JP2023095798A - セファロスポリンｃアシラーゼ活性を有するポリペプチドおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】セファロスポリンＣ（ＣＰＣ）に対して優れた酵素活性を有するＣＰＣアシラーゼの開発。【解決手段】本明細書では、セファロスポリンＣ（ＣＰＣ）アシラーゼ活性を有するポリペプチドおよびその使用が、開示される。より具体的には、点変異が導入され、それによって改善された酵素活性および／または安定性を示す変異ＣＰＣアシラーゼ、ならびに７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）を生成するための変異ＣＰＣアシラーゼの使用が、提供される。【選択図】図２
Description
本出願は、２０２１年１２月２４日に出願された韓国特許出願第１０－２０２１－０１８７７６１号の優先権の利益を主張し、その開示全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、セファロスポリンＣ（ＣＰＣ）アシラーゼ活性を有するポリペプチドおよびその使用、より具体的には、点突然変異が導入されているため改善された酵素活性および／または安定性を示す変異ＣＰＣアシラーゼ、ならびに７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）を生成するためのその使用に関する。
βラクタム系抗生物質の一種であるセファロスポリンＣ（以下、ＣＰＣ）は、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどの微生物によって産生される。ＣＰＣは、グラム陰性菌の細胞壁合成を阻害することにより、グラム陰性菌に対して抗生物質活性を示すが、活性が非常に弱いため、主に半合成セファロスポリン系抗生物質（以降、「セファロスポリン類」という）の原料調製に利用されている。中でも、ＣＰＣからＤ－α－アミノアジポイル側鎖を除去して得られる７－アミノセファロスポラン酸（以降、「７－ＡＣＡ」という）は、世界の抗生物質市場の４０％超を占めるほとんどのセファロスポリンの原料として使用されている。
従来、ＣＰＣから７－ＡＣＡを調製するためには、化学的および酵素的プロセスが、存在する。化学的プロセスは複雑な反応条件と高い環境処理コストを必要とするため、近年は環境に優しい酵素的プロセスで７－ＡＣＡを生成する傾向にある。
典型的な酵素プロセスは、以下の２つのステップからなる：第１ステップでは、ＣＰＣがＤ－アミノ酸オキシダーゼ（以降、「ＤＡＯ」という）の酵素反応によってグルタリル－７－アミノセファロスポラン酸（以降、「Ｇｌ－７－ＡＣＡ」という）に変換され、第２ステップは、Ｇｌ－７－ＡＣＡのアシラーゼの酵素反応によってＧｌ－７－ＡＣＡから７－ＡＣＡに変換するよう適合されている（図１の左の反応スキームを参照）。
しかし、２ステップの酵素法では、第１ステップの酵素反応で生成される過酸化水素が基質（ＣＰＣ）、反応生成物（Ｇｌ－７－ＡＣＡ）、ＤＡＯを攻撃するため、生産収率が低いという欠点がある。
この問題を解決するための代替案として、第一ステップを経ずにＣＰＣから直接７－ＡＣＡを生成する１ステップ酵素プロセスが、提案される（図１の右の反応スキームを参照）。このため、ＣＰＣから７－ＡＣＡを直接生成する触媒であるＣＰＣアシラーゼが求められている。ＣＰＣアシラーゼは天然には存在しないため、天然に存在する様々なタイプのＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼ（別名：グルタリルアミダーゼ（ＧＡ））を改変して合成している。しかし、Ｇｌ－７－ＡＣＡアシラーゼは、ＣＰＣに対する活性が低い。
したがって、ＣＰＣに対して優れた酵素活性を有するＣＰＣアシラーゼの開発が必要とされている。
（発明の概要）
本明細書では、セファロスポリンＣ（以下、「ＣＰＣ」という）に対する酵素活性が向上したＣＰＣアシラーゼおよびその使用が、提供される。
本明細書では、セファロスポリンＣ（以下、「ＣＰＣ」という）に対する酵素活性が向上したＣＰＣアシラーゼおよびその使用が、提供される。
１つの態様では、α－サブユニットおよびβ－サブユニットを含むＣＰＣアシラーゼに由来する、変異ＣＰＣアシラーゼであって、
対応する元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のヒスチジン（Ｈ４５３β）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼが、提供される。
対応する元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のヒスチジン（Ｈ４５３β）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼが、提供される。
１つの実施形態では、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、
（ｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）での置換（Ａ１１αＮ）；
（ｉｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
（ｉｉｉ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；
（ｉｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）;
（ｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３βＴ）、
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の置換による変異を、含み得る。
（ｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）での置換（Ａ１１αＮ）；
（ｉｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
（ｉｉｉ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；
（ｉｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）;
（ｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３βＴ）、
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の置換による変異を、含み得る。
別の実施形態では、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、上記のアミノ酸置換に加えて、配列番号４のβ－サブユニットにおける、以下の置換、
（ｖｉ）４５位のイソロイシン（Ｉ４５β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉ－１）Ｉ４５βＶ；
（ｖｉｉ）５８位のフェニルアラニン（Ｆ５８β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｖｉｉ－１）Ｆ５８βＶ、
（ｖｉｉｉ）１５３位のチロシン（Ｙ１５３β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉｉｉ－１）Ｙ１５３βＴ；
（ｉｘ）１７７位のフェニルアラニン（Ｆ１７７β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｘ－１）Ｆ１７７βＬ；および
（ｘ）３８２位のバリン（Ｖ３８２β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｘ－１）Ｖ３８２βＬ
から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、例えば５つ）の置換による変異を、さらに含み得る。
（ｖｉ）４５位のイソロイシン（Ｉ４５β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉ－１）Ｉ４５βＶ；
（ｖｉｉ）５８位のフェニルアラニン（Ｆ５８β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｖｉｉ－１）Ｆ５８βＶ、
（ｖｉｉｉ）１５３位のチロシン（Ｙ１５３β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉｉｉ－１）Ｙ１５３βＴ；
（ｉｘ）１７７位のフェニルアラニン（Ｆ１７７β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｘ－１）Ｆ１７７βＬ；および
（ｘ）３８２位のバリン（Ｖ３８２β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｘ－１）Ｖ３８２βＬ
から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、例えば５つ）の置換による変異を、さらに含み得る。
別の態様では、前述の変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸配列、前記核酸配列を担持する組換え発現ベクター、ならびに前記核酸配列および／または前記組換え発現ベクターを固定する（含む）組換え細胞が、提供される。
別の態様では、７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）またはその塩を生成するための組成物であって、上記変異ＣＰＣアシラーゼ、前記変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸分子、前記核酸分子を担持する組換え発現ベクター、前記核酸分子および／または前記組換え発現ベクターを含む組換え細胞、ならびに前記組換え細胞の培養物を含む、組成物が、提供される。
別の態様では、７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）またはその塩を生成するための、上記の変異ＣＰＣアシラーゼ、前記変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸分子、前記核酸分子を担持する組換え発現ベクター、前記核酸分子および／または前記組換え発現ベクターを含む組換え細胞、ならびに前記組換え細胞の培養物からなる群から選択されるうちの少なくとも１つの使用が、提供される。
別の態様では、上記の変異ＣＰＣアシラーゼ、前記変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸分子、前記核酸分子を担持する組換え発現ベクター、前記核酸分子および／または前記組換え発現ベクターを含む組換え細胞、ならびに前記組換え細胞の培養物からなる群から選択される少なくとも１つを用いて、７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）またはその塩を生成する方法が、提供される。
（詳細な説明）
本出願では、セファロスポリンＣ（以下、「ＣＰＣ」という）に対する酵素活性が向上したＣＰＣアシラーゼ、およびその使用が、提供される。
本出願では、セファロスポリンＣ（以下、「ＣＰＣ」という）に対する酵素活性が向上したＣＰＣアシラーゼ、およびその使用が、提供される。
（用語の定義）
本明細書で使用され場合、ポリヌクレオチド（「遺伝子」または「核酸分子」と互換的に使用される）またはポリペプチド（「タンパク質」または「酵素」と互換的に使用される）が、「特定の核酸配列」もしくは「アミノ酸配列」を含む（または有する）、または「特定の核酸配列」もしくは「アミノ酸配列」から（本質的に）構成される、または、なる、という用語は、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその中に特定の核酸配列またはアミノ酸配列を本質的に含んでいることを意味するか、または、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または所望の機能を保持する程度に、特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）を付与した結果、「実質的に同一の配列」を含むまたは有するものと解釈される。
