CN101351549A - 突变体Ⅱ型β-内酰胺酰化酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及突变体II型β－内酰胺酰化酶，其是具有II型β－内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，突变体β－内酰胺酰化酶较之具有β－内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，针对己二酰－7－ADCA的体外β－内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍。

Description

突变体Ⅱ型β-内酰胺酰化酶
本发明涉及突变体II型β-内酰胺酰化酶(acylase)、编码所述酶的多肽以及经所述多肽转化的微生物和生产所述突变体II型β-内酰胺的方法。本发明还涉及使用本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶来生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺。
β-内酰胺抗生素构成了抗生物化合物的最重要的组，其临床应用已有很长的历史。在该组中，突出的有青霉素和头孢菌素。青霉素是多种有丝真菌，例如，Penicillium(例如P.chrysogenum)天然生产的。头孢菌素是多种微生物，例如Acremonium(例如，A.chrysogenum)和Streptomyces(例如，Streptomyces clavuligerus)天然生产的。
作为经典菌株改进技术的结果，过去数十年来，P.chrysogenum和A.chrysogenum中的抗生素生产水平也显著增加。随着对产生青霉素和头孢菌素的生物合成途径的了解逐渐增加以及重组DNA技术的出现，已经可以用新的工具来改进生产菌株。
β-内酰胺生物合成中涉及的很多酶已被鉴定出来，它们对应的基因也已被克隆，如Ingolia and Queener，Med Res Rev(1989)9：245-264(生物合成途径和酶)以及Aharonowitz，Cohen，and Martin，Ann Rev Microbiol(1992)46：461-495(基因克隆)所述。
P.chrysogenum中对青霉素进行生物合成的前两个步骤是三个氨基酸L-5-氨基-5-羧基戊酸(L-αα-氨基己二酸)(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)缩合为三肽LLD-ACV，接着是该三肽环化为异青霉素N的形式。该化合物含有典型的β-内酰胺结构。第三个步骤涉及通过酰基转移酶(AT)的作用用疏水侧链代替L-5-氨基-5-羧基戊酸的亲水侧链。
在EP-A-0448180中描述，AT介导的酶促交换反应在细胞内的细胞器——微体中发生。可通过表达脱乙酰氧头孢菌素C合酶(EC 1.14.20.1-DAOCS，在本文中还被称为扩环酶(expandase))的非前驱(non-precursed)P.chrysogenum转化子形成相当大量的脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC)，这一现象暗示了显著量的青霉素N——扩环酶天然底物在P.chrysogenum中的存在(Alvi et al.，J Antibiot(1995)48：338-340)。但是，DAOC的D-α-氨基-己二酰基侧链不能被容易地去除。
头孢菌素比青霉素贵得多。一个原因在于，一些头孢菌素(例如头孢氨苄(cephalexin))是通过多次化学转化从青霉素制得的。另一原因在于，目前仅具有D-α-氨基-己二酰基侧链的头孢菌素才能被发酵。在这方面最重要的起始材料——头孢菌素C在任何pH下都易溶于水，因此，这暗示要使用麻烦且昂贵的柱技术来进行长且浪费的分离工艺。还必须经过多次化学和酶促转化，将以这种方式获得的头孢菌素C转化为治疗用的头孢菌素。
目前工业界偏好用来制备7-氨基-脱乙酰氧头孢烷酸(7-ADCA)的方法涉及复杂的化学步骤，对青霉素G进行扩环和衍生化。生产7-ADCA的一个必要的化学步骤涉及将5元青霉素环结构扩环为6元头孢菌素环结构(见，例如US 4,003,894)。该复杂的化学加工既昂贵又对环境有害。因此，人们很想用酶促反应(例如酶促催化，优选地，在发酵期间进行的)来代替此类化学过程。通过生物学过程来代替化学扩环过程的关键是头孢菌素生物合成途径中的中枢酶——扩环酶。来自细菌Streptomycesclavuligerus(S.clavuligerus)的扩环酶被发现能在一些情况下进行青霉素环扩展。当将其引入P.chrysogenum时，其能将青霉素环结构转化为头孢菌素环结构，如Cantwell et a1.，Proc R Soc Lond B(1992)248：283-289所述。鉴于扩环酶能催化青霉素N的5元噻唑烷环扩环为DAOC的6元二氢噻嗪环，因此从逻辑上讲该酶当然将是代替化学工艺中环扩展步骤的候选者。但不幸的是，该酶作用于头孢菌素生物合成途径的青霉素N中间产物，而在通过P.chrysogenum生产的容易获得的便宜的青霉素(例如青霉素V或青霉素G)上却没有作用或者非常低效。青霉素N并不能商业获得，甚至当其被扩环时，其D-α-氨基-己二酰基侧链都不能被青霉素酰化酶容易地除去。
已有报道，扩环酶能将具有特定侧链的青霉素扩环为对应的7-ADCA衍生物。扩环酶的这一特征被用于WO93/05158、WO95/04148和WO95/04149公开的技术中。在这些公开文本中，通过在经扩环酶基因转化过的重组Penicillium chrysogenum菌株中对某些6-氨基青霉烷酸(6-APA)衍生物进行体内转化，来代替将青霉素G体外转化为7-ADCA的传统化学转化。更具体地，WO93/05158教导了扩环酶在P.chrysogenum中的体内使用，这与作为储备的己二酰基侧链(也被称为己二酰基)组合，所述侧链是P.chrysogenum中酰基转移酶的底物。这导致了己二酰-6-APA的形成，己二酰-6-APA被引入P.chrysogenum菌株的扩环酶转化，产生了己二酰-7-ADCA，其被真菌细胞排进周围培养基。
在随后的步骤中，可通过化学方法或通过酰化酶酶促切掉对应的7-ADCA衍生物的侧链，由此产生7-ADCA和对应的侧链。文献中已提到多种类型的微生物可用作为酰化酶产生菌株，用于对通过发酵获得的β-内酰胺衍生物脱酰基化。此类生产酰化酶的微生物的例子是Escherichia coli、Kluyvera citrophila、Proteus rettgeri、Pseudomonas sp.、Alcaligenesfaecalis、Bacillus megaterium、Bacillus sphaericus和Arthrobacter viscosus种的某些菌株。
根据文献，基于其分子结构和底物特异性而言，可以考虑若干种类型的酰化酶(Vandamme E.J.Penicillin acylases and beta-lactamases″In：″Microbial Enzymes and Bioconversions″E.H.Rose(Ed.)，EconomicMicrobiology 5(1980)467-552，Acad.Press，New York)。
I型酰化酶是对青霉素V特异性的。这些酶由四个相同的亚基构成，每个亚基具有35kDa的分子量。来自Bacillus sphaericus的克隆基因的完整核苷酸序列已被报道(Ollson A.Appl.Environm.Microb.(1976)，203)。
II型酰化酶都共享下述共有的分子结构：这些酶是小α-亚基(20-25kDa)和大β-亚基(60-65kDa)构成的异二聚体。在底物特异性方面，II型酰化酶可被进一步分为两组。
IIA型酰化酶对青霉素G非常特异，因此通常被称为青霉素酰化酶。通常，它们对邻近酰胺基氮原子的基元(这可能是头孢霉素核(cephem)基团、青霉烯(penem)基团、氨基酸等)并不太特异，但是对底物的酰基基元有底物特异性。该酰基基元必须非常疏水，其优选是苯甲基或(短)烷基。不被IIA型酰化酶水解的底物的例子是具有二羧酸作为酰基基元的那些：琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基和氨基己二酰基，CefC的侧链。IIA型酰化酶的例子是来自Escherichia coli、Kluyvera citrophila、Proteus rettgeri和Alcaligenes faecalis的酶。
已有报道，IIB型酰化酶能将具有琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基和α-酮己二酰基作为酰基基元的头孢菌素(包括脱乙酰氧衍生物)以及甚至CefC水解至非常有限的程度。还可基于氨基酸序列同源性，将该IIB型酰化酶的组再分为两组。这些亚组在本文中被定义为SY77组和SE83组，它们是因为分别来自Pseudomonas SY77和Pseudomonas SE83-acyII的酰化酶得名的。
Matsuda et al(J.Bacteriol(1985)，163，1222已经对编码SY77-酰化酶的基因进行克隆及测序，其表明，该酶对戊二酰-7-ACA具有活性，但是对琥珀酰-7-ACA和己二酰-7-ACA的活性要少得多。SY77-前体的三维结构是已知的(J.Biol.Chem.(2002)，277，2823)。
此后，Matsuda et al.(J.Bacteriol(1987)，169，5815和J.Bacteriol.(1987)，169，5821)对编码SE83-acyII酰化酶的基因进行了克隆和测序，其表明，该酶对戊二酰-7-ACA、己二酰-7-ACA、琥珀酰-7-ACA和CEFC(头孢菌素C)具有活性(降序排列)。与SE83相关的所有研究都集中于酶水解70ACA衍生物的能力，特别是水解CEFC的能力。
在WO91/16435中已显示，SY77和SE83-acyII之间的氨基酸同源性非常低：酰化酶的α-亚基大约25％，β-亚基大约28％。
WO9512680公开了来自Brevundimonas diminuta的另一种SE83组的酰化酶，其被命名为N176，其与SE83-acyII大约94％同源，并且针对其CEFC-酰化酶活性进行了测试。SE83组的第三个成员是来自Brevundimonas diminuta V22的V22。这三种酰化酶的氨基酸序列由Aramori et al在Journal of Fermentation and Bioengineering 72，232-243(1991)中公开。表1显示了SE83组的多种IIB型酰化酶氨基酸序列的全长序列同一性矩阵。
表1
 Type-IIB酰化酶  SE83acyii  N176  V22
 SE83acyii  100  94  93
 N176  94  100  98
 V22  93  98  100
已经有若干种尝试，企图增加数种现有酰化酶的CEFC-酰化酶活性：WO2005014821公开了SE83-酰化酶的突变体，EP-A-1553175公开了N176-酰化酶的突变体，所有突变体都是为了提高CEFC-酰化酶活性。提到的参考文献都没有关注对感兴趣的其它酰化β-内酰胺化合物(例如己二酰-7-ADCA)的脱酰基化反应的改进。因此，人们仍迫切需要下述酰化酶，其具有针对己二酰-7-ADCA的提高的脱酰基化活性，并且可有利地用于从己二酰-7ADCA(例如，通过对经转化的Penicillium菌株发酵生产的)来生产7-ADCA的工艺。
图1：对β-内酰胺酰化酶——来自Pseudomonas SE83的II型SE83-acyii(SEQ ID No.1)、来自Brevundimonas diminuta N-176的N176(SEQID No.2)和来自Brevundimonas diminuta V22的V22(SEQ ID No.3)的氨基酸序列进行的多比对。
图2：在pH＝8.8和30℃(图2a)下以及pH＝9.5和40℃(图2b)下，通过固定的酰化酶对己二酰-7-ADCA的转化。Peudomonas SE83ACYii野生型的固定的酰化酶(实线)和突变体L161T固定的酰化酶(虚线)。速率(ml KOH/分钟，Y轴上)被作为百分比转化率(％，X轴上)的函数作图。
在第一个方面，本发明提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，突变体β-内酰胺酰化酶较之具有β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍。在材料和方法章节对针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性的测定进行了详细描述。更优选地，突变体II型β-内酰胺酰化酶的针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少2倍，更优选地，至少2.5倍，更优选地，至少3倍，更优选地，至少4倍，更优选地，至少5倍，更优选地，至少6倍，更优选地，至少7倍，更优选地，至少8倍，更优选地，至少9倍，更优选地，至少10倍，更优选地，至少11倍。
在本发明的上下文中，“改变的或突变体II型β-内酰胺酰化酶”指具有酰化酶活性的、并非从天然来源获得的并且其氨基酸序列与天然II型β-内酰胺酰化酶的完整氨基酸序列有所不同的任何酶。
本发明还提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在选自第161、270、296、442和589位构成的组或第10、29、274、280、314、514、645、694、706和726位构成的组或第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位构成的组或第10、29、270、274、280、442、514、589、645、694和726构成的组的氨基酸位置上经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
更优选地，本发明还提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，突变体β-内酰胺酰化酶较之具有β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍，更优选地，至少2倍，更优选地，至少2.5倍，更优选地，至少3倍，更优选地，至少4倍，更优选地，至少5倍，更优选地，至少6倍，更优选地，至少7倍，更优选地，至少8倍，更优选地，至少9倍，更优选地，至少10倍，更优选地，至少11倍，并且，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在选自第161、270、296、442和589位构成的组或第10、29、274、280、314、514、645、694、706和726位构成的组或第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位构成的组或第10、29、270、274、280、442、514、589、645、694和726构成的组的氨基酸位置上经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
