JPH0614777A - 新規セファロスポリンｃアシラーゼ及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 新規な変異型セファロスポリンＣアシラー
ゼ、それをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する発
現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換体およ
び該形質転換体を培養することによる変異型セファロス
ポリンＣアシラーゼの製造法。上記形質転換体の培養物
またはその処理物を用いる式： 【化１】 （Ｒ¹ はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素。Ｒ² はカ
ルボン酸アシル。) で示される化合物(I) またはその塩
の製造法。 【効果】 高い酵素力および高いプロセッシング効率を
もつ変異型セファロスポリンＣアシラーゼ、該酵素を高
収率発現する発現系並びに該酵素の製造方法を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規セファロスポリン
Ｃアシラーゼ（以下、ＣＣアシラーゼという）に関す
る。より詳細には、新規な変異型ＣＣアシラーゼ、それ
をコードする遺伝子、その遺伝子を含有する発現ベクタ
ー、該発現ベクターで形質転換された微生物及び変異型
ＣＣアシラーゼの製造法に関する。更に、本発明は上記
形質転換体の培養物またはその処理物を用いたセファロ
スポリン化合物の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＣアシラーゼは、一般にセファロスポ
リンＣを７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）
に加水分解する酵素である。今まで、ＣＣアシラーゼと
して分類される酵素としては、セファロスポリンＣアシ
ラーゼＳＥ８３、Ｎ１７６及びＶ２２の三酵素が見つか
っており、それらのアミノ酸配列は、Journal of Ferme
ntation and Bioengineering, Vol.72, p232-243 (199
1) に開示されている。この文献では、ＣＣアシラーゼ
のアミノ酸配列の番号表記はそのＮ末端部位のメチオニ
ン基から始まっている。

【０００３】しかし、本明細書においてはＣＣアシラー
ゼのアミノ酸配列の番号表記はＮ末端部のメチオニン基
に隣接するスレオニン基から始まる（後記配列表参
照）。これは原核生物中でＣＣアシラーゼ遺伝子を発現
することによって得られる成熟ＣＣアシラーゼのα−サ
ブユニットのＮ末端部のメチオニンは、通常、宿主細胞
の酵素（例えば、アミノペプチダーゼなど）によって脱
離して、Ｎ末端アミノ酸としてスレオニン基をもつ成熟
ＣＣアシラーゼとなるからである。

【０００４】上記文献は、組換えＤＮＡ技術による天然
型ＣＣアシラーゼの製造についても開示するものであ
り、発現されたＣＣアシラーゼは細胞内でプロセッシン
グを受けてα−サブユニットとβ−サブユニットからな
る活性体となることが知られている。しかしながら、大
腸菌中における該プロセッシングの効率は、一般に低
い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
な変異型セファロスポリンＣアシラーゼ、それをコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡを含む発現ベクター、該ベクター
を導入した形質転換体、及び該形質転換体を培養するこ
とによる変異型セファロスポリンＣアシラーゼの製造方
法を提供することである。また、本発明の他の目的は、
上記形質転換体の培養物またはその処理物を用いたセフ
ァロスポリン化合物の製造法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、より高い
酵素活性、より高いプロセッシング効率などのより望ま
しい特性を有するＣＣアシラーゼを得るべく鋭意研究を
重ねた結果、かかる望ましい性質を持つ変異型ＣＣアシ
ラーゼの製造に成功し、本発明を完成した。

【０００７】即ち本発明は、下記 (1)〜(4) の特徴を有
する新規な変異型ＣＣアシラーゼに関するものである。 (1)天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列３０５位のシ
ステインがセリン等の他のアミノ酸で置換されてなる変
異型ＣＣアシラーゼ。 (2)天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列２６９位のメ
チオニンがチロシン、フェニルアラニン、ロイシン等の
他のアミノ酸で置換されてなる変異型ＣＣアシラーゼ。 (3)天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列２７１位のア
ラニンがチロシン等の他のアミノ酸で置換されてなる変
異型ＣＣアシラーゼ。 (4)上記 (1)〜(3) から選択される２もしくは３カ所の
点変異部をもつ変異型ＣＣアシラーゼ。

【０００８】言い換えると、変異型ＣＣアシラーゼは、
α−サブユニットとβ−サブユニットとにプロセッシン
グされる前の前駆体形として次式で示すことができる。 Ａ^1-268 −Ｘ₁ −Ｔｙｒ−Ｘ₂ −Ａ^272-304 −Ｘ₃ −Ａ^306-773 式中、Ａ^1-268 は、天然型ＣＣアシラーゼのＴｈｒ¹ か
らＧｌｙ²⁶⁸ までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列
を示す。Ａ^272-304 は、天然型ＣＣアシラーゼのＧｌｎ
²⁷² からＴｙｒ³⁰⁴ までのアミノ酸配列と同一のアミノ
酸配列を示す。Ａ^306-773 は、天然型ＣＣアシラーゼの
Ｖａｌ³⁰⁶ からＡｌａ⁷⁷³ までのアミノ酸配列と同一の
アミノ酸配列を示す。Ｘ₁ は、Ｍｅｔまたはその他のア
ミノ酸を、Ｘ₂ は、Ａｌａまたはその他のアミノ酸を、
Ｘ₃ はＣｙｓまたはその他のアミノ酸を示す。但し、Ｘ
₁ がＭｅｔであり、かつＸ₂ がＡｌａであるとき、Ｘ₃
はＣｙｓ以外のアミノ酸である。また本発明は、上記式
中、Ｘ₁ がＴｙｒ、Ｘ₂ がＡｌａおよびＸ₃ がＳｅｒで
ある変異型セファロスポリンＣアシラーゼに関する。

【０００９】この明細書では、個々の変異型ＣＣアシラ
ーゼの命名について、この分野の学会で広く用いられて
いる次のような命名法を便宜的に採用する。即ち、天然
型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の３０５位のシステイ
ン残基をセリンで置換した変異型ＣＣアシラーゼは変異
型ＣＣアシラーゼＣ３０５Ｓと命名され、ここでＣは置
換されるシステイン（アミノ酸）残基の一文字記号を意
味し、３０５は天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の
置換位置を意味し、Ｓは前記システイン（アミノ酸）残
基を置換したセリン（他のアミノ酸）の一文字記号を意
味する。言い換えれば、例えば、変異型ＣＣアシラーゼ
Ｍ２６９ＹまたはＭ２６９Ｔは天然型ＣＣアシラーゼの
アミノ酸配列の２６９位のメチオニン残基をチロシンま
たはトレオニンでそれぞれ置換した変異型ＣＣアシラー
ゼを意味する。そして、変異型ＣＣアシラーゼＭ２６９
Ｙ／Ｃ３０５Ｓは天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列
の２６９位のメチオニン残基をチロシンで置換し、天然
型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の３０５位のシステイ
ン残基をセリンで置換した変異型ＣＣアシラーゼを意味
する。

【００１０】かかる特徴を有する本発明の変異型ＣＣア
シラーゼのアミノ酸配列、ならびにそれをコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列の具体例を後記配列表に記す。
配列番号１に、プラスミドｐＹＳＣ３０５ＳとｐＣＫ３
０５で発現される、変異型ＣＣアシラーゼＣ３０５Ｓの
前駆体をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およびそ
れから推定したアミノ酸配列を示す。配列番号２に、プ
ラスミドｐＣＫ３０５Ｂ中における変異型ＣＣアシラー
ゼＣ３０５Ｓの前駆体をコードするＤＮＡのヌクレオチ
ド配列およびそれから推定したアミノ酸配列を示す。配
列番号３に、プラスミドｐＣＫ２６９Ｙ中における変異
型ＣＣアシラーゼＭ２６９Ｙの前駆体をコードするＤＮ
Ａのヌクレオチド配列およびそれから推定したアミノ酸
配列を示す。配列番号４に、プラスミドｐＹＳＡ２７１
ＹおよびｐＣＫ２７１Ｙ中における変異型ＣＣアシラー
ゼＡ２７１Ｙの前駆体をコードするＤＮＡのヌクレオチ
ド配列およびそれから推定したアミノ酸配列を示す。配
列番号５に、プラスミドｐ２６９Ｙ３０５Ｓ中における
変異型ＣＣアシラーゼＭ２６９Ｙ／Ｃ３０５Ｓの前駆体
をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれから
推定したアミノ酸配列を示す。

【００１１】本発明の変異型ＣＣアシラーゼは、組換え
ＤＮＡ技術、ポリペプチド合成法などによって調製する
ことができる。

【００１２】組換えＤＮＡ技術を用いる場合には、新規
ＣＣアシラーゼは、そのアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地
中で培養し、該培養物から新規ＣＣアシラーゼを採取す
ることによって調製することができる。

【００１３】この過程について、その詳細を以下に詳し
く説明する。宿主細胞としては、微生物〔細菌（例え
ば、Escherichia coli，Bacillus subtilis など）、酵
母菌（例えば、Saccharomyces cerevisiaeなど）、動物
細胞系および培養植物細胞など〕が挙げられる。微生物
として好適には、細菌、特にEscherichia 属に属する菌
株（例えば E. coli JM109 ATCC 53323, E. coli HB101
ATCC 33694, E. coli HB101-16 FERM BP-1872, E. col
i 294 ATCC 31446 など）、酵母、特にSaccharomyces
属に属する菌株（例えば、Saccharomyces cerevisiae A
H22 ）、動物細胞（例えばマウスＬ９２９細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）などが挙げ
られる。

【００１４】細菌、特に E. coliを宿主細胞として用い
る場合、一般に発現ベクターは少なくともプロモーター
−オペレーター領域、開始コドン、新規ＣＣアシラーゼ
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン、ター
ミネーター領域および複製可能単位から構成される。酵
母または動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベ
クターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シグ
ナルペプチドおよび新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列
をコードするＤＮＡ、及び終止コドンを含んでいること
が好ましい。エンハンサー配列、新規ＣＣアシラーゼの
５’側及び３’側の非翻訳領域、スプライシング接合
部、ポリアデニレーション部位及び複製可能単位もまた
発現ベクターに組み込むことが可能である。

【００１５】プロモーター−オペレーター領域は、プロ
モーター、オペレーター及び Shine-Dalgarno(SD) 配列
（例えば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。好ましく
はプロモーター−オペレーター領域は、常套的に用いら
れるプロモーター−オペレーター領域（例えば、E. col
i のＰＬ−プロモーター及びｔｒｐ−プロモーター）及
びＣＣアシラーゼ Ｎ−１７６染色体遺伝子のプロモー
ターを含んでいてもよい。

【００１６】酵母中で新規ＣＣアシラーゼを発現させる
ためのプロモーターとしては、S. cerevisiae の場合、
ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨＩＩ遺伝子、
および酸ホスファターゼ（ｐＨ０５）遺伝子のプロモー
ターが挙げられる。および哺乳動物細胞中で新規ＣＣア
シラーゼを発現させるためのプロモーターとしては、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターまたは後期プロモーター、ＨＴ
ＬＶ−ＬＴＲ−プロモーター、マウスメタロチオネイン
Ｉ（ＭＭＴ）−プロモーター、ワクシニア−プロモータ
ーなどが含まれる。