本明細書で使用され場合、ポリヌクレオチド（「遺伝子」または「核酸分子」と互換的に使用される）またはポリペプチド（「タンパク質」または「酵素」と互換的に使用される）が、「特定の核酸配列」もしくは「アミノ酸配列」を含む（または有する）、または「特定の核酸配列」もしくは「アミノ酸配列」から（本質的に）構成される、または、なる、という用語は、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその中に特定の核酸配列またはアミノ酸配列を本質的に含んでいることを意味するか、または、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または所望の機能を保持する程度に、特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）を付与した結果、「実質的に同一の配列」を含むまたは有するものと解釈される。
１つの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む（または有する）」または「（本質的に）特定の核酸配列またはアミノ酸配列から構成される、または、で表される」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、
（ｉ）特定の核酸配列またはアミノ酸配列を本質的に含むか、または
（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列との、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有する核酸配列またはアミノ酸配列から本質的に構成されるかまたは含み、所望の機能を保持することを意味し得る。ここで、前記所望の機能は、ＣＰＣアシラーゼ機能（例えば、ＣＰＣを加水分解する触媒活性および／またはＣＰＣから７－ＡＣＡを生成する触媒活性）（アミノ酸配列の場合）、またはそのようなＣＰＣアシラーゼ機能を有するタンパク質をコードする機能であり得る。
（ｉ）特定の核酸配列またはアミノ酸配列を本質的に含むか、または
（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列との、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有する核酸配列またはアミノ酸配列から本質的に構成されるかまたは含み、所望の機能を保持することを意味し得る。ここで、前記所望の機能は、ＣＰＣアシラーゼ機能（例えば、ＣＰＣを加水分解する触媒活性および／またはＣＰＣから７－ＡＣＡを生成する触媒活性）（アミノ酸配列の場合）、またはそのようなＣＰＣアシラーゼ機能を有するタンパク質をコードする機能であり得る。
本明細書において、「配列同一性」という用語は、２つの核酸配列間または２つのアミノ酸配列間の一致の程度を意味し、百分率（％）で表すことができる。核酸配列との同一性に関しては、例えば、アルゴリズムＢＬＡＳＴ（参照：Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国，９０，５８７３，１９９３）またはＰｅａｒｓｏｎが開発したアルゴリズムＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８３，６３，１９９０）を使用して、その判定を行うことができる。また、前記アルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＸというプログラムが、開発されている（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照）。
本明細書において、「タンパク質（酵素）のアミノ酸配列における特定位置のアミノ酸残基」とは、前記アミノ酸配列における特定位置のアミノ酸残基、または前記タンパク質と同じ酵素活性を有する同種アイソタイプタンパク質および／または異種タンパク質における対応する位置のアミノ酸残基を意味する。
本明細書に記載されるタンパク質のアミノ酸配列における第１のＮ末端アミノ酸残基がメチオニンである場合、メチオニンは天然状態で含まれる残基であってもよく、組換えプロセスで合成される残基であってもよい。メチオニンは、タンパク質のアミノ酸配列において１位に存在しない場合、組換え法でタンパク質を生成する際に、第１のＮ末端残基として付加され得る。
本明細書で使用される場合、用語「約」は、それに続く数値と同一の数値またはある変動範囲内にある数値、例えば、所定の数値の±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１、±０．０５または±０．０１の変動範囲内の数値を含むことが意図されるが、これらに限定されない。
以下、本開示について詳細に説明する。
変異ＣＰＣアシラーゼ
本記載では、改善された酵素活性を有する変異ＣＰＣアシラーゼが説明される。前記変異ＣＰＣアシラーゼは、従来のＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼがＣＰＣアシラーゼ活性を有するように改変することから、生じ得る。
本記載では、改善された酵素活性を有する変異ＣＰＣアシラーゼが説明される。前記変異ＣＰＣアシラーゼは、従来のＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼがＣＰＣアシラーゼ活性を有するように改変することから、生じ得る。
典型的な２ステップの酵素プロセス（図１の左の反応スキーム参照）に用いられるＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼは、以下の表１（Ｇｌ－７－ＡＣＡアシラーゼの分類）のように５つのグループに分類される様々な土壌微生物において見出される（Ｓｏｎａｗａｎｅ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６：９５－１２０，２００６）。
表１の分類に基づくと、同じグループ内のタンパク質は、サイズ、アミノ酸配列、基質特異性、および反応性が非常に似ているが、異なるグループにおけるタンパク質間では、大きく異なる特性が見られる。
グループＩＩＩのＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼは、７－ＡＣＡおよび無機塩により活性が阻害されやすく、酵素反応の安定性が悪いという欠点がある。グループＩＩＩのＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼに由来する改変酵素でも、この欠点を有している。一方、グループＩＩ－ＢにおけるＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼはＩＩＩ群の酵素の欠点がないため、ＩＩ－Ｂ群のＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼを改変することにより、７－ＡＣＡ生成のための１ステップ酵素プロセス（図１の右の反応スキームを参照）に有利に適用可能な変異酵素を開発することが可能になる。
ほとんどのＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼは、α－サブユニット、スペーサーペプチド、およびβ－サブユニットの順で構成されている。本開示で用いる基本遺伝子（ｇａ遺伝子）は、転写および翻訳を経て、約７７ｋＤａのサイズを有する不活性な単鎖から構成されるポリペプチドが生じる。次いで、スペーサーペプチドが切断処理され、１８ｋＤａのα－サブユニット（配列番号３）と５８ｋＤａのβ－サブユニット（配列番号４）とからなる二量体が形成される。
従って、本明細書の変異ＣＰＣアシラーゼは、グループＩＩ－ＢのＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼに加えられた改変から生じ得る。グループＩＩ－ＢにおけるＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．株、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＧＫ１６に由来するＧｌ－７－ＡＣＡアシラーゼであり得る。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＧＫ１６由来の野生型Ｇｌ－７－ＡＣＡアシラーゼ（配列番号１）は、例えば、配列番号２の核酸分子によってコードされ得るか、またはスペーサーペプチドを切断することによって二量体鎖にプロセシングされるＮ末端から順に、１８ｋＤａα－サブユニット（例えば、配列番号３）、スペーサーペプチド（例えば、配列番号５）、およびβ－サブユニット（例えば、配列番号４）を含む７７ｋＤａ不活性単量体鎖に由来する１８ｋＤａのα－サブユニット（配列番号３）および５８ｋＤａのβ－サブユニット（配列番号４）を含む二量体の形態であり得る。また、α－サブユニットおよび／またはβ－サブユニットの１つまたは複数の残基に点変異を導入して、ＣＰＣアシラーゼ活性を有する変異体をもたらすことができる。
１つの態様では、α－サブユニットおよびβ－サブユニットを含むＣＰＣアシラーゼに由来する変異ＣＰＣアシラーゼであって、
対応する元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のヒスチジン（Ｈ４５３β）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼが、提供される。
対応する元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のヒスチジン（Ｈ４５３β）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼが、提供される。
１つの態様では、α－サブユニットおよびβ－サブユニットを含むＣＰＣアシラーゼに由来する変異ＣＰＣアシラーゼであって、
対応する元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）
からなる群から選択されるうちの少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼが、提供される。
対応する元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）
からなる群から選択されるうちの少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼが、提供される。
サブユニット上のアミノ酸残基を置換するためのアミノ酸は、アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）、リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）およびグリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）からなる群から選択され得、対応する元のアミノ酸残基とは異なる。
１つの実施形態では、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、
（ｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）での置換（Ａ１１αＮ）；
（ｉｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
（ｉｉｉ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；
（ｉｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）;および
（ｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３βＴ）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の置換による変異を、含み得る。
（ｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）での置換（Ａ１１αＮ）；
（ｉｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
（ｉｉｉ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；
（ｉｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）;および
（ｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３βＴ）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の置換による変異を、含み得る。
１つの実施形態では、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、
（ｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）での置換（Ａ１１αＮ）；
（ｉｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
（ｉｉｉ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；および
（ｉｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、または４つ）の置換による変異を、含み得る。
（ｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）での置換（Ａ１１αＮ）；
（ｉｉ－１）配列番号３のα－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
（ｉｉｉ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；および
（ｉｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）
からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、または４つ）の置換による変異を、含み得る。
別の実施形態では、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、アミノ酸置換（ｉ）～（ｉｖ）（例えば、アミノ酸置換（ｉ－１）、（ｉｉ－１）、（ｉｉｉ－１）、および（ｉｖ－１））からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、または４つ）の置換に加えて、（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のヒスチジンの、それとは異なるあるアミノ酸での置換による変異（Ｈ４５３β）、例えば、（ｖ－１）配列番号４のβ－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３βＴ）による変異を、さらに含み得る。
別の実施形態では、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、アミノ酸置換（ｉ）～（ｖ）（例えば、アミノ酸置換（ｉ－１）、（ｉｉ－１）、（ｉｉｉ－１）、（ｉｖ－１）、および（ｉｖ－１））からなる群から選択される上記のアミノ酸置換に加えて、配列番号４のβ－サブユニットにおける、
（ｖｉ）４５位のイソロイシン（Ｉ４５β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉ－１）Ｉ４５βＶ；
（ｖｉｉ）５８位のフェニルアラニン（Ｆ５８β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｖｉｉ－１）Ｆ５８βＶ、
（ｖｉｉｉ）１５３位のチロシン（Ｙ１５３β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉｉｉ－１）Ｙ１５３βＴ；
（ｉｘ）１７７位のフェニルアラニン（Ｆ１７７β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｘ－１）Ｆ１７７βＬ；および
（ｘ）３８２位のバリン（Ｖ３８２β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｘ－１）Ｖ３８２βＬ
から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、例えば５つ）の置換による変異を、さらに含み得る。
（ｖｉ）４５位のイソロイシン（Ｉ４５β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉ－１）Ｉ４５βＶ；
（ｖｉｉ）５８位のフェニルアラニン（Ｆ５８β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｖｉｉ－１）Ｆ５８βＶ、
（ｖｉｉｉ）１５３位のチロシン（Ｙ１５３β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉｉｉ－１）Ｙ１５３βＴ；
（ｉｘ）１７７位のフェニルアラニン（Ｆ１７７β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｘ－１）Ｆ１７７βＬ；および
（ｘ）３８２位のバリン（Ｖ３８２β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｘ－１）Ｖ３８２βＬ
から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、例えば５つ）の置換による変異を、さらに含み得る。
アミノ酸置換（ｖｉ）～（ｘ）による変異を含む前記変異ＣＰＣアシラーゼ（例えば、アミノ酸置換（ｖｉ－１）、（ｖｉｉ－１）、（ｖｉｉｉ－１）、（ｉｘ－１）、および（ｘ－１））は、ＣＰＣアシラーゼ活性を保持するが、アミノ酸置換（ｉ）から（ｖ）（例えば、アミノ酸置換（ｉ－１）、（ｉｉ－１）、（ｉｉｉ－１）、（ｉｖ－１）、および（ｖ－１））からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の置換により、さらに変異させると、より向上したＣＰＣアシラーゼ活性および／または熱安定性を示す。
第１の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ、
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ、
による変異を、含み得る。
第２の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ
による変異を、含み得る。
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ
による変異を、含み得る。
第３の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
第４の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第５の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第６の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ
による変異を、含み得る。
第７の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
第８の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第９の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第１０の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
第１１の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第１２の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第１３の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第１４の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第１５の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第１６の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ
による変異を、含み得る。
第１７の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第１８の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第１９の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第２０の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第２１の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第２２の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第２３の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第２４の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第２５の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ
による変異を、含み得る。
第２６の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第２７の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第２８の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第２９の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
第３０の実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、以下の置換、
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
（ｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１１α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉ－１）Ａ１１αＮ；
（ｉｉ）配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のアミノ酸残基グリシン（Ｇ２４α）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉ－１）Ｇ２４αＤ；
（ｉｉｉ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアミノ酸残基アラニン（Ａ１３６β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｉｉ－１）Ａ１３６βＴ；
（ｉｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のアミノ酸残基イソロイシン（Ｉ１７９β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｖ－１）Ｉ１７９βＹ；および