本发明优选提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在第10位或至少在第29位，至少在第161位或至少在第270位或至少在第274位或至少在第280位或至少在第296位或至少在第314位或至少在第442位或至少在第514位或至少在第589位或至少在第645位或至少在第694位或至少在第706位或至少在第726位经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。在本发明的一种实施方式中，提供了在第161位或第296位具有单种修饰的突变体II型β-内酰胺酰化酶。
本发明还提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在位置161+270的组合或至少在位置161+296的组合或至少在位置161+442的组合或至少在位置161+589的组合或至少在位置270+296的组合或至少在位置270+442的组合或至少在位置270+589的组合或至少在位置296+442的组合或至少在位置296+589的组合或至少在位置442+589的组合或至少在位置161+270+296的组合或至少在位置161+270+442的组合或至少在位置161+270+589的组合或至少在位置161+296+589的组合或至少在位置296+442+589的组合或至少在位置161+296+442的组合或至少在位置161+296+589的组合或至少在位置296+442+589的组合或至少在选自161、270、296、442和589构成的组的4个位置的任何组合或至少在位置161、270、296、442和589的组合处经过修饰，并且，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶可能在除了这些位置或前述所有可能的其组合处之外的其它氨基酸位置具有修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
本文中使用的具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽选自由下列多肽构成的组：具有II型β-内酰胺酰化酶活性且优选具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列(即，Pseudomonas的种SE83的SE83-acyII酰化酶)或具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(即，Pseudomonas的种N176的N176酰化酶)或具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列(即，Brevundimonas diminuta V22的V22酰化酶)的多肽和具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列的且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽。作为用于本发明的具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，更优选的是具有II型β-内酰胺酰化酶活性，并且具有SEQID NO：1的氨基酸序列或具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列的多肽。作为具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽而言，最优选的是Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶(SEQ ID NO：1)  。
本发明优选提供了选自下述组的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体，所述组由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶，以及具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽构成，并且，所述突变体具有至少在第10位或至少在第29位，至少在第161位或至少在第270位或至少在第274位或至少在第280位或至少在第296位或至少在第314位或至少在第442位或至少在第514位或至少在第589位或至少在第645位或至少在第694位或至少在第706位或至少在第726位上的修饰。在一种实施方式中，本发明提供了下述突变体II型β-内酰胺酰化酶，其在第161位或第296位具有单种修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
在氨基酸位置上的修饰可包含另外的氨基酸(选自天然存在的20种L-氨基酸的组，见表1)的取代。或者，氨基酸位置上的修饰可包含所述位置上氨基酸的缺失。此外，氨基酸位置上的修饰可包含对所述氨基酸C-末端侧或N-末端侧一个或多个氨基酸的取代。
表1
氨基酸 三字母编码  单字母编码
丙氨酸 Ala  A
精氨酸 Arg  R
天冬酰胺 Asn  N
天冬氨酸 Asp  D
半胱氨酸 Cys  C
谷氨酸 Glu  E
谷氨酰胺 Gln  Q
甘氨酸 Gly  G
组氨酸 His  H
异亮氨酸 Ile  I
亮氨酸 Leu  L
赖氨酸 Lys  K
甲硫氨酸 Met  M
苯丙氨酸 Phe  F
脯氨酸 Pro  P
丝氨酸 Ser  S
苏氨酸 Thr  T
色氨酸 Trp  W
酪氨酸 Tyr  Y
缬氨酸 Val  V
本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶，优选地，选自具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体可能携带一种或多种下述修饰：
◆第10位上的谷氨酸(SEQ ID NO：1)或丙氨酸(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)被带正电荷的氨基酸残基(例如赖氨酸或精氨酸)或具有α-螺旋形成的构象偏好的小氨基酸残基(例如丙氨酸)取代，优选被赖氨酸取代；
◆第29位上的丝氨酸被具有芳香族(样)侧链的氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)或具有更大的不带电荷的极性侧链或带正电荷的侧链的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸和赖氨酸)取代，优选被天冬酰胺或苯丙氨酸取代；
◆第161位上的亮氨酸被更小且更具极性的氨基酸(例如苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸和半胱氨酸)或在pH＝9左右带正电荷的氨基酸(例如精氨酸和赖氨酸)取代，优选被丝氨酸或苏氨酸或甘氨酸取代，最优选被苏氨酸取代；
◆第274位上的组氨酸被至少在侧链γ位含有碳、氧或硫原子并且尺寸比组氨酸要小的氨基酸残基(例如亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、缬氨酸和脯氨酸)取代，优选被亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；
◆第280位上的精氨酸被由负电荷取代了正电荷的氨基酸残基(例如天冬氨酸和谷氨酸)或被具有不分支且不带电荷的极性侧链的氨基酸残基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺和丝氨酸)取代，优选被谷氨酰胺和天冬酰胺取代，最优选被谷氨酰胺取代；
◆第296位上的组氨酸被带电荷的或极性的氨基酸或能代替模型酰化酶中已有的键合到组氨酸残基的N-δ或N-ε原子上的氢键的氨基酸残基取代，例如，被天冬酰胺和谷氨酰胺取代，优选被谷氨酰胺取代；
◆第314位上的异亮氨酸被具有β-分支的更小的氨基酸残基(例如缬氨酸)或具有中等大小的极性侧链的氨基酸残基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸)取代，优选被缬氨酸或谷氨酰胺取代；
◆第442位上的谷氨酸被没有疏水侧链或具有小疏水侧链的氨基酸残基(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)取代，优选被甘氨酸取代；
◆第514位上的脯氨酸被具有更具极性和/或更具柔性的侧链(能带来额外的氢键)的氨基酸残基(例如谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)取代，优选被谷氨酰胺取代；
◆第589位上的精氨酸被在某些环境下能保持正电荷的氨基酸残基(例如组氨酸和赖氨酸)或被具有能形成氢键的芳香族侧链的氨基酸残基(例如酪氨酸和色氨酸)或被能代替模型酰化酶中已有的键合到组氨酸残基的N-δ或N-ε原子上的氢键的氨基酸残基(例如天冬酰胺和谷氨酰胺)取代，优选被组氨酸取代；
◆第645位上的丙氨酸被具有对β-链形成的增加的偏好的小氨基酸残基(例如苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和亮氨酸)取代，优选被苏氨酸取代；
◆第694位上的天冬酰胺被具有小于天冬酰胺的侧链的氨基酸残基(例如丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和甘氨酸)取代，优选被苏氨酸取代；
◆第706位上的酪氨酸被没有侧链或具有比亮氨酸小的侧链的氨基酸残基(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和脯氨酸)取代，优选被甘氨酸取代；
◆第726位上的缬氨酸被具有更大疏水侧链的氨基酸残基(例如异亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸)取代，优选被异亮氨酸取代。
本发明的高度优选的实施方式是选自下述组的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体，所述组由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶，以及具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽构成，并且，所述突变体携带下述修饰中之一：H296Q、L161G、L161S或L161T。
本发明的更加高度优选的实施方式是选自下述组的模型II型β-内酰胺酰化酶的突变体，所述组由具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的酰化酶和具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的酰化酶，以及具有与SEQ ID NO：1有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：3有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的百分比同一性的氨基酸序列且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽构成，并且，所述突变体携带位置上突变。最优选的是下述突变体酰化酶，其在下述2个位置的组合处具有修饰：[161+10]、[161+29]或[161+694]或[161+726]或[161+274]或[161+706]或[161+442]或[161+589]或[161+314]，或在下述3个位置的组合处：[161+29+274]、[161+29+706]、[161+29+514]、[161+274+589]或[161+274+706]，或在下述4个位置的组合处：[161+29+274+726]、[161+274+280+314]，或在下述5个位置的组合处：[161+29+274+314+694]、[161+274+280+514+726]，或在下述6个位置的组合处具有修饰：[161+29+280+314+645+726]。
本发明优选提供了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶(SEQ ID NO：1)的突变体，其具有至少在位置L161+M270的组合上或至少在位置L161+H296的组合上或至少在位置L161+E442的组合上或至少在位置L161+R589的组合上或至少在位置M270+H296的组合上或至少在位置M270+E442的组合上或至少在位置M270+R589的组合上或至少在位置H296+E442的组合上或至少在位置H296+R589的组合上或至少在位置E442+R589的组合上或至少在位置L161+M270+H296的组合上或至少在位置L161+M270+E442的组合上或至少在位置L161+M270+R589的组合上或至少在位置L161+H296+R589的组合上或至少在位置H296+E442+R589的组合上或至少在位置L161+H296+E442的组合上或至少在位置L161+H296+R589的组合上或至少在位置H296+E442+R589的组合上或至少在选自L161、M270、H296、E442和R589构成的组的4个位置的任何组合上或至少在位置L161、M270、H296、E442和R589的组合上的修饰，并且，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶可能在除了这些位置或前述所有可能的其组合处之外的其它氨基酸位置上具有修饰。本发明的高度优选的实施方式是实施例中表2-5的Pseudomonas SE83-AcyII突变体。
在第二个方面，本发明提供了编码本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶的多核苷酸。本发明还提供了编码所述突变体II型β-内酰胺酰化酶的α-亚基的多核苷酸以及编码所述突变体II型β-内酰胺酰化酶的β-亚基的多核苷酸。WO2005/014821在第8页和第9页公开：编码SE83-组的酰化酶的基因编码由α-亚基、间隔肽和β-亚基(按该顺序)构成的多肽。在宿主细胞中经历转录和翻译之后，源自Pseudomonas sp.SE83的酰化酶以大小为大约84kDa的非活性单链多肽的形式产生。之后，SEQ ID NO：1的氨基酸序列中第230和第231位以及第239和第240位上的氨基酸之间发生两次自消化，这导致除去了由9个氨基酸构成的间隔肽，并将其分离为25kDa的α-亚基和58kDa的β-亚基。一个α-亚基和一个β-亚基通过疏水相互作用结合，形成大约83kDa的具有酰化酶活性的异二聚体。如技术人员所公知的，编码N-末端甲硫氨酸的第一个密码子(ATG)是在原核生物中进行蛋白合成期间翻译起始所必需的。甲硫氨酸在翻译后被去除。