【００１７】好適な開始コドンとしては、メチオニンコ
ドン（ＡＴＧ）が含まれる。

【００１８】シグナルペプチドとしては、一般に使用さ
れる他の酵素のシグナルペプチド（天然型ｔ−ＰＡのシ
グナルペプチド、天然型プラスミノーゲンのシグナルペ
プチド）などが含まれる。

【００１９】新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡは、従来の方法で調製することができる。
例えば、ＤＮＡ合成機を用いて一部のまたは全てのＤＮ
Ａを合成したり、および／または形質転換体〔例えば、
E. coli JM109（ｐＣＣＮ１７６−２） FERM BP-3047
〕から得られる適切なベクター（例えば、ｐＣＣＮ１
７６−２）に挿入された天然型ＣＣアシラーゼをコード
する完全なＤＮＡ配列を適切な方法、例えば適切な酵素
（例えば、制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラ
ーゼなど）での処理に加えて、常套の変異方法〔例え
ば、カセット変異法〔徳永，Ｔら、Eur. J.Biochem. Vo
l.153, p445-449 (1985) 参照〕、ＰＣＲ変異法〔樋
口，Ｒら、Nucleic Acids Res. Vol.16, p7351-7367 (1
988)参照〕、クンケル法〔Kunkel, T. Aら. ，Methods
Enzymol. Vol. 154, p367 (1987)など参照〕のような適
切な方法で処理することによって調製することができ
る。

【００２０】終止コドンとしては、常用の終止コドン
（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡなど）が含まれる。

【００２１】ターミネーター領域としては、天然または
合成のターミネーター（例えば、合成ｆｄファージター
ミネーターなど）が含まれる。

【００２２】複製可能単位とは、宿主細胞中においてそ
の全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮ
Ａ化合物をいい、天然のプラスミド、人工的に修飾され
たプラスミド（例えば、天然のプラスミドから調製され
たＤＮＡフラグメント）および合成プラスミドが含まれ
る。好適なプラスミドとしては、 E. coliではプラスミ
ドｐＢＲ３２２、もしくはその人工的修飾物（ｐＢＲ３
２２を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグ
メント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵
母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミド p
RSVneo ATCC 37198 、プラスミド pSV2dhfr ATCC 3714
5、プラスミド pdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミド
pSV2neo ATCC 37149 などが挙げられる。

【００２３】エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエ
ンハンサー配列（７２b.p.）が含まれる。

【００２４】ポリアデニレーション部位としては、ＳＶ
４０のポリアデニレーション部位が含まれる。

【００２５】スプライシング接合部位としては、ＳＶ４
０のスプライシング接合部位が含まれる。

【００２６】プロモーター、開始コドン、新規ＣＣアシ
ラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン
およびターミネーター領域は、連続的かつ環状に適当な
複製可能単位（プラスミド）に連結させることができ、
この際所望により、常法（例えば、制限酵素での消化、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション）で適当な
ＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリ
クションサイトなど）を用いることにより、発現ベクタ
ーを得る。

【００２７】宿主細胞は、上述の発現ベクターを用いて
形質転換（形質移入）される。形質転換（形質移入）は
従来の方法（例えば、 E. coliは Kushner法、哺乳動物
細胞はリン酸カルシウム法、マイクロインジェクション
など）を用いて行うことができ、形質転換体（形質移入
体）が得られる。

【００２８】本発明の工程で新規ＣＣアシラーゼを製造
するために、かくして得られた上記発現ベクターを含む
形質転換体は、栄養培養水溶液中で培養される。

【００２９】栄養培地は、炭素源（例えば、グルコー
ス、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクト
ースなど）および無機窒素もしくは有機窒素源（例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水
分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプト
ン、ビーフ抽出物など）を含んでいてもよい。所望によ
り、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナ
トリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウ
ム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシ
ウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ₁ ）、抗生物
質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など〕を培
地中に添加してもよい。哺乳動物細胞を培養するため
に、胎児ウシ血清および抗生物質を配合した Dulbecco'
s Modified Eagle's Minimum Essenntial Medium (DME
M) がしばしば用いられる。

【００３０】形質転換体（形質移入体）の培養は、通常
ｐＨ５．５−８．５（好適にはｐＨ７−７．５）、１８
−４０℃（好適には２０−３０℃）で５−５０時間実施
される。

【００３１】かくして製造された新規ＣＣアシラーゼが
培養液中に存在する場合は、その培養物を濾過または遠
心することにより、培養濾液（上清）を得る。新規ＣＣ
アシラーゼは、該培養濾液から、天然または合成蛋白質
を精製並びに単離するために一般に用いられる常法（例
えば、透析、ゲル濾過、抗ＣＣアシラーゼモノクローナ
ル抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィ
ー、適当な吸着材上でのカラムクロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィーなど）を用いて精製すること
ができる。

【００３２】製造された新規ＣＣアシラーゼが、培養さ
れた形質転換体のペリプラズムおよび細胞質内に存在す
る場合は、細胞を濾過および遠心により集め、当該細胞
の細胞壁および／または細胞膜を、例えば超音波および
／またはライソザイムで処理して、細胞破片を得る。該
細胞破片を適当な水溶液（例えば、８Ｍ尿素水溶液、６
Ｍグアニジウム塩水溶液）に溶解する。新規ＣＣアシラ
ーゼは、該水溶液から先に例示したような常法により精
製することができる。

【００３３】本発明は更に、式：

【００３４】

【化３】

【００３５】（式中、Ｒ¹ はアセトキシ、ヒドロキシま
たは水素を示す。Ｒ² はカルボン酸アシルを示す。）で
示される化合物(II)またはその塩を、本発明の新規ＣＣ
アシラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形
質転換された微生物の培養物またはその処理物と接触さ
せて、式：

【００３６】

【化４】

【００３７】（式中、Ｒ¹ は前記と同意義である。）で
示される化合物(I) またはその塩の製造方法を提供する
ものである。

【００３８】Ｒ² で示されるカルボキン酸アシルとして
は、脂肪族、芳香族または複素環カルボン酸アシルが挙
げられ、その適切な例としては、アミノ基、カルボキシ
基、Ｃ１−Ｃ６のアルカノイルアミノ基、ベンズアミド
基およびチエニル基等からなる群から選択される１つも
しくは２つの適当な置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ
６のアルカノイルが挙げられる。

【００３９】化合物（Ｉ）および化合物（II）の適当な
塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、
カリウム塩、リチウム塩）が挙げられる。

【００４０】ＣＣアシラーゼ活性が通常形質転換細胞内
に存在するなら、培養物を処理して得られる物質（以
下、処理物という）としては、以下のものが例示され
る。

【００４１】（１）生細胞；濾過または遠心等の常法に
て培養物から分離される。 （２）乾燥細胞；上記(1) の生細胞を凍結乾燥または真
空乾燥等の常法により乾燥させることにより得られる。 （３）無細胞抽出物；上記(1) の生細胞または上記(2)
の乾燥細胞を常法（例えば、有機溶媒を用いた細胞の自
己消化、アルミナ、海砂などを用いた細胞の粉砕、また
は超音波にて細胞を処理すること）により破壊すること
により得られる。 （４）酵素溶液；上記(3) の無細胞抽出物を常法（例え
ば、カラムクロマトグラフィー）により精製または部分
精製することによって得られる。 （５）固定化細胞または酵素；上記(1) もしくは(2) の
細胞または上記(4) の酵素を常法（例えば、アクリルア
ミド、グラスビーズ、イオン交換樹脂などを用いた方
法）により固定化することにより調製される。

【００４２】本発明の化合物（II）を酵素と接触させる
ことからなる反応は、水または緩衝液のような水性媒質
中で実施することができる。即ち、通常、化合物（II）
を含む水または緩衝液のような水性媒質中に、培養物ま
たはその処理物を溶解または懸濁することによって行わ
れる。

【００４３】該反応混液の好適なｐＨ、化合物（II）の
濃度、反応時間および反応温度は、用いられる培養物ま
たはその処理物の性質によって変わりうる。一般に、該
反応はｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９、５〜４０
℃、好ましくは５〜３７℃で０．５〜５０時間実施され
る。

【００４４】反応混液中、基質としての化合物（II）の
濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で好適に選択する
ことができる。

【００４５】このようにして製造された化合物（Ｉ）
は、上記反応混液から慣用の方法で精製、単離される。

【００４６】以下の実施例において、プラスミド、制限
酵素のような酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、及び他の物質
は市販のものであり、常法により使用された。ＤＮＡの
クローニング、宿主細胞の形質転換、形質転換体の培
養、該培養物からの新規ＣＣアシラーゼの採取などに用
いられた操作は、当業者によく知られているものである
か、もしくは文献から採用できるものである。

【００４７】

【実施例・実験例】以下の実施例は、本発明を説明する
ことを目的として挙げられているものであり、本発明は
これらにより何ら限定されるものではない。

【００４８】実施例１ オリゴデオキシリボヌクレオ
チドＳＮ−６の合成 ＤＮＡオリゴマーＳＮ−６（５’ＧＧＴＣＧＣＣＴＡＴ
ＡＧＣＧＴＣＡＣＧＣＡＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧ ３’）
を３８１Ａ型ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム
ズ社製）を用いて合成した。そのＤＮＡを、ＣＰＧ（co
ntrolled poreglass)ポリマー支持体から２８％アンモ
ニア水で遊離し、その後６０℃で９時間加熱することに
より全保護基を除去した。その反応混合物を真空下で減
圧留去し、残渣をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．４）−１ｍＭ ＥＤＴＡ〕２００μｌに溶解し
た。得られた粗ＤＮＡ溶液を、逆相ＨＰＬＣ〔カラム；
COSMOSIL C18, 4.6 mm ×150 mm（ナカライテスク）、
溶離液；Ａ：０．１Ｍ トリエチルアンモニウム酢酸緩
衝液（ｐＨ７．２〜７．４）、Ｂ：アセトニトリル、グ
ラジェント；開始：Ａ（１００％）、終わり：Ａ（６０
％）＋Ｂ（４０％）、２５分間直線グラジェント、流
速；１．２ ml/min 〕に付した。目的のＤＮＡオリゴマ
ーを含む溶出液を集め、真空下で減圧留去した。精製さ
れたＤＮＡをＴＥ緩衝液２００μｌに溶解し、使用まで
−２０℃で保存した。