（ｖ）配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ４５３β）の、異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖ－１）Ｈ４５３βＴ
による変異を、含み得る。
別の態様において、第１～第２８のいずれかの実施形態による変異ＣＰＣアシラーゼは、配列番号４のβ－サブユニットにおいて、以下の置換、
（ｖｉ）４５位のイソロイシン（Ｉ４５β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉ－１）Ｉ４５βＶ；
（ｖｉｉ）５８位のフェニルアラニン（Ｆ５８β） の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｖｉｉ－１）Ｆ５８βＶ、
（ｖｉｉｉ）１５３位のチロシン（Ｙ１５３β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉｉｉ－１）Ｙ１５３βＴ；
（ｉｘ）１７７位のフェニルアラニン（Ｆ１７７β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｘ－１）Ｆ１７７βＬ；および
（ｘ）３８２位のバリン（Ｖ３８２β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｘ－１）Ｖ３８２βＬ
から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、例えば５つ）による変異を、さらに含み得る。
（ｖｉ）４５位のイソロイシン（Ｉ４５β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉ－１）Ｉ４５βＶ；
（ｖｉｉ）５８位のフェニルアラニン（Ｆ５８β） の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば（ｖｉｉ－１）Ｆ５８βＶ、
（ｖｉｉｉ）１５３位のチロシン（Ｙ１５３β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｖｉｉｉ－１）Ｙ１５３βＴ；
（ｉｘ）１７７位のフェニルアラニン（Ｆ１７７β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｉｘ－１）Ｆ１７７βＬ；および
（ｘ）３８２位のバリン（Ｖ３８２β）の、それとは異なるあるアミノ酸での置換、例えば、（ｘ－１）Ｖ３８２βＬ
から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、例えば５つ）による変異を、さらに含み得る。
前述のアミノ酸置換（ｉ）～（ｖ）（例えば、アミノ酸置換（ｉ－１）、（ｉｉ－１）、（ｉｉｉ－１）、（ｉｖ－１）、および（ｖ－１））からなる群から選択される少なくとも１つ（１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の置換により、本明細書で提供される変異ＣＰＣアシラーゼは、いずれの変異（置換）も有していないＣＰＣアシラーゼと比較して、ＣＰＣに対する酵素活性（アシラーゼ活性）、熱安定性、またはその両方が向上している可能性がある。
より詳細には、アミノ酸置換（ｖｉ）～（ｘ）（例えば、アミノ酸置換（ｖｉ－１）、（ｖｉｉ－１）、（ｖｉｉｉ－１）、（ｉｘ－１）、および（ｘ－１））（しかしアミノ酸置換（ｉ）～（ｖ）（例えば、アミノ酸置換（ｉ－１）、（ｉｉ－１）、（ｉｉｉ－１）、（ｉｖ－１）、および（ｖ－１））のいずれでもない）の少なくとも１つによる変異を含む変異ＣＰＣアシラーゼと比較して、本願で提供される変異体ＣＰＣアシラーゼは、
ＣＰＣに対する酵素活性に関して、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約４．５倍以上、約５倍以上、約５．５倍以上、約６倍以上、約６．５倍以上、約７倍以上、約７．５倍以上、約８倍以上、約８．５倍以上、約９倍以上、約９．５倍以上、約１０倍以上、約１０．５倍以上、約１１倍以上、約１１．５倍以上、約１２倍以上、約１２．５倍以上、約１３倍以上、約１３．５倍以上、約１４倍以上、約１４．５倍以上、約１５倍以上（上限は特に設けられず、例えば約１００倍、約９０倍、約８０倍、約７０倍、約６０倍、約５０倍、約４０倍、約３０倍または約２５倍までであるが、それらに限定されない）向上している、および／または、
熱安定性に関して、１．０５倍以上、約１．０８倍以上、約１．１倍以上、約１．３倍以上、約１．５倍以上、約１．８倍以上、約２倍以上、または約２.３倍以上（上限は特に設けられず、例えば、約１０倍、約９倍、約８倍、約７倍、約６倍、約５倍、約４倍、約３．５倍、または約３倍までであるが、それらに限定されない）向上している。
ＣＰＣに対する酵素活性に関して、約２倍以上、約２．５倍以上、約３倍以上、約３．５倍以上、約４倍以上、約４．５倍以上、約５倍以上、約５．５倍以上、約６倍以上、約６．５倍以上、約７倍以上、約７．５倍以上、約８倍以上、約８．５倍以上、約９倍以上、約９．５倍以上、約１０倍以上、約１０．５倍以上、約１１倍以上、約１１．５倍以上、約１２倍以上、約１２．５倍以上、約１３倍以上、約１３．５倍以上、約１４倍以上、約１４．５倍以上、約１５倍以上（上限は特に設けられず、例えば約１００倍、約９０倍、約８０倍、約７０倍、約６０倍、約５０倍、約４０倍、約３０倍または約２５倍までであるが、それらに限定されない）向上している、および／または、
熱安定性に関して、１．０５倍以上、約１．０８倍以上、約１．１倍以上、約１．３倍以上、約１．５倍以上、約１．８倍以上、約２倍以上、または約２.３倍以上（上限は特に設けられず、例えば、約１０倍、約９倍、約８倍、約７倍、約６倍、約５倍、約４倍、約３．５倍、または約３倍までであるが、それらに限定されない）向上している。
この点に関して、用語「ＣＰＣに対する酵素活性」は、ＣＰＣアシラーゼ活性を指し、酵素活性を示すＣＰＣアシラーゼの単位は、１分間に１マイクロモルの基質ＣＰＣの７－ＡＣＡへの変換を触媒する酵素量と定義される。例えば、ＣＰＣに対するアシラーゼ活性とは、酵素を、細胞溶解緩衝液（１．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３７５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）中で、２５℃で２時間放置し、次いで１０℃で1時間放置した後、１０℃で１６～１８時間反応させたときのＣＰＣからの７－ＡＣＡの生産能を意味し得る。用語「熱安定性」という用語は、高温（約４０℃以上、例えば、約４５℃、約５０℃、約５５℃、または約６０℃）でのＣＰＣからの７－ＡＣＡの生産能、例えば、酵素を、細胞溶解緩衝液（１．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３７５％（ｗ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）中、２５℃で２時間放置し、次いで５５℃で１．５時間放置した後、１０℃で１６～１８時間基質ＣＰＣと反応させる場合の生産能を意味し得る（例４および表３参照）。
１つの実施形態において、本明細書で提供される変異ＣＰＣアシラーゼは、例えば、組換え法または化学合成によって生成される非天然型酵素であり得るが、それに限定されない。
（核酸分子、組換え発現ベクター、および組換え細胞）
別の態様では、上記した変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸分子が提供される。核酸分子は、変異ＣＰＣアシラーゼの全長配列をコードするものであってもよく、変異ＣＰＣにおけるα－サブユニットをコードする核酸分子と、β－サブユニットをコードする核酸分子との組合せであってもよい。
別の態様では、核酸分子を担持する組換えベクターが提供される。前記組換えベクターは、適切な宿主細胞において核酸分子を発現させることができる発現ベクターであり得る。前記組換えベクターは、前記変異ＣＰＣアシラーゼの全長配列をコードする核酸分子（例えば、１つのベクターにおけるα－サブユニットをコードする核酸分子およびβ－サブユニットをコードする核酸分子）を担持する単一ベクターであってもよく、または前記変異ＣＰＣアシラーゼのα－サブユニットをコードする核酸分子を担持する第１組換えベクターと、前記変異ＣＰＣアシラーゼのβ－サブユニットをコードする核酸分子を担持する第２組換えベクターとの組み合わせであってもよい。
別の態様では、核酸分子および／または組換えベクターを含む組換え細胞が提供される。前記組換え細胞は、核酸分子および／または組換えベクターを、適切な宿主細胞に導入することによって得ることができる。
１つの実施形態において、前記組換え細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株であってもよく、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１に核酸分子を導入して得られる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１－ｐＢＣ－ＴＥＰ１１株（寄託番号：ＫＣＴＣ １４８２１ＢＰ）などであり得るが、これらに限定されない。
前記変異ＣＰＣアシラーゼは、前記組換え細胞を、適切な培地中、適切な条件下で培養することにより生成され得る。
１つの実施形態において、前記変異ＣＰＣアシラーゼは、変異ＣＰＣアシラーゼの全長配列をコードする核酸分子を有する組換えベクターで形質転換された宿主細胞を適切な培地および条件で培養することによって、生成され得る。別の実施形態では、変異ＣＰＣアシラーゼのα－サブユニットをコードする遺伝子またはそれと機能的に同等な配列を有する遺伝子を担持する組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞と、前記変異ＣＰＣアシラーゼのβ－サブユニットをコードする遺伝子またはそれと機能的に同等な配列を有する遺伝子を担持する組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞とを、それぞれの適切な培地および条件で培養して対応するＣＰＣアシラーゼサブユニットタンパク質を得た後、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこの２つのサブユニットタンパク質を混合することによって、前記変異ＣＰＣアシラーゼが、生成され得る。
本開示に従って上記のように調製された変異ＣＰＣアシラーゼは、目的産物の生成のために用いてもよいし、使用前に精製してもよい。前記変異ＣＰＣアシラーゼの単離および精製は、ＣＰＣアシラーゼの既知の性質をそのまま利用して様々なクロマトグラフィー法によるタンパク質分離方法をそのまま使用するか、または実験目的に合わせて変更した方法で、行うことができる。あるいは、ヒスチジンペプチドとニッケルカラム成分との結合親和性、または、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）とセルロースとの結合親和性などの特定の結合親和性を用いた親和性クロマトグラフィーによって、前記変異ＣＰＣアシラーゼが、精製され得る。
また、本開示の変異ＣＰＣアシラーゼは、遊離状態ではなく、固定化された状態で使用され得る。前記変異ＣＰＣアシラーゼは、当該技術分野で公知の典型的な方法を用いて固定化され得る。これに関して、セルロース、デンプン、デキストラン、アガロースなどの天然ポリマー；ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃなどの合成ポリマー；またはシリカ、ベントナイト、金属などの鉱物が、担体として使用され得る。前記変異ＣＰＣアシラーゼは、共有結合、疎水性結合、物理的吸着、マイクロカプセル化などによって、担体に結合させることができる。また、担体－酵素コンジュゲート形態での前記変異ＣＰＣアシラーゼの固定化は、担体の臭化シアンと酵素との間に共有結合を形成するグルタルアルデヒドによって実現することができる。ＣＰＣアシラーゼを含む微生物は、酵素を別途精製することなく、そのまま固定化することができる。このような全細胞固定化を採用する場合、そこに含まれる変異ＣＰＣアシラーゼの反応性を高めるために、細胞を穿刺するか、または表面発現などの技法を適用してもよい。