根据本发明的编码突变体II型β-内酰胺酰化酶或α-亚基或β-亚基的多核苷酸可以是编码根据本发明的合适的氨基酸序列的任何多核苷酸。或者，本发明的多核苷酸可包含这样的编码序列，其中，针对多种氨基酸的密码子使用源自Pseudomonas中的密码子使用。例如，可对密码子使用加以改变，使其适合将或已用编码改变的II型β-内酰胺酰化酶的DNA片段转化的特定宿主细胞的密码子使用。
在第三个方面，本发明提供了包含前文定义的本发明多核苷酸的表达载体或表达盒。
在第四个方面，本发明提供了经转化的宿主细胞，其是用本发明的多核苷酸或本发明的表达载体或表达盒转化过的。经转化的宿主细胞可用于生产本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶。
用于生产本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶的宿主细胞优选是本领域已知能细胞外或细胞内高效生产蛋白或酶的那些宿主细胞，例如，微生物，例如真菌、酵母和细菌。优选的宿主细胞的例子包括但不限于下述属：Aspergillus(例如A.niger、A.oryzea)、Penicillium(例如P.emersonii、P.chrysogenum)、Saccharomyces(例如S.cerevisiae)、Kluyveromyces(例如K.lactis)、Bacillus(例如B.subtilis、B.licheniformis、B.amyloliquefaciens)、Escherichia(E.coli)、Streptomyces(例如S.clavuligerus)、Pseudomonas。
在第五个方面，本发明提供了生产本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶的工艺，所述工艺包括在有益于生产突变体扩环酶的条件下培养经转化的宿主细胞，以及可选地，回收所述突变体扩环酶。
在第六个方面，本发明提供了生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺，所述工艺包括使用本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶对感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的步骤。感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物可以是天然存在的青霉素或头孢菌素的衍生物，例如，6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC、7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸(例如WO2004/106347)等。优选地，感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA，最优选是7-ADCA。感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体可具有属于二羧酸构成的组的酰基。优选的酰基是琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、α-酮己二酰基和氨基己二酰基。更优选的是己二酰基和氨基己二酰基，高度优选的是己二酰基。优选的感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、氨基己二酰-7-ADCA和氨基己二酰-7-ACA，后者作为CEFC已知；最优选的是己二酰-7-ADCA。
本发明用于生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺可以以分批模式进行，其中，突变体II型β-内酰胺酰化酶在包含感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体的溶液中以溶解状态使用。
更优选地，突变体II型β-内酰胺酰化酶作为被固定的形式使用。其好处在于，完成脱酰基化反应后可回收突变体II型β-内酰胺酰化酶，并将其重新用于进一步的脱酰基化反应。以这种方式，使用突变体II型β-内酰胺酰化酶的成本可显著降低，由此增加脱酰基化的经济吸引力。用于脱酰基化反应的条件以及对酶的固定是现有技术已知的(例如，Kallenberg，A.I.etal.Adv.Synth.Catal.(2005)，347，905-926)。
在第七个方面，本发明涉及本发明的突变体II型β-内酰胺酰化酶用于生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺中的用途，所述工艺包括对感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的步骤。感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物可以是天然存在的青霉素或头孢菌素的衍生物，例如，6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC、7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸等。优选地，感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA，最优选是7-ADCA。感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体可具有属于二羧酸构成的组的酰基。优选的酰基是琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、α-酮己二酰基和氨基己二酰基。更优选的是己二酰基和氨基己二酰基，高度优选的是己二酰基。最优选的感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体是己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ACA、己二酰-7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸、α-酮己二酰-7-ADCA、α-酮己二酰-7-ACA、氨基己二酰-7-ADCA和氨基己二酰-7-ACA，后者作为CEFC已知。本发明用于生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺可以以分批模式进行，其中，突变体II型β-内酰胺酰化酶在包含感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体的溶液中以溶解状态使用。更优选地，突变体II型β-内酰胺酰化酶以被固定的形式使用。
材料和方法
制备酰化酶
将具有wt基因或突变体基因的质粒转入E.coli Top 10细胞(Invitrogen)。使用20ml 2xTY培养基(含有50μg/ml Zeocine)，在37℃和280rpm下，在100ml瓶中接种细胞。24小时后，以1∶1000向具有100ml 2xTY培养基、50μg/ml Zeocine和0.05％阿拉伯糖的瓶中接种50μl培养物，在25℃和280rpm下培养。对培养物进行离心，冷冻于-20℃。为制备不含细胞的提取物，将沉淀团重新悬浮于提取缓冲液(50mM Tris/HCL、0.1mg/ml DNAse1、2mg/ml Lysozyme、10mM DTT(二硫苏糖醇)、5mM MgSO4)中，并进行孵育。30分钟后，对提取物进行离心，含有酰化酶活性的上清液被用于进行活性测量。
使用SDS-PAGE凝胶电泳和分析性HPLC尺寸排除色谱(在TSK3000SWxl柱上，用0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)作为洗脱剂来进行)来测定酰化酶含量。应用的色谱条件：流速1.0ml/分钟，在280nm处检测。通过比较观察到的酰化酶的峰的面积，可对不同样品的蛋白含量进行比较。使用154350(M-1.cm-1)的摩尔消光系数，从OD280来计算酰化酶蛋白含量。HPLC色谱有其它峰的情况下，针对其它峰的作用对样品的E280值加以校正。
纯化
将来自100ml培养物的细胞沉淀团重新悬浮于1ml 20mM Tris pH 8中。在冰上以10μ的振幅进行9×10秒的超声波处理(Soniprep 150 I-BU03)后，在微离心管中于14000rpm和4℃下对细胞悬浮液进行5分钟的离心。用0.1M HCl将上清液调节为pH 5.3-5.4之后，对其进行离心，以除去沉淀。随后，用NaOH将上清液滴定回pH＝8。大约100-400μl被加到1ml MonoQ柱(用含有10％NaCl的20mM Tris pH8平衡过)上。洗脱期间按照下文所述来混合缓冲液A(20mM Tris pH8)和缓冲液B(20mM Tris pH8+1M NaCl)：0-1分钟，10％B/90％A；1-5分钟，20％B/80％A；5-9分钟，40％B/60％A；9-12分钟，60％B/40％A；12-15分钟，100％B。收集含有酰化酶活性的峰级分，加到凝胶过滤柱TSKGel3000SWxl上，该柱已用100mM磷酸钠缓冲液pH 7平衡过。收集峰级分，储藏起来以备后用。
试剂
可按照WO9848037所述，通过酶促合成，从己二酸和7-ADCA来制备己二酰-7-ADCA。此外，可按照Shibuya et al.在Agric.Biol.Chem.，1981，45(7)，1561-1567中所述，但从己二酸酐开始(代替戊二酸酐)，通过化学合成来制备己二酰-7-ADCA。
在合适的缓冲液中制备己二酰-7-ADCA底物的8％(w/v)贮液，用4N NaOH将其调节至想要的pH。
通过将200mg 4-(二甲基氨基)-苯甲醛(p-DMBA)溶解于100ml柠檬酸(溶解于1升乙醇中的315.5g柠檬酸单水合物)中，来新鲜制备颜料试剂。
在0.2M CHES缓冲液(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)中，于pH 8.0至pH 10.0的范围内进行活性测量，如果需要的话，用4N HCl或4N NaOH将所述缓冲液调节至想要的pH。
测量酰化酶活性
将180μl合适的缓冲液与200μl处于相应缓冲液中的底物贮液和20μl酶溶液混合，在想要的温度下孵育20分钟，如无特别指明的话，通常是在室温下孵育。加入600μl颜料试剂来停止反应。室温下10分钟后，在415nm处测量吸光度。通过在加入酶之前就向检验体系中加入颜料溶液来进行空白测量。酰化酶活性被计算为每分钟光密度(OD)的增加(δOD/分钟)。为计算绝对活性，使用每升0.1至1g 7-ADCA范围内的7-ADCA校正线。
KM测定和pH曲线。
按照所述的检验来进行KM测定。但是，己二酰-7-ADCA浓度在0.5至4％(w/v)己二酰-7-ADCA之间变化。
实施例
实施例1 SE83 ACYii突变体的酰化酶活性
用己二酰-7-ADCA作为底物，在pH＝8.5和pH＝9.5时测量突变体的酰化酶活性。结果示于表2中。
表2：野生型和突变体酰化酶对己二酰-7-ADCA的相对活性，将pH＝8.5时野生型的活性设定为1。括号中是pH＝9.5时相对于野生型活性的活性。在室温下进行检验。在存在4％(w/w)己二酰-7-ADCA时测量起始速。
Figure A20068005011500211
在pH＝8.5以及pH＝9.5时，突变体的活性较之野生型酰化酶显著更高。此外，当将pH＝9.5时的活性与pH＝8.5时的活性相比时，明显可见，突变体酰化酶在pH 9.5的活性较之野生型相对更高。突变体的pH活性曲线向更高的pH迁移，这使得这些突变体特别适合在升高的pH下使用。这点特别重要，因为转化产率将在更高的pH下增加，这是由于热力学平衡更进一步朝向完成水解反应的方向。
鉴于在己二酰-7-ADCA向7-ADCA和己二酸转化的过程中，后者的浓度将增加，因此，产物抑制可能会降低在初始速率条件下测量到的突变体的提高效果。因此，在存在1.5％(w/v)的己二酸时，测量野生型和突变体酰化酶的活性。表3显示，在这些条件下，在pH＝8.5以及pH＝9.5时，突变体的活性较之野生型也显著更高。这些突变体的pH活性曲线没有迁移到更高的pH。
使用己二酰-7-ADCA作为底物，在pH＝8.6、pH＝9.1和pH＝9.5时，存在1.5％(w/v)的己二酸时，测定野生型和突变体酰化酶的酰化酶活性。结果如表4所示。
表4显示，在pH＝8.6、pH＝9.1和pH＝9.5时，突变体的活性较之野生型酰化酶显著更高。当将pH＝9.1时的活性提高与pH＝8.6时的活性提高相比时，明显可见，突变体酰化酶在pH 9.1的活性较之野生型提高更显著。突变体的pH活性曲线向更高的pH迁移，这使得这些突变体特别适合在升高的pH下使用。当将pH＝9.5与pH＝8.6相比时，大多数突变体酰化酶的活性相对野生型而言在pH＝9.5时仍比pH＝8.5时提高更多。
表3：野生型和突变体酰化酶对己二酰-7-ADCA的相对活性，将pH＝8.5时野生型的活性设定为1。括号中是pH＝9.5时相对于野生型活性的活性。在室温下进行检验。在存在4％(w/w)己二酰-7-ADCA时测量起始底物浓度。在存在1.5％(w/v)己二酸时测量起始活性。
表4：野生型和突变体酰化酶对己二酰-7-ADCA的相对活性，将pH＝8.6时野生型的活性设定为1。括号中是分别在pH＝9.1和pH＝9.5时相对于野生型活性的活性。在室温下进行检验。在存在2％(w/w)己二酰-7-ADCA时测量起始底物浓度。在存在1.5％(w/v)己二酸时测量起始活性。
Figure A20068005011500231
实施例2通过对SE83 ACYii突变体的K M 测量指示底物亲和性
表5显示了针对多种突变体测得的相对于野生型的KM值。Michaelis常数KM代表当酶以其最大速度的50％运作时的底物浓度。在低于KM的底物浓度下，酶会更慢，而在高于KM的底物浓度下，酶会运作得更快，直到在高底物浓度下酶完全饱和并且以最大速度运作。在酶促转化的终点(此时底物耗尽)，低KM是关键的，以保持相当的活性。在突变体的相对KM值＜1.00时，这表示在更低的底物浓度(例如在转化终点)时，突变体相对野生型而言在保持相对较高的活性方面具有优势。
表5：以相对KM值表示的相对底物亲和性。使用前文所述的检验来进行KM测定。己二酰-7-ADCA的浓度在0.5至4％己二酰-7-ADCA之间变化。
Figure A20068005011500251
实施例3被固定的SE83 ACYii突变体的酰化酶活性
按照WO97/04086所述，使用明胶和壳多糖作为胶凝剂，戊二醛作为交联剂，来进行固定。通过在温度和pH受控的100ml反应器中进行对己二酰-7-ADCA的完全水解，来测量被固定的野生型酰化酶和突变体酰化酶的表现。以3.2％己二酰-7-ADCA进行实验。以使得能在想要的条件下在120分钟内获得至少90％的转化的方式，来提供被固定的酶。在pH＝8.8和30℃以及pH＝9.5和40℃下进行转化。用同样的量(重量)的野生型和突变体酰化酶来进行转化。反应期间，通过加入1M KOH溶液使pH保持恒定。被固定的酰化酶的活性被表示为每分钟的KOH ml数。在图2a和图2b中，显示了作为转化率函数的速率(其被表示为每分钟的ml KOH)。
