CN115851687A - 具有头孢菌素c酰基转移酶活性的多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了具有头孢菌素C(CPC)酰基转移酶活性的多肽及其用途。更具体地，提供了突变型CPC酰基转移酶以及该突变型CPC酰基转移酶用于生产7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)的用途，该突变型CPC酰基转移酶包含引入其中的点突变，从而表现出提高的酶活性和/或稳定性。

Description

具有头孢菌素C酰基转移酶活性的多肽及其用途
技术领域
本申请要求于2021年12月24日提交的第10-2021-0187761号韩国专利申请的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
本说明书涉及具有头孢菌素C(CPC)酰基转移酶活性的多肽及其用途，更具体地，涉及其中引入了点突变并因此表现出提高的酶活性和/或稳定性的突变型CPC酰基转移酶，及其用于生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的用途。
背景技术
头孢菌素C(以下简称“CPC”)是β-内酰胺类抗生素家族，由诸如产黄枝顶孢霉(Acremonium chrysogenum)的微生物产生。CPC通过抑制革兰氏阴性菌细胞壁的合成而表现出对革兰氏阴性菌的抗菌活性，但由于其活性很弱，发现主要应用于制备半合成头孢类抗生素(以下简称“头孢菌素”)的原料。其中，通过从CPC脱去D-α-氨基己二酰侧链而获得的7-氨基头孢烷酸(以下简称“7-ACA”)被用作大多数头孢菌素的原料，占全球抗生素市场的高于40％。
通常，由CPC制备7-ACA有化学方法和酶促方法。由于化学方法需要复杂的反应条件和高昂的环境处理成本，近来7-ACA的生产趋向于采用环境友好的酶促方法。
典型的酶促方法由以下两个步骤组成：第一步，CPC通过D-氨基酸氧化酶(以下简称“DAO”)的酶促反应转化为戊二酰-7-氨基头孢烷酸(以下简称“Gl-7-ACA”)；第二步，通过Gl-7-ACA酰基转移酶的酶促反应将Gl-7-ACA转化为7-ACA(见图1左侧的反应方案)。
然而，两步酶促法存在产率低的缺点，因为第一步的酶促反应中产生的过氧化氢会攻击底物(CPC)、反应产物(Gl-7-ACA)和DAO。
建议作为解决该问题的替代方法是直接由CPC生产7-ACA的单步酶促方法，而不进行第一步(参见图1中右侧反应方案)。为此，需要催化由CPC直接生产7-ACA的CPC酰基转移酶。由于CPC酰基转移酶在自然界中不存在，它是通过修饰天然存在的各种类型的Gl-7-ACA酰基转移酶(也称为戊二酰基酰胺酶(GA))而合成的。然而，Gl-7-ACA酰基转移酶对CPC的活性较差。
因此，需要开发对CPC具有优异的酶活性的CPC酰基转移酶。
发明内容
本文提供了一种对头孢菌素C(以下简称“CPC”)具有提高的酶活性的CPC酰基转移酶及其用途。
一方面提供了一种突变型CPC酰基转移酶，其衍生自包括α-亚基和β-亚基的CPC酰基转移酶，其中该突变型CPC酰基转移酶包含通过用不同于相应的原始氨基酸残基的氨基酸对选自由以下组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种)进行取代而发生的突变：
(i)SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位的丙氨酸(A11α)；
(ii)SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位的甘氨酸(G24α)；
(iii)SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位的丙氨酸(A136β)；
(iv)SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位的异亮氨酸(I179β)；和
(v)SEQ ID NO：4(H453β)的β-亚基中的第453位的组氨酸。
在一种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可包含通过进行选自由以下组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种)取代而发生的突变：
(i-1)用天冬酰胺(N)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的A11α(A11αN)；
(ii-1)用天冬氨酸(D)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的G24α(G24αD)；
(iii-1)用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的A136β(A136βT)；
(iv-1)用酪氨酸(Y)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的I179β(I179βY)；和
(v-1)用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的H453β(H453βT)。
在另一种实施方式中，除了上述氨基酸取代外，突变型CPC酰基转移酶还可以包括通过在SEQ ID NO：4的β-亚基中进行选自以下取代中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种，例如五种)而发生的突变：
(vi)将第45位的异亮氨酸(I45β)用与其不同的氨基酸取代，例如(vi-1)I45βV；
(vii)将第58位的苯丙氨酸(F58β)用与其不同的氨基酸取代，例如(vii-1)F58βV；
(viii)将第153位的酪氨酸(Y153β)用与其不同的氨基酸取代，例如(viii-1)Y153βT；
(ix)将第177位的苯丙氨酸(F177β)用与其不同的氨基酸取代，例如(ix-1)F177βL；和
(x)将第382位的缬氨酸(V382β)用与其不同的氨基酸取代，例如(x-1)V382βL。
另一方面提供了编码上述突变型CPC酰基转移酶的核酸序列、携带该核酸序列的重组表达载体、以及锚定(包含)该核酸序列和/或重组表达载体的重组细胞。
另一方面提供了用于生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)或其盐的组合物，该组合物包含上述突变型CPC酰基转移酶、编码该突变型CPC酰基转移酶的核酸分子、携带该核酸分子的重组表达载体、包含该核酸分子和/或重组表达载体的重组细胞和该重组细胞的培养物。
另一方面提供了选自由上述突变型CPC酰基转移酶、编码该突变型CPC酰基转移酶的核酸分子、携带该核酸分子的重组表达载体、包含该核酸分子和/或重组表达载体的重组细胞和该重组细胞的培养物组成的组中的至少一种用于生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)或其盐的用途。
另一方面提供了生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)或其盐的方法，该方法使用选自由上述突变型CPC酰基转移酶、编码该突变型CPC酰基转移酶的核酸分子、携带该核酸分子的重组表达载体、包含该核酸分子和/或重组表达载体的重组细胞和该重组细胞的培养物组成的组中的至少一种。
附图说明
图1是显示由CPC生产7-ACA的一步和两步酶促过程的示意图。
图2为显示根据一种实施方式的突变型CPC酰基转移酶的制备过程的示意图。
具体实施方式
本文提供了一种对头孢菌素C(以下简称“CPC”)具有提高的酶活性的CPC酰基转移酶及其用途。
术语定义
如本文所用，短语多核苷酸(可与“基因”或“核酸分子”互换使用)或多肽(可与“蛋白质”或“酶”互换使用)包含(或包括)“特定核酸序列”或“氨基酸序列”或由“特定核酸序列”或“氨基酸序列”组成或构成的意思是，多核苷酸或多肽基本上包含其中的特定核酸序列或氨基酸序列，或被解释为包括或包含“基本相同的序列”，该“基本相同的序列”是通过对特定核苷酸或氨基酸序列进行突变(缺失、取代、改变和/或添加)以达到保留多核苷酸或多肽的原始功能和/或期望的功能的程度而获得的。
在一种实施方式中，多核苷酸或多肽“包括(包含)特定核酸序列或氨基酸序列”或“(基本上)由特定核酸序列或氨基酸序列组成或表示”的意思可以是，多核苷酸或多肽
(i)基本上包含该特定核酸序列或氨基酸序列，或