本明細書に開示された核酸配列のコード領域において、そのコード領域から発現されるポリペプチドのアミノ酸配列および／または機能を変更しないことを条件として、タンパク質が発現される生物によって好まれるコドンを考慮して、そのコドン縮重により種々の改変または修飾を行うことができる。
核酸分子またはベクターの導入は、当業者によって適切に選択された公知の形質転換法を用いて行うことができる。本明細書において、「形質転換」という用語は、核酸分子によってコードされたタンパク質が宿主細胞内で発現するように、標的タンパク質（外来タンパク質）をコードする核酸を担持するベクターを、宿主細胞内に導入することを意味する。形質転換された核酸分子は、宿主細胞内で発現している限り、宿主細胞の染色体に組み込まれた状態、および／または染色体外に存在する状態のいずれであってもよい。さらに、前記核酸分子は、標的タンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。前記核酸分子は、宿主細胞に導入され、そこで発現することができる限り、いかなる形態で導入されてもよい。例えば、前記核酸分子は、その自律的な発現に必要な全てのエレメントを含む遺伝子構築物である発現カセットの形態を介して宿主細胞内に導入され得る。典型的には、前記発現カセットは、プロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、および／または翻訳終結シグナルなど、核酸分子に作動可能に連結された発現調節エレメントを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記核酸分子は、そのまま宿主細胞に導入され、宿主細胞での発現に必要な配列に作動可能に連結され得る。本明細書において、用語「作動可能に連結された」とは、発現調節エレメントが標的タンパク質（外来タンパク質）をコードする核酸分子の転写を制御（例えば、開始）するための、核酸分子と発現調節エレメント（例えば、プロモーター）との間の機能的な連結を意味する。前記機能的な連結は、当該技術分野において公知の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。一例として、前記連結は、典型的な部位特異的ＤＮＡ切断およびライゲーションによって実施され得るが、それらに限定されない。
宿主細胞（微生物）への核酸分子の導入を確実にする限り、任意の形質転換体が、本開示において使用され得る。宿主細胞に応じて、当技術分野で公知の形質転換技術を適切に選択することができる。当該技術分野で公知の形質転換法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介取り込み、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介遺伝子導入、カチオン性リポソーム媒介遺伝子導入、リポフェクション、酢酸リチウム・ＤＭＳＯ法、熱ショック、粒子ガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、炭化ケイ素ウィスカー（ｓｉｌｉｃｏｎ ｃａｒｂｉｄｅ ｗｈｉｓｋｅｒｓ）および超音波処理が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞のゲノム（染色体）への核酸分子の導入（挿入）は、当業者によって適切に選択された公知の方法を用いて行うことができる。例えば、前記核酸分子は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ系またはＣＲＩＳＰＲ系（例えば、（ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（すなわち、Ｃａｓ９タンパク質など）、それをコードする遺伝子、またはその遺伝子を担持するベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（すなわち、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など））、それをコードするＤＮＡ、またはそのＤＮＡを担持するベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼタンパク質とガイドＲＮＡとの混合物など）、複合体（例えば、リボ核タンパク質（ＲＮＰ））、組換えベクター（例えば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ遺伝子と、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡとの両方を有するベクター）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、標的タンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を指し、これは、適切な宿主細胞において標的タンパク質を発現するために適切な発現調節配列に作動可能に連結される。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または翻訳の終結を調節する配列を含み得る。適切な宿主細胞に形質転換された後、ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製または機能し得るか、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
本発明で使用できるベクターは、宿主細胞内で複製可能であれば特に限定されず、当技術分野で公知の任意のベクターを使用することができる。従来のベクターの例としては、天然または組換えプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、またはＣｈａｒｏｎ２１Ａが、使用され得、プラスミドベクターの例としては、ｐＢＣ型（例えば、ｐＢＣ－ＫＳ（＋））、ｐＢＲ型（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５）、ｐＵＣ型（例えば、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ型、ｐＧＥＭ型、ｐＴＺ型、ｐＣＬ型、ｐＥＴ型（例えば、ｐＥＴ－２２ｂ（＋））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス由来のプラスミド、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のプラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。
通常用いられる任意の種類の単細胞生物が、宿主細胞として利用可能である。例えば、前記宿主細胞は、各種細菌（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属など）などの原核微生物、および酵母などの真核微生物からなる群から選択することができる。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ属微生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））などが選択され得るが、これらに限定されない。
本明細書で利用可能なベクターは、周知の発現ベクターおよび／または核酸分子を染色体へ挿入するためのベクターであり得る。宿主細胞の染色体への核酸分子の挿入は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えば、相同組換えまたはＣＲＩＳＰＲシステムによって実施することができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、染色体への挿入を示すための選択マーカーをさらに含み得る。前記選択マーカーは、形質転換細胞を選択するため、すなわち、ポリヌクレオチドが挿入されているか否かを決定するために適合され、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現などの選択可能な表現型をもたらす遺伝子から選択され得る。選択剤の存在下では、選択マーカーを発現している細胞のみが、生存しているか、あるいは異なる発現形質を示すため、選択され得る。
７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）の生成
本明細書の別の態様では、７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）またはその塩を生成するための組成物が提供され、前記組成物は、前述した変異ＣＰＣアシラーゼ、前記変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸配列、前記核酸配列を担持する組換え発現ベクター、前記核酸配列および／または前記組換え発現ベクターを含む組換え細胞、ならびに前記組換え細胞の培養物、からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
別の態様では、７－ＡＣＡまたはその塩を生成するための、前述した変異ＣＰＣアシラーゼ、前記変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸配列、前記核酸配列を担持する組換え発現ベクター、前記核酸配列および／または前記組換え発現ベクターを含む組換え細胞、ならびに前記組換え細胞の培養物からなる群から選択されるうちの少なくとも１つの使用が、提供される。
別の態様では、前記変異ＣＰＣアシラーゼ、前記変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸配列、前記核酸配列を担持する組換え発現ベクター、前記核酸配列および／または前記組換え発現ベクターを含む組換え細胞、および前記組換え細胞の培養物からなる群より選択される少なくとも１つを用いて７－ＡＣＡまたはその塩を生成する方法が、提供される。
別の態様では、化学式２の化合物またはその塩を生成する方法が提供され、この方法は、前述した変異ＣＰＣアシラーゼ、前記変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸配列、前記核酸配列を担持する組換え発現ベクター、前記核酸配列および／または前記組換え発現ベクターを含む組換え細胞、および前記組換え細胞の培養物からなる群から選択された少なくとも１つと、化学式１の化合物またはその塩とを接触させるステップを含む。
（式中、Ｒは、アセトキシ（－ＯＣＯＣＨ３）基、ヒドロキシ（－ＯＨ）基、または水素（－Ｈ）基である。）
前記塩は、任意のタイプの薬学的に許容可能な塩であり得る。例えば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩など）が使用され得るが、これらに限定されない。１つの実施形態において、化学式１の化合物は、ＣＰＣ基質化合物であってもよく、化学式２の化合物は、７－ＡＣＡであってもよい。
化学式２の化合物またはその塩、例えば７－ＡＣＡまたはその塩を生成するための、本明細書で提供される方法は、ＣＰＣから直接７－ＡＣＡまたはその塩を生成するための１ステップの方法であり得る。
すなわち、本方法は、ＣＰＣをＤ－アミノ酸オキシダーゼで処理するステップを含まなくてもよい。Ｄ－アミノ酸オキシダーゼの酵素反応により、ＣＰＣは、グルタリル－７－アミノセファロスポラン酸（以下、「Ｇｌ－７－ＡＣＡ」という）に変換されるが、その際に過酸化水素も発生し、基質（ＣＰＣ）、反応生成物（Ｇｌ－７－ＡＣＡ）およびＤ－アミノ酸オキシダーゼを攻撃するので、生産収率が低下する。これに対し、本明細書で提供される方法は、ＣＰＣをＤ－アミノ酸オキシダーゼで処理するステップを含まず、ＣＰＣから直接７－ＡＣＡまたはその塩を生成し、それにより、課題が解決される。
前記組換え細胞は、前記変異ＣＰＣアシラーゼを生成するための株である。