在pH＝8.8和30℃时取六次的平均。转化的最初30％的数据不包括在内，因为系统还没有完全稳定，使得数据大为发散。在pH＝9.5和40℃时取两次的平均。因此，变动更大。但是，计算出的斜率给出了对活性的良好指示。图2a和图2b显示，整个转化期间，突变体酰化酶的活性都显著更高。
通过用同一批被固定的酰化酶，测量随后20次180分钟的转化率，来测定被固定的酰化酶的稳定性。测量每次孵育中转化的30至50％之间的速率。被固定的酰化酶的残余活性在本文中被定义为相对于第一次孵育而言在第20次孵育时的活性。
表6概括了结果。观察到，特别是在能使水解反应的动力学平衡迁移为更完全的转化的条件下(高温和高pH下)，经突变酰化酶的稳定性较之野生型显著提高。
作为经突变的酰化酶的这种更高的水解活性和更高的稳定性的结果，每克经突变的酰化酶的生产能力也相当大地增加。
表6：在指出的条件下进行20次转化后的残余活性。
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120>突变体酰化酶
<130>24988WO
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>3141
<212>DNA
<213>Pseudomonas sp.SE83
<220>
<221>CDS
<222>(562)..(2886)
<400>1
aagcttgcga tcgcggacgc cgctgccgcc ctgaagaaga ccgcctacaa gggcgagccg     60
gtggtcttcc tgacggtcgc cgggtcgatc tcgcagacgg ccggcgcggt tctggccagc    120
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gcaacgaggt ccagacagag a atg acg atg gcg gcc aag acc gat cgc gag      591
                        Met Thr Met Ala Ala Lys Thr Asp Arg Glu
                        1               5                   10
gcc ctg cag gcg gcg ctg ccg ccg ctt tcc ggc agc ctc tcc att ccc      639
Ala Leu Gln Ala Ala Leu Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro
                15                  20                  25
gga ttg agc gcg ccg gtc cgt gtc cag cgc gat ggc tgg ggc atc ccg      687
Gly Leu Ser Ala Pro Val Arg Val Gln Arg Asp Gly Trp Gly Ile Pro
            30                  35                  40
cat atc aag gcc tcg ggc gag gcc gat gcc tat cgc gcg ctg ggc ttc      735
His Ile Lys Ala Ser Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe
        45                  50                  55
gtc cat gcg cag gac cgc ctt ttc cag atg gaa ctg acg cgc cgc aag    783
Val His Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys
    60                  65                  70
gcg ctg ggt cgc gcg gcc gaa tgg ctg ggc gcc gag gca gcc gag gcc    831
Ala Leu Gly Arg Ala Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala
75                  80                  85                  90
gat atc ttg gtg cgc cgg ctc ggc atg gaa aaa gtc tgc cgg cgc gat    879
Asp Ile Leu Val Arg Arg Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp
                95                  100                 105
ttc gag gcc ctg ggt gcc gag gcg aag gac atg ctg cgg gcc tat gtc    927
Phe Glu Ala Leu Gly Ala Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val
            110                 115                 120
gcc ggc gtg aac gcg ttc ctg gct tcc ggt gct cct ttg ccc atc gaa    975
Ala Gly Val Asn Ala Phe Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu
        125                 130                 135
tat ggc ctg ctc ggc gcc gaa ccg gag ccc tgg gaa ccc tgg cac agc   1023
Tyr Gly Leu Leu Gly Ala Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser
    140                 145                 150
atc gcc gtg atg cgg cgg ctg ggg ctc ctg atg ggc tcc gtc tgg ttc   1071
Ile Ala Val Met Arg Arg Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe
155                 160                 165                 170
aag ctc tgg cgg atg ctg gcg ctg ccg gtg gtc gga gcc gcg aat gcg   1119
Lys Leu Trp Arg Met Leu Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala
                175                 180                 185
ctg aag ctg cgc tat gac gat ggc ggc caa gac ctg ctc tgc atc ccg   1167
Leu Lys Leu Arg Tyr Asp Asp Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro
            190                 195                 200
ccg ggt gtc gag gcc gag cgg ctc gaa gcg gat ctc gcg gcg ctg agg   1215
Pro Gly Val Glu Ala Glu Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg
        205                 210                 215
ccc gcg gtt gat gcc ctg ctg aaa gcg atg ggc ggc gac gcc tcc gat   1263
Pro Ala Val Asp Ala Leu Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp
    220                 225                 230
gcg gcc ggc ggc ggc agc aac aac tgg gcg gtc gcg ccg ggc cgc acg   1311
Ala Ala Gly Gly Gly Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr
235                 240                 245                 250
gcg acg ggc cgg ccc atc ctc gcg ggc gat ccg cat cgc gtc ttc gaa   1359
Ala Thr Gly Arg Pro Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu
                255                 260                 265
atc ccc ggc atg tat gcg cag cat cac ctg gcc tgc gat cgg ttc gac   1407
Ile Pro Gly Met Tyr Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp
            270                 275                 280
atg atc ggt ctg acc gtg ccg ggt gtg ccg ggc ttc ccg cat ttc gcg   1455
Met Ile Gly Leu Thr Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala
        285                 290                 295
cat aac ggc aag gtc gcc tac tgc gtc acc cat gcc ttc atg gac att    1503
His Asn Gly Lys Val Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile
    300                 305                 310
cac gat ctc tat ctc gag caa ttc gcg gag gac ggg cgc acg gcg cgg    1551
His Asp Leu Tyr Leu Glu Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg
315                 320                 325                 330
ttc ggc aac gag ttc gag ccc gta gcc tgg cgc cga gac cgt atc gcg    1599
Phe Gly Asn Glu Phe Glu Pro Val Ala Trp Arg Arg Asp Arg Ile Ala
                335                 340                 345
gtc cgg ggt ggc gcc gat cgc gaa ttc gat atc gtc gag acg cgc cat    1647
Val Arg Gly Gly Ala Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His
            350                 355                 360
ggc ccc gtc atc gcg ggc gat ccg ctc gag gga gca gcg ctc acg ctg    1695
Gly Pro Val Ile Ala Gly Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu
        365                 370                 375
cgc tcg gtc cag ttc gcc gag acc gac ctt tcc ttc gat tgc ctg acg    1743
Arg Ser Val Gln Phe Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr
    380                 385                 390
cgg atg ccg ggc gca tcg acc gtg gcg cag ctt tac gac gcg acg cgc    1791
Arg Met Pro Gly Ala Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg
395                 400                 405                 410
ggc tgg ggc ctg atc gac cat aat ctc gtc gcc ggg gat gtc gcg ggc    1839
Gly Trp Gly Leu Ile Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly
                415                 420                 425
tcg atc ggc cat ctg gtc cgc gcc cgc gtc ccg tcc cgc ccg cgc gag    1887
Ser Ile Gly His Leu Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu
            430                 435                 440