(ii)基本上由以下组成或含有以下：与该特定核酸序列或氨基酸序列具有60％或更高、70％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.1％或更高、99.2％或更高、99.3％或更高、99.4％或更高、99.5％或更高、99.6％或更高、99.7％或更高、99.8％或更高、或99.9％或更高的序列同一性的核酸序列或氨基酸序列，并且保留期望的功能。在本文中，期望的功能可以是CPC酰基转移酶功能(例如，水解CPC和/或由CPC生产7-ACA的催化活性)(对于氨基酸序列)、或编码具有此类CPC酰基转移酶功能的蛋白质的功能。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个核酸序列之间或两个氨基酸序列之间的匹配程度，并且可以以百分比(％)表示。至于与核酸序列的同一性，例如，可以使用算法BLAST(参见：Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873,1993)或由Pearson开发的算法FASTA(参见：Methods Enzymol.,183,63,1990)进行确定。基于BLAST算法，开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所用，术语“蛋白质(酶)的氨基酸序列中特定位置的氨基酸残基”是指氨基酸序列中特定位置处的氨基酸残基、或同源同种型蛋白质和/或与该蛋白质具有相同酶活性的异源蛋白质中相应位置处的氨基酸残基。
当本文提供的蛋白质的氨基酸序列中的第一个N末端氨基酸残基是甲硫氨酸时，它可以是以天然状态包含的残基或可以是在重组过程中合成的。如果在蛋白质的氨基酸序列的第1位处不存在甲硫氨酸，则可以在以重组方式进行的蛋白质生产过程中添加甲硫氨酸作为第一个N末端残基。
如本文所用，术语“约”旨在涵盖与其后的数字相同的数值或在其后的数字的特定变化范围内的数值，例如在给定值的±0.5，±0.4、±0.3、±0.2、±0.1、±0.05或±0.01的变化范围内，但不限于此。
下面，将给出本公开的详细描述。
突变型CPC酰基转移酶
本说明书提供了一种具有改进的酶活性的突变型CPC酰基转移酶。突变型CPC酰基转移酶可以由对常规G1-7-ACA酰基转移酶赋予CPC酰基转移酶活性的修饰而产生。
在典型的两步酶促过程中使用的Gl-7-ACA酰基转移酶(参见图1中左侧的反应方案)存在于各种土壤微生物中，这些微生物分为五组，如下表1所示(Gl-7-ACA酰基转移酶的分类)(Sonawane,Crit.Rev.Biotech.26:95-120,2006)：
表1
组 代表性菌株/酶
第I组 假单胞菌属(Pseudomonas sp.)A14
第II-A组 侧孢芽胞杆菌(Bacillus lacteroporus)J1
第II-B组 假单胞菌属GK16
第II-C组 假单胞菌属SE83 AcyI
第III组 假单胞菌属N176
根据表1中的分类，同一组中的蛋白质在大小、氨基酸序列、底物特异性和反应性方面非常相似，而不同组中的蛋白质之间的特征存在很大差异。
第III组中的Gl-7-ACA酰基转移酶的缺点在于其活性容易被7-ACA和无机盐抑制并且酶促反应稳定性差。甚至衍生自第III组中的Gl-7-ACA酰基转移酶的修饰酶也保留了这些缺点。相比之下，由于第II-B组中的Gl-7-ACA酰基转移酶没有第III组中的酶的缺点，因此对第II-B组中的Gl-7-ACA酰基转移酶进行的修饰允许开发一种突变酶，该突变酶可有利地应用于用于生产7-ACA的一步酶促过程(参见图1中右侧的反应方案)。
大多数Gl-7-ACA酰基转移酶依次由α亚基、间隔肽和β亚基组成。本发明所用的基础基因(ga基因)被转录并翻译成由无活性单链组成的多肽，大小约为77kDa。然后，通过切割加工间隔肽以形成由18kDa的α-亚基(SEQ IDNO：3)和58kDa的β-亚基(SEQ ID NO：4)组成的二聚体。
因此，本说明书的突变型CPC酰基转移酶可通过对第II-B组中的G1-7-ACA酰基转移酶进行修饰产生。第II-B组中的G1-7-ACA酰基转移酶可以是源自假单胞菌属菌株(例如假单胞菌属菌株GK16)的G1-7-ACA酰基转移酶。
假单胞菌属GK16来源的野生型G1-7-ACA酰基转移酶(SEQ ID NO：1)可以例如由SEQ ID NO：2的核酸分子编码，或者可以是包含18kDa的α亚基(SEQ ID NO：3)和58kDa的β-亚基(SEQ ID NO：4)的二聚体形式，其衍生自从N末端开始按顺序包括α-亚基(例如SEQ IDNO：3)、间隔肽(例如SEQ ID NO：5)和β-亚基(例如SEQ ID NO：4)的77kDa的无活性单体链，该无活性单体链通过裂解间隔肽而被加工成二聚链。可以将点突变引入α-亚基和/或β-亚基上的一种或多种残基以提供具有CPC酰基转移酶活性的突变体。
一方面提供了一种突变型CPC酰基转移酶，其衍生自包括α-亚基和β-亚基的CPC酰基转移酶，其中该突变型CPC酰基转移酶包含通过对选自由以下组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种)用不同于相应的原始氨基酸残基的氨基酸进行取代而发生的突变：
(i)SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位的丙氨酸(A11α)；
(ii)SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位的甘氨酸(G24α)；
(iii)SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位的丙氨酸(A136β)；
(iv)SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位的异亮氨酸(I179β)；和
(v)SEQ ID NO：4(H453β)的β-亚基中的第453位的组氨酸。
另一方面提供了一种突变型CPC酰基转移酶，其衍生自包括α-亚基和β-亚基的CPC酰基转移酶，其中该突变型CPC酰基转移酶包含通过对选自由以下组成的组中的至少一种(一种、两种、三种或四种)用不同于相应的原始氨基酸残基的氨基酸进行取代而发生的突变：
(i)SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位的丙氨酸(A11α)；
(ii)SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位的甘氨酸(G24α)；
(iii)SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位的丙氨酸(A136β)；和
(iv)SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位的异亮氨酸(I179β)。
用于取代亚基上的氨基酸残基的氨基酸可以选自由丙氨酸(A，Ala)、天冬酰胺(N，Asn)、苏氨酸(T，Thr)、谷氨酸(E，Glu)、丝氨酸(S，Ser)、缬氨酸(V，Val)、异亮氨酸(I，Ile)、亮氨酸(L，Leu)、天冬氨酸(D，Asp)、半胱氨酸(C，Cys)、谷氨酰胺(Q，Gln)、甲硫氨酸(M，Met)、苯丙氨酸(F，Phe)、脯氨酸(P，Pro)、色氨酸(W，Trp)、酪氨酸(Y，Tyr)、精氨酸(R，Arg)、组氨酸(H，His)、赖氨酸(K，Lys)和甘氨酸(G，Gly)组成的组，并且与相应的原始氨基酸残基不同。
在一种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可包含通过进行选自由以下组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种)取代而发生的突变：
(i-1)用天冬酰胺(N)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的A11α(A11αN)；
(ii-1)用天冬氨酸(D)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的G24α(G24αD)；
(iii-1)用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的A136β(A136βT)；
(iv-1)用酪氨酸(Y)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的I179β(I179βY)；和
(v-1)用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的H453β(H453βT)。
在一种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可包含通过进行选自由以下组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种)取代而发生的突变：
(i-1)用天冬酰胺(N)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的A11α(A11αN)；
(ii-1)用天冬氨酸(D)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的G24α(G24αD)；
(iii-1)用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的A136β(A136βT)；和
