CN109913436A - 含有一个或几个点突变的头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物生产领域，具体涉及头孢类抗生素生产及其生产用酶，尤其地，涉及含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体、编码其的核酸、相关表达载体和宿主细胞、其制备方法和所述突变体用于一步裂解CPC制备7‑ACA的用途。

Description

含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体及其制备 方法

技术领域

本发明涉及药物生产领域，具体涉及头孢类抗生素生产及其生产用酶，更具体地，涉及含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体、编码其的核酸、相关表达载 体和宿主细胞、其制备方法和所述突变体用于一步裂解CPC制备7-ACA的用途。

背景技术

7-ACA(7-aminocephalosporanic acid，7-氨基头孢烷酸)是一种非常重要的抗生素 合成中间体，可以用来进行多种头孢类抗生素的合成，具有重要的医用价值。工业上，最早期采用化学裂解法裂解头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)制备7-ACA，但是化 学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，且涉及大量的有毒有害 的有机溶剂，会带来环境污染等问题。因此，近些年来对环境友好的酶法开始成为工业 生产的新方向。早期工业化生产采用二步酶法进行催化，第一步，通过D-氨基酸氧化 酶(DAO)将CPC转变为戊二基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)；第二步，通过GL-7-ACA 酰化酶将GL-7-ACA转变为7-ACA。但是，二步酶法催化时，第一步产生的过氧化氢 与DAO底物或反应产物发生反应，产生大量的副产物，且其工艺过程长，控制难，成 本高，因此现在更多地采用一步酶法催化CPC裂解反应。

一步酶法催化反应采用的酶为头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase)，可直 接催化CPC转变为7-APA。已在若干微生物中发现了对CPC有活性的CPC酰化酶， 如假单胞菌属(Pseudomonas Sp.)、巨大芽胞杆菌杆菌(Bacillus megaterium)、气单胞 菌属(Aeromnas sp.)、粘性节杆菌(Arthrobacter viscous)等，有些CPC酰化酶的基因 已被克隆并测序，如假单胞菌属SE83来源的acyII基因(Matsuda等， J.Bacteriol.169：5821-5829,1987)；假单胞菌属N176来源的CPC酰化酶基因 (US5192678)；假单胞菌属V22来源的CPC酰化酶基因(Aramori等， J.Ferment.Bioeng.72：232-243,1991)；泡囊假单胞菌(Pseudomonasvesicularis)B965来源 的CPC酰胺水解酶基因(US6297032)；巨大芽孢杆菌来源的CPC酰胺酶基因 (US5229274)；以及假单胞菌属130来源的CPC酰化酶基因(Li等，Eur.J.Biochem.262：713-719,1999)。然而，这些CPC酰化酶基因不具有足够的水解活性 以裂解CPC第7位上的酰胺键，不适用于由CPC制备7-ACA的一步酶法。因此，为 了获得可用于一步酶法制备7-ACA的CPC酰化酶，研究者们对野生型的CPC酰化酶 进行了一系列的突变设计，如中国专利CN1836044B(头孢菌素C酰基转移酶突变体及 用其制备7－ACA的方法)，要求保护CPC酰基转移酶突变体或其功能等效衍生物，其 中CPC酰基转移酶α-亚基中的Val121α、Gly139α和Phe169α和CPC酰基转移酶β-亚 基中的Met31β、Phe58β、His70β、Ile75β、Ile176β和Ser471β位点发生取代突变，这 些突变体对CPC的反应性增强；CN103060298B(一种头孢菌素C酰化酶突变体及其 编码基因与应用)，公开了K171S、M270W、I314S、L535T位点突变；CN102321603B (头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用)，涉及H296A、H309V位点突变等； CN102978192B要求保护V288M、H417G、H296等突变。

一步酶法催化具有工艺过程短、环保、成本低的优势。然而，酶对温度较为敏感，反应最适温度在37-40℃左右。实际工业应用中为了降低反应过程的杂质生成，反应温 度不宜超过25℃，一般维持在25到30℃，但此时酶活力较低，副产物仍较大，杂质较 高，同时酶稳定性受到影响，使用批次也会相应减少。Pseudomonas Sp.SE83、 PseudomonasSp.N176来源的头孢菌素C酰化酶作为AcyII类酰化酶，热稳定差，α亚 基较大，虽然高温酶活力较高，但因其生产过程杂质较高，应用受到很大的限制。