aac ggc tgg ctg ccg gtg ccg ggc tgg tcc ggc gag cat gaa tgg cgc    1935
Asn Gly Trp Leu Pro Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg
        445                 450                 455
ggc tgg att ccg cac gag gcg atg ccg cgc gtc atc gat ccg ccg ggc    1983
Gly Trp Ile Pro His Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly
    460                 465                 470
ggc ctc atc gtc acg gcg aac aac cgc gtc gtg gcc gat gat cat ccc    2031
Gly Leu Ile Val Thr Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro
475                 480                 485                 490
gat tat ctc tgt acc gat tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gaa cgg atc    2079
Asp Tyr Leu Cys Thr Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile
                495                 500                 505
atg gag cgc ctg gtc gcc agt ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcg gcc    2127
Met Glu Arg Leu Val Ala Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala
            510                 515                 520
gcg atc cac gcc gat acg ctg tcc ccc cat gtc ggc ttg ctg cgc gcg    2175
Ala Ile His Ala Asp Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala
        525                 530                 535
agg ctc gaa gcg ctc gga atc cag ggc agt ctc cct gcc gaa gag ttg    2223
Arg Leu Glu Ala Leu Gly Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu
    540                 545                 550
agg cag acc ctc atc gcc tgg gac ggc cgc atg gat gct ggc tcg cag    2271
Arg Gln Thr Leu Ile Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln
555                 560                 565                 570
gcg gct tcc gct tat aat gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gta    2319
Ala Ala Ser Ala Tyr Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val
                575                 580                 585
acg gcc cgc agc ggg ctg gag caa gcg ata gcg cat ccc ttc gcg gcc    2367
Thr Ala Arg Ser Gly Leu Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala
            590                 595                 600
gtc ccg ccc ggc gtc tcg ccg cag ggg cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg    2415
Val Pro Pro Gly Val Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro
        605                 610                 615
acc ctg ctg cgc aac gac gat gcc ggg atg ctg aaa ggc tgg agc tgg    2463
Thr Leu Leu Arg Asn Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp
    620                 625                 630
gac gag gcc ttg tcg gag gcc ctg tcc gtc gcg acg cag aac ctg acc    2511
Asp Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu Thr
635                 640                 645                 650
ggg cgc ggc tgg ggc gag gag cat cgg ccg cgt ttc acg cac ccg ctc    2559
Gly Arg Gly Trp Gly Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu
                655                 660                 665
tcc gcg cag ttc ccg gcc tgg gcc gcg ctg ctg aac ccg gtt tcg cgc    2607
Ser Ala Gln Phe Pro Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser Arg
            670                 675                 680
ccg atc ggc ggc gat ggc gac acc gtg ctg gcg aac ggg ctc gtc cca    2655
Pro Ile Gly Gly Asp Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro
        685                 690                 695
tcg gcc gga cct gag gcg acc tat ggc gcc ctg tcg cgc tac gtc ttc    2703
Ser Ala Gly Pro Glu Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe
    700                 705                 710
gat gtc ggc aat tgg gac aat agc cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc    2751
Asp Val Gly Asn Trp Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala
715                 720                 725                 730
tcg ggg cat ccg gcc agc ccc cac tat gcc gac cag aat gcg cca tgg    2799
Ser Gly His Pro Ala Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp
                735                 740                 745
agc gac tgc gcg atg gtg ccg atg ctc tat agc tgg gac agg atc gcc      2847
Ser Asp Cys Ala Met Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala
            750                 755                 760
gcg gag gcc gtg acc tcg cag gaa ctc gtc ccg gcc tga ggggcaaggc       2896
Ala Glu Ala Val Thr Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala
        765                 770
tgcggtcagc ctgccgcagc attcttgcgg caggcgcggg tgcgtaagcc cgctgtttcg    2956
ccgccgtcga cggtcaggac ggcgccgttc acatagctcg acgcgtcgga caggagccag    3016
gccgcgagat cggcgacctc gtccggcgtg ccgagccggc ctgccggaat gcgcagctca    3076
agctgctcca gccgcagcgg gtcggccagc accttgtcca tcatccgcgt cgcgatctgc    3136
ccggg                                                                3141
<210>2
<211>2847
<212>DNA
<213>Brevundimonas diminuta N-176
<220>
<221>CDS
<222>(483)..(2801)
<400>2
cccggggatc tcgcagacgg ctggcgcggt cctggccagc aatatgcgca aggccggctt     60
cacggtggaa cagcaggtga tggattgggg cacggtgctc gcccgccggg ccaagaagga    120
cggctggagc gttttcccgg tctacgccaa cggcatcgac atgatgtcgc cgctgacgca    180
tttctacatc ggcaacaact gcgtgaacta tgcgggctgg agctgcgacg ccgtcatcac    240
cgaaaagctc gccgcctatg ccaaggcgcc cgatccggct acccgcaaac gcatcgcggc    300
cgaaatccag gtcgaggcct acaaggacac gccctccgtg atgtggggcc agttcagccg    360
gccggcgggc taccgcctgc gcctcaagaa catcgtccag tccagcttcc cgatcttctg    420
gcagctcacg ctcgacgcgt gagcttgccc agattccgac aagcaatgag gtcccgacgc    480
ga atg act atg gcg gcc aac acc gat cgc gcg gtc ttg cag gcg gcg       527
   Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala
   1               5                   10                  15
ctg ccg ccg ctt tcc ggc agc ctc ccc att ccc gga ttg agc gcg tcg      575
Leu Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser
                20                  25                  30
gtc cgc gtc cgg cgc gat gcc tgg ggc atc ccg cat atc aag gcc tcg    623
Val Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser
            35                  40                  45
ggc gag gcc gat gcc tat cgg gcg ctg ggc ttc gtc cat tcg cag gac    671
Gly Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp
        50                  55                  60
cgt ctt ttc cag atg gag ctg acg cgt cgc aag gcg ctg gga cgc gcg    719
Arg Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala
    65                  70                  75
gcc gaa tgg ctg ggc gcc gag gcc gcc gag gcc gat atc ctc gtg cgc    767
Ala Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg
80                  85                  90                  95
cgg ctc gga atg gaa aaa gtc tgc cgg cgc gac ttc gag gcc ttg ggc    815