(iv-1)用酪氨酸(Y)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的I179β(I179βY)。
在另一种实施方式中，除了选自由氨基酸取代(i)至(iv)(例如氨基酸取代(i-1)、(ii-1)、(iii-1)和(iv-1))组成的组中的至少一种外，突变型CPC酰基转移酶还可以包括通过在SEQ ID NO：4的β-亚基中进行以下取代而发生的突变：(v)将SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位的组氨酸用与其不同的氨基酸取代，例如，(v-1)将SEQ ID NO：4的β-亚基中的H453β用苏氨酸(T)取代(H453βT)。
在另一种实施方式中，除了选自由氨基酸取代(i)至(v)(例如氨基酸取代(i-1)、(ii-1)、(iii-1)、(iv-1)和(v-1))组成的组中的前述氨基酸取代外，突变型CPC酰基转移酶还可以包括通过在SEQ ID NO：4的β-亚基中进行选自由以下取代组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种，例如五种)而发生的突变：
(vi)将第45位的异亮氨酸(I45β)用与其不同的氨基酸取代，例如(vi-1)I45βV；
(vii)将第58位的苯丙氨酸(F58β)用与其不同的氨基酸取代，例如(vii-1)F58βV；
(viii)将第153位的酪氨酸(Y153β)用与其不同的氨基酸取代，例如(viii-1)Y153βT；
(ix)将第177位的苯丙氨酸(F177β)用与其不同的氨基酸取代，例如(ix-1)F177βL；和
(x)将第382位的缬氨酸(V382β)用与其不同的氨基酸取代，例如(x-1)V382βL。
包含通过进行以下氨基酸取代(vi)至(x)(例如，氨基酸取代(vi-1)、(vii-1)、(viii-1)、(ix-1)和(x-1))而发生的突变的突变型CPC酰基转移酶保留了CPC酰基转移酶活性，但当进一步通过选自由氨基酸取代(i)至(v)(例如，氨基酸取代(i-1)、(ii-1)、(iii-1)、(iv-1)和(v-1))组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种)而发生突变时表现出更强的CPC酰基转移酶活性和/或热稳定性。
在第一种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN。
在第二种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD。
在第三种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT。
在第四种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第五种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第六种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；和
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD。
在第七种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；和
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT。
在第八种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；和
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第九种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第十种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；和
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT。
在第十一种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；和
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第十二种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第十三种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第十四种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第十五种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第十六种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；和
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT。
在第十七种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；和
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第十八种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第十九种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第二十种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第二十一种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY；和
(v)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)。
在第二十二种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第二十三种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第二十四种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第二十五种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY。
在第二十六种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第二十七种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT；
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第二十八种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第二十九种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT。
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在第三十种实施方式中，突变型CPC酰基转移酶可以包含通过进行以下取代而发生的突变：
(i)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位氨基酸残基丙氨酸(A11α)，例如(i-1)A11αN；
(ii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位氨基酸残基甘氨酸(G24α)，例如(ii-1)G24αD；
(iii)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位氨基酸残基丙氨酸(A136β)，例如(iii-1)A136βT。
(iv)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位氨基酸残基异亮氨酸(I179β)，例如(iv-1)I179βY；和
(v)用不同的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位氨基酸残基组氨酸(H453β)，例如(v-1)H453βT。
在另一方面，根据第一至第二十八种实施方式中任一种的突变型CPC酰基转移酶可以包含通过在SEQ ID NO：4的β-亚基中进行选自由以下取代组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种，例如五种)而发生的额外突变：