本发明的目的在于开发一种新型的耐低温、高活力、高稳定性的7-ACA生产用CPC酰化酶突变体，其可直接用于一步裂解CPC制备7-ACA。本发明选用α亚基较小(18KDa) 的假单胞菌属130来源的的CPC酰化酶突变体进行一步酶法催化CPC生成7-ACA。该 CPC酰化酶突变体可以在14-37℃下很好地催化底物CPC生成7-ACA反应，尤其在低 温14℃反应时，酶活力下降仅30％，反应速度快，转化率高至99％以上，生成杂质低 至0.3％，同时耐受45℃高温处理，稳定性高，最终制备的固定化酶重复批次可达400-800 批，具有重大工业价值。

发明内容

本发明人通过大量的试验研究，提供了一种假单胞菌属(Pseudomonas sp.)130来源的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍 生物在SEQ ID NO.1序列的基础上包含Iβ179Y突变。

进一步地，所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物还包括选自以下的一个或几个点突变：Sβ3G、Pβ100V、Aβ136T、Nβ68S、Vβ70F、Mβ73I突变。

进一步地，所述的头孢菌素C酰化酶突变体或其功能等效衍生物包含的一个或几个点突变中，Pβ100V被Pβ100Q所替代。

更具体地，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的氨基酸序列与SEQ IDNO.1序列相比，存在Iβ179Y突变(突变体1)；或Iβ179Y和Pβ100Q突变(突变体2)； 或Iβ179Y和Pβ100Q和Sβ3G和Aβ136T突变(突变体3)；或Iβ179Y和Pβ100V和Sβ3G 和Aβ136T突变(突变体4)；或Iβ179Y和Pβ100Q和Sβ3G和Aβ136T和Nβ68S和Vβ70 F和Mβ73I突变(突变体5)；或Iβ179Y和Pβ100V和Sβ3G和Aβ136T和Nβ68S和Vβ70 F和Mβ73I突变(突变体6)。

氨基酸名称及缩写见表1

表1 氨基酸名称及缩写

中文名称	英文名称	三字母缩写	单字母缩写
				甘氨酸	Glvcine	Gly	G
丙氨酸	Alanine	Ala	A
				缬氨酸	Valine	Val	V
亮氨酸	Leucine	Leu	L
				异亮氨酸	Isoleucine	Ile	I
脯氨酸	Proline	Pro	P
				苯丙氨酸	Phenylalanine	Phe	F
酪氨酸	Tyrosine	Tyr	Y
				色氨酸	Tryptophan	Trp	W
丝氨酸	Serine	Ser	S
				苏氨酸	Threonine	Thr	T
半胱氨酸	Cysteine	Cys	C
				蛋氨酸	Methionine	Met	M
天冬酰胺	Asparagine	Asn	N
				谷氨酰胺	Glutamine	Gln	Q
天冬氨酸	Aspartic acid	Asp	D
				谷氨酸	Glutamic acid	Glu	E
赖氨酸	Lysine	Lys	K
				精氨酸	Arginine	Arg	R
组氨酸	Histidine	His	H

本发明还提供了编码上述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的核酸、包含所述的核酸的表达载体及包含所述表达载体的宿主细胞。

本发明所述的编码上述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的核酸包括根据简并性编码本文所述的CPC酰化酶突变体的核酸。本发明中可以采用的表达载体包括 所有含有必须表达元件的载体，如pET载体、pQE等常用表达载体。本发明中所述的 宿主可以为原核或真核微生物或细胞。所述表达载体可通过转化、转染或侵染等本领域 公知方式导入表达宿主。

另外，本发明还提供了上述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的制备方法，包括在适当条件下培养上述的含有编码CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的核酸 的表达载体的宿主细胞，并从培养基中回收CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的 步骤。

最后，本发明还提供了上述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物用于一步催化CPC转变为7-ACA反应中的用途。

上述的用途中，在CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物用于一步催化CPC转变为7-ACA反应中，反应条件为：pH7.8-8.4，温度14-37度，底物浓度1-30g/L，酶投量 300-10000U/mL。