【００４９】次表１、２、３および４に挙げるその他全
てのＤＮＡオリゴマーを、上述と同様の方法で合成、精
製した。

【００５０】

【表１】

【００５１】

【表２】

【００５２】

【表３】

【００５３】

【表４】

【００５４】実施例２ ｔｒｐプロモーター制御下での
天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６の発現ベクターの調製 （１）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のアンピシリン耐
性発現ベクターであるｐＣＣ００２Ａの構築： （ｉ）ｐＣＣ００１Ａの構築：プラスミドｐＣＣＮ１７
６−３（１．０μｇ）〔JOURNAL OF FERMENTATION AND
BIOENGINEERING, Vol. 72, p235 (1991)に、プラスミド
ｐＣＣＮ１７６−２（これは、常法により E. coli JM1
09 (ｐＣＣＮ１７６−２）ＦＥＲＭ ＢＰ−３０４７か
ら入手可能である）からこのプラスミドを調製する方法
が記載されている〕を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで
消化し、ＣＣアシラーゼＮ１７６の全てのコーディング
領域を担持する２．９ｋｂフラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動によって単離した。一方、変異型ｔ−ＰＡの
発現ベクターであるｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ（１．０μ
ｇ）、〔これは、常法により形質転換体であるＥ．ｃｏ
ｌｉＨＢ１０１−１６（ｐＴＱｉＰＡΔｔｒｐ）ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１８７０から得ることができる。その調製方
法については、欧州特許出願公開明細書第３０２４５６
号に記載されている〕をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で
消化した。得られたｔｒｐプロモーター、ｔ−ＰＡコー
ディング領域の一部分（Ｃｙｓ⁹²からＴｒｐ¹¹³ ）、及
びｆｄファージセントラルターミネーターの複写配列を
担持する４．３ｋｂＤＮＡを単離した。５０ｍＭのトリ
ス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイ
トール及び１ｍＭ ＡＴＰからなるライゲーション緩衝
液４０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット、
宝酒造製）の存在下、先に得られた２．９ｋｂのＤＮＡ
フラグメントと当該４．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを
混合して、１６℃、５時間かけて結合させた。該結合物
を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。ア
ンピシリン耐性の形質転換体の一つからｐＣＣ００１Ａ
と命名する所望のプラスミドを取得し、制限酵素マッピ
ングにより、その特性を調べた。

【００５５】（ii）ｐＣＣ００２Ａの構築 (i) で得られたプラスミドｐＣＣ００１Ａは、ｔｒｐプ
ロモーターとアシラーゼ遺伝子との間のｔ−ＰＡ遺伝子
の一部分（Ｃｙｓ⁹²からＴｒｐ¹¹³ ）を含む。この領域
を除去するために、ｐＣＣ００１Ａ（１．０μｇ）をＣ
ｌａＩ及びＭｌｕＩで消化し、得られる６．１ｋｂのＤ
ＮＡフラグメントを単離した。一方、ｐＣＣＮ１７６−
３（１μｇ）をＭｌｕＩおよびＳａｕ３ＡＩで消化し、
アシラーゼのＡｓｐ⁷ からＡｒｇ⁷¹間をコードする１８
９ｂｐのＤＮＡを単離した。合成ＤＮＡオリゴマー００
２ａ及び００２ｂ（各々０．５ｎｍｏｌ、表１参照）
を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１．５ユニット、
宝酒造製）を用いて、緩衝液（キネーション緩衝液；５
０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤ
ＴＴ、１．０ｍＭ ＡＴＰ）中、３７℃、１時間でリン
酸化し、該反応混合物を５５℃で２０分間加熱して酵素
を不活性化させた。その結果得られた混合物を、ライゲ
ーション緩衝液２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在
下、１５℃、３時間、先に得られた１８９ｂｐのＳａｕ
３ＡＩ／ＭｌｕＩＤＮＡと混合して結合させた。得られ
た結合物に、６．１ｋｂ ＣｌａＩ／ＭｌｕＩ ＤＮＡ
フラグメントを添加し、その混合物を更に追加したＴ４
ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）の存在下で４℃、１
６時間インキュベーションした。その結果得られた結合
物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。
これらの形質転換体の一つから、ＣＣアシラーゼＮ１７
６の発現ベクターである所望のプラスミドｐＣＣ００２
Ａを単離して、制限酵素マッピングによりその特性を調
べた。

【００５６】（２）カナマイシン耐性ＣＣアシラーゼＮ
１７６の発現ベクターであるｐＣＫ００２の構築 プラスミドｐＣＣ００２ＡをＤｒａＩ（東洋紡績（株）
製）で消化した。その結果得られた混合液をフェノール
で処理して酵素を除去し、エタノールで沈澱させた。回
収されたＤＮＡをライゲーション緩衝液２０μｌに懸濁
し、リン酸化されたＥｃｏＲＩリンカー（２μｇ、ファ
ルマシア製）と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユ
ニット）とともに４℃で１６時間インキュベーションし
た。該反応混合物をフェノールで抽出し、エタノールで
沈澱させた。回収したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そ
の結果得られたアンピシリン耐性遺伝子を欠失した５．
６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって単離
した。一方、プラスミドｐＡ０９７（１μｇ）〔これ
は、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９（ｐＡＯ９７）
ＦＥＲＭ ＢＰ−３７７２から常法により得ることがで
きる。〕をＥｃｏＲＩで消化し、その結果カナマイシン
耐性遺伝子である１．２ｋｂＤＮＡを単離した。ライゲ
ーション緩衝液５０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３０
０ユニット）を用いて、当該１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ
ＤＮＡを１６℃、２時間反応させ、５．６ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ ＤＮＡに結合させた。該結合物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９を形質転換し、抗生物質マーカーとして
カナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプラスミドｐ
ＣＫ００２を得た。

【００５７】実施例３ ＣＣアシラーゼＮ１７６の高発
現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築 （１）ｐＣＣ０１３Ａの構築 （ｉ）ｐＣＣ００７Ａの構築 プラスミドｐＣＣ００１ＡをＥｃｏＲＩおよびＭｌｕＩ
で消化し、その結果得られた６．４ｋｂのＤＮＡフラグ
メントをアガロースゲル電気泳動により単離した。回収
されたＤＮＡを、予めリン酸化しておいた合成ＤＮＡオ
リゴマー００７ａ及び００７ｂ（各々０．５μｇ、表１
参照）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を用
いて１６℃、５時間処理し、結合させた。得られた混合
物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、所望
のプラスミドｐＣＣ００７Ａを得た。

【００５８】（ii）ｐＣＣＮｔ０１３の構築 プラスミドｐＣＣ００７Ａ（１．０μｇ）をＣｌａＩと
ＢａｍＨＩで消化し、得られた６．１ｋｂのＤＮＡを５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。該
ＤＮＡを合成オリゴマー０１３ａと０１３ｂ（各々０．
５μｇ、それらの各々はリン酸化されている。表１参
照）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００ユニット）を用い
て、結合した。該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ
１０９を形質転換し、所望のプラスミドｐＣＣＮｔ０１
３をアンピシリン耐性形質転換体から単離した。

【００５９】（iii) ｐＣＣ０１３Ａの構築 プラスミドｐＣＣＮｔ０１３をＢａｍＨＩとＭｌｕＩで
消化し、その結果得られる６．１ｋｂのＤＮＡを単離し
た。一方、ｐＣＣ００２Ａ（１．０μｇ）をＭｌｕＩと
Ｓａｕ３ＡＩで消化して１８９ｂｐのＤＮＡフラグメン
トを取得した。得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ
（３００ユニット）を用いて、６．１ｋｂのＢａｍＨＩ
／ＭｌｕＩのＤＮＡフラグメントに結合し、該結合混合
物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。ア
ンピシリン耐性の形質転換体の一つから、ＡＴリッチな
ＮＨ₂ 末端側ＤＮＡ配列（天然型ＣＣアシラーゼＮ１７
６のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする）
をもつ所望のプラスミドｐＣＣ０１３Ａを単離した。

【００６０】（２）天然型ＣＣアシラーゼＮ１７６のカ
ナマイシン耐性発現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築 （ｉ）ｐΔＮ１７６の構築 プラスミドｐＣＫ００２（１．０μｇ）をＡａｔII（東
洋紡績（株）製）で消化し、得られたＤＮＡを自己結合
させる為にＴ４ＤＮＡリガーゼ（１５０ユニット）で処
理した。かかる結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１
０９を形質転換し、ユニークなＡａｔII制限酵素切断部
位を担持する所望のプラスミドｐΔＮ１７６を取得し
た。

【００６１】（ii）ｐＣＫ０１３の構築 プラスミドｐΔＮ１７６（１．０μｇ）をＡａｔIIで消
化し、直線化したＤＮＡを細菌由来のアルカリホスファ
ターゼ（１ユニット、宝酒造製）で、１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、４２℃にて１時間処理し
た。その脱リン酸化されたＤＮＡを単離して、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いてｐＣＣ０１３Ａ由来の２．５ｋｂの
ＡａｔIIＤＮＡに結合した。該結合混合物を用いてＥ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換し、マーカーとしてカナ
マイシン耐性遺伝子を担持する所望のプラスミドｐＣＫ
０１３を取得した。

【００６２】実施例４ ＣＣアシラーゼＮ１７６をコー
ドするＤＮＡのクンケル法によるポイントミューテーシ
ョン （１）ＣＣアシラーゼＮ１７６をコードするＤＮＡのＭ
１３ファージへのサブクローニング （ｉ）ｍｐ１８ＶＶＲの調製 プラスミドｐＣＣ０１３ＡをＥｃｏＲＶで消化し、ＣＣ
アシラーゼＮ１７６のＩｌｅ⁹²からＡｓｐ³¹⁵ までをコ
ードする７９５ｂｐのＤＮＡを単離した。該ＤＮＡを、
ＨｉｎｃIIで消化されたＭ１３ｍｐ１８に、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結し、該結合混合物を用いてＥ．ｃ
ｏｌｉＪＭ１０９を形質転換した。プラークのうちの一
つから、上記アシラーゼＤＮＡ部分がＭ１３のｏｒｉを
含むＤＮＡを伴って逆方向に挿入された所望のＲＦ Ｄ
ＮＡｍｐ１８ＶＶＲを単離し、制限酵素マッピングによ
りその特性を調べた。該ＲＦ ＤＮＡｍｐ１８ＶＶＲか
ら調製されたファージ溶液を使用するまで４℃で保存し
た。

【００６３】上述と同様の方法で、ｐＣＣ０１３Ａ由来
の１１６２ｂｐのＨｐａＩ／Ｅｃｏ４７III ＤＮＡと
ＨｉｎｃIIで消化した７２５０ｂｐのＭ１３ｍｐ１８か
ら、ＲＦ ＤＮＡｍｐ１８ｐ１８３を調製した。