(vi)将第45位的异亮氨酸(I45β)用与其不同的氨基酸取代，例如(vi-1)I45βV；
(vii)将第58位的苯丙氨酸(F58β)用与其不同的氨基酸取代，例如(vii-1)F58βV；
(viii)将第153位的酪氨酸(Y153β)用与其不同的氨基酸取代，例如(viii-1)Y153βT；
(ix)将第177位的苯丙氨酸(F177β)用与其不同的氨基酸取代，例如(ix-1)F177βL；和
(x)将第382位的缬氨酸(V382β)用与其不同的氨基酸取代，例如(x-1)V382βL。
由于上文描述的选自由氨基酸取代(i)至(v)(例如氨基酸取代(i-1)、(ii-1)、(iii-1)和(iv-1))组成的组中的至少一种(一种、两种、三种、四种或五种)取代，本说明书中提供的突变型CPC酰基转移酶可在对CPC的酶活性(酰基转移酶活性)、热稳定性或这两者方面与不具有任何突变(取代)的CPC酰基转移酶相比具有改善。
更详细地，与包含通过进行氨基酸取代(vi)至(x)(例如，氨基酸取代(vi-1)、(vii-1)、(viii-1)、(ix-1)和(x-1))中的至少一种，而不进行氨基酸取代(i)至(v)(例如，氨基酸取代(i-1)、(ii-1)、(iii-1)、(iv-1)和(v-1))中的任一种取代而发生的突变的突变型CPC酰基转移酶相比，本文提供的突变型CPC酰基转移酶可以在如下方面得到提高：
就对CPC的酶活性而言，提高约2倍或更高、约2.5倍或更高、约3倍或更高、约3.5倍或更高、约4倍或更高、约4.5倍或更高、约5倍或更高、约5.5倍或更高、约6倍或更高、约6.5倍或更高、约7倍或更高、约7.5倍或更高、约8倍或更高、约8.5倍或更高、约9倍或更高、约9.5倍或更高、约10倍或更高、约10.5倍或更高、约11倍或更高、约11.5倍或更高、约12倍或更高、约12.5倍或更高、约13倍或更高、约13.5倍或更高、约14倍或更高、约14.5倍或更高、或约15倍或更高(对上限没有特别限制，例如最高约100倍、约90倍、约80倍、约70倍、约60倍、约50倍、约40倍、约30倍、或约25倍，但不限于此)，和/或
就热稳定性而言，提高1.05倍或更高、约1.08倍或更高、约1.1倍或更高、约1.3倍或更高、约1.5倍或更高、约1.8倍或更高、约2倍或更高、或约2.3倍或更高(对上限没有特别限制，例如最高约10倍、约9倍、约8倍、约7倍、约6倍、约5倍、约4倍、约3.5倍、或约3倍，但不限于此)。
在这方面，术语“对CPC的酶活性”是指CPC酰基转移酶活性，并且考虑酶活性，将CPC酰基转移酶的单位定义为每分钟催化1微摩尔底物CPC转化为7-ACA的酶的量。例如，CPC的酰基转移酶活性可以指当酶在25℃下放置2小时然后在细胞裂解缓冲液(1.25mg/mL溶菌酶、1.25mM EDTA和0.375％(w/v)TritonX-100)中在10℃下放置1小时后，使酶与底物CPC在10℃下反应16至18小时时，由CPC生产7-ACA的生产率。术语“热稳定性”可以指在高温(约40℃或更高，例如约45℃、约50℃、约55℃或约60℃)下，例如当酶在25℃下放置2小时然后在细胞裂解缓冲液(1.25mg/mL溶菌酶、1.25mM EDTA和0.375％(w/v)TritonX-100)中在55℃下放置1.5小时后，使酶与底物CPC在10℃下反应16至18小时时，由CPC生产7-ACA的生产率(参见实施例4和表3)。
在一种实施方式中，本文提供的突变型CPC酰基转移酶可以是非天然存在的酶，例如以重组方式或通过化学合成产生，但不限于此。
核酸分子、重组表达载体和重组细胞
另一方面提供了编码前述突变型CPC酰基转移酶的核酸分子。核酸分子可以编码突变型CPC酰基转移酶的全长序列，或者可以是分别编码突变型CPC中的α-亚基和β-亚基的核酸分子的组合。
另一方面提供了携带核酸分子的重组载体。重组载体可以是可以在合适的宿主细胞中表达核酸分子的表达载体。重组载体可以是携带编码突变型CPC酰基转移酶全长序列的核酸分子的单个载体(例如，在一个载体中编码α-亚基和β-亚基的核酸分子)，或者可以是携带编码突变型CPC酰基转移酶的α-亚基的核酸分子的第一重组载体和携带编码突变型CPC酰基转移酶的β-亚基的核酸分子的第二重组载体的组合。
另一方面提供了包含核酸分子和/或重组载体的重组细胞。可通过将核酸分子和/或重组载体导入合适的宿主细胞来获得重组细胞。
在一种实施方式中，重组细胞可以是大肠杆菌菌株，例如将核酸分子导入大肠杆菌MC1061中而得到的大肠杆菌MC1061-pBC-TEP11菌株(登录号：KCTC 14821BP)，但不限于此。
突变型CPC酰基转移酶可以通过在合适的条件下在合适的培养基中培养重组细胞来产生。
在一种实施方式中，通过在合适的培养基和条件下培养用携带编码突变型CPC酰基转移酶的全长序列的核酸分子的重组载体转化的宿主细胞，可以产生突变型CPC酰基转移酶。在另一种实施方式中，可以通过在用于获得相应的CPC酰基转移酶亚基蛋白的合适的培养基和条件下培养用携带编码突变型CPC酰基转移酶的α-亚基的基因或具有与该基因功能等同的序列的基因的重组表达载体转化的宿主细胞和用携带编码突变型CPC酰基转移酶的β-亚基的基因或具有与该基因功能等同的序列的基因的重组表达载体转化的宿主细胞，然后将两种亚基蛋白在体外组合，来产生突变型CPC酰基转移酶。
根据本公开如上制备的突变型CPC酰基转移酶可用于生产目标产物或可以纯化后使用。突变型CPC酰基转移酶的分离和纯化可以利用CPC酰基转移酶的已知特性通过各种层析蛋白质分离方法原样实现或以出于实验目的而修改的方式来实现。或者，突变型CPC酰基转移酶可以利用特异性结合亲和力(例如组氨酸肽和镍柱组分之间的结合亲和力或纤维素结合结构域(CBD)和纤维素之间的结合亲和力)通过亲和层析纯化。
此外，本公开的突变型CPC酰基转移酶可以以固定状态而非游离状态使用。可以使用本领域已知的典型方法固定突变型CPC酰基转移酶。在这方面，天然聚合物如纤维素、淀粉、葡聚糖、琼脂糖等；合成聚合物如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、EupergitC等；或者矿物质如二氧化硅、膨润土、金属等可以用作载体。突变型CPC酰基转移酶可以通过共价键、疏水键、物理吸附、微囊化等方式与载体偶联。此外，可以通过在载体的溴化氰和酶之间形成共价键的戊二醛实现突变型CPC酰基转移酶以载体-酶缀合物的形式固定化。含有CPC酰基转移酶的微生物可按原样固定，无需单独纯化酶。当采用这种全细胞固定化时，可以刺穿细胞或可以应用诸如表面表达的技术以增加其中包含的突变型CPC酰基转移酶的反应性。
在本文公开的核酸序列的编码区中，考虑要在其中表达蛋白质的生物体偏好的密码子，由于密码子简并性，可以进行各种改变或修饰，只要它们不改变由编码区表达的多肽的氨基酸序列和/或功能即可。
可以使用本领域技术人员适当地选择的公知的转化方法导入核酸分子或载体。如本文所用，术语“转化”是指将携带编码靶蛋白(外源蛋白)的核酸的载体引入宿主细胞，使得由核酸分子编码的蛋白在宿主细胞中表达。只要转化的核酸分子在宿主细胞中表达，它就可以整合到宿主细胞的染色体中和/或可以存在于染色体外。此外，核酸分子包括编码靶蛋白的DNA和/或RNA。核酸分子可以以任何形式导入，只要该形式可以导入宿主细胞并在宿主细胞中表达即可。例如，可以通过表达盒的形式将核酸分子导入宿主细胞，所述表达盒是包括其自主表达所需的所有元件的基因构建体。通常，表达盒包括可操作地连接至核酸分子的表达调节元件，例如启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和/或翻译终止信号。表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，可将核酸分子原样导入宿主细胞并可操作地连接至在宿主细胞中表达所需的序列。如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸分子与表达调控元件(例如，启动子)之间的功能性连接，以便表达调控元件来控制(例如，起始)编码靶蛋白(外源蛋白)的核酸分子的转录。可以使用本领域已知的基因重组技术进行可操作的连接。例如，连接可以通过典型的位点特异性DNA切割和连接来实现，但不限于此。
只要确保将核酸分子导入宿主细胞(微生物)，任何转化都可以用于本公开。根据宿主细胞，可以适当地选择本领域已知的转化技术。本领域已知的转化方法的实例包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)介导的摄取、DEAE-葡聚糖介导的基因转移、阳离子脂质体-介导的基因转移、脂质转染、醋酸锂-DMSO法、热休克、粒子枪轰击、碳化硅晶须和超声处理，但不限于此。
将核酸分子导入(插入)宿主细胞的基因组(染色体)可以使用本领域技术人员适当选择的已知方法进行。例如，可以使用选自由以下组成的组中的至少一种来导入核酸分子：RNA引导的核酸内切酶系统或CRISPR系统(例如，(a)RNA引导的核酸内切酶(即，Cas9蛋白等)、其编码基因、或携带该基因的载体；和(b)向导RNA(即单向导RNA(sgRNA)等))、其编码DNA、包含携带该DNA的载体的混合物(例如RNA引导的核酸内切酶蛋白和向导RNA等的混合物)、复合物(例如核糖核蛋白(RNP))和重组载体(例如，携带RNA引导的核酸内切酶编码基因和向导RNA编码DNA的载体)，但不限于此。