本发明中，“功能等效衍生物”是指保留与本发明CPC酰化酶突变体相同功能特性的CPC酰化酶衍生物，即功能等效物包括所有可能的变体，如天然、合成或重组多肽， 其可能经过修饰(即通过序列突变、缺失、插入、替代、一个或几个核苷酸的倒置或其 组合)并能够行使CPC酰化酶突变体的功能。

本发明中，“固定化酶”可以通过常规方法(如共价键、离子键、亲水键、物理键以及微囊化等)将CPC酰化酶突变体固定在本领域中通常使用的常规载体中而制备得到。 此外，也可以通过固定化整个细胞的方法固定生产CPC酰化酶突变体的微生物。

本发明采用的编号系统是对CPC酰化酶氨基酸序列中的每一α亚基和每一β亚基连续编号。对于在CPC酰化酶的氨基酸序列突变中引入的特定残基的命名，遵循常规 命名法：如替代β亚基中第179位的异亮氨酸残基的酪氨酸用Iβ179Y表示。

附图说明

图1为构建的野生型CPC酰化酶的酶切鉴定图，1.marker；2.pET29a-CPCA环质粒；3. pET29a-CPCA酶切鉴定图谱；

图2为CPC酰化酶突变体6的蛋白表达图，1.诱导表达前；2.诱导表达后上清；3.诱导表达后沉 淀；4.marker；5.浓缩固定前，箭头所指为目的蛋白；

图3为以CPC酰化酶突变体6催化CPC转化为7-ACA后的杂质分析图

具体实施方式

以下实施例是对本发明内容作进一步的详细说明，但不应理解为是对本发明保护范 围的限制。凡在不背离本发明精神和范围的前提下对本发明进行的修饰和改变，均在本发明的保护范围内。

实施例1 CPC酰化酶突变体的构建

1.1 CPC酰化酶基因的克隆

全基因合成Pseudomonas sp.130来源的CPC酰化酶基因(见SEQ ID NO.1，由金 斯瑞公司合成)，并将该基因克隆到表达载体pUC57中，获得重组质粒pUC57-CPCA。 以pUC57-CPCA为模板，扩增目的基因片段。PCR所用DNA聚合酶PrimeSTAR及相 应缓冲液和dNTP溶液均购于宝生物公司。引物序列由金斯瑞公司合成，引物序列为： F：GGGAATTCCATATGCTGAGAGTTCTGCACCG(带下划线碱基为NdeI识别位点) R：CCGGAATTCTCATGGCTTGAAGTTGAAGGG(带下划线碱基为EcoRI识别位点)

PCR扩增反应体系：灭菌水：32.5μL

5×PrimeSTAR缓冲液(Mg²⁺Plus)：10μL

dNTP溶液(2.5mM each)：4μL

DNA聚合酶PrimeSTAR：0.5μL

引物F(10μM)：1μL

引物R(10μM)：1μL

模板：1μL

总体积：50μL。

PCR反应条件为：98℃4min；98℃10sec，55℃5sec，72℃2min，30个循环；72℃10min。扩增的目的基因片段大小约2.1Kb。采用通用纯化回收试剂盒(购于天根生化 科技(北京)有限公司)对PCR产物进行纯化回收。用NdeI和EcoRI(购自Thermo Fisher 公司)分别双酶切PCR产物和大肠杆菌表达载体pET29a(购于Invitrogen公司)，再 次纯化回收得到酶切产物。在T4NDA连接酶(购于宝生物工程(大连)有限公司) 的作用下，将目的基因连接入大肠杆菌表达载体pET29a中，获得重组质粒 pET29a-CPCA。连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞Top10(购自北京全式金生物技术 有限公司)中，涂布在有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。以目的基因特异 性引物对平板上生长的单菌落进行菌落PCR鉴定，对菌落PCR鉴定的阳性转化子进行 质粒提取，相应质粒用Nde1和EcoR1双酶切鉴定，酶切后应得到两个片段，大小约 2160bp和5.3kb(见图1)，对于鉴定条带正确的重组质粒进行测序(测序服务由北京 中美泰和公司提供)，测序正确的即为重组质粒pET29a-CPCA。