【００６４】（ii）一本鎖Ｕ−ｍｐ１８ＶＶＲ−ＳＳの
調製（Kunkel, T.A. et al., MethodsEnzyml. 154, 367
参照) ：Ｅ．ｃｏｌｉＣＪ２３６（ｄｕｔ−，ｕｎｇ
−，Ｆ’）（バイオ・ラッドラボラトリーズ製）のシン
グルコロニーをクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍ
ｌ）を含有する２ＸＴＹブロス２ｍｌ中で３７℃、１６
時間培養した。細胞（０．１ｍｌ）を３０μｇ／ｍｌク
ロラムフェニコールを含有する新鮮な２ＸＴＹブロス
（５０ｍｌ）に移し、３７℃で培養を継続した。６００
ｎｍでの吸光度が０．３に達したとき、該培養物にｍｐ
１８ＶＶＲのファージ溶液（ＭＯＩ＜０．２）を添加
し、さらに５時間培養を続けた。得られた培養物を４
℃、１７，０００×ｇで１５分間遠心をした後、再び上
清を遠心した。その結果得られた上清（３０ｍｌ）を室
温下、３０分間ＲＮａｓｅ（１５０μｇ／ｍｌ，シグマ
社製）で処理し、７．５ｍｌのＰＥＧ溶液（３．５Ｍ
ＮＨ₄ ＯＡｃの２０％ポリエチレングリコール８，００
０溶液）を添加した。遠心（１７，０００×ｇ，１５
分，４℃）後、残渣を３００ｍＭ ＮａＣｌ，１００ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）及び０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
からなる緩衝液２００μｌに懸濁した。得られた溶液を
フェノール２００μｌおよびフェノール／ＣＨＣｌ
₃ （１／１）２００μｌで抽出し、続いてＣＨＣｌ
₃ （２００μｌ）で２回洗浄した。該溶液に、７．５Ｍ
ＮＨ ₄ ＯＡｃ（１００μｌ）とエタノール（６００μ
ｌ）を添加してファージＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮＡ
を遠心により回収し、氷冷９０％エタノール７００μｌ
で洗浄し、真空下で乾燥させた。精製された１本鎖Ｕ−
ＤＮＡ（Ｕ−ｍｐ１８ＶＶＲ−ＳＳ）をＴＥ緩衝液２０
μｌで懸濁し、使用するまで４℃で保存した。クンケル
の変異方法に用いる他の１本鎖Ｕ−ＤＮＡもまた上述と
同様の方法で調製した。

【００６５】（２）変異型ＣＣアシラーゼＣ３０５Ｓを
コードするＲＦ ＤＮＡの調製 （ｉ）オリゴデオキシリボヌクレオチドのリン酸化 ＤＮＡオリゴマーＳＮ−６（１．８４μｇ，約１６７ｐ
ｍｏｌ）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（４．５ユ
ニット、宝酒造製）を用いて、５０ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、２０ｍＭジチオス
レイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭ ＡＴＰ及び５０μｇ／
ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなるライゲーシ
ョン緩衝液３０μｌ中で、３７℃で１時間リン酸化し
た。

【００６６】（ii）アニーリング反応 １０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 及び４０ｍＭ ＮａＣｌからなる緩衝液９μｌ中にお
いて、(i) でリン酸化されたオリゴマー（１μｌ、約
５．６ｐｍｏｌ）を鋳型Ｕ−ｍｐ１８ＶＶＲ−ＳＳ
（０．１０ｐｍｏｌ、約２５０ｎｇ）と混合した。該混
合物を７０℃、５分間加熱して、その後４０分かけて３
０℃で冷却して０℃で静置した。

【００６７】（iii)ｉｎ ｖｉｔｒｏでの２重鎖ＤＮＡ
の合成 得られたアニーリング溶液（１０μｌ）を、合成緩衝液
〔２００ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８．０）−４０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 〕１μｌ、５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄ
ＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）１μｌ、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（３００ユニット、宝酒造製）およびＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ（１０ユニット、ファルマシア）と混合
した。該混合物を氷上で５分間、２５℃で５分間、さら
に３７℃で９０分間、順次インキューベーションした。
１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）および１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡからなる緩衝液９０μｌを添加して、反応を停止
させた。

【００６８】（iv）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の形質転換 （iii)で得られた合成ＤＮＡ溶液（３μｌ）をＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０９のコンピテントセル（２００μｌ）に添
加し、該セルを氷上で３０分間インキュベーションし
て、形質転換体を得た。一方、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
のシングルコロニーをＬブロス（２ｍｌ）中で１６時間
培養した。該培養物（０．１ｍｌ）を新鮮なＬブロス
（２ｍｌ）に移し、更に２時間培養して、インディケー
ターセルを取得した。形質転換された細胞（２００μ
ｌ）に、インディケーターセル（２００μｌ）を加え
て、それらを５５℃で前加熱したＨ−Ｔｏｐ寒天（１％
バクトトリプトン、０．８％ＮａＣｌ、０．８％寒天）
３ｍｌと混合した。該細胞−寒天混合物をＨプレート
（１％バクトトリプトン、０．５％ ＮａＣｌ、１．５
％寒天）上に延展し、そのプレートを３７℃で１６時間
培養した。

【００６９】（ｖ）形質転換体から得られたＲＦ ＤＮ
Ａの特性Ｅ ．ｃｏｌｉＪＭ１０９のシングルコロニーを２ＸＴＹ
ブロス（１．６％バクトトリプトン、１％酵母抽出物、
０．５％ＮａＣｌ）２ｍｌ中で１６時間培養した。該培
養物（０．１ｍｌ）を新しい２ＸＴＹブロス（２ｍｌ）
に移し、更に２時間培養した。ステップ（iv）で調製さ
れたプレートのプラークを竹製爪楊枝（１５ｃｍ）で拾
い、爪楊枝を直ちに先に培養した２ＸＴＹブロスに移し
た。培養を３７℃、５〜６時間続けた。該培養物１ｍｌ
から、室温下１５秒、１０，０００ｒｐｍで遠心するこ
とにより、細胞を収集し、上清（次の実験でのＲＦ Ｄ
ＮＡの大量調製のために使用されるファージ溶液）につ
いては、使用するまで４℃で保存した。該細胞をＧＴＥ
緩衝液〔５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ８．０）、２５ｍＭ ＥＤＴＡ〕１００μｌに懸濁
し、アルカリ−ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％
ＳＤＳ）２００μｌと緩やかに混合し、そしてボルテッ
クスＴＭミキサーを用いて高塩緩衝液（３Ｍ ＫＯＡ
ｃ、３Ｍ ＡｃＯＨ）１５０μｌと激しく混合した。得
られた混合液を室温で５分間、１０，０００ｒｐｍで遠
心した。得られた上清（４００μｌ）をイソプロピルア
ルコール３００μｌで処理し、１０，０００ｒｐｍで５
分間遠心した。その上層部（３００μｌ）を分離し、エ
タノール６００μｌと混合した。その混液を遠心（１
０，０００ｒｐｍ、５分）した後、得られた沈澱を氷冷
７０％エタノール５００μｌで洗浄し、真空下で乾燥
し、ＲＮａｓｅ（シグマ社製）１μｇ／ｍｌを含有する
ＴＥ緩衝液５０μｌに懸濁し、ＲＦ ＤＮＡ ｍｐ１８
ＶＶＲＣ３０５Ｓ溶液を得た。該ＲＦＤＮＡ溶液の一部
分（１０μｌ）をＳｐｈＩを用いた制限エンドヌクレア
ーゼマッピングに用いた。これは、変異を調べるため、
ＤＮＡオリゴマーＳＮ−６がその配列中にＳｐｈＩ認識
部位を計画的に含んでいることによる。

【００７０】（３）変異型ＣＣアシラーゼＭ２６９Ｙを
コードするＲＦ ＤＮＡの調製 変異型ＲＦ ＤＮＡ（ｐ１８３Ｍ２６９Ｙと命名）を上
述の方法と同様にｍｐ１８ｐ１８３の一本鎖Ｕ−ＤＮＡ
（鋳型として）、及びプライマーＺ６１（ＡＴＧＣＴＧ
ＣＧＣＡＴＡＡＴＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＧ）から
調製した。

【００７１】（４）変異型ＣＣアシラーゼＡ２７１Ｙを
コードするＲＦ ＤＮＡの調製 変異型ＲＦ ＤＮＡ（ｍｐ１８ＶＶＲＡ２７１Ｙと命
名）を上述の方法と同様にｍｐ１８ＶＶＲと合成ＤＮＡ
オリゴマーＳＮ−１６から調製した。

【００７２】（５）ｍｐ１８ＶＶＲ（ＳＮ−２１）と名
付けられたＲＦ ＤＮＡの調製 Ｇｌｙ²³⁸ Ｓｅｒ²³⁹ 位ＢａｍＨＩサイレント変異体を
コードする変異ＲＦＤＮＡを上述の方法と同様の方法に
て、ｍｐ１８ＶＶＲと合成ＤＮＡオリゴマーＳＮ−２１
から調製した。

【００７３】実施例５ 発現ベクターの構築 （１）アンピシリン耐性型発現ベクターの構築 （ｉ）ｐＹＳＣ３０５Ｓの構築 実施例４で得られたＲＦ ＤＮＡ（ｍｐ１８ＶＶＲＣ３
０５Ｓと表示）（１０μｇ）をＢｓｔＢＩ（５ユニッ
ト、ニューイングランドバイオラボラトリーズ製）およ
びＸｈｏＩ（５ユニット、東洋紡績（株）製）で消化し
た。得られた１６２ｂｐのＤＮＡフラグメントを５％の
ＰＡＧＥにかけて消化混合物から単離した。一方、ｐＣ
Ｃ０１３Ａ（１０μｇ）をＸｈｏＩ（５ユニット）およ
びＮｃｏＩ（５ユニット、東洋紡績（株）製）で消化
し、１２８ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離した。さら
に、ｐＣＣ０１３Ａ（１０μｇ）をＢｓｔＢＩ（５ユニ
ット）及びＮｃｏＩ（５ユニット）で消化し、大型ＤＮ
Ａを単離した。１６２ｂｐのＢｓｔＢＩ／ＸｈｏＩ Ｄ
ＮＡ、１２８ｂｐのＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ ＤＮＡおよび
６ｋｂのＢｓｔＢＩ／ＮｃｏＩ ＤＮＡをライゲーショ
ン緩衝液２０μｌ中で４℃、１６時間条件で連結した。
該ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０
９を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体の一
つから、ｐＹＳＣ３０５Ｓと称する所望のプラスミドを
単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化により、その特性
を調べた。

【００７４】（ii）ｐＹＳＡ２７１Ｙの構築 変異型ＣＣアシラーゼＡ２７１Ｙの発現ベクター（ｐＹ
ＳＡ２７１Ｙ）を、上述と同様の方法でｍｐ１８ＶＶＲ
Ａ２７１Ｙから調製した。

【００７５】（iii)ｐＥＸ２１の構築 Ｇｌｙ²³⁸ ／Ｓｅｒ²³⁹ のＢａｍＨＩサイレント変異体
の発現ベクター（ｐＥＸ２１）を、上述と同様の方法で
ｍｐ１８ＶＶＲ（ＳＮ−２１）から調製した。

【００７６】（２）カナマイシン耐性型発現ベクターの
構築 （ｉ）ｐＣＫ３０５の構築 プラスミドｐＹＳＣ３０５ＳをＭｌｕＩ及びＮｃｏＩで
消化し、８７２ｂｐのＤＮＡを単離した。一方、ｐＣＫ
０１３をＮｃｏＩ及びＭｌｕＩで消化し、大型ＤＮＡ
（約６．０ｋｂ）を単離した。得られたＤＮＡをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて先に得られた８７２ｂｐのＤＮＡ
フラグメントと連結し、マーカーとしてカナマイシン耐
性遺伝子を担持する所望のプラスミドｐＣＫ３０５を得
た。