如本文所用，术语“载体”是指包含编码靶蛋白的核酸分子的核苷酸序列的DNA构建体，该核苷酸序列可操作地连接至合适的表达调节序列以在合适的宿主细胞中表达靶蛋白。调节序列可包括可启动转录的启动子、任选的用于调节转录的操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和/或调节转录和/或翻译终止的序列。在被转化到合适的宿主细胞中之后，载体可以独立于宿主基因组复制或发挥作用，或者可以整合到宿主细胞的基因组中。
可用于本发明的载体不受特别限制，只要它能够在宿主细胞中复制即可，可以使用本领域已知的任何载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A或Charon21A可用作噬菌体载体或粘粒载体，质粒载体的实例包括pBC型(例如，pBC-KS(+))、pBR型(例如pBR322、pBR325)、pUC型(例如pUC118和pUC119)、pBluescriptII型、pGEM型、pTZ型、pCL型、pET型(例如pET-22b(+))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的质粒(例如pUB110、pTP5)、诸如逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒等动物病毒来源的质粒、诸如杆状病毒等昆虫病毒来源的质粒，但不限于此。
通常使用的任何类型的单细胞生物体都可用作宿主细胞。例如，宿主细胞可以选自由原核微生物如各种细菌(例如，梭菌属(Clostridia spp.)、埃希氏菌属(Escherichiaspp.)等)和真核微生物如酵母组成的组。可以选择例如梭菌属微生物(例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖丙丁酸梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)和糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum))和埃希氏菌属微生物(例如大肠杆菌(Escherichia coli))，但不限于此。
本文可用的载体可以是公知的表达载体和/或用于将核酸分子插入染色体的载体。可以通过本领域已知的任何方法将核酸分子插入宿主细胞的染色体中，所述方法例如同源重组或CRISPR系统，但不限于此。该载体还可以包括用于指示插入到染色体中的选择标记。选择标记适于选择转化的细胞，即确定多核苷酸是否被插入，并且可以选自导致产生可选择的表型(例如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白表达)的基因。在选择剂存在的情况下，只有表达选择标记的细胞是活的或表现出不同的表达特征，因此可以被选择。
7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的生产
另一方面提供了用于生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)或其盐的组合物，该组合物包含选自由上述突变型CPC酰基转移酶、编码该突变型CPC酰基转移酶的核酸序列、携带该核酸序列的重组表达载体、包含该核酸序列和/或重组表达载体的重组细胞和该重组细胞的培养物组成的组中的至少一种。
另一方面提供了选自由上述突变型CPC酰基转移酶、编码该突变型CPC酰基转移酶的核酸序列、携带该核酸序列的重组表达载体、包含该核酸序列和/或重组表达载体的重组细胞和该重组细胞的培养物组成的组中的至少一种用于生产7-ACA或其盐的用途。
另一方面提供了生产7-ACA或其盐的方法，该方法使用选自由上述突变型CPC酰基转移酶、编码该突变型CPC酰基转移酶的核酸序列、携带该核酸序列的重组表达载体、包含该核酸序列和/或重组表达载体的重组细胞和该重组细胞的培养物组成的组中的至少一种。
另一方面提供了生产化学式2的化合物或其盐的方法，该方法包括以下步骤：使选自由上述突变型CPC酰基转移酶、编码该突变型CPC酰基转移酶的核酸序列、携带该核酸序列的重组表达载体、包含该核酸序列和/或重组表达载体的重组细胞和该重组细胞的培养物组成的组中的至少一种与化学式1的化合物或其盐接触：
化学式1
Figure BDA0003986513720000221
化学式2
Figure BDA0003986513720000222
(其中，R是乙酰氧基(-OCOCH3)、羟基(-OH)或氢(-H))。
盐可以是任何类型的药学上可接受的盐。例如，可以使用碱金属盐(例如钠盐、钾盐、锂盐等)，但不限于此。在一种实施方式中，化学式1的化合物可以是CPC底物化合物，化学式2的化合物可以是7-ACA。
本文提供的用于生产化学式2的化合物或其盐例如7-ACA或其盐的方法可以是用于直接由CPC生产7-ACA或其盐的一步法。
也就是说，该方法可以不包括用D-氨基酸氧化酶处理CPC的步骤。通过D-氨基酸氧化酶的酶促反应，CPC转化为戊二酰-7-氨基头孢烷酸(以下简称“Gl-7-ACA”)，在此期间还产生过氧化氢并攻击底物(CPC)、反应产物(Gl-7-ACA)和D-氨基酸氧化酶，从而降低产量。相反，本文提供的方法不包括用D-氨基酸氧化酶处理CPC的步骤，而是直接由CPC生产7-ACA或其盐，从而解决了该问题。
该重组细胞是生产突变型CPC酰基转移酶的菌株。
化学式2的化合物可以通过使化学式1的化合物与突变型CPC酰基转移酶接触来制备，该突变型CPC酰基转移酶可以在突变型CPC酰基转移酶生产菌株内或突变型CPC酰基转移酶生产菌株的培养物内(例如，液相、半固相、或固相培养物、或浓缩或干燥形式的培养物)或是组合物的形式，或可以处于分离状态或固定化状态。突变型CPC酰基转移酶与化学式1的化合物之间的接触可以在水或水溶液(例如，缓冲液)中进行。在这方面，酶促反应的条件包括化学式1的化合物的浓度为1至500mM，突变型CPC酰基转移酶的量为0.1至100U/mL，反应混合物的pH值为7至10，反应时间为0.1至24小时，反应温度为4至40℃，但不限于此。可以通过典型方法分离和/或纯化通过酶促反应产生的化学式2的化合物。
此外，化学式2的化合物可以通过突变型CPC酰基转移酶和化学式1的化合物之间的接触在细胞中制备。将携带突变型CPC酰基转移酶编码基因或具有功能等价序列的衍生物的重组表达载体导入能够生物合成化学式1的化合物的菌株，例如大肠杆菌或产黄枝顶孢霉，并将所得转化子在合适的条件下在合适的培养基中培养，在此期间生物合成的化学式1的化合物自发地与转化子中的突变型CPC酰基转移酶接触以制备化学式2的化合物。
发明效果
本发明提供了生产用作头孢菌素原料的7-ACA的突变型酶。更具体地，提供了突变为对头孢菌素C的酶活性和/或热稳定性增加的头孢菌素C酰基转移酶和使用其的7-ACA生产方法，其中本公开的突变型CPC酰基转移酶表现出，对CPC底物的酶活性是常规突变型CPC酰基转移酶(PM2)的约5倍，例如约5至约21倍，热活性是常规突变型CPC酰基转移酶(PM2)的约2.5倍。此外，本公开的技术是一步过程，具有直接由CPC有效地生产7-ACA的优点。
实施例
参照以下实施例可以更好地理解本公开，这些实施例用于说明但不应解释为限制本公开。对本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开的基本要点的情况下，可以修改下面描述的实施例。
实施例1：突变型CPC酰基转移酶的制备和活性测量
1-1.pBC-PM2质粒的构建
为了开发具有提高的酶活性的突变型CPC酰基转移酶，假单胞菌属GK16菌株(Matsuda等人,J.Bacteriol.163:1222-1228,1985)来源的戊二酰酰胺酶(GA)突变体(SEQID NO：6)的编码基因(以下称为“pm基因”；SEQ ID NO：7)用作基础基因。戊二酰酰胺酶(GA)突变体(下文称为“PM2突变体”)是单链多肽，其中野生型α-亚基(SEQ ID NO：3)、间隔区(SEQ ID NO：5)和β-亚基(SEQ ID NO：4)的五重突变体(I45βV/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL；SEQ ID NO：8)通过肽酰基键从N末端开始依次连接(参见韩国专利号10-2014-0094150A；通过引用将其全部内容并入本文)。
pm基因用作本文的前体并表达为单链多肽(SEQ ID NO：6)，其中SEQ IDNO：3的野生型α-亚基和SEQ ID NO：8的突变型β-亚基由肽酰基键通过SEQ ID NO：5的间隔区彼此连接，然后通过细胞内的自催化过程形成由α-亚基和β-亚基组成的成熟活性二聚体形式。将SEQ ID NO：7的pm基因插入pBC-KS(+)载体(Stratagene，美国)的由XbaI和NotI限制酶识别位点识别的位点，以构建表达PM2突变体的pBC-PM2质粒。具体的构建方法如下。