1.2 CPC酰化酶基因的原核表达以及液体粗酶制备

重组质粒pET29a-CPCA转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(购自北京全式 金公司)中，涂布在有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行保 种，命名为BL21(DE3)-pET29a-CPCA，表达备用。将菌种BL21(DE3)-pET29a-CPCA 培养于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养4～5h，至OD为1.0左 右时加入IPTG诱导目的蛋白表达。诱导条件为：30℃，4h，220rpm。离心收集菌体， 称取菌体湿重。将收集到的菌体用pH8.0的50mM磷酸缓冲液进行重悬，菌体浓度为 100mg/mL。超声破碎菌体：超声功率200W，设置超声工作时间3s，间歇7s，总时长 30min。离心超声裂解液，收集酶液上清，同时制备上清和沉淀中的蛋白样品，进行 SDS-PAGE检测，上清中有活性的蛋白分子量为55kDa左右(β亚基)，18kDa左右(α 亚基)沉淀中总蛋白分子量约79-80kDa(见图2)。酶液上清保存于-80℃，以备检测 酶活。

1.3 CPC酰化酶基因的定点突变

以pET29a-CPCA为模板，设计对应的点突变引物(见表2，引物设计及合成，由 金斯瑞公司完成)进行PCR反应。定点突变引物与突变位点的对应关系如表2所示， 例如Iβ179Y突变体的突变引物为对应的1F，1R。定点突变位点的选取同时参考CPC 酰化酶三维结构模拟以及实际工业上筛选到的温稳性自发突变酶送测序公司DNA测序 后的测序结果共同推测有意义突变位置，本发明人共设计突变位点20多个，突变位点 组合累计800多种，经过大量的实验验证，其中大部分突变体为无意义，无活力突变菌 株，表格显示的为最终有显著效果改善的突变位点及其对应的引物。采用各突变位点对 应的引物进行PCR反应，先进行Iβ179Y单点突变，然后以获得的单点突变体为模板， 进行两点突变以获得包含Iβ179Y和选自Sβ3G、Pβ100V、Aβ136T、Nβ68S、Vβ70F、 Mβ73I中任意一个突变位点的CPC酰化酶突变体。依照上述方法分别获得三点突变体、 四点突变体、五点突变体、六点突变体和七点突变体，PCR反应体系同1.1。定点突变 PCR反应条件为：95℃4min；95℃10sec，55℃，72℃8min，25个循环；72℃10min。 将PCR产物加入DpnI(购自Thermo Fisher公司)酶，在37℃消化2h，转化入大肠杆 菌感受态细胞Top10(购自北京全式金公司)中，涂布在有卡那霉素抗性的LB平板上， 37℃培养过夜。每个平板挑取若干单克隆进行摇菌、提取质粒，并送测序。测序正确的点突变质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(购自北京全式金公司)中，涂 布在有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行表达，表达方法参 见1.2。

表2 突变位点及对应的引物

注：表2中下划线标示的是突变位点处碱基。

1.4 CPC酰化酶突变体活力检测

色谱柱：依利特C18柱250mm×4.6mm 5μm；流动相：A：20mM醋酸铵(pH5.0)， B：乙腈A：B＝95∶5；检测波长：254nm，流速1.0mL/min；柱温：30℃；称取0.23g CPC， 加入0.1MpH8.0的PBNa缓冲液10ml，震荡溶解吸取600μL加入2ml离心管中，加入 1.0M pH8.0的PBNa缓冲液液200μL及酶液200μL，混匀，37℃或者14℃水浴反应10min。 取100μL反应液加入750μL流动相A和150μL乙醇，震荡混匀，终止反应，经0.45μm 微孔滤膜滤过，向HPLC注入10μL，记录生成的7-ACA的峰面积。根据面积归一法计 算生成的7-ACA质量浓度，并计算酶活力。酶活力定义方式：对应温度下，PH8.0，每 分钟转化CPC生成1μM 7-ACA所需的酶量。

1.5 CPC酰化酶突变体热稳定性测定

吸取200μl CPC酰化酶或其突变体，加入2ml离心管中，分别在14℃、37℃、45℃ 水浴锅中，热处理15min。依据酶活力测定方法，测定热处理后的酶活力，同时测定相 应酶液热处理前的酶活力。本文同时验证了CN1836044B中公开的CPC酰化酶突变体 S12的热稳定性，即对比例。酶活保持率定义为热处理后酶活占热处理前的酶活百分率。 酶活保持率越高，相应的酶热稳定性越好(表3)，“-”代表基本无法测出。