【００７７】（ii）ｐＣＫ２７１Ｙの構築 プラスミドｐＣＫ２７１Ｙをまた、上述と同様の方法
で、ｐＣＫ０１３およびｐＹＳＡ２７１Ｙから調製し
た。

【００７８】（iii)ｐＣＫ３０５Ｂの構築 ｐＣＫ３０５をＢｓｔＢＩ及びＭｌｕＩで消化して得ら
れる大型ＤＮＡと、ｐＥＸ２１をＢｓｔＢＩ及びＭｌｕ
Ｉで消化して得られる小型ＤＮＡとからプラスミドｐＣ
Ｋ３０５Ｂを調製した。

【００７９】（iv）ｐＣＫ２６９Ｙの構築 ｐ１８３Ｍ２６９ＹをＭｌｕＩとＮｃｏＩで消化した。
小型ＤＮＡフラグメント（８７２ｂｐ）を単離し、それ
を、ＭｌｕＩとＮｃｏＩを用いて消化したｐＣＫ０１３
の大型ＤＮＡ（５．９ｋｂ）に、ライゲーション緩衝液
２０μｌ〔５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ₂ 、２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ
ＡＴＰ、５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ〕中で連結した。該
結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質転換
した。これらの形質転換体の一つから、所望のプラスミ
ドｐＣＫ２６９Ｙを単離し、制限エンドヌクレアーゼ消
化により、その特性を調べた。

【００８０】実施例６ Ｍ２６９ＹＣ３０５Ｓ二重変異
型アシラーゼの発現ベクターであるｐ２６９Ｙ３０５Ｓ
の構築 （１）ｐＣＫ３０５のＢｓｔＢＩ／ＮｃｏＩ ＤＮＡの
変異化と増幅 変異化と増幅は、ザイモリアクターＡＢ−１８０（ＡＴ
ＴＯ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を使用して、Ｔａｑ緩衝液〔５
０ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラ
チン〕中、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造製）を用いて行
った。プライマーＳＮ−５７（ＣＡＴＣＧＣＧＴＣＴＴ
ＣＧＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＴＡＴＴＡＴＧＣＧＣＡＧ
ＣＡＴ）およびＳＮ−４２（ＡＴＡＡＣＣＧＧＧＣＣＡ
ＴＧＧＣＧＡＧＴＣＴＣＧＡＣＧ）（各々１２５ｐｍｏ
ｌ）を、ｄＮＴＰ（各２００μｍｏｌ）とＴａｑポリメ
ラーゼ（１．２５Ｕ）を含むＴａｑ緩衝液（１００μ
ｌ）中でｐＣＫ３０５（０．５ｆｍｏｌ）と混合した。
該混合液の液表面を、鉱油を数滴添加することによって
被覆した。該混合液を、初期変性（９８℃、２分間）、
次に３０サイクルの増幅（９８℃２分間、４８℃２分
間、７２℃３分間）、最終延長（７２℃、８分間）処理
に供した。得られた混合液の水層をクロロホルムで洗浄
し、フェノールで抽出してエタノールで処理した。遠心
後、回収されたＤＮＡをＢｓｔＩ及びＮｃｏＩで消化し
た。その結果得られた２９０ｂｐのＤＮＡを単離し、そ
れをｐＣＫ３０５をＢｓｔＩ及びＮｃｏＩ消化すること
によって得られる大型ＤＮＡフラグメントに結合した。
該結合混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９を形質
転換した。その形質転換体の一つから、所望のプラスミ
ドｐ２６９Ｙ３０５Ｓを単離し、制限エンドヌクレアー
ゼ消化により、その特性を調べた（図１）。

【００８１】実施例７ 変異型アシラーゼのＤＮＡ配列 （１）ｐＹＳＣ３０５Ｓの配列 （ｉ）Ｍ１３ｍｐ１８へのサブクローニング：ｐＹＳＣ
３０５ＳをＥｃｏＲＶとＳｍａＩで消化し、変異型ＣＣ
アシラーゼＣ３０５ＳのＧｌｙ²⁶⁸ からＡｓｐ³¹⁵ まで
をコードする２６５ｂｐのＤＮＡを単離した。一方、Ｍ
１３ｍｐ１８をＳｍａＩで消化し、直線化ＤＮＡを単離
した。当該ＤＮＡを先に得られた２５６ｂｐのＳｍａＩ
／ＥｃｏＲＶ ＤＮＡに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
結合し、該結合混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０３
を形質転換した。プラークの一つから、変異型アシラー
ゼＤＮＡ部分（ＮＨ₂ からＣＯＯＨまで）をＭ１３ファ
ージのｏｒｉを含む部分を伴って、右回り方向に担持す
る、所望の一本鎖ファージＤＮＡｍｐ１８Ｃ３０５Ｓ
（＋）を得た。

【００８２】（ii）Ｍ１３ｍｐ１９へのサブクローニン
グ (i) で得られたｍｐ１８Ｃ３０５Ｓ（＋）からＲＦ Ｄ
ＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で消化し
て、３１６ｂｐのＤＮＡフラグメントを取得した。一
方、Ｍ１３ｍｐ１９をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII で消
化し、大型ＤＮＡ（約７．２ｋｂ）を単離した。当該Ｄ
ＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて先に得られた３１６
ｂｐのＤＮＡに結合し、該結合混合物を用いてＥ．ｃｏ
ｌｉＪＭ１０３を形質転換した。プラークの一つから、
変異型アシラーゼＤＮＡ部分をｍｐ１８Ｃ３０５Ｓ
（＋）に対して逆方向に担持する、所望の一本鎖ファー
ジＤＮＡｍｐ１９Ｃ３０５Ｓ（−）を得た。

【００８３】（iii)シークエンス反応 １本鎖ファージＤＮＡｍｐ１８Ｃ３０５Ｓ（＋）および
ｍｐ１９Ｃ３０５Ｓ（−）のＤＮＡ配列をＴ７ポリメラ
ーゼ（Sequenase TM）を用いてモデル３７０ＡＤＮＡシ
ークエンサー（アプライドバイオシステムズ製）にて、
決定した。両鎖のヌクレオチド配列を測定したところ、
ｐＹＳＣ３０５ＳのＤＮＡ配列は、予想されたものと一
致することが確認された（表３参照）。ｐＹＳＡ２７１
ＹのＤＮＡ配列を上述と類似の方法で測定したところ、
予想されたものと一致することがわかった。

【００８４】（３）ｐＣＫ２６９Ｙ、ｐ２６９Ｙ３０５
Ｓ及びｐＣＫ３０５Ｂのヌクレオチド配列決定 ｐＣＫ２６９Ｙ、ｐ２６９Ｙ３０５Ｓ及びｐＣＫ３０５
Ｂのヌクレオチド配列を直接、３７３Ａ型ＤＮＡシーク
エンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用い
て、Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ^TM法にて決定した。ＤＮＡオリ
ゴマーＳＮ６３（ＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣ
ＧＡＴＧ、コーディング鎖：ヌクレオチドＮｏ．６７１
−６９１）およびＳＮ６４（ＧＧＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣ
ＧＴＴＧＣＣＧＡＡ、逆鎖：ヌクレオチド鎖Ｎｏ．９９
８−１０１８）をプライマーに用いた。決定された配列
は予想されたものと一致していた。

【００８５】実施例８ 組換えＥ．ｃｏｌｉの培養 （１）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＹＳＣ３０５Ｓの培
養Ｅ ．ｃｏｌｉＪＭ１０９をｐＹＳＣ３０５Ｓ（１ｍｌ）
で形質転換して調製された形質転換体であるＥ．ｃｏｌ
ｉＪＭ１０９／ｐＹＳＣ３０５Ｓのグリセロールストッ
クを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有１００ｍｌＬブ
ロス（１％バクトトリプトン、０．５％酵母抽出物、
０．５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に移し、該混合物を
３０℃で８時間培養した。該培養物（０．２ｍｌ）を５
０μｇ／ｍｌアンピシリン含有２０ｍｌＭＳブロス
（１．２％バクトトリプトン、２．４％酵母抽出物、
１．２５％グリセロール、０．１１％ロイシン、０．１
１％プロリン、０．１１％イソロイシン、１．２５％
Ｋ₂ ＨＰＯ₄ 、０．３８％ ＫＨ₂ＰＯ₄ 、５０μｇ／
ｍｌチアミン・塩酸、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、
０．２ｍＭ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ、０．０５ｍＭ Ｆ
ｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ）に添加し、該混合液を３０℃で１
６時間培養した。得られた培養物（３．４ｍｌ）を、１
％のグリセロールと２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
む２％Ｍ９ＣＡブロス（２％カザミノ酸、１．５２％
Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ、０．３％ ＫＨ ₂ Ｐ
Ｏ₄ 、０．１％ ＮＨ₄ Ｃｌ、０．０５％ ＮａＣｌ、
２ｍＭ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂ Ｏ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ
₂ ・２Ｈ₂ Ｏ、５０μｇ／ｍｌチアミン・塩酸、ｐＨ
７．２）に添加し、その混合液を２０℃で激しく振盪し
ながら培養した（３５０−４００ｒｐｍ／ｍｉｎ）。８
時間目に、３−インドールアクリル酸を最終濃度が２０
μｇ／ｍｌになるように該培養物に添加し、更に４０時
間培養を継続した。得られた培養物のうち２０ｍｌを４
℃下、７，０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、
細胞を集め、それをＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍｌ
に懸濁し、超音波処理により破砕した。該破砕物を、４
℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心して不溶解物質
を除去した。得られた上清は４℃で保存され、ＣＣアシ
ラーゼ活性およびＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性を測定
するために、及び精製された変異型ＣＣアシラーゼＣ３
０５Ｓを調製するために使用された。

【００８６】アンピシリン耐性発現ベクターｐＣＣ００
２Ａ、ｐＣＣ０１３Ａ、ｐＹＳＣ３０５Ｓ、ｐＹＳＡ２
７１ＹおよびｐＥＸ２１をそれぞれ担持する他の全ての
Ｅ．ｃｏｌｉを上述と同様な方法で培養した。カナマイ
シン耐性発現ベクターｐＣＫ０１３、ｐＣＫ３０５Ｂ、
ｐＣＫ３０５、ｐＣＫ２６９Ｙ、ｐＣＫ２７１Ｙ及びｐ
２６９Ｙ３０５Ｓをそれぞれ担持するその他のＥ．ｃｏ
ｌｉを上述と同様の方法で、アンピシリンの代わりにカ
ナマイシンを含有した対応ブロス中で培養した。