pm基因DNA产物(大小约2.1kb)用限制酶XbaI和NotI消化，并使用纯化试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit；QIAGEN，德国)纯化以制备待插入的DNA。单独地，pBC KS(+)载体(Stratagene，美国)也用XbaI和NotI切割并用CIP(小牛肠碱性磷酸酶)去磷酸化以产生载体DNA。在T4 DNA连接酶(New England Biolabs，瑞典)存在下，将准备好的待插入DNA与载体DNA在16℃下连接12至16小时，然后通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌MC1061中。将菌株铺在含有20μg/mL氯霉素抗生素的LB琼脂平板上，并在30℃下静置孵育过夜以选择转化子。从选定的转化子中分离质粒并进行碱基测序以鉴定DNA插入物的核苷酸序列。所得到的携带具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的pm基因的pBC-PM2质粒被设计用于表达包括β-亚基的五重突变体(I45βV/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL)的PM2突变蛋白。
1-2.酶溶液的制备
测定在实施例1-1中制备的含有pBC-PM2血浆的重组大肠杆菌转化子的CPC(头孢菌素C)酰基转移酶的生产率。为了用于该测定，如下制备CPC酰基转移酶辅酶溶液：将大肠杆菌转化子接种到3mL含有20μg/mL氯霉素的LB肉汤(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％ NaCl)，并在30℃下培养16小时，同时以200rpm搅拌。此后，将350μL培养物接种到35mL含有20μg/mL氯霉素的新鲜LB培养基中并在25℃下培养48小时，同时以200rpm搅拌。将所得培养物离心(4℃，8000rpm，10分钟)以回收细胞团，然后用0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)洗涤一次。将细胞在35mL相同的缓冲液中悬浮，通过超声处理(Vibra Cell VC750，Sonics&Materials Inc，美国)在4℃下裂解10分钟，然后在4℃和13,500rpm下离心20分钟。如此形成的上清液用作突变型CPC酰基转移酶辅酶溶液。下面，使用根据上述方法从每个菌株制备的酶溶液测定CPC酰基转移酶的活性和热稳定性。
1.3.CPC酰基转移酶活性测定
使用Park等人的方法(Park et al.,Kor.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.23:559-564,1995)以其修改版本(如下)测量了实施例1.2中制备的CPC酰基转移酶的活性。
将CPC底物(纯度90％；Hayao，中国)以40mM的浓度溶解在0.1M磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，得到底物溶液。向20μL的CPC底物溶液中添加20μL(微升)的实施例1.2中制备的酶溶液。在37℃下酶促反应5分钟后，添加200μL 50mM NaOH-20％(w/v)冰醋酸(1:2，NaOH:冰醋酸，体积比)终止反应。然后，以13000rpm离心5分钟，然后向200μL由此形成的上清液中添加40μL 0.5％(w/v)PDAB(对二甲基氨基苯甲醛；Sigma，美国)的甲醇溶液。反应10分钟后，在415nm处读取吸光度。通过将吸光度投影到参考物质的校准曲线来进行定量。在这方面，一个单位定义为每分钟催化一微摩尔CPC底物转化为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的酶的量。单独地，CPC底物的比活性表示为每毫克总蛋白质的酶活性单位，其通过Bradford方法在酶溶液中进行定量(Bradford,M.,Anal.Biochem.72:248-254,1976).
作为CPC酰基转移酶活性测定的结果，实施例1.1中制备的重组大肠杆菌MC1061(pBC-PM2)菌株被测量为以约1300个单位/L的生产率表达CPC酰基转移酶。
实施例2：高活性CPC酰基转移酶的制备与筛选
2.1.通过易错PCR构建初级文库
为了制备具有提高的CPC酰基转移酶活性的突变型CPC酰基转移酶，对实施例1.1中描述的pm基因的核苷酸序列进行人工随机突变。为此，进行了易错PCR以构建突变体文库。构建突变体文库的具体过程如下。
使用多样性PCR随机突变试剂盒(Diversity PCR Random Mutagenesis kit)(Clontech，美国)进行易错PCR，每1000bp产生1至2个突变。PCR反应混合物含有作为底物DNA的1ng/μL pBC-PM2质粒(实施例1.1)、10pmol T3引物(SEQ ID NO：15)、10pmol T7引物(SEQ ID NO：16)、2mM dGTP、50X多样性dNTP混合物、10X TITANIUM Taq缓冲液和TITANIUMTaq聚合酶，总体积为50μL。PCR反应条件为：PCR以95℃预变性2分钟起始，95℃变性30秒、52℃退火30秒、68℃延伸3分钟，共进行18个循环，然后以68℃后延伸5分钟。在这种情况下，通过易错PCR进行的扩增产生了大小约为2.1kb的突变型DNA片段。
在该条件下通过易错PCR获得的突变基因(即2.1kb的PCR产物)用限制酶XbaI和NotI切割，然后使用纯化试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit；QIAGEN，德国)纯化以制备待插入的DNA。单独地，pBC-KS(+)载体(Stratagene，美国)也用XbaI和NotI切割并用CIP去磷酸化以产生载体DNA。在T4 DNA连接酶(New England Biolabs，瑞典)存在下，将准备好的待插入DNA与载体DNA在16℃下连接12至16小时，然后通过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌MC1061中。将菌株铺在含有20μg/mL氯霉素抗生素的LB琼脂平板上，并在30℃下静置孵育过夜以构建随机突变文库。
从突变体文库中，如下筛选了对CPC底物具有提高的反应性的突变型CPC酰基转移酶。
大肠杆菌MC1061转化子包含如上所述的引入了额外突变的突变型CPC酰基转移酶基因，将该大肠杆菌MC1061转化子接种到96孔板中，每个孔含有160μL补充有氯霉素的LB肉汤，并在30℃下培养60至70小时，同时以165rpm搅拌。此后，将从每个孔中取出20μL培养物，转移到新的96孔板中，并添加105μL细胞裂解缓冲液(1.25mg/mL溶菌酶、1.25mM EDTA和0.375％(w/v)TritonX-100)，然后在25℃下孵育2小时，然后在10℃下孵育1小时。向每个孔中添加125μL的50mM CPC在25mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的底物溶液，在10℃下对CPC底物进行水解反应16至18小时。水解反应后，将40μL上清液转移到新的96孔板的每个孔中。用100μL反应终止液(乙酸:250mM NaOH，2:1)终止酶促反应，添加30μL显色试剂(0.5％(w/v)PDAB的甲醇溶液)，并置于室温10分钟。随后，在415nm(指示7-ACA形成的波长)处读取96孔板读板器的吸光度，从而筛选对CPC底物具有提高的活性的突变体。
结果，从大约30000个突变体中选择了四个突变体(EM5、EM9、EM17和EM42)，与PM2(包含I45βV/F58βV/Y153βT/F177βL/V382βL突变)相比，四个突变体提高了CPC酰基转移酶活性。突变体基因的碱基测序揭示了，EM5突变酶中的氨基酸残基A11α(α-亚基中的第11位的丙氨酸)被天冬酰胺取代(A11αN)，EM9突变酶中的氨基酸残基G24α被天冬氨酸取代(A11αD)，EM17突变酶中的氨基酸残基A136β(β-亚基中的第136位的丙氨酸)被苏氨酸取代(A136βT)，EM42突变酶中的氨基酸残基I179β被酪氨酸取代(I179βY)。
2.2.通过定点诱变(DNA改组)构建二级突变体文库-修饰菌株(CSH17)的选择
为了进一步提高CPC酰基转移酶活性，在实施例2.1中通过易错PCR获得的修饰菌株的活性的基础上，构建了四个氨基酸残基的定点突变体文库(A11αN、G24αD、A136βT和I179βY)。
简而言之，为了构建A11α和G24α的突变体文库，针对底物PM2和EM5，使用M13-R引物(SEQ ID NO：17)和SH24α-R引物(SEQ ID NO：18)进行PCR，以获得大小约为240bp的PCR产物。通过针对底物PM2和EM17，使用SH24α-F引物(SEQ ID NO：19)和SH179β-R引物(SEQ IDNO：20)进行PCR以获得大小约为975bp的PCR产物，从而构建G24α、A136β和I179β的突变体文库。对于I179β的突变体文库，以PM2为模板，使用SH179β-F引物(SEQ ID NO：21)和M13-F引物(SEQ ID NO：22)进行PCR，得到大小约为1120bp的PCR产物。