変異ＣＰＣアシラーゼ産生株または前記変異ＣＰＣアシラーゼ産生株の培養物（例えば、液相、半固相、もしくは固相の培養物、または、培養物の濃縮物もしくは乾燥形態）内にあってもよく、または組成物の形態であってもよく、単離状態または固定化状態にあってもよい、前記変異ＣＰＣアシラーゼと、化学式１の化合物と、を接触させることによって、化学式２の化合物が、調製され得る。前記変異ＣＰＣアシラーゼと化学式１の化合物との接触は、水または水溶液（例えば、緩衝液）中で行われ得る。この際、酵素反応の条件は、化学式１の化合物の濃度が１～５００ｍＭ、前記変異ＣＰＣアシラーゼの量が０．１～１００Ｕ／ｍＬ、反応混合物のｐＨが７～１０、反応時間が０．１～２４時間、反応温度が４～４０℃であるが、これらに限定されない。前記酵素反応を通じて生成された化学式２の化合物は、典型的な方法で分離および／または精製され得る。
また、前記変異ＣＰＣアシラーゼと化学式１の化合物とを接触させることにより、細胞内で、化学式２の化合物が、調製され得る。前記変異ＣＰＣアシラーゼコード遺伝子または機能的に同等の配列を有する誘導体を担持する組換え発現ベクターが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどの化学式１の化合物を生合成できる菌株に導入され、得られた形質転換体が、適切な培地で適切な条件下で培養され、この際に、生合成された化学式１の化合物が、形質転換体内の前記変異ＣＰＣアシラーゼと自然発生的に接触し、化学式２の化合物が、調製される。
（発明の効果）
本発明は、セファロスポリンの原料として使用される７－ＡＣＡを生成するための変異型酵素を提供する。より具体的には、セファロスポリンＣに対する酵素活性および／または熱安定性が向上するように変異させたセファロスポリンＣアシラーゼおよびこれを用いた７－ＡＣＡの生成方法が、提供される。これにより、本開示の変異ＣＰＣアシラーゼは、従来の変異ＣＰＣアシラーゼ（ＰＭ２）と比較して、ＣＰＣ基質に対する酵素活性が約５倍、例えば、約５～約２１倍高く、熱活性が約２．５倍高い。また、本開示の技法は、ＣＰＣから直接７－ＡＣＡを効率的に生成できるという利点を有する１ステッププロセスである。
本開示のより良い理解は、本開示を説明するために記載されているが、本開示を限定すると解釈されるべきではない以下の実施例に照らして得ることができる。本開示の主旨を逸脱しない範囲で以下の実施例を変更し得ることは、当業者に自明である。
実施例１：変異ＣＰＣアシラーゼの調製および活性測定
１－１．ｐＢＣ－ＰＭ２プラスミドの構築
酵素活性が向上した変異ＣＰＣアシラーゼを開発するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＧＫ１６株（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：１２２２－１２２８、１９８５）由来のグルタリルアミダーゼ（ＧＡ）変異体（配列番号６）をコードする遺伝子（以下「ｐｍ遺伝子」という、配列番号７）を、ベース遺伝子として使用した。グルタリルアミダーゼ（ＧＡ）変異体（以下、「ＰＭ２変異体」という）は、野生型α－サブユニット（配列番号３）、スペーサー（配列番号５）、および β－サブユニット（配列番号：４）の５重変異体（Ｉ４５βＶ／Ｆ５８βＶ／Ｙ１５３βＴ／Ｆ１７７βＬ／Ｖ３８２βＬ；配列番号：８）がＮ末端からこの順番でペプチド結合を介し連結されている、単鎖ポリペプチドである（韓国特許第１０－２０１４－００９４１５０Ａ号参照；参照によりその全体が本明細書に援用される）。
本明細書では、ｐｍ遺伝子を前駆体として用い、配列番号３の野生型α－サブユニットと配列番号８の変異β－サブユニットとが配列番号５のスペーサーを介して互いにペプチド結合で連結した一本鎖ポリペプチド（配列番号６）が発現され、細胞内の自己触媒プロセスによってα－サブユニットとβ－サブユニットとからなる成熟活性二量体に発達する。配列番号７のｐｍ遺伝子をｐＢＣ－ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）のＸｂａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素認識部位によって認識される部位に挿入し、ＰＭ２変異体を発現させるためのｐＢＣ－ＰＭ２プラスミドを構築した。具体的な構築方法は、以下の通りである。
ｐｍ遺伝子ＤＮＡ産物（約２．１ｋｂのサイズ）を制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩで消化し、精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）を用いて精製し、挿入するＤＮＡを調製した。また、別途、ｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）をＸｂａＩとＮｏｔＩで切断し、ＣＩＰ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で脱リン酸化して、ベクターＤＮＡを得た。調製した挿入すべきＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，スウェーデン）の存在下、１６℃で１２～１６時間、ベクターＤＮＡにライゲーションし、ライゲーション混合物をエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１に形質転換させた。この菌株を２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール抗生物質を含むＬＢ寒天プレートに広げ、３０℃で一晩静置培養し、形質転換体を選択した。選択された形質転換体からプラスミドを単離し、塩基配列決定を行って挿入ＤＮＡの塩基配列を同定した。得られた、配列番号７のヌクレオチド配列を有するｐｍ遺伝子を担持するｐＢＣ－ＰＭ２プラスミドは、β－サブユニットの５重変異体（Ｉ４５βＶ／Ｆ５８βＶ／Ｙ１５３βＴ／Ｆ１７７βＬ／Ｖ３８２βＬ）を含むＰＭ２変異タンパク質を発現するように設計された。
１－２．酵素液の調製
実施例１－１で調製したｐＢＣ－ＰＭ２血漿含有組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体を、ＣＰＣ（セファロスポリンＣ）アシラーゼの生産性についてアッセイした。このアッセイに用いるため、ＣＰＣアシラーゼ補酵素溶液を以下のように調製した：２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢブロス（１％Ｂａｃｔｏ－ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％酵母エキス（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、０．５％ＮａＣｌ）３ｍＬに大腸菌形質転換体を接種し、２００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で１６時間培養を行った。その後、この培養液３５０μＬを２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む新鮮なＬＢ培地３５ｍＬに接種し、２００ｒｐｍで攪拌しながら２５℃で４８時間培養を行った。得られた培養液を遠心分離（４℃、８０００ｒｐｍ、１０分）して細胞塊を回収し、これを０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で１回洗浄した。この細胞を３５ｍＬの同緩衝液に懸濁し、超音波処理（Ｖｉｂｒａ Ｃｅｌｌ ＶＣ７５０，Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ，米国）により４℃で１０分間溶解し、その後４℃、１３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。こうして形成された上清を変異ＣＰＣアシラーゼ補酵素溶液とした。以下、各株から調製した酵素溶液を用いて、上記の方法でＣＰＣアシラーゼの活性および熱安定性を測定した。
１．３．ＣＰＣアシラーゼ活性の測定
実施例１．２で調製したＣＰＣアシラーゼの活性は、Ｐａｒｋらの方法（Ｐａｒｋら、Ｋｏｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５５９－５６４，１９９５）を用い、それに改変を加えて以下のように測定した。
ＣＰＣ基質（純度９０％；Ｈａｙａｏ、中国）を０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に４０ｍＭの濃度で溶解し、基質溶液を得た。このＣＰＣ基質溶液２０μＬに、実施例１．２で調製した酵素溶液２０μＬ（マイクロリットル）を加えた。３７℃で５分間酵素反応を行った後、５０ｍＭ ＮａＯＨ－２０％（ｗ/ｖ）氷酢酸（１：２、ＮａＯＨ：氷酢酸、容量比）を２００μＬ加えて反応を停止させた。その後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、こうして形成された上清２００μＬに、０．５％（ｗ/ｖ）ＰＤＡＢ（ｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド；Ｓｉｇｍａ，米国）のメタノール溶液を４０μＬ加えた。１０分間反応させた後、４１５ｎｍで吸光度を読み取った。吸光度を標準物質の検量線に投影することにより、定量を行った。この際、１単位は、１分間に１マイクロモルのＣＰＣ基質を７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）に変換することを触媒する酵素の量と定義される。別途、ＣＰＣ基質に対する比活性は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８－２５４，１９７６）により酵素溶液中で定量した全タンパク質１ミリグラムあたりの酵素の活性単位で表した。
ＣＰＣアシラーゼ活性の測定の結果、実施例１．１で調製した組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１（ｐＢＣ－ＰＭ２）株は、約１３００ユニット／Ｌの生産性でＣＰＣアシラーゼを発現すると測定された。
実施例２：高活性ＣＰＣアシラーゼの調製と選択
２．１．エラープローンＰＣＲによるプライマリライブラリの構築
向上したＣＰＣアシラーゼ活性を有する変異ＣＰＣアシラーゼを調製するために、実施例１．１に記載したｐｍ遺伝子の塩基配列に人為的にランダムな変異を加えた。この目的のため、エラープローンＰＣＲを行い、変異ライブラリを構築した。変異ライブラリの構築の具体的なプロセスは、以下の通りである。
Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国）を用いて、１，０００ｂｐあたり１～２個の変異が生じるように、エラープローンＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応混合物は、基質ＤＮＡとして１ｎｇ／μＬのｐＢＣ－ＰＭ２プラスミド（実施例１．１）、１０ｐｍｏｌのＴ３プライマー（配列番号１５）、１０ｐｍｏｌのＴ７プライマー（配列番号１６）、２ｍＭのｄＧＴＰ、５０× Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、１０× ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ バッファーおよびＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ポリメラーゼが全量を５０μＬで混合されたものだった。ＰＣＲ反応条件は以下の通りである。ＰＣＲは９５℃で２分間の予備変性で開始し、９５℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長を１８サイクル行い、その後６８℃で５分間の最終伸長を行った。この条件では、エラープローンＰＣＲによる増幅の結果、約２．１ｋｂのサイズの変異ＤＮＡ断片が得られた。