表3 CPC酰化酶突变体及其对应的突变位点和不同温度下的酶活

可见本发明的CPC酰化酶突变体与野生型相比，其酶活力有显著提升，37℃下提高了14-180倍。对比例中突变体的酶活力也有明显提高，提高了130倍。然而，对比 例的CPC酰化酶突变体远不如本发明的CPC酰化酶突变体温稳性强。本发明的突变体 在14℃的酶活力保持率在65％以上，而对比例突变体在14℃下的酶活力保持率低于 50％。即使在高温下(45℃)，本发明的突变体的酶活力仍保持了37℃下酶活的6％以 上，而对比例中突变体在高温下的酶活力保持率不到4％。可见，本发明的突变体耐受 温度的稳定性较好。对比例采用CN1836044B专利中涉及的SE83来源CPC酰化酶突 变体S12，该突变体S12是该专利中公开的效果最显著的一个突变体。

1.6 CPC酰化酶固定化酶制备

取一定量环氧树脂LX-1000HFA，纯化水漂洗3～5遍，抽滤至干备用。称取上述树脂样品若干置于锥形瓶中，加入头孢菌素C酰化酶酶液150-300U/g树脂(固定前蛋白 经过简单纯化，纯度见图2)，加入一定量的2M pH6.5的磷酸钾缓冲液使得终浓度至 1M，用纯化水补充至4ml/g树脂，混合均匀后，密封瓶口，于25℃下150rpm摇床振 荡24h。滤出固载了酶的树脂，纯化水洗涤3～5次，4℃下保存并进行酶活检测。固定 化酶酶活为90-150U/g，酶活收率为45-70％。酶活力定义：在一定反应条件下，每克固 定化头孢菌素C酰化酶每分钟转化CPC生成7-ACA的微摩尔数。

实施例2转化反应

2.1突变体1催化的转化反应

反应条件：CPC 1g/L，投入酶活600-800U/L(固定化酶或者液体酶)，反应温度 25℃，结果：反应时间40-120min，转化率98-99％。

2.2突变体2催化的转化反应

反应条件：CPC 1g/L，投入酶活600-800U/L(固定化酶或者液体酶)，反应温度 14-25℃，结果：反应时间20-120min，转化率99％以上。

2.3突变体3催化的转化反应

反应条件：CPC 1g/L，投入酶活600-800U/L(固定化酶或者液体酶)，反应温度 14-25℃，结果：反应时间20-120min，转化率99％以上。

2.4突变体4催化的转化反应

反应条件：CPC 1-5g/L，投入酶活600-4000U/L(固定化酶或者液体酶)，反应温 度14-30℃，结果：反应时间20-120min，转化率99％以上。

2.5突变体5催化的转化反应

反应条件：CPC 1-10g/L，投入酶活600-5000U/L(固定化酶或者液体酶)，反应温度14-30℃，结果：反应时间20-120min，转化率99％以上。

2.6突变体6催化的转化反应

2.6.1头孢菌素C 1g/L，投入酶活300U/L液体酶，反应温度37℃，pH7.8-8.4。结果：反应时间20-50分钟，转化率99％以上。

2.6.2头孢菌素C 30g/L，投入酶活8000-10000U/L液体酶，反应温度12-14℃，pH7.8-8.4。 结果：反应时间60-80min，转化率99％以上。

2.6.3头孢菌素C 30g/L，投入酶活8000-10000U/L固定化酶，反应温度37℃，pH7.8-8.4。 结果：酶循环使用400批，初始反应时间70min，反应pH8.2，结束使用时反应时间 120min，pH8.4，每批转化率99％以上。

2.6.4头孢菌素C 30g/L，投入酶活8000-10000U/L固定化酶，反应温度12-14℃，pH7.8-8.4。 结果：反应后50-100批左右补充固定化酶原投入量的10％-20％，酶循环共使用800批， 初始反应时间80min，反应pH8.2，结束使用时反应时间120min，pH8.4，每批转化率 99％以上。

2.7对比例S12催化的转化反应

反应条件：CPC 1-30g/L，投入酶活300-20000U/L(固定化酶或者液体酶)，反应 温度12-14℃，pH7.8-8.4。结果：反应时间20-120min，转化率90-97％，反应不充分。

反应条件：CPC 1-30g/L，投入酶活300-10000U/L(固定化酶或者液体酶)，反应 温度30℃，pH7.8-8.4。结果：反应时间20-120min，转化率96-98％，反应不充分。