【００８７】実施例９ アシラーゼの精製と特性 （１）ＣＣアシラーゼＮ１７６の精製 培養物２０ｍｌから得られたＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／
ｐＣＣ０１３Ａの破砕物（２０ｍｌ）に、硫酸アンモニ
ウム（４．１８ｇ、最終濃度：３５％飽和）を添加し、
該混合物を室温で２０分間攪拌した。得られた混合液を
遠心（２０℃、１５，０００ｒｐｍ、２０分間）し、上
清を集めて硫酸アンモニウム処理した（５．５６ｇ、最
終濃度：７５％飽和）。遠心（２０℃、１５，０００ｒ
ｐｍ、２０分間）により沈澱物を集め、それを１００ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ９．０）５ｍｌに溶解した。得られ
た溶液を４℃で１００ｍＭトリス塩酸緩衝液各々４Ｌに
対して２回の透析を行った。得られた透析物をＭｉｌｌ
ｅｘ−ＨＶ^TM（０．４５μｍ、ミリポア）で濾過し、高
速液体クロマトグラフィーにより精製した〔カラム；Ｔ
ＳＫｇｅｌ^TM ＤＥＡＥ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−５ＰＷ
（東ソー）、溶離液；Ａ：２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．０）、Ｂ：０．５Ｍ ＮａＣｌ−トリス塩酸（ｐＨ
８．０）、グラジェント；始め：Ａ（８０％）＋Ｂ（２
０％）、終わり（３０分後）：Ａ（５０％）＋Ｂ（５０
％）、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕。約０．１６Ｍ濃度
のＮａＣｌ溶液と共に溶出したメインピークを集め、ト
リス塩酸（ｐＨ９．０）４Ｌに対して透析して、純粋な
天然型組換えＣＣアシラーゼＮ１７６を得た。

【００８８】精製されたアシラーゼを逆相ＨＰＬＣカラ
ム〔ＣＯＳＭＯＳＩＬ４．６ｍｍ×５０ｍｍ（ナカライ
テスク製）、溶離液；Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）、Ｂ：６０％アセトニトリル含有０．０５％
ＴＦＡ、グラジェント；開始：Ａ（４０％）＋Ｂ（６０
％）、終わり（２０分後）：Ａ（０％）＋Ｂ（１００
％）〕、およびドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。
そのようにして得られたアシラーゼの純度は、ＨＰＬＣ
及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、約９５％であった。他の
変異型アシラーゼについて、上述と同様の方法で精製、
分析を行った。

【００８９】（２）比活性の測定 （ｉ）ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性 ３７℃で１０分間プレインキュベーションしたＧＬ−７
ＡＣＡ溶液２００μｌ〔０．１５Ｍトリス塩酸（ｐＨ
８．７）中に１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨは１Ｎ ＮａＯＨで
８．７に再調整された〕に、サンプルアシラーゼ２０μ
ｌを添加して、該混合液を３７℃で５分間インキュベー
ションした。これに、５％酢酸を２２０μｌ添加するこ
とにより反応を止めた。得られた混合液を遠心し（室温
下、１０，０００ｒｐｍで５分間）、上清を用いて７Ａ
ＣＡの生成を測定した。ＨＰＬＣ条件：カラム；ＴＳＫ
ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ ＴＭＣＴＲ ４．４ｍｍ×１０
０ｍｍ（東ソー製）、溶離液；５％（ｗ／ｖ）酢酸アン
モニウム含有３％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、流速；
１．０ｍｌ／ｍｉｎ、注入量；１０μｌ、検出器２５４
ｎｍ１ユニットを、３７℃で１分間にＧＬ−７ＡＣＡか
ら１．０μｍｏｌの７ＡＣＡを生成しうる活性として定
義した。

【００９０】（ii）ＣＣアシラーゼ活性 ３７℃で１０分間プレインキュベーションしたＣＣアシ
ラーゼ溶液２００μｌ〔１０ｍｇ／ｍｌセファロスポリ
ンＣナトリウム塩を含む０．１５Ｍトリス塩酸（ｐＨ
８．７）溶液、ｐＨは１Ｎ ＮａＯＨで８．７に再調整
された〕に、サンプルアシラーゼ２０μｌを添加して、
該混合液を３７℃で３０分間インキュベーションした。
これに、５％酢酸を２２０μｌ添加することにより反応
を止めた。得られた混合液を遠心し（室温下、１０，０
００ｒｐｍで５分間）、上清を用いて７ＡＣＡの生成を
測定した。 ＨＰＬＣ条件：カラム；ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０
ＴＭＣＴＲ ４．４ｍｍ×１００ｍｍ（東ソー製）、溶
離液；２０ｍＭ，テトラブチルアンモニウムブロマイド
−１０％（ｗ／ｖ）アセトニトリル、流速；１．０ｍｌ
／ｍｉｎ、注入量；２０μｌ、検出器２５４ｎｍ １ユニットを、３７℃下で１分間にセファロスポリンＣ
ナトリウム塩から１．０μｍｏｌの７ＡＣＡを生成しう
る活性として定義した。変異型アシラーゼの比活性は、
上述の方法に従って測定した。

【００９１】（３）天然型および変異型アシラーゼのア
ミノ末端配列の決定 （ｉ）ＣＣアシラーゼＮ１７６の両鎖の単離：精製され
たＣＣアシラーゼＮ１７６を逆相ＨＰＬＣに付した〔カ
ラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ４（４．６ｍｍ×３５ｍ
ｍ，ナカライテスク製）、溶離液；０．０５％ＴＦＡ
中、アセトニトリル初濃度３６％から２０分で６０％の
直線グラジェント、流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕。ＣＣ
アシラーゼＮ１７６のβ鎖およびα鎖は、それぞれ約４
８％および約５１％濃度のアセトニトリルと共に溶出さ
れた。各溶出液を集め、凍結乾燥して、アシラーゼのα
（β）鎖を得た。

【００９２】（ii）アミノ末端配列の決定 当該α（β）鎖のアミノ末端配列を、気相シークエンサ
ー４７０Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定
し、予想されたものと一致することを確認した。

【００９３】実施例１０ （１）Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐ２６９Ｙ３０５Ｓの
培養Ｅ ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐ２６９Ｙ３０５Ｓのグリセ
ロールストックを５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有
するＬブロス１００ｍｌに加え、３０℃で８時間培養し
た。得られた培養物の一部（３．７５ｍｌ）をＮ−３ブ
ロス（成分：５％大豆加水分解物，１％グリセロール，
０．６０８％ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ，０．７％ ＫＨ₂ ＰＯ
₄ ，０．７％ Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ，０．１２％（ＮＨ₄ ）₂
ＳＯ₄ ，０．０２％ ＮＨ₄ Ｃｌ，０．００１１％ Ｆ
ｅＳＯ₄ ，０．０９６％ ＭｇＳＯ₄ ，０．００２５％
カナマイシン，０．００１１％ ＣａＣｌ₂ ，０．０
００２８％ ＭｎＳＯ₄ ・ｎＨ₂ Ｏ，０．０００２８％
ＡｌＣｌ₃ ・６Ｈ₂ Ｏ，０．０００１１％ ＣｏＣｌ
₂ ・６Ｈ₂ Ｏ，０．００００５５％ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ
₂ Ｏ，０．００００５５％ ＮａＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ，
０．００００２８％ＣｕＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ，０．０００
０１４％ Ｈ₃ ＢＯ₄ ）２５ｍｌに添加した。培養は２
０〜２２℃で行った。１６時間後に、グリセロール及び
ＩＡＡをそれぞれ最終濃度が１％および２０μｇ／ｍｌ
となるように該培養物に添加し、２４時間後に再びグリ
セロールを最終濃度１％になるように該培養物に添加し
た。３０時間後に培養物の吸光度Ａ６００が１５．０に
達したとき、細胞を遠心（４℃，７０００rpm ，１０分
間）により採取し、超音波処理により破砕した。それを
遠心した後、上清を集め、そのＧＬ−７ＡＣＡアシラー
ゼ活性を測定した（４１．１ユニット／ｍｌ培養物）。

【００９４】（２）変異型ＣＣアシラーゼＭ２６９Ｙ／
Ｃ３０５Ｓの精製Ｅ ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐ２６９Ｙ３０５Ｓを上述と
同様の方法で５Ｌ容のジャーファーメンター中で培養し
た。２Ｌの培養物から得られた細胞を２０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．０）１．５Ｌ中で懸濁し、マントン−ゴー
リンにより破砕した（５００ｋｇ／ｃｍ，２，３回）。
それを遠心（４℃、７，０００rpm 、３０分間）した
後、上清をＰｏｌｙｍｉｎ Ｐ（最終濃度０．０１％）
で処理した。この混合物を７，０００rpm で３０分間、
更に１５，０００rpm で２０分間連続的に遠心した。上
清を０．４５μｍ ＭＦ膜を用いて濾過滅菌し、粗アシ
ラーゼ２０．１ｇ（ＨＰＬＣ分析）を得た。該アシラー
ゼ（４．８ｇ）をＱＡＥ−トーヨーパール５５０Ｃカラ
ムクロマトグラフィー〔条件：カラム；５．０×１３ｃ
ｍ（２６０ｍｌ），開始平衡溶液；２０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０），溶出液；０．５Ｍ ＮａＣｌ−２０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０），流速；１０ｍｌ／ｍｉ
ｎ〕により精製して、３．４５ｇの精製された変異型Ｃ
ＣアシラーゼＭ２６９Ｙ／Ｃ３０５Ｓを得た。精製され
たＭ２６９Ｙ／Ｃ３０５Ｓの比活性は、実施例９−(2)
で述べた方法に従って測定されたＣＣアシラーゼと同様
に２．１４ユニット／ｍｇであった。

【００９５】（３）天然型ＣＣアシラーゼ及び変異型Ｃ
ＣアシラーゼＣ３０５Ｓの発現の比較Ｅ ．ｃｏｌｉＨＢ１０１を常法によりプラスミドｐＣＫ
３０５またはｐＣＫ０１３で形質転換することによって
調製されたＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＣＫ３０５（ま
たはＨＢ１０１／ｐＣＫ０１３）のグリセロールストッ
ク溶液（１ｍｌ）を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを
含有するＬブロス２０ｍｌに移し、該混合物を３０℃で
８時間培養した。該培養物（０．２ｍｌ）を５０μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有するＭＳブロス（成分：１．
２％バクトトリプトン，２．４％酵母抽出物，１．２５
％グリセロール，０．１１％ロイシン，０．１１％プロ
リン，０．１１％イソロイシン，１．２５％ Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ ，０．３８％ ＫＨ₂ＰＯ₄ ，５０μｇ／ｍｌチア
ミン塩酸，２ｍＭ ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ，０．２ｍＭ
ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ，０．０５ｍＭ ＦｅＳＯ₄ ・
７Ｈ₂ Ｏ）２０ｍｌに添加し、３０℃で１６時間培養し
た。得られた培養物（６ｍｌ）を１％グリセロールおよ
び２５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２％のＭ９Ｃ
Ａブロス（成分：２％カザミノ酸，１．５２％ Ｎａ₂
ＨＰＯ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ，０．３％ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ，０．
１％ ＮＨ₄ Ｃｌ，０．０５％ ＮａＣｌ，２ｍＭ Ｍ
ｇＳＯ ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ，０．２ｍＭ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂
Ｏ，５０μｇ／ｍｌチアミン塩酸，ｐＨ７．２）に添加
し、該混合物を３０℃で激しく攪拌しながら（３５０〜
４００ｒｐｍ／ｍｉｎ）培養した。６時間後、該培養物
に３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を最終濃度が４
０μｇ／ｍｌとなるように添加し、培養を更に４０時間
続けた。細胞を４℃、１４，０００rpm で１５分間遠心
することにより採取し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）４０
ｍｌに再懸濁して超音波処理により破砕した。該破砕物
を４℃、１４，０００rpm で２０分間遠心して上清
（“スープ”画分と称する）を得た。残渣を１００ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡおよび８
Ｍ尿素を含む緩衝液４０ｍｌに懸濁し、超音波処理によ
り破砕した。それを遠心して不溶解物を除去した後、上
清を回収した（“ｐｐｔ”画分と称する）。変異型ＣＣ
アシラーゼＣ３０５Ｓおよび天然型ＣＣアシラーゼＮ１
７６それぞれの“スープ”画分と“ｐｐｔ”画分を１５
％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。細胞の不溶解性
前駆体蛋白質は、天然型ＣＣアシラーゼから変異型ＣＣ
アシラーゼＣ３０５Ｓへの変異により非常に減少した。
結果は、逆相ＨＰＬＣで測定した“スープ”中の成熟ア
シラーゼ（天然型ＣＣアシラーゼまたは変異型ＣＣアシ
ラーゼＣ３０５Ｓ）の量と一致していた（表５）。