エラープローンＰＣＲによって得られた変異遺伝子、すなわち２．１ｋｂのＰＣＲ産物を制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩで切断し、精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ，ドイツ）を用いて精製し、挿入ＤＮＡを調製した。また、別途、ｐＢＣ－ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，米国）をＸｂａＩとＮｏｔＩで切断し、ＣＩＰで脱リン酸化してベクターＤＮＡを得た。調製した挿入ＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、スウェーデン）の存在下、１６℃で１２～１６時間ベクターＤＮＡにライゲーションし、ライゲーション混合物をエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１に形質転換させた。この菌株を２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール抗生物質を含むＬＢ寒天プレートに広げ、３０℃で一晩静置培養し、ランダム変異ライブラリを構築した。
前記変異ライブラリの中から、ＣＰＣ基質に対する反応性が向上した変異ＣＰＣアシラーゼを、以下のようにスクリーニングした。
上記のように追加の変異が導入された変異ＣＰＣアシラーゼ遺伝子を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１形質転換体を、クロラムフェニコール添加ＬＢブロスを１６０μＬずつ含む９６ウェルプレートに接種し、１６５ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で６０～７０時間培養を行った。その後、各ウェルから取り出した培養液２０μＬを新しい９６ウェルプレートに移し、１０５μＬの細胞溶解緩衝液（１．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．３７５％（ｗ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を加えて、２５℃で２時間、その後１０℃で１時間インキュベートした。各ウェルに、５０ｍＭ ＣＰＣを２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した基質溶液を１２５μＬ加え、１０℃で１６～１８時間、ＣＰＣ基質に対する加水分解反応を行った。加水分解反応後、上清４０μＬを新しい９６ウェルプレートの各ウェルに移した。酵素反応を反応停止液（酢酸：２５０ｍＭ ＮａＯＨ、２：１）１００μＬで停止し、発色試薬（メタノール中 ０．５％（ｗ／ｖ）ＰＤＡＢ）３０μＬを加え、室温で１０分間静置した。その後、９６ウェルプレートリーダーを用いて７－ＡＣＡの生成を示す波長である４１５ｎｍでの吸光度を読み取り、ＣＰＣ基質に対する活性が向上した変異体をスクリーニングした。
その結果、約３００００の変異体の中から、ＰＭ２に比べてＣＰＣアシラーゼ活性が向上した４つの変異体（ＥＭ５、ＥＭ９、ＥＭ１７、およびＥＭ４２）（Ｉ４５βＶ／Ｆ５８ｓＶ／Ｙ１５３βＴ／１７７βＬ／Ｖ３８２βＬ変異を含む）が選択された。変異体の遺伝子をシークエンシングにより、ＥＭ５変異体酵素ではアミノ酸残基Ａ１１α（α－サブユニットの１１位のアラニン）がアスパラギンに置換（Ａ１１αＮ）され、ＥＭ９変異体酵素ではアミノ酸残基Ｇ２４αがアスパラギン酸に置換（Ａ１１αＤ）され、ＥＭ１７変異体ではアミノ酸残基Ａ１３６β（β－サブユニット１３６位のアラニン）がトレオニンに置換（Ａ１３６βＴ）され、ＥＭ４２変異体ではアミノ酸残基Ｉ１７９βがチロシンに置換（Ｉ１７９βＹ）されていることが判明した。
２．２．部位特異的変異導入（ＤＮＡシャッフリング）による二次変異ライブラリの構築－改変株の選択（ＣＳＨ１７）
ＣＰＣアシラーゼ活性をさらに高めるために、４つのアミノ酸残基（Ａ１１αＮ、Ｇ２４αＤ、Ａ１３６βＴ、およびＩ１７９βＹ）の部位特異的変異ライブラリを、実施例２．１のエラープローンＰＣＲで得られた改変株の活性に基づいて構築した。
簡単に説明すると、Ａ１１αおよびＧ２４αについての変異ライブラリを構築するために、基質ＰＭ２およびＥＭ５上でＭ１３－Ｒプライマー（配列番号１７）およびＳＨ２４α－Ｒプライマー（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行い、約２４０ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を得た。Ｇ２４α、Ａ１３６β、およびＩ１７９βに対する変異ライブラリは、基質ＰＭ２およびＥＭ１７に対してＳＨ２４α－Ｆプライマー（配列番号１９）およびＳＨ１７９β－Ｒプライマー（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、約９７５ｂｐのサイズのＰＣＲ生成物を得ることにより構築された。Ｉ１７９βの変異ライブラリについては、ＰＭ２を鋳型として、ＳＨ１７９β－Ｆプライマー（配列番号２１）およびＭ１３－Ｆプライマー（配列番号２２）を用いてＰＣＲを行い、約１，１２０ｂｐのサイズのＰＣＲ産物を得た。
ＰＣＲ反応液の最終容量１００μＬには、対応する基質ＤＮＡ、プライマー、ｐｆｕ－ｘ緩衝液、ｄＮＴＰｓ ｍｉｘ、およびｐｆｕ－ｘポリメラーゼが含まれていた。ＰＣＲは９５℃で２分間の予備変性で開始し、９５℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長を１８サイクル行い、６８℃で５分間の最終伸長を行った。
この条件でＰＣＲを行って得られた約２４０ｂｐ、約９７５ｂｐ、約１１２０ｂｐのサイズを有するＰＣＲ産物を混合し、Ｔ３プライマー（配列番号１５）とＴ７プライマー（配列番号１６）を用いたＰＣＲに供して複数の変異を有する２．１ｋｂ ＤＮＡフラグメントを増幅させた。この２．１ｋｂのＰＣＲ産物を、実施例２．１と同様の方法でｐＢＣ－ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡに挿入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１に形質転換して部位特異的変異ライブラリを構築した。
部位特異的変異ライブラリでは、実施例２．１と同様にして、ＣＰＣ基質に対して活性を高めた変異ＣＰＣアシラーゼを探索した。その結果、実施例２．１と同様にして、ＰＭ２よりもＣＰＣアシラーゼ活性が高い四重変異体（Ａ１１αＮ／Ｇ２４αＤ／Ａ１３６βＴ／Ｉ１７９βＹ）を選択し、ＣＳＨ１７と命名した。ＣＳＨ１７変異酵素（配列番号９）は、配列番号１０のα－サブユニットおよび配列番号１１のβ－サブユニットを含む。
実施例３：酵素安定性に必要な熱安定性が向上した変異体の調製と選択－エラープローンＰＣＲによる３次変異ライブラリの構築－改変株ＴＥＰ１１の選択
実施例２．２で調製した改変株ＣＳＨ１７の熱安定性をさらに高めるため、ＣＳＨ１７（配列番号９）をコードするＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして使用し、実施例２．１と同様の方法でエラープローン変異ライブラリを構築した。
前記変異ライブラリにおいて、熱処理条件以外は実施例２．１と同様にして、熱安定性が向上した変異ＣＰＣアシラーゼを探索した。すなわち、ＣＳＨ１７（配列番号９）をコードするＤＮＡを鋳型として、エラープローンＰＣＲ（実施例２．１参照）を行い、ランダム変異ライブラリを構築した。得られた、変異を導入した変異ＣＰＣアシラーゼ遺伝子を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１形質転換体を、クロラムフェニコール添加ＬＢブロスを各ウェル１６０μＬずつ含む９６ウェルプレートに接種し、１６５ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で６０～７０時間培養を行った。その後、各ウェルから取り出した培養液２０μＬを新たな９６ウェルプレートに移し、１０５μＬの細胞溶解緩衝液（１．２５ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．３７５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を加え、２５℃で２時間インキュベートし、次に５５℃で１．５時間加熱処理を行った。各ウェルに、５０ｍＭ ＣＰＣを２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した基質溶液を１２５μＬ加え、１０℃で１６～１８時間、ＣＰＣ基質に対する加水分解反応を行った。
このようにして構築したエラープローン変異ライブラリにおいて、熱安定性が向上した変異ＣＰＣアシラーゼを探索した。その結果、Ｈ４５３βのトレオニンでの置換による変異（Ｈ４５３βＴ）＋ＣＳＨ１７変異（四重変異Ａ１１αＮ／Ｇ２４αＤ／Ａ１３６βＴ／Ｉ１７９βＹ）を含む株が、ＣＳＨ１７変異体と比較して、高いＣＰＣアシラーゼ活性と著しく高い熱安定性とを示すことを確認し、ＴＥＰ１１と命名した。ＴＥＰ１１（配列番号１２）は、配列番号１３のα－サブユニットおよび配列番号１４のβ－サブユニットを含む。
以下では、実施例２および３の代表的な変異体を、ＣＰＣアシラーゼ活性および熱安定性についてアッセイした。
実施例４：ＣＰＣアシラーゼ変異体の活性と熱安定性のアッセイ
実施例２および３のＣＰＣアシラーゼ変異体について、それぞれ実施例１．３および３と同様の方法で酵素活性および熱安定性についてアッセイした。結果を表２および３にまとめた（変異酵素の活性または熱安定性は、ＰＭ２に対する相対値（倍率）として表す）。
変異酵素の中で、ＴＥＰ１１変異酵素が最も高い活性と熱安定性を示すことが観察された。ＴＥＰ１１変異酵素をコードする遺伝子を担持するｐＢＣ－ＴＥＰ１１プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１株に形質転換し、これを「Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１－ｐＢＣ－ＴＥＰ１１」と命名し、２０２１年１２月１３日付で大韓民国全羅北道井邑市に所在するＫｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ １４８２１ＢＰ）。
実施例５：ＣＰＣアシラーゼ変異体の酵素活性と熱安定性の比較（対 野生型ＣＰＣアシラーゼ）
実施例２および実施例３で選択した５つのＣＰＣアシラーゼ変異（Ａ１１αＮ、Ｇ２４αＤ、Ａ１３６βＴ、Ｉ１７９βＹ、Ｈ４５３βＴ）を野生型ＣＰＣアシラーゼに導入した変異酵素について、酵素活性および熱安定性を評価した。
５つのＣＰＣアシラーゼ変異（Ａ１１αＮ、Ｇ２４αＤ、Ａ１３６βＴ、Ｉ１７９βＹ、およびＨ４５３βＴ）を含む変異体を、それぞれ部位特異的変異導入法により調製した。
簡単に説明すると、野生型ＣＰＣアシラーゼ（配列番号１）を鋳型として、５つのＣＰＣアシラーゼ変異体（Ａ１１αＮ、Ｇ２４αＤ、Ａ１３６βＴ、Ｉ１７９βＹ、およびＨ４５３βＴ）を、ＰＣＲによって調製した。ＰＣＲにおけるプライマーを、以下の表４にまとめた。
ＰＣＲ反応液の最終容量１００μＬには、対応する基質ＤＮＡ、プライマー、ｐｆｕ－ｘバッファー、ｄＮＴＰ ｍｉｘ、およびｐｆｕ－ｘポリメラーゼが含まれていた。ＰＣＲは９５℃で２分間の予備変性で開始し、９５℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長を１８サイクル行い、その後６８℃で５分間の最終伸長を行った。この条件で得られた２．１ｋｂのサイズのＰＣＲ産物を、実施例２．１と同様の方法でｐＢＣ－ＫＳ（＋）ベクターＤＮＡに挿入し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１に形質転換して部位特異的変異株を得た。比較のため、野生型ＣＰＣアシラーゼ（配列番号１）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１に導入し、組換え株を調製した。
上記で調製した５種類のＣＰＣアシラーゼ変異株を、野生型株（配列番号１）と比較して、実施例１．３（酵素活性）および実施例３（熱安定性、４０℃で３０分間放置した酵素溶液を用いて測定）の方法を参照してＣＰＣ基質に対する酵素活性および熱安定性を評価した。その結果を下記表５に示す。
表５に示されるように、５つのＣＰＣアシラーゼ変異（Ａ１１αＮ、Ｇ２４αＤ、Ａ１３６βＴ、Ｉ１７９βＹ、およびＨ４５３βＴ）を単独で導入した各変異体は、野生型（配列番号１）と比較して、ＣＰＣ基質に対して約２．９～約６．２倍、熱活性に対して約２．４倍高い活性を示した。