实施例3杂质检测

色谱柱：phenomenex(菲罗门)填料：Gemini 5um C18；

流动相配制：

缓冲液：1.54g NH₄COOCH₃→1000mL pH＝6.0；缓冲液：乙腈＝95∶5(1000mL 缓冲液加入53mL乙腈)；检测波长：260nm柱温箱温度：25℃；流速：1.2mL/min。按 时间顺序分别是D-CPC，D-7ACA，DO-CPC，DO-7ACA，CPC，7-ACA，采用突变体 1-6进行反应，杂质分析小于0.3％(图3，突变体6反应结果)，对比例S12杂质分析 大于0.7％。

序列表

<110> 石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司

石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司

<120> 含有一个或几个点突变的头孢菌素C酰化酶突变体及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2163

<212> DNA

<213> 假单胞菌sp.130(Pseudomonas sp.130)

<400> 1

atgctgagag ttctgcaccg ggcggcgtcc gccttggtta tggcgactgt gatcggcctt 60

gcgcccgccg tcgcctttgc gctggccgag ccgacctcga cgccgcaggc gccgattgcg 120

gcctataaac cgagaagcaa tgagatcctg tgggacggct acggcgtccc gcacatctac 180

ggcgtcgacg cgccctcagc cttctacggc tatggctggg cccaggcgcg cagccacggc 240

gacaatatcc tgcgcctgta tggagaagcg cggggcaagg gggccgaata ctggggcccg 300

gattacgaac agacgaccgt ctggctgctg accaacggcg tgccggagcg cgctcagcag 360

tggtatgcgc agcagtcgcc tgatttccgc gccaacctcg acgccttcgc ggcgggcatc 420

aacgcctatg cgcagcagaa ccccgacgac atctcgcccg acgtgcggca ggtgctgccg 480

gtttccggcg ccgacgtggt ggcccacgcc caccgcctga tgaacttcct ctatgtcgcg 540

tcgcccggcc gcaccctggg cgagggcgac ccgccggacc tggccgatca aggatccaac 600

tcctgggcgg tggcgccggg aaagacggcg aacgggaacg ccctgctgct gcagaacccg 660

cacctgtcct ggacgacgga ctacttcacc tactacgagg cgcatctcgt cacgccggac 720

ttcgaaatct atggcgcgac ccagatcggc ctgccggtca tccgcttcgc cttcaaccag 780

cggatgggca tcaccaatac cgtcaacggc atggtggggg ccaccaacta tcggctgacg 840

cttcaggacg gcggctatct gtatgacggt caggtgcggc cgttcgagcg gcgtcaggcc 900

tcgtatcgcc tgcgtcaggc ggacgggacg acggtcgaca agccgttgga gatccgctcc 960

agcgtccatg gcccggtctt cgagcgcgcg gacggcacgg ccgtcgccgt tcgggtcgcc 1020

ggtctggacc ggccgggcat gctcgagcag tatttcgaca tgatcacggc ggacagcttc 1080

gacgactacg aagccgcttt ggcgcggatg caggtgccga ccttcaacat cgtctacgcc 1140

gaccgcgaag ggaccatcaa ctacagcttc aacggcgtgg cgcccaaacg ggccgagggc 1200

gacatcgcct tctggcaggg gctcgtgccg ggcgattcct cgcgttacct gtggaccgag 1260

acacacccgc tggacgatct gccgcgcgtc accaatccgc cgggcggctt cgtgcagaac 1320

tccaatgatc cgccgtggac gccgacctgg cccgtcacct acacgcccaa ggacttcccc 1380

tcctatctgg cgccccagac gccgcattcc ctgcgtgcgc aacaaagcgt gcgtctgatg 1440

tccgagaacg acgacctgac gctggagcgc ttcatggcgc tgcagttgag ccatcgcgcc 1500

gtcatggccg accgcacctt gccggacctg atcccggccg ccctgatcga ccccgatccc 1560

gaggtccagg cggcggcgcg cctgctggcg gcgtgggatc gcgagttcac cagcgacagc 1620

cgcgccgccc tgctgttcga ggaatgggcg cgtctgttcg ccggccagaa tttcgcaggc 1680

caggccggct tcgccacgcc ctggtcgctg gataagccgg tcagcacgcc ttacggcgtc 1740

cgcgacccca aggccgccgt cgatcaactg cggaccgcca tcgccaacac caagcgcaaa 1800

tacggcgcga tcgaccggcc gttcggcgac gcctcgcgca tgatcctgaa cgacgtgaat 1860

gttccgggcg ccgccggcta cggcaacctg ggttccttcc gggtcttcac ctggtccgat 1920

cctgacgaaa acggggttcg cacgcccgtc cacggcgaga cgtgggtggc gatgatcgag 1980

ttctccacgc cggtgcgggc ctatggcctg atgagctacg gcaactctcg ccagccgggc 2040

acgacgcact acagcgatca gatcgaacgc gtgtcgcgcg ccgacttccg cgaactgttg 2100

ctgcggcgag agcaggtcga ggccgccgtc caggaacgca cgcccttcaa cttcaagcca 2160

tga 2163

<210> 2

<211> 720

<212> PRT

<213> 假单胞菌sp.130(Pseudomonas sp.130)

<400> 2

Met Leu Arg Val Leu His Arg Ala Ala Ser Ala Leu Val Met Ala Thr

1 5 10 15

Val Ile Gly Leu Ala Pro Ala Val Ala Phe Ala Leu Ala Glu Pro Thr

20 25 30

Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg Ser Asn Glu

35 40 45

Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly Val Asp Ala

50 55 60

Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg Ser His Gly

65 70 75 80

Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys Gly Ala Glu

85 90 95

Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu Leu Thr Asn

100 105 110

Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln Ser Pro Asp

115 120 125

Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn Ala Tyr Ala