【００９６】

【表５】

【００９７】実施例１１ 〔カセット変異による変異型
ＣＣアシラーゼＭ２６９（２６９位のＭｅｔを他のアミ
ノ酸で置換したもの）の調製〕 ｐＣＫＨ２７４ＱのＢｓｔＢＩ位とＮｈｅＩ位の間のＤ
ＮＡを、対応する変異アミノ酸配列をコードする合成Ｄ
ＮＡオリゴマーで置換することによって、変異ＣＣアシ
ラーゼＭ２６９ＹおよびＭ２６９Ｔ以外のＭ２６９変異
体を調製した（カセット変異法）。

【００９８】（１）ｐＣＫＨ２７４Ｑの調製 （ｉ）ｍｐ１８ｐ１８３（Ｈ２７４Ｑ）の調製 実施例４に記載したクンケル法により、Ｈｉｓ²⁷⁴ 〜Ａ
ｌａ²⁷⁶ のＤＮＡ配列にＮｈｅＩ部位を担持する変異型
ＲＦ ＤＮＡ ｍｐ１８ｐ１８３（Ｈ２７４Ｑ）を、ｍ
ｐ１８ｐ１８３および合成ＤＮＡオリゴマーＺ８４（３
０−ｍｅｒ，５’−ＣＣＧＧＴＣＧＣＡＧＧＣＴＡＧＣ
ＴＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣＡＴＡ）とから調製した。

【００９９】（ii）ｐＣＫＨ２７４Ｑの調製 実施例５−(2)− (iv) の記載と同様の方法で、ｐＣＫ
０１３のＭｌｕＩとＮｃｏＩとの間の小型ＤＮＡを、ｍ
ｐ１８ｐ１８３（Ｈ２７４Ｑ）の対応するＤＮＡで置換
することによって、ｐＣＫＨ２７４Ｑを調製した。

【０１００】（２）Ｍ２６９Ｖの調製 実施例２−(1)−(ii)と同様の方法で、合成オリゴマー
であるＳＯ−Ｍ２６９Ｖｃ（５’−ＣＧＡＡＡＴＣＣＣ
ＡＧＧＣＧＴＣＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴ）およ
びＳＯ−Ｍ２６９Ｖｒ（５’−ＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣ
ＴＧＣＧＣＡＴＡＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＡＴＴＴ）をＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。得られた
オリゴマーをＢｓｔＢＩおよびＮｈｅＩで消化したｐＣ
ＫＨ２７４Ｑの大型ＤＮＡに結合し、所望の発現ベクタ
ーｐＣＫＭ２６９Ｖを得た。変異型ＣＣアシラーゼの他
の発現ベクターであるＭ２６９Ｅ，Ｍ２６９Ｌ，Ｍ２６
９Ｗ，Ｍ２６９Ｓ，Ｍ２６９Ｎ，Ｍ２６９Ａ，Ｍ２６９
Ｉ，Ｍ２６９Ｋ，Ｍ２６９Ｈ，Ｍ２６９Ｐ，Ｍ２６９
Ｒ，Ｍ２６９Ｃ，Ｍ２６９Ｄ，Ｍ２６９Ｇ，Ｍ２６９Ｑ
及びＭ２６９Ｆを、ｐＣＫＨ２７４Ｑ及び表６および表
７に挙げる合成オリゴマーから、上述と同様の方法にて
調製した。Ｍ２６９Ｅ変異体用の発現ベクターｐＣＫＭ
２６９Ｅ、及びＭ２６９Ｌ変異体用の発現ベクターｐＣ
ＫＭ２６９Ｌを、オリゴマーであるＳＯ−Ｍ２６９Ｅ
（コーディング鎖）とＳＯ−Ｍ２６９Ｌ（逆鎖）のペア
をＢｓｔＢＩ及びＮｈｅＩで消化した大型ＤＮＡに挿入
することによって調製した。得られた該ベクターをＳｍ
ａＩ制限酵素部位を持つ（ｐＣＫＭ２６９Ｅ）か持たな
い（ｐＣＫＭ２６９Ｌ）かによって区別した。

【０１０１】

【表６】

【０１０２】

【表７】

【０１０３】（３）ｐＣＫＭ２６９Ｔの調製 実施例４の記載と同様の方法で、ｐＣＫ０１３のＭｌｕ
Ｉ位とＮｃｏＩ位との間の小型ＤＮＡを、クンケル法に
より合成オリゴマーＺ６３（２４ｍｅｒ，５’−ＧＣＴ
ＧＣＧＣＡＴＡＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＴＴＴ）とｍｐ
１８ｐ１８３とから構築されたｍｐ１８ｐ１８３（Ｍ２
６９Ｔ）の対応するＤＮＡで置換することによって、ｐ
ＣＫＭ２６９Ｔを調製した。

【０１０４】（４）ｐＣＫＭ２６９Ｆの調製 実施例２−(1)−(ii)と同様の方法で、合成オリゴマー
ＳＯ−Ｍ２６９Ｆｃ（５’−ＣＧＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧ
ＴＴＴＣＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＡＴ）およびＳＯ
−Ｍ２６９Ｆｒ（５’−ＣＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣ
ＧＣＡＴＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴ）をＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。得られたオリゴ
マーをＢｓｔＢＩおよびＮｈｅＩで消化したｐＣＫＨ２
７４Ｑの大型ＤＮＡに結合し、所望の発現ベクターｐＣ
ＫＭ２６９Ｆを得た。

【０１０５】（５）ｐＣＫＭ２６９Ｌの調製 実施例２−(1)−(ii)と同様の方法で、合成オリゴマー
ＳＯ−Ｍ２６９Ｅ（コーディング鎖，５’−ＣＧＡＧＡ
ＴＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＴＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＴＣＡ
Ｔ）およびＳＯ−Ｍ２６９Ｌ（逆鎖，５’−ＣＴＡＧＡ
ＴＧＡＴＧＣＴＧＣＧＣＡＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＧＡ
ＴＣＴ）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し
た。得られたオリゴマーをＢｓｔＢＩおよびＮｈｅＩで
消化したｐＣＫＨ２７４Ｑの大型ＤＮＡに結合した。該
ライゲーション混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９
を形質転換した。得られた形質転換体から、ＳｍａＩ部
位を一つ持ち、かつＢｓｔＢＩ部位およびＮｈｅＩ部位
のどちらも持たないプラスミドが所望のプラスミドｐＣ
ＫＭ２６９Ｌであることを確認した。

【０１０６】（６）Ｍ２６９変異型アシラーゼ発現ベク
ターを担持するＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９の培養Ｅ ．ｃｏｌｉＪＭ１０９をｐＣＫＭ２６９Ｙ（ｐＣＫＭ
２６９ＦまたはｐＣＫＭ２６９Ｌ）で形質転換した。シ
ングルコロニーを５０μｇ／ｍｌカナマイシン（５ｍ
ｌ）を含有するＬブロス中で、３７℃で１６時間培養し
た。得られた培養物のうちの一部（０．８ｍｌ）を８０
％のグリセロール水溶液（０．２ｍｌ）と混合し、Ｅ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＭ２６９Ｙのグリセロール
ストックを得た。該Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＫＭ
２６９Ｙ（ｐＣＫＭ２６９ＦまたはｐＣＫＭ２６９Ｌ）
のストック（１ｍｌ）を実施例８に記載と同様の方法で
培養した。

【０１０７】（７）Ｍ２６９変異型アシラーゼの精製と
特性 Ｍ２６９Ｙ，Ｍ２６９Ｆ及びＭ２６９Ｌを、上記で得ら
れたそれぞれ対応する培養細胞の破砕物から、実施例９
−(1)に記載と同様の方法で、精製した。実施例９−(2)
に記載の方法に従って、精製されたＭ２６９Ｙ，Ｍ２６
９ＦおよびＭ２６９Ｌの比活性を測定した。結果を表８
に記載する。

【０１０８】

【表８】

【０１０９】

【発明の効果】本発明によれば、高い酵素活性および高
いプロセッシング効率をもつ変異型セファロスポリンＣ
アシラーゼ、該酵素を高収率発現する発現系並びに該酵
素の製造方法を提供することができる。

