Giy Ala Leu Ser Arg Tyr vai Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 720

aat age cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc tcc ggg cat ccg gcc age 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 725 730 735

gcc cat tat gcc gat cag aat gcg ccc tgg age gac tgt gcg atg gtg 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asrt Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met vai 740 745 750

ccg atg ctc tat age tgg gac agg ate gcg gea gag gcc gtg acg tcg 2304 Pro Ket Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala vai Thr ser 755 760 765

cag gaa ctc gtc ccg gcc tga 2325

Gln Glu Leu vai Pro Ala 770

Claims (18)

1. Beta-Iactama acilase tipo II mutante, CARACTERIZADA pelo fato de ser uma variante de um polipeptideo modelo com a atividade da beta-lactama acilase tipo II, por meio da qual a beta-lactama acilase modificada tem pelo menos uma atividade beta-lactama acilase in vitro -1,5 vez melhorada para a adipil-7-ADCA em comparação com o polipeptideo modelo com atividade da beta-lactama acilase.

2. Beta-lactama acilase tipo II mutante, CARACTERIZADA pelo fato de ser uma variante de um polipeptideo modelo com a atividade da beta-lactama acilase tipo II, por meio da qual a beta-lactama acilase tipo II modificada foi modificada em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo das posições -10, 29, 161, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, -694, 706 e 726 usando a numeração da posição de aminoácidos da seqüência de aminoácidos da SE83-acill acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1).

3. Beta-lactama acilase tipo II mutante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a beta-lactama acilase tipo II mutante foi modificada em pelo menos uma posição de aminoácido selecionada do grupo consistindo das posições 10, 29, 161, 270, 274, 280, -296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 e 726 usando a numeração da posição de aminoácidos da seqüência de aminoácidos da SE83-acill acilase de Pseudomonas (SEQ ID N°: 1).

4. Beta-lactama acilase tipo II mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptideo modelo com atividade beta-lactama acilase tipo II é selecionado do grupo consistindo de SE83-acill acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1), Nl76 (SEQ ID NO: 2) de Brevundimonas diminuta e a V22 acilase (SEQ ID NO: 3) de Brevundimonas diminuta e polipeptídeos com atividade beta-lactama acilase tipo II com uma seqüência de aminoácidos com uma identidade porcentual com a SEQ ID NO: 1 de pelo menos 70%, ou com a SEQ ID NO: 2 de pelo menos 70%, ou com a SEQ ID NO: 3 de pelo menos 70%.

5. Beta-lactama acilase tipo II mutante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptideo modelo é a SE83-acill acilase de Pseudomonas (SEQ ID NO: 1).

6. Beta-lactama acilase tipo II mutante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, CARACTERIZADA pelo fato de que a beta-lactama acilase tipo II mutante foi modificada na posição 161 preferivelmente juntamente com pelo menos uma outra modificação numa posição selecionada do grupo consistindo de 10, 29, 270, 274, 280, 296, 314, 442, 514, 589, 645, 694, 706 e 726.

7. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO pelo fato de codificar a beta-lactama acilase tipo II mutante de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

8. Cassete ou vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o polinucleotídeo da reivindicação 7.

9. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de ser transformada com o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 7 ou com o vetor ou cassete de acordo com a reivindicação 8.

10. Método de produção da beta-lactama acilase tipo II mutante de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, - 4, 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o cultivo de uma célula hospedeira de acordo co a reivindicação 9 sob condições condutivas para a produção da beta-lactama acilase tipo II mutante e a recuperação do polipeptideo.

11. Processo para a produção de um composto beta-lactama desacilado de interesse, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o passo de desacilar um precursor acilado do composto beta-lactâmico de interesse usando a beta-lactama acilase tipo II mutante de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto beta-lactama desacilado de interesse é 6-ΑΡΑ, 7-ACA, 7-ADCA, 7-ADAC ou ácido 7-amino-3-carbamoiloximetil-3-cefem-4-carboxílico.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo acil do precursor acilado do composto beta-lactâmico de interesse pertence ao grupo de ácidos dicarboxílicos, preferivelmente succinil, glutaril, adipil, alfa-cetoadipil e aminoadipil, mais preferivelmente de adipil.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12 ou 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a beta-lactama acilase tipo II mutante é usada numa forma imobilizada.

15. Uso da beta-lactama acilase tipo II mutante de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a desacilação de um precursor acilado de um composto beta-lactâmico de interesse.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto beta-lactâmico de interesse é 7-ADCA ou 7-ACA.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o precursor acilado do composto beta-lactâmico de interesse pertence ao grupo dos ácidos dicarboxílicos, preferivelmente succinil, glutaril, adipil, alfa-cetoadipil e aminoadipil, mais preferivelmente, adipil.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a beta-lactama acilase tipo II mutante é usada numa forma imobilizada.