Arg Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly
                100                 105                 110
gtc gag gcg aag gac atg ctg cgg gct tat gtc gcc ggc gtg aac gca    863
Val Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala
            115                 120                 125
ttc ctg gct tcc ggt gct ccc ctg cct gtc gaa tac gga ttg ctc gga    911
Phe Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly
        130                 135                 140
gca gag ccg gag ccc tgg gag cct tgg cac agc atc gcg gtg atg cgc    959
Ala Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg
    145                 150                 155
cgg ctg ggc ctg ctt atg ggt tcg gtg tgg ttc aag ctc tgg cgg atc   1007
Arg Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Ile
160                 165                 170                 175
ctg gcg ctg ccg gtg gtc gga gcc gcc aat gcg ctg aag ctg cgc tat   1055
Leu Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr
                180                 185                 190
gac gat ggc ggc cgg gat ttg ctc tgc atc ccg ccg ggc gcc gaa gcc   1103
Asp Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala
            195                 200                 205
gat cgg ctc gag gcg gat ctc gcg acc ctg cgg ccc gcg gtc gat gcg   1151
Asp Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala
        210                 215                 220
ctg ctg aag gcg atg ggc ggc gat gcc tcc gat gct gcc ggc ggc ggc   1199
Leu Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly
    225                 230                 235
agc aac aac tgg gcg gtc gct ccg ggc cgc acg gcg acc ggc agg ccg   1247
Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro
240                 245                 250                 255
atc ctc gcg ggc gat ccg cat cgc gtc ttc gaa atc ccg ggc atg tat   1295
Ile Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr
                260                 265                 270
gcg cag cat cat ctg gcc tgc gac cgg ttc gac atg atc ggc ctg acc    1343
Ala Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr
            275                 280                 285
gtg ccg ggc gtg ccg ggc ttc ccg cac ttc gcg cat aac ggc aag gtc    1391
Val Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val
        290                 295                 300
gcc tat tgc gtc acc cat gcc ttc atg gac atc cac gat ctc tat ctc    1439
Ala Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu
    305                 310                 315
gag cag ttc gcg ggg gag ggc cgc act gcg cgg ttc ggc aac gat ttc    1487
Glu Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe
320                 325                 330                 335
gag ccc gtc gcc tgg agc cgg gac cgt atc gcg gtc cgg ggt ggc gcc    1535
Glu Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala
                340                 345                 350
gat cgc gag ttc gat atc gtc gag acg cgc cat ggc ccg gtt atc gcg    1583
Asp Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala
            355                 360                 365
ggc gat ccg cgc gat ggc gca gcg ctc acg ctg cgt tcg gtc cag ttc    1631
Gly Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe
        370                 375                 380
gcc gag acc gat ctg tcc ttc gac tgc ctg acg cgg atg ccg ggc gca    1679
Ala Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala
    385                 390                 395
tcg acc gtg gcc cag ctc tac gac gcg acg cgc ggc tgg ggc ctg atc    l727
Ser Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile
400                 405                 410                 415
gac cat aac ctc gtc gcc ggg gat gtc gcg ggc tcg atc ggc cat ctg    1775
Asp His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu
                420                 425                 430
gtc cgc gcc cgc gtt ccg tcc cgt ccg cgc gaa aac ggc tgg ctg ccg    1823
Val Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro
            435                 440                 445
gtg ccg ggc tgg tcc ggc gag cat gaa tgg cgg ggc tgg att ccg cac    1871
Val Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His
        450                 455                 460
gag gcg atg ccg cgc gtg atc gat ccg ccg ggc ggc atc atc gtc acg    1919
Glu Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr
    465                 470                 475
gcg aat aat cgc gtc gtg gcc gat gac cat ccc gat tat ctc tgc acc    1967
Ala Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr
480                 485                 490                 495
gat tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gag cgc atc atg aag cgc ctg gtc    2015
Asp Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val
                500                 505                 510
gcc aat ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcc gcc gcg atc cat gcc gat    2063
Ala Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp
            515                 520                 525
acg ctg tcg ccc cat gtc ggg ttg ctg cgc cgg agg ctc gag gcg ctt    2111
Thr Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu
        530                 535                 540
gga gcc cgc gac gac tcc gcg gcc gaa ggg ctg agg cag atg ctc gtc    2159
Gly Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val
    545                 550                 555
gcc tgg gac ggc cgc atg gat gcg gct tcg gag gtc gcg tct gcc tac    2207
Ala Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr
560                 565                 570                 575
aat gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gtg acg gac cgc agc ggg    2255
Asn Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly
                580                 585                 590
ctg gag cag gcg ata tcg cat ccc ttc gcg gct gtc gcg ccg ggc gtc    2303
Leu Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val
            595                 600                 605
tca ccg caa ggc cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg acc ctg ctg cgc gac    2351
Ser Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp
        610                 615                 620
gac gat gcc gga atg ctg aag ggc tgg agc tgg gac cag gcc ttg tct    2399
Asp Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser
    625                 630                 635
gag gcc ctc tcg gtc gcg tcg cag aac ctg acc ggg cga agc tgg ggc    2447
Glu Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly
640                 645                 650                 655
gaa gag cat cgg ccg cgc ttc acg cat ccg ctt gcc acg caa ttc ccg    2495
Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro
                660                 665                 670
gcc tgg gcg ggg ctg ctg aat ccg gct tcc cgt ccg atc ggt ggc gat    2543
Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp
            675                 680                 685
ggc gat acc gtg ctg gcg aac ggg ctc gtc ccg tca gcc ggg ccg cag    2591
Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln
        690                 695                 700
gcg acc tat ggt gcc ctg tcg cgc tac gtc ttc gat gtc ggc aat tgg    2639
Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp
    705                 710                 715
gac aat agc cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc tcc ggg cat ccg gcc    2687
Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala
720                 725                 730                 735
agc gcc cat tat gcc gat cag aat gcg ccc tgg agc gac tgt gcg atg    2735
Ser Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met
                740                 745                 750
gtg ccg atg ctc tat agc tgg gac agg atc gcg gca gag gcc gtg acg    2783
Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr
            755                 760                 765
tcg cag gaa ctc gtc ccg gcctgagggc cgggcctgtt gtcagcctgc           2831
Ser Gln Glu Leu Val Pro
        770
cgcagctctc ttcggc                                                  2847
<210>3
<211>2325
<212>DNA
<213>Brevundimonas diminuta V22
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2322)
<400>3
atg act atg gct gcc aac acc gat cgc gcc gtc ttg cag gcg gcg ctg    48
Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu
1               5                   10                  15
ccg ccg ctt tcc ggc agc ctc ccc att ccc gga ttg agc gcg tcg gtc    96
Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val
            20                  25                  30
cct atc cag cgc gat gcc tgg ggc atc ccg cat atc aag gcc tcc ggc   144
Pro Ile Gln Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly
        35                  40                  45
gag gcc gat gcc tat cgc gcg ctg ggc ttc gtc cat gcg cag gac cgc   192
Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ala Gln Asp Arg
    50                  55                  60
ctt ttc cag atg gag ctg acg cgt cgc aag gcg ctg gga cgc gcg gcc   240
Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala
65                  70                  75                  80
gaa tgg ctg ggt gcc gag gcc gcc gag gcc gat atc ctc gtg cgc cgg   288
Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg
                85                  90                  95
ctc ggt atg gaa aaa gtc tgc cga cgc gat ttc gag gcc ctg ggc gcc   336
Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala
            100                 105                 110
gag gcg aag gac atg ctc cgg gcc tac gtc gcc ggc gtg aac gca ttc    384
Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe
        115                 120                 125
ctg gct tcc ggt gtt ccc ctg cct gtc gaa tac gga ttg ctc gga gca    432
Leu Ala Ser Gly Val Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala
    130                 135                 140
gag ccg gag ccc tgg gag cct tgg cac agc atc gcg gtg atg cgc cgg    480
Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg
145                 150                 155                 160
ctg ggc ctg ctg atg ggt tcg gtc tgg ttc aag ctc tgg cgg atg ctg    528
Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu
                165                 170                 175
gcg ctg ccg gtg gtc gga gcc gcg aat gcg ctg aag ctg cgc tat gac    576
Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp
            180                 185                 190
gat ggc ggc cgc gat ttg ctc tgc atc ccg ccg cgc gcc gaa gcg gat    624
Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Arg Ala Glu Ala Asp
        195                 200                 205
cgg ctc gag gcg gat ctc gcg acc ctg cgg ccc gcg gtc gat gcg ctg    672
Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu
    210                 215                 220
ctg aag gcg atg ggc ggg gat gcc tca gat gcc gcc ggt ggc ggc agc    720
Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser
225                 230                 235                 240
aac aac tgg gcg gtc gcg ccg ggc cgt acg gcg acc ggc cgg ccg atc    768
Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile
                245                 250                 255
ctc gcg ggc gat ccg cat cgc gtc ttc cag atc ccc ggc atg tat gcc    816
Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Gln Ile Pro Gly Met Tyr Ala
            260                 265                 270
cag cat cat ctg gcc tgc gat cgc ttc gac atg atc ggc ctg acc gtg    864
Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val
        275                 280                 285
ccg ggc gtg ccg ggt ttt ccg cat ttc gcg cat aac ggc aag gtc gcc    912
Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala
    290                 295                 300
tac tgc gtc acc cat gcc ttc atg gac att cac gat ctc tac ctt gag    960
Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu
305                 310                 315                 320
cag ttc gcg gag gag ggc cgc agg gcg cgg ttc ggc aac gat ttc gag   1008
Gln Phe Ala Glu Glu Gly Arg Arg Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu
                325                 330                 335
ccc gcc gcc tgg agc cgg gac cgt atc gcg gtc cgg ggt ggt gcc gac    1056
Pro Ala Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp
            340                 345                 350
cgc gaa ttc gat atc atc gag acg cgc cat ggt ccc gtc ata gca ggc    1104
Arg Glu Phe Asp Ile Ile Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly
        355                 360                 365
gat ccg cgc gat ggc gca gcg ctc acg ctg cgc tcg gtc cag ttc gcc    1152
Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala
    370                 375                 380
gag acc gat ctg tcc ttc gat tgc ctg acg cgg atg ccg ggc gca tcg    1200
Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser
385                 390                 395                 400
acc gtg gcg cag ctc tac gac gcg acg cgc ggc tgg ggc ctg atc gac    1248
Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp
                405                 410                 415
cat aat ctc gtc gcc ggg gat gtc ggg ggc tcg atc ggc cat ctg gtc    1296
His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Gly Gly Ser Ile Gly His Leu Val