【０１１０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２３２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：３０５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT AGC GTC ACG CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770 配列番号：２ 配列の長さ：２３２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：３０５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGA TCC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT AGC GTC ACG CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【０１１１】配列番号：３ 配列の長さ：２３２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：２６９ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCT GGC TAT TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Tyr Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT TGC GTC ACC CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【０１１２】配列番号：４ 配列の長さ：２３２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：２７１ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCG GGC ATG TAC TAT 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Tyr 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT TGC GTC ACC CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACG CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【０１１３】配列番号：５ 配列の長さ：２３２５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：４．．２３２２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｍｕｔａｔｉｏｎ 存在位置：２６９，３０５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG ACT ATG GCA GCT AAT ACG GAT CGC GCG GTC TTG CAG GCG GCG CTG 48 Met Thr Met Ala Ala Asn Thr Asp Arg Ala Val Leu Gln Ala Ala Leu -1 1 5 10 15 CCG CCG CTT TCC GGC AGC CTC CCC ATT CCC GGA TTG AGC GCG TCG GTC 96 Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Pro Ile Pro Gly Leu Ser Ala Ser Val 20 25 30 CGC GTC CGG CGC GAT GCC TGG GGC ATC CCG CAT ATC AAG GCC TCG GGC 144 Arg Val Arg Arg Asp Ala Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly 35 40 45 GAG GCC GAT GCC TAT CGG GCG CTG GGC TTC GTC CAT TCG CAG GAC CGT 192 Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ser Gln Asp Arg 50 55 60 CTT TTC CAG ATG GAG CTG ACG CGT CGC AAG GCG CTG GGA CGC GCG GCC 240 Leu Phe Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala 65 70 75 GAA TGG CTG GGC GCC GAG GCC GCC GAG GCC GAT ATC CTC GTG CGC CGG 288 Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg 80 85 90 95 CTC GGA ATG GAA AAA GTC TGC CGG CGC GAC TTC GAG GCC TTG GGC GTC 336 Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Val 100 105 110 GAG GCG AAG GAC ATG CTG CGG GCT TAT GTC GCC GGC GTG AAC GCA TTC 384 Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe 115 120 125 CTG GCT TCC GGT GCT CCC CTG CCT GTC GAA TAC GGA TTG CTC GGA GCA 432 Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Val Glu Tyr Gly Leu Leu Gly Ala 130 135 140 GAG CCG GAG CCC TGG GAG CCT TGG CAC AGC ATC GCG GTG ATG CGC CGG 480 Glu Pro Glu Pro Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg 145 150 155 CTG GGC CTG CTT ATG GGT TCG GTG TGG TTC AAG CTC TGG CGG ATG CTG 528 Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu 160 165 170 175 GCG CTG CCG GTG GTC GGA GCC GCG AAT GCG CTG AAG CTG CGC TAT GAC 576 Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp 180 185 190 GAT GGC GGC CGG GAT TTG CTC TGC ATC CCG CCG GGC GCC GAA GCC GAT 624 Asp Gly Gly Arg Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Ala Glu Ala Asp 195 200 205 CGG CTC GAG GCG GAT CTC GCG ACC CTG CGG CCC GCG GTC GAT GCG CTG 672 Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Thr Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu 210 215 220 CTG AAG GCG ATG GGC GGC GAT GCC TCC GAT GCT GCC GGC GGC GGC AGC 720 Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser 225 230 235 AAC AAC TGG GCG GTC GCT CCG GGC CGC ACG GCG ACC GGC AGG CCG ATC 768 Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile 240 245 250 255 CTC GCG GGC GAT CCG CAT CGC GTC TTC GAA ATC CCT GGC TAT TAT GCG 816 Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Tyr Tyr Ala 260 265 270 CAG CAT CAT CTG GCC TGC GAC CGG TTC GAC ATG ATC GGC CTG ACC GTG 864 Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Asp Met Ile Gly Leu Thr Val 275 280 285 CCG GGC GTG CCG GGC TTC CCG CAC TTC GCG CAT AAC GGC AAG GTC GCC 912 Pro Gly Val Pro Gly Phe Pro His Phe Ala His Asn Gly Lys Val Ala 290 295 300 TAT AGC GTC ACG CAT GCC TTC ATG GAC ATC CAC GAT CTC TAT CTC GAG 960 Tyr Ser Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu 305 310 315 CAG TTC GCG GGG GAG GGC CGC ACT GCG CGG TTC GGC AAC GAT TTC GAG 1008 Gln Phe Ala Gly Glu Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Asp Phe Glu 320 325 330 335 CCC GTC GCC TGG AGC CGG GAC CGT ATC GCG GTC CGG GGT GGC GCC GAT 1056 Pro Val Ala Trp Ser Arg Asp Arg Ile Ala Val Arg Gly Gly Ala Asp 340 345 350 CGC GAG TTC GAT ATC GTC GAG ACT CGC CAT GGC CCG GTT ATC GCG GGC 1104 Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly 355 360 365 GAT CCG CGC GAT GGC GCA GCG CTC ACG CTG CGT TCG GTC CAG TTC GCC 1152 Asp Pro Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala 370 375 380 GAG ACC GAT CTG TCC TTC GAC TGC CTG ACG CGG ATG CCG GGC GCA TCG 1200 Glu Thr Asp Leu Ser Phe Asp Cys Leu Thr Arg Met Pro Gly Ala Ser 385 390 395 ACC GTG GCC CAG CTC TAC GAC GCG ACG CGC GGC TGG GGC CTG ATC GAC 1248 Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp 400 405 410 415 CAT AAC CTC GTC GCC GGG GAT GTC GCG GGC TCG ATC GGC CAT CTG GTC 1296 His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val 420 425 430 CGC GCC CGC GTT CCG TCC CGT CCG CGC GAA AAC GGC TGG CTG CCG GTG 1344 Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val 435 440 445 CCG GGC TGG TCC GGC GAG CAT GAA TGG CGG GGC TGG ATT CCG CAC GAG 1392 Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu 450 455 460 GCG ATG CCG CGC GTG ATC GAT CCG CCG GGC GGC ATC ATC GTC ACG GCG 1440 Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Ile Ile Val Thr Ala 465 470 475 AAT AAT CGC GTC GTG GCC GAT GAC CAT CCC GAT TAT CTC TGC ACC GAT 1488 Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp 480 485 490 495 TGC CAT CCG CCC TAC CGC GCC GAG CGC ATC ATG AAG CGC CTG GTC GCC 1536 Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Lys Arg Leu Val Ala 500 505 510 AAT CCG GCT TTC GCC GTC GAC GAT GCC GCC GCG ATC CAT GCC GAT ACG 1584 Asn Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr 515 520 525 CTG TCG CCC CAT GTC GGG TTG CTG CGC CGG AGG CTC GAG GCG CTT GGA 1632 Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Arg Arg Leu Glu Ala Leu Gly 530 535 540 GCC CGC GAC GAC TCC GCG GCC GAA GGG CTG AGG CAG ATG CTC GTC GCC 1680 Ala Arg Asp Asp Ser Ala Ala Glu Gly Leu Arg Gln Met Leu Val Ala 545 550 555 TGG GAC GGC CGC ATG GAT GCG GCT TCG GAG GTC GCG TCT GCC TAC AAT 1728 Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Ala Ser Glu Val Ala Ser Ala Tyr Asn 560 565 570 575 GCG TTC CGC AGG GCG CTG ACG CGG CTG GTG ACG GAC CGC AGC GGG CTG 1776 Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Asp Arg Ser Gly Leu 580 585 590 GAG CAG GCG ATA TCG CAT CCC TTC GCG GCT GTC GCG CCG GGC GTC TCA 1824 Glu Gln Ala Ile Ser His Pro Phe Ala Ala Val Ala Pro Gly Val Ser 595 600 605 CCG CAA GGC CAG GTC TGG TGG GCC GTG CCG ACC CTG CTG CGC GAC GAC 1872 Pro Gln Gly Gln Val Trp Trp Ala Val Pro Thr Leu Leu Arg Asp Asp 610 615 620 GAT GCC GGA ATG CTG AAG GGC TGG AGC TGG GAC CAG GCC TTG TCT GAG 1920 Asp Ala Gly Met Leu Lys Gly Trp Ser Trp Asp Gln Ala Leu Ser Glu 625 630 635 GCC CTC TCG GTC GCG TCG CAG AAC CTG ACC GGG CGA AGC TGG GGC GAA 1968 Ala Leu Ser Val Ala Ser Gln Asn Leu Thr Gly Arg Ser Trp Gly Glu 640 645 650 655 GAG CAT CGG CCG CGC TTC ACG CAT CCG CTT GCC ACG CAA TTC CCG GCC 2016 Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro Leu Ala Thr Gln Phe Pro Ala 660 665 670 TGG GCG GGG CTG CTG AAT CCG GCT TCC CGT CCG ATC GGT GGC GAT GGC 2064 Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro Ala Ser Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly 675 680 685 GAT ACC GTG CTG GCG AAC GGG CTC GTC CCG TCA GCC GGG CCG CAG GCG 2112 Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val Pro Ser Ala Gly Pro Gln Ala 690 695 700 ACC TAT GGT GCC CTG TCG CGC TAC GTC TTC GAT GTC GGC AAT TGG GAC 2160 Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp 705 710 715 AAT AGC CGC TGG GTC GTC TTC CAC GGC GCC TCC GGG CAT CCG GCC AGC 2208 Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly Ala Ser Gly His Pro Ala Ser 720 725 730 735 GCC CAT TAT GCC GAT CAG AAT GCG CCC TGG AGC GAC TGT GCG ATG GTG 2256 Ala His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro Trp Ser Asp Cys Ala Met Val 740 745 750 CCG ATG CTC TAT AGC TGG GAC AGG ATC GCG GCA GAG GCC GTG ACG TCG 2304 Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser 755 760 765 CAG GAA CTC GTC CCG GCC TGA 2325 Gln Glu Leu Val Pro Ala 770

【図面の簡単な説明】

【図１】変異型ＣＣアシラーゼＭ２６９Ｙ／Ｃ３０５Ｓ
の発現ベクターｐ２６９Ｙ／Ｃ３０５Ｓの制限酵素地図
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/80 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 宿主細胞中でα−サブユニットとβ−サ
   ブユニットにプロセッシングされる前の前駆体形として
   のアミノ酸配列が、式： Ａ^1-268 −Ｘ₁ −Ｔｙｒ−Ｘ₂ −Ａ^272-304 −Ｘ₃ −Ａ^306-773 （式中、Ａ^1-268 は、天然型ＣＣアシラーゼのＴｈｒ¹
   からＧｌｙ²⁶⁸ までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配
   列を示す。Ａ^272-304 は、天然型ＣＣアシラーゼのＧｌ
   ｎ²⁷² からＴｙｒ³⁰⁴ までのアミノ酸配列と同一のアミ
   ノ酸配列を示す。Ａ^306-773 は、天然型ＣＣアシラーゼ
   のＶａｌ³⁰⁶ からＡｌａ⁷⁷³ までのアミノ酸配列と同一
   のアミノ酸配列を示す。Ｘ₁ は、Ｍｅｔまたはその他の
   アミノ酸を、Ｘ₂ は、Ａｌａまたはその他のアミノ酸
   を、Ｘ₃ はＣｙｓまたはその他のアミノ酸を示す。但
   し、Ｘ₁ がＭｅｔであり、かつＸ₂ がＡｌａであると
   き、Ｘ₃ はＣｙｓ以外のアミノ酸である。）で示され
   る、変異型セファロスポリンＣアシラーゼ。
2. 【請求項２】 Ｘ₁ がＴｙｒ、Ｘ₂ がＡｌａおよびＸ₃
   がＳｅｒである請求項１記載の変異型セファロスポリン
   Ｃアシラーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１または請求項２記載のセファロ
   スポリンＣアシラーゼをコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３記載のＤＮＡを含む発現ベクタ
   ー。
5. 【請求項５】 請求項４記載の発現ベクターによって形
   質転換された宿主細胞。
6. 【請求項６】 請求項５記載の宿主細胞を培地で培養
   し、得られる培養物から変異型セファロスポリンＣアシ
   ラーゼを採取することを特徴とする請求項１および請求
   項２記載の変異型セファロスポリンＣアシラーゼの製造
   方法。
7. 【請求項７】 式： 【化１】 （式中、Ｒ¹ はアセトキシ、ヒドロキシまたは水素を示
   す。Ｒ² はカルボン酸アシルを示す。）で示される化合
   物（II）またはその塩に請求項５の形質転換体の培養物
   またはその処理物を接触させて、式： 【化２】 （式中、Ｒ¹ は前記と同意義。）で示される化合物
   （Ｉ）またはその塩を得ることを特徴とする化合物
   （Ｉ）の製造法。