在终体积为100μL的PCR反应液中，含有相应的底物DNA、引物、pfu-x缓冲液、dNTP混合物和pfu-x聚合酶。PCR以95℃预变性2分钟起始，95℃变性30秒、52℃退火30秒、68℃延伸3分钟，共进行18个循环，然后以68℃后延伸5分钟。
将在该条件下通过PCR获得的大小为约240bp、约975bp和约1120bp的PCR产物混合并使用T3引物(SEQ ID NO：15)和T7引物(SEQ ID NO：16)进行PCR，从而扩增具有多个突变的2.1kb DNA片段。按照与实施例2.1相同的方式将2.1kb PCR产物插入到pBC-KS(+)载体DNA中，然后转化到大肠杆菌MC1061中以构建定点突变体文库。
在定点突变体文库中，以与实施例2.1中相同的方式搜索对CPC底物具有增加的活性的突变型CPC酰基转移酶。结果，以与实施例2.1相同的方式选择CPC酰基转移酶活性高于PM2的四重突变体(A11αN/G24αD/A136βT/I179βY)，并命名为CSH17。CSH17突变酶(SEQIDNO：9)包括SEQ ID NO：10的α亚基和SEQ ID NO：11的β亚基。
实施例3：酶稳定性所必需的热稳定性提高的突变体的制备和选择-通过易错PCR构建三级突变体文库-修饰菌株TEP11的选择
为了进一步提高实施例2.2制备的修饰菌株CSH17的热稳定性，使用编码CSH17(SEQ ID NO：9)的DNA为模板DNA，按照与实施例2.1相同的方式构建易错突变体文库。.
在突变体文库中，除了热处理条件之外，以与实施例2.1相同的方式搜索具有增加的热稳定性的突变型CPC酰基转移酶。简言之，以编码CSH17(SEQ ID NO：9)的DNA为模板进行易错PCR(见实施例2.1)，构建随机突变体文库。得到的大肠杆菌MC1061转化子含有其中引入了突变的突变型CPC酰基转移酶基因，将该大肠杆菌MC1061转化子接种到96孔板中，每个孔含有160μL补充有氯霉素的LB肉汤，然后在30℃下培养60至70小时，同时以165rpm搅拌。此后，将从每个孔中取出的20μL培养物转移到新的96孔板中，并添加105μL细胞裂解缓冲液(1.25mg/mL溶菌酶、1.25mM EDTA和0.375％(w/v)TritonX-100)，然后在25℃下孵育2小时，然后在55℃下热处理1.5小时。向每个孔中添加125μL的50mM CPC在25mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中的底物溶液，在10℃下对CPC底物进行水解反应16至18小时。
在由此构建的易错突变体文库中，搜索具有增加的热稳定性的突变型CPC酰基转移酶。结果观察到，与CSH17突变体相比，具有通过用苏氨酸取代H453β(H453βT)而发生的突变加上CSH17突变(四重突变A11αN/G24αD/A136βT/I179βY)的菌株表现出高的CPC酰基转移酶活性和显著增加的热稳定性，该菌株被命名为TEP11。TEP11(SEQ ID NO：12)包括SEQ IDNO：13的α亚基和SEQ ID NO：14的β亚基。
下面，测定了实施例2和实施例3的代表性突变体的CPC酰基转移酶活性和热稳定性。
实施例4：CPC酰基转移酶突变体的活性和热稳定性测定
以与实施例1.3和实施例3相同的方式分别测定实施例2和实施例3的CPC酰基转移酶突变体的酶活性和热稳定性。结果总结在表2和表3中(突变酶的活性或热稳定性表示为相对于PM2的相对值(倍数))。
表2
突变型CPC酰基转移酶的突变残基及CPC酰基转移酶的酶活性比较
Figure BDA0003986513720000291
表3
突变型CPC酰基转移酶的突变残基及CPC酰基转移酶的热稳定性比较
Figure BDA0003986513720000301
在突变酶中，观察到TEP11突变酶表现出最高的活性和热稳定性。将携带TEP11突变酶编码基因的pBC-TEP11质粒转化到大肠杆菌MC1061菌株中，然后将该菌株命名为“大肠杆菌(Escherichia coli)MC1061-pBC-TEP11”，并于2021年12月13日保藏在位于韩国全罗北道井邑市的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 14821BP)。
实施例5：CPC酰基转移酶突变体(相对于野生型CPC酰基转移酶)的酶活性和热稳定性的比较
测定了在野生型CPC酰基转移酶中引入了实施例2和实施例3中选择的五个CPC酰化突变(A11αN、G24αD、A136βT、I179βY和H453βT)的突变酶的酶活性和热稳定性。
通过定点诱变制备分别包含五个CPC酰基转移酶突变(A11αN、G24αD、A136βT、I179βY和H453βT)的突变体。
简而言之，以野生型CPC酰基转移酶(SEQ ID NO：1)作为模板，通过PCR制备五种CPC酰基转移酶突变体(A11αN、G24αD、A136βT、I179βY和H453βT)。PCR中的引物总结于下表4中。
表4
Figure BDA0003986513720000302
Figure BDA0003986513720000311
在终体积为100μL的PCR反应液中，含有相应的底物DNA、引物、pfu-x缓冲液、dNTP混合物和pfu-x聚合酶。PCR以95℃预变性2分钟起始，95℃变性30秒、52℃退火30秒、68℃延伸3分钟，共进行18个循环，然后以68℃后延伸5分钟。将此条件下获得的大小为2.1kb的PCR产物以与实施例2.1中相同的方式插入到pBC-KS(+)载体DNA中，并转化到大肠杆菌MC1061中，得到定点突变菌株。为了比较，通过将野生型CPC酰基转移酶(SEQ ID NO：1)引入大肠杆菌MC1061来制备重组菌株。
参照实施例1.3(酶活性)和实施例3(热稳定性，使用酶溶液在40℃下静置30分钟来测量)的方法，与野生型菌株(SEQ ID NO：1)相比，测定上述制备的5个CPC酰基转移酶突变株对CPC底物的酶活性和热稳定性。结果在下表5中给出。
表5
Figure BDA0003986513720000312
如表5所示，与野生型(SEQ ID NO：1)相比，具有在其中单独引入五个CPC酰基转移酶突变(A11αN、G24αD、A136βT、I179βY和H453βT)的各个突变体表现出约2.9倍至约6.2倍的对CPC底物的活性以及相当于约2.4倍的热活性。
实施例6：根据A11α突变的CPC酰基转移酶突变体的酶活性和热稳定性的比较
参考实施例5，测定根据A11α的突变残基的CPC酰基转移酶的酶活性和热稳定性。
简而言之，对野生型CPC酰基转移酶序列(SEQ ID NO：1)作为模板进行定点诱变，以获得CPC酰基转移酶突变体A11αN、A11αP、A11αQ、A11αI、A11αV、A11αL和A11αT，其中氨基酸性残基A11α分别被天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和苏氨酸(T)取代。
参照实施例1.3(酶活性)和实施例3(热稳定性，使用酶溶液在40℃下静置30分钟来测量)的方法，测定上述制备的CPC酰基转移酶突变体和野生型CPC酰基转移酶对CPC底物的酶活性和热稳定性。
CPC酰基转移酶突变体的测定结果表示为下表6中相对于野生型CPC酰基转移酶的测定结果的相对值(倍数)。
表6
Figure BDA0003986513720000321
如表6所示，CPC酰基转移酶突变体A11αN、A11αP、A11αQ、A11αI、A11αV和A11αL对CPC底物的酶活性优于野生型的酶活性，是CPC酰基转移酶突变体A11αT的酶活性的约2.3至5倍。此外，CPC酰基转移酶突变体A11αN、A11αP、A11αQ、A11αI、A11αV和A11αL的热稳定性与野生型相当或高于野生型，而CPC酰基转移酶突变体A11αT的稳定性低于野生型。此外，与CPC酰基转移酶突变体A11αT相比，CPC酰基转移酶突变体A11αN、A11αP、A11αQ、A11αI、A11αV和A11αL表现出稳定性提高至约1.14至1.22倍。
从该数据可知，A11α被天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或亮氨酸(L)取代的突变型CPC酰基转移酶与野生型和其中相同氨基酸残基(A11α)被不同氨基酸(例如，苏氨酸(T))取代的突变体相比，保留了显著改进的特征。
基于以上描述，本领域的技术人员将理解，在不改变本公开的技术精神或本质特征的情况下，可以以不同的具体形式实施本公开。因此，应当理解，在所有方面，上述实施方式不是限制性的，而是说明性的。本公开的范围由所附权利要求书而不是由其前文的说明书的描述限定，因此，属于权利要求书的界限(metes and bounds)或此类界限的等同物之内的所有改变和修改旨在被权利要求书所涵盖。
[保藏信息]
菌株名称：大肠杆菌(Escherichia coli)MC1061-pBC-TEP11；