実施例６：Ａ１１α変異によるＣＰＣアシラーゼ変異体の酵素活性と熱安定性の比較
実施例５を参照して、ＣＰＣアシラーゼを、Ａ１１αに対する変異残基に従って、酵素活性および熱安定性についてアッセイした。
簡単に説明すると、部位特異的変異誘発は、野生型ＣＰＣアシラーゼ配列（配列番号１）を鋳型として行い、アミノ酸残基Ａ１１αを、それぞれアスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびトレオニン（Ｔ）で置換したＣＰＣアシラーゼ変異体Ａ１１αＮ、Ａ１１αＰ、Ａ１１αＱ、Ａ１１αＩ、Ａ１１αＶ、Ａ１１αＬおよびＡ１１αＴを得ることを目的とする。
上記で調製したＣＰＣアシラーゼ変異体および野生型ＣＰＣアシラーゼを、実施例１．３（酵素活性）および実施例３（熱安定性、４０℃で３０分間放置した酵素溶液を用いて測定）の方法を参照して、ＣＰＣ基質に対する酵素活性および熱安定性を評価した。
ＣＰＣアシラーゼ変異体のアッセイ結果を、野生型ＣＰＣアシラーゼに対する相対値（倍率）として、以下の表６に示す。
表６に示すように、ＣＰＣアシラーゼ変異体Ａ１１αＮ、Ａ１１αＰ、Ａ１１αＱ、Ａ１１αＩ、Ａ１１αＶ、Ａ１１αＬのＣＰＣ基質に対する酵素活性は、野生型よりも優れており、ＣＰＣアシラーゼ変異体Ａ１１αＴよりも約２．３～５倍高いことが示された。また、ＣＰＣアシラーゼ変異体Ａ１１αＮ、Ａ１１αＰ、Ａ１１αＱ、Ａ１１αＩ、Ａ１１αＶ、およびＡ１１αＬは熱安定性において野生型と同等かそれ以上であったが、ＣＰＣアシラーゼ変異体Ａ１１αＴは、野生型より安定性が低かった。さらに、ＣＰＣアシラーゼ変異体Ａ１１αＮ、Ａ１１αＰ、Ａ１１αＱ、Ａ１１αＩ、Ａ１１αＶ、およびＡ１１αＬは、前記ＣＰＣアシラーゼ変異体Ａ１１αＴと比較して、安定性が約１．１４倍～１．２２倍向上していることを示した。
このデータから、Ａ１１αをアスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、またはロイシン（Ｌ）で置換した変異ＣＰＣアシラーゼは、野生型、および同じアミノ酸残基（Ａ１１α）を、異なるあるアミノ酸（例えば、トレオニン（Ｔ））で置換した変異体に比べて、著しく向上した特性を保持していると理解された。
上記の説明から、本開示は、その技術的精神または本質的な特徴を変更することなく、異なる具体的な形態で実施され得ることが当業者には理解されよう。したがって、上記の実施形態は、限定的なものではなく、すべての態様において例示的なものであることが理解されるべきである。本開示の範囲は、それらに先行する記載によってではなく、添付の請求項によって定義され、したがって、請求項の計量値またはその同等物の範囲に含まれるすべての変更および改変は、請求項によって包含されることを意図している。
（寄託番号）
寄託機関：Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
寄託番号：ＫＣＴＣ １４８２１ＢＰ
寄託日：２０２１年１２月１３日
寄託機関：Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
寄託番号：ＫＣＴＣ １４８２１ＢＰ
寄託日：２０２１年１２月１３日
Claims (17)
- α－サブユニットおよびβ－サブユニットを含むセファロスポリンＣ（ＣＰＣ）アシラーゼに由来する、変異ＣＰＣアシラーゼであって、
配列番号３の前記α－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）の、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、またはロイシン（Ｌ）での置換；
配列番号３の前記α－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換；
配列番号４の前記β－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換；
配列番号４の前記β－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換；および
配列番号４の前記β－サブユニットにおける４５３位のヒスチジン（Ｈ４５３β）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼ。 - 前記置換が、
配列番号３の前記α－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、またはロイシン（Ｌ）での置換；
配列番号３の前記α－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
配列番号４の前記β－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；
配列番号４の前記β－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）；および
配列番号４の前記β－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３β）
からなる群から選択される少なくとも１つの置換である、請求項１に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。 - 前記変異ＣＰＣアシラーゼが、以下の置換、
配列番号３のα－サブユニットにおける１１位のアラニン（Ａ１１α）の、アスパラギン（Ｎ）での置換；
配列番号３のα－サブユニットにおける２４位のグリシン（Ｇ２４α）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換；
配列番号４のβ－サブユニットにおける１３６位のアラニン（Ａ１３６β）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換；および、
配列番号４のβ－サブユニットにおける１７９位のイソロイシン（Ｉ１７９β）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換
による変異を含む、請求項１に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。 - 前記変異ＣＰＣアシラーゼが、配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のヒスチジンの、元のアミノ酸残基と異なるあるアミノ酸での置換による変異をさらに含む、請求項３記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。
- 配列番号４のβ－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３βＴ）により、４５３位のヒスチジンの置換が、行われる、請求項４に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。
- 前記置換が、以下の全ての置換、
配列番号３のα－サブユニットにおけるＡ１１αの、アスパラギン（Ｎ）での置換（Ａ１１αＮ）；
配列番号３のα－サブユニットにおけるＧ２４αの、アスパラギン酸（Ｄ）での置換（Ｇ２４αＤ）；
配列番号４のβ－サブユニットにおけるＡ１３６βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ａ１３６βＴ）；および、
配列番号４のβ－サブユニットにおけるＩ１７９βの、チロシン（Ｙ）での置換（Ｉ１７９βＹ）、
を含む、請求項２に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。 - 前記変異ＣＰＣアシラーゼが、配列番号４のβ－サブユニットにおける４５３位のヒスチジン（Ｈ４５３β）の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での置換による変異をさらに含む、請求項６に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。
- 配列番号４のβ－サブユニットにおけるＨ４５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｈ４５３βＴ）により、４５３位のヒスチジンの置換が、行われる、請求項７に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。
- 前記変異ＣＰＣアシラーゼが、配列４のβ－サブユニットにおける、以下のアミノ酸：
４５位のイソロイシン（Ｉ４５β）、５８位のフェニルアラニン（Ｆ５８β）、１５３位のチロシン（Ｙ１５３β）、１７７位のフェニルアラニン（Ｆ１７７β）、および３８２位のバリン（Ｖ３８２β）
から選択される少なくとも１つのアミノ酸の、元のアミノ酸残基とは異なるあるアミノ酸での追加の置換による変異を、さらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。 - 前記追加の置換が、配列番号４のβ－サブユニットにおける、
Ｉ４５βの、バリン（Ｖ）での置換（Ｉ４５βＶ）；
Ｆ５８βの、バリン（Ｖ）での置換（Ｆ５８βＶ）；
Ｙ１５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｙ１５３βＴ）；
Ｆ１７７βの、ロイシン（Ｌ）での置換（Ｆ１７７βＬ）;および、
Ｖ３８２βの、ロイシン（Ｌ）での置換（Ｖ３８２βＬ）
からなる群から選択される少なくとも１つの置換である、請求項９に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。 - 前記追加の置換が、配列番号４のβ－サブユニットにおける、
Ｉ４５βの、バリン（Ｖ）での置換（Ｉ４５βＶ）；
Ｆ５８βの、バリン（Ｖ）での置換（Ｆ５８βＶ）；
Ｙ１５３βの、トレオニン（Ｔ）での置換（Ｙ１５３βＴ）；
Ｆ１７７βの、ロイシン（Ｌ）での置換（Ｆ１７７βＬ）;および、
Ｖ３８２βの、ロイシン（Ｌ）での置換（Ｖ３８２βＬ）
の全ての置換を含む、請求項１０に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。 - 前記変異ＣＰＣアシラーゼが、配列番号９または配列番号１２のアミノ酸配列によって表される、請求項１０に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ。
- （１）請求項１～８のいずれか１項に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ、または
（２）（１）の変異ＣＰＣアシラーゼにおける変異に加えて、置換Ｉ４５βＶ、置換Ｆ５８βＶ、置換Ｙ１５３βＴ、置換Ｆ１７７βＬおよび置換Ｖ３８２βＬからなる群から選択される少なくとも１つの置換による変異を含む変異ＣＰＣアシラーゼ、
をコードする、核酸分子。 - 請求項１３に記載の核酸分子を担持する、組換え発現ベクター。
- 請求項１３に記載の核酸分子を含む、組換え細胞。
- ７－アミノセファロスポラン酸（７－ＡＣＡ）またはその塩の生成のための組成物であって、
（１）請求項１～８のいずれか１項に記載の変異ＣＰＣアシラーゼ；
（２）（１）の変異ＣＰＣアシラーゼにおける変異に加えて、Ｉ４５βＶ、Ｆ５８βＶ、Ｙ１５３βＴ、Ｆ１７７βＬおよびＶ３８２βＬからなる群から選択される少なくとも１つの置換による変異を含む、変異ＣＰＣアシラーゼ：
（３）（１）の変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸分子、または前記核酸分子を含む組換え発現ベクターもしくは組換え細胞；
（４）（２）の変異ＣＰＣアシラーゼをコードする核酸分子、または前記核酸分子を担持する組換え発現ベクター；および
（５）前記核酸分子または前記組換えベクターを含む組換え細胞、またはその培養物、
からなる群から選択されるうちの少なくとも１つを含む、組成物。 - 化学式２の化合物またはその塩を生成するための方法であって、請求項１６に記載の組成物と、化学式１の化合物またはその塩とを接触させるステップを含む、方法。
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