130 135 140

Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Asp Val Arg Gln Val Leu Pro

145 150 155 160

Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu Met Asn Phe

165 170 175

Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gly Asp Pro Pro

180 185 190

Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys

195 200 205

Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp

210 215 220

Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp

225 230 235 240

Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe

245 250 255

Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val

260 265 270

Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr

275 280 285

Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu

290 295 300

Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser

305 310 315 320

Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala

325 330 335

Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe

340 345 350

Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala

355 360 365

Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly

370 375 380

Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly

385 390 395 400

Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr

405 410 415

Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn

420 425 430

Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro

435 440 445

Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala

450 455 460

Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met

465 470 475 480

Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu

485 490 495

Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro

500 505 510

Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu

515 520 525

Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu

530 535 540

Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly

545 550 555 560

Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr

565 570 575

Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr

580 585 590

Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe

595 600 605

Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala

610 615 620

Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp

625 630 635 640

Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val

645 650 655

Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser

660 665 670

Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile

675 680 685

Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu

690 695 700

Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro

705 710 715 720

Claims (10)

1.一种假单胞菌属(Pseudomonas sp.)130来源的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物在SEQ ID NO.1序列的基础上包含Iβ179Y突变。

2.根据权利要求1所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，还包括选自以下的一个或几个点突变：Sβ3G、Pβ100V、Aβ136T、Nβ68S、Vβ70F、Mβ73I突变。

3.根据权利要求2所述的头孢菌素C酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，Pβ100V被Pβ100Q点突变替代。

4.根据权利要求1所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物，其特征在于，所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的氨基酸序列与SEQ ID NO.1序列相比，存在Iβ179Y突变；或Iβ179Y和Pβ100Q突变；或Iβ179Y和Pβ100Q和Sβ3G和Aβ136T突变；或Iβ179Y和Pβ100V和Sβ3G和Aβ136T突变；或Iβ179Y和Pβ100Q和Sβ3G和Aβ136T和Nβ68S和Vβ70F和Mβ73I突变；或Iβ179Y和Pβ100V和Sβ3G和Aβ136T和Nβ68S和Vβ70F和Mβ73I突变。

5.编码权利要求1-4任一项所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的核酸。

6.包含权利要求5所述的核酸的表达载体。

7.包含权利要求6所述的表达载体的宿主细胞。

8.权利要求1-4任一项所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的制备方法，其特征在于，包括在适当条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，并从培养基中回收CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物的步骤。

9.权利要求1-4任一项所述的CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物用于催化CPC转变为7-ACA反应中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，在所述CPC酰化酶突变体或其功能等效衍生物用于催化CPC转变为7-ACA反应中，反应条件为：pH7.8-8.4，温度14-37度，底物浓度1-30g/L，酶投量300-10000U/mL。