保藏单位：韩国典型培养物保藏中心；
保藏号：KCTC14821BP；
保藏日期：2021年12月13。

Claims (17)

1.一种突变型头孢菌素C(CPC)酰基转移酶，其衍生自包括α-亚基和β-亚基的CPC酰基转移酶，
其中，所述突变型CPC酰基转移酶包含通过进行选自由以下组成的组中的至少一种氨基酸取代而发生的突变：
用天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或亮氨酸(L)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位的丙氨酸(A11α)；
用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位的甘氨酸(G24α)；
用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位的丙氨酸(A136β)；
用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位的异亮氨酸(I179β)；和
用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位的组氨酸(H453β)。
2.权利要求1所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述取代是选自由以下组成的组中的至少一种：
用天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或亮氨酸(L)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的A11α；
用天冬氨酸(D)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的G24α(G24αD)；
用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的A136β(A136βT)；
用酪氨酸(Y)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的I179β(I179βY)；和
用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的H453β(H453βT)。
3.权利要求1所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述突变型CPC酰基转移酶包含通过进行以下取代而发生的突变：
用天冬酰胺(N)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第11位的丙氨酸(A11α)；
用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的第24位的甘氨酸(G24α)；
用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第136位的丙氨酸(A136β)；和
用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第179位的异亮氨酸(I179β)。
4.权利要求3所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述突变型CPC酰基转移酶还包含通过用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位的组氨酸而发生的突变。
5.权利要求4所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述第453位的组氨酸的取代通过用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的H453β来进行(H453βT)。
6.权利要求2所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述取代包括所有以下取代：
用天冬酰胺(N)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的A11α(A11αN)；
用天冬氨酸(D)取代SEQ ID NO：3的α-亚基中的G24α(G24αD)；
用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的A136β(A136βT)；和
用酪氨酸(Y)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的I179β(I179βY)。
7.权利要求6所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述突变型CPC酰基转移酶还包含通过用不同于原始氨基酸残基的氨基酸取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的第453位的组氨酸(H453β)而发生的突变。
8.权利要求7所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述第453位的组氨酸的取代通过用苏氨酸(T)取代SEQ ID NO：4的β-亚基中的H453β来进行(H453βT)。
9.权利要求1至8中任一项所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述突变型CPC酰基转移酶还包含通过用不同于相应的原始氨基酸的氨基酸对SEQ ID NO：4的β-亚基中的选自以下氨基酸中的至少一种氨基酸进行额外取代而发生的突变：
第45位的异亮氨酸(I45β)、第58位的苯丙氨酸(F58β)、第153位的酪氨酸(Y153β)、第177位的苯丙氨酸(F177β)和第382位的缬氨酸(V382β)。
10.权利要求9所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述额外取代是在SEQ ID NO：4的β-亚基中进行的选自由以下组成的组中的至少一种：
用缬氨酸(V)取代I45β(I45βV)；
用缬氨酸(V)取代F58β(F58βV)；
用苏氨酸(T)取代Y153β(Y153βT)；
用亮氨酸(L)取代F177β(F177βL)；和
用亮氨酸(L)取代V382β(V382βL)。
11.权利要求10所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述额外取代包括在SEQ ID NO：4的β-亚基中进行的所有以下取代：
用缬氨酸(V)取代I45β(I45βV)；
用缬氨酸(V)取代F58β(F58βV)；
用苏氨酸(T)取代Y153β(Y153βT)；
用亮氨酸(L)取代F177β(F177βL)；和
用亮氨酸(L)取代V382β(V382βL)。
12.权利要求10所述的突变型CPC酰基转移酶，其中，所述突变型CPC酰基转移酶由SEQID NO：9或SEQ ID NO：12的氨基酸序列表示。
13.一种核酸分子，其编码：
(1)权利要求1至8中任一项所述的突变型CPC酰基转移酶，或
(2)除了(1)中所述的突变型CPC酰基转移酶中的突变外，还包含通过进行选自由I45βV、F58βV、Y153βT、F177βL和V382βL取代组成的组中的至少一种而发生的突变的突变型CPC酰基转移酶。
14.一种重组表达载体，其携带权利要求13所述的核酸分子。
15.一种重组细胞，其包含权利要求13所述的核酸分子。
16.一种用于生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)或其盐的组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组中的至少一种：
(1)权利要求1至8中任一项所述的突变型CPC酰基转移酶；
(2)除了(1)中所述的突变型CPC酰基转移酶中的突变外，还包含通过进行选自由I45βV、F58βV、Y153βT、F177βL和V382βL组成的组中的至少一种取代而发生的突变的突变型CPC酰基转移酶；
(3)编码(1)中所述的突变型CPC酰基转移酶的核酸分子，或包含所述核酸分子的重组表达载体或重组细胞；
(4)编码(2)中所述的突变型CPC酰基转移酶的核酸分子，或携带所述核酸分子的重组表达载体；和
(5)包含所述核酸分子或所述重组载体的重组细胞，或其培养物。
17.一种制备化学式2的化合物或其盐的方法，所述方法包括使权利要求16所述的组合物与化学式1的化合物或其盐接触的步骤：
<化学式1>
Figure FDA0003986513710000041
<化学式2>
Figure FDA0003986513710000042
其中，R是乙酰氧基(-OCOCH3)、羟基(-OH)或氢(-H)。
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