            420                 425                 430
cgc gcc cgt gtc ccg tcc cgc tcg cgc gaa aac ggc tgg ctg ccg gtg    1344
Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Ser Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val
        435                 440                 445
ccg ggc tgg tcc ggc gag cat gaa tgg cgg ggt tgg att ccg cac gag    1392
Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu
    450                 455                 460
gcg atg ccg cgc gtg atc gat ccg ccg ggc ggc atc atc gtc acg gcg    1440
Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala
465                 470                 475                 480
aat aat cgc gtc gtg gcc gat gac cat ccc gat tat ctc tgc acc gat    1488
Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp
                485                 490                 495
tgc cat ccg ccc tac cgc gcc gag ccc atc atg aag cgc ctg gtc gcc    1536
Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Pro Ile Met Lys Arg Leu Val Ala
            500                 505                 510
aat ccg gct ttc gcc gtc gac gat gcc gcc gcg atc cat gcc gat acg    1584
Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr
        515                 520                 525
ctg tcg ccc cat gtc ggg ttg ctg cgc cgg agg ctc gag gcg ctt gga    1632
Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly
    530                 535                 540
gcc cgc gac gac tcc gcg gcc gaa ggg ctg agg cag atg ctc gtc gcc    1680
Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala
545                 550                 555                 560
tgg gac ggc cgc atg gat gcg gct tcg gag gtc gcg tct gcc tac aat    1728
Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn
                565                 570                 575
gcg ttc cgc agg gcg ctg acg cgg ctg gtg acg gac cgc agc ggg ctg    1776
Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu
            580                 585                 590
gag cag gcg ata tcg cat ccc ttc gcg gct gtc gcg ccg ggc gtc tca    1824
Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser
        595                 600                 605
ccg caa ggc cag gtc tgg tgg gcc gtg ccg acc ctg ctg cgc gac gac    1872
Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp
    610                 615                 620
gat gcc gga atg ctg aag ggc tgg agc tgg gac cag gcc ttg tct gag    1920
Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu
625                 630                 635                 640
gcc ctc tcg gtc gcg tcg cag aac ctg agc cgg cga agc tgg ggc gaa    1968
Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Ser Arg Arg Ser Trp Gly Glu
                645                 650                 655
gag cat cgg ccg cgc ttc acg cat ccg ctt gcc acg caa ttc ccg gcc    2016
Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala
            660                 665                 670
tgg gcg ggg ctg ctg aat ccg gct tcc cgt ccg atc ggc ggc gat ggc    2064
Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly
        675                 680                 685
gac acc gtg ctg gcg aac ggg ctc gtc ccg tca gcc ggg ccg cag gcg    2112
Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala
    690                 695                 700
acc tat ggc gcc ctg tcg cgc tac gtc ttt gat gtc ggc aat tgg gac    2160
Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp
705                 710                 715                 720
aat agc cgc tgg gtc gtc ttc cac ggc gcc tcc ggg cat ccg gcc agc    2208
Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser
                725                 730                 735
gcc cat tat gcc gat cag aat gcg ccc tgg agc gac tgt gcg atg gtg    2256
Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val
            740                 745                 750
ccg atg ctc tat agc tgg gac agg atc gcg gca gag gcc gtg acg tcg    2304
Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser
        755                 760                 765
cag gaa ctc gtc ccg gcc tga                                        2325
Gln Glu Leu Val Pro Ala
    770

Claims (18)

1.突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体β-内酰胺酰化酶较之具有β-内酰胺酰化酶活性的所述模型多肽而言，针对己二酰-7-ADCA的体外β-内酰胺酰化酶活性提高了至少1.5倍。
2.突变体II型β-内酰胺酰化酶，其是具有II型β-内酰胺酰化酶活性的模型多肽的变体，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶至少在选自第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位构成的组的氨基酸位置上经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
3.如权利要求1所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶，其至少在选自第10、29、161、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726位构成的组的氨基酸位置上经过修饰，其中采用了Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置编号。
4.如前述任意一项权利要求所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶，其中，具有β-内酰胺酰化酶活性的所述模型多肽选自下述组，所述组由Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶(SEQ ID NO：1)、来自Brevundimonasdiminuta的N176(SEQ ID NO：2)和来自Brevundimonas diminuta的V22酰化酶(SEQ ID NO：3)以及具有与SEQ ID NO：1有至少70％或与SEQ IDNO：2有至少70％或与SEQ ID NO：3有至少70％的百分比同一性的氨基酸序列的且具有II型β-内酰胺酰化酶活性的多肽构成。
5.如权利要求4所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶，其中，所述模型肽是Pseudomonas的SE83-acyII酰化酶(SEQ ID NO：1)。
6.如前述任意一项权利要求所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶在第161位经过修饰，优选地，与选自由10、29、270、274、280、296、314、442、514、589、645、694、706和726构成的组的位置上的至少一处其它修饰组合。
7.编码如前述任意一项权利要求所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶的多核苷酸。
8.包含权利要求7所述的多核苷酸的表达载体或表达盒。
9.经权利要求7所述的多核苷酸或权利要求8所述的载体或盒转化的宿主细胞。
10.生产权利要求1-6所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶的工艺，所述工艺包括在有益于生产突变体II型β-内酰胺酰化酶的条件下培养如权利要求9所述的宿主细胞，以及可选地，回收所述多肽。
11.生产感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物的工艺，所述工艺包括使用权利要求1-6所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶对感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的步骤。
12.如权利要求11所述的工艺，其中，所述感兴趣的脱酰基化β-内酰胺化合物是6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ADAC或7-氨基-3-氨基甲酰氧甲基-3-头孢霉素核-4-羧酸。
13.如权利要求11或12所述的工艺，其中，所述感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体具有属于二羧酸构成的组的酰基，优选地，琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、α-酮己二酰基和氨基己二酰基，更优选地，己二酰基。
14.如权利要求11-13中任意一项所述的工艺，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶以被固定的形式使用。
15.如权利要求1-6所述的突变体II型β-内酰胺酰化酶用于对感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体进行脱酰基化的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述感兴趣的β-内酰胺化合物是7-ADCA或7-ACA。
17.如权利要求15或16所述的用途，其中，所述感兴趣的β-内酰胺化合物的酰化前体属于二羧酸构成的组，优选地，琥珀酰基、戊二酰基、己二酰基、α-酮己二酰基和氨基己二酰基，更优选地，己二酰基。
18.权利要求15-17中任意一项所述的工艺，其中，所述突变体II型β-内酰胺酰化酶以被固定的形式